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CELL CYCLE
细胞增殖是生命的基本特征。
初生婴儿1012个细胞,成人1014个,约200种类型。
成人每秒钟有数百万新细胞产生。
一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次,并保持这一速度,则两天即可超过地球的重量。
第一节什么是细胞周期
Eucaryotic Cell Cycle
根据细胞周期可将高等动物细胞分为3类:
①连续分裂细胞,如表皮生发层、骨髓干细胞。
②休眠细胞,称G0期细胞。
③不分裂细胞,又称终端细胞,如神经、肌肉、多形核细胞等。
一、细胞分裂的类型
Amitosis,Remark 1841
Mitosis,Fleming 1882,Strasburger 1880
Meiosis
Gametic
Sporic
Zygotic
Somatic
Amitosis
Mitosis
Prophase
Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nucleus.
图片来自http://www.wadsworth.org/
图片来自http://www.wadsworth.org
Spindle
Premetaphase
Metaphase
Anaphase
Anaphase A and B
Microtubules and Motors in the spindle
Telophase
Cytokinesis
Dividing Muscle Myoblast (SEM x8,000)
Telophase in plant cells
Meiosis
Meiosis in mouse spermatogenesis
Zygotic meiosis
Gametic meiosis
Sporic meiosis
synaptonemal complex
Chromosome recombination 1
Chromosome recombination 2
二、细胞周期时间的测定
G1期差异较大,M期最短,约0.5~4.5小时。
周期长短与物种/细胞类型有关。
测定方法:标记有丝分裂百分率法(PLM),用3H TdR对测定细胞脉冲标记、定时取材,通过统计标记有丝分裂细胞百分数来测定细胞周期。
T
常以(TG2+1/2TM)-TG2的方式求出TM
三、细胞同步化
(一)自然同步化
1. 多核体:粘菌、疟原虫。
2 . 水生动物受精卵:海胆、两栖类。
3. 增殖抑制解除后的同步分裂:真菌休眠孢子。
(二)人工同步化
1. 选择同步化
1)有丝分裂选择法
优点:操作简单,同步化程度高,细胞不受药物伤害。
缺点:获得的细胞数量较少(分裂细胞约占1%~2%) 。
2)细胞沉降分离法
优点:可用于任何悬浮培养的细胞。
缺点:同步化程度较低。
2. 诱导同步化
1)DNA合成阻断法:用DNA合成抑制剂,可逆阻断细胞周期,然后释放。常用TDR双阻断法。
优点:同步化程度高;
缺点:产生非均衡生长,个别细胞体积增大。
2)中期阻断法
用秋水仙素等微管抑制剂将细胞阻断在中期。优点是便于观察染色体,缺点是可逆性较差。
第二节 细胞周期调控
CELL CYCLE CONTROL
prematurely condensed chromosome,PCC
G1
S
G2
一、研究背景
1970s Rao等发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩,说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子 ( MPF)。
Hartwell 1960s, Nurse 1970s 分别以芽殖酵母和裂殖酵母为材料,利用温度敏感突变株,发现许多与细胞分裂有关的基因( cdc)。
FISSION YEAST
BUDDING YEAST
T. Hunt 1980s发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡,命名为cyclin A和B,其mRNA能诱导蛙卵成熟。
1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定MPF由32KD和45KD两种蛋白组成,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。进一步的研究发现MPF=cdc2+clyclin B
Leland H. Hartwell
R. Timothy (Tim) Hunt
Sir Paul M. Nurse
2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。
二、CDK
cdc2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性,故名细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。
cdc2又称CDK1,可将特定蛋白磷酸化,如:
将核纤肽磷酸化导致核纤层解体、核膜消失;
将H1磷酸化导致染色体的凝缩等。
在动物中已知十多种CDK,均含PSTAIRE序列
Different CDKs
三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子
CKI对细胞周期起负调控作用,分为:
①Ink4: 抑制cdk4·cyclin D1, cdk6·cyclin D1。
②Kip:抑制大多数CDK。其中P21cip1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA结合,直接抑制DNA的合成。
四、细胞周期蛋白cyclin
特点:在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列,称为周期蛋白框,介导与CDK结合。
作用:激活和引导CDK作用于不同底物。
已知30余种,分为4类:G1型、G1/S型、S型、M型。
不同类型的CDK/cyclin复合体
*包括D1-3,各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同,但具有相同的功效。
CELL CYCLE REGULATION
中期当MPF活性达到最高时,激活APC,通过泛素化途径降解cyclin B,完成细胞周期。
分裂期周期蛋白N端具有降解盒。
泛素由76个氨基酸组成,高度保守。共价结合泛素的蛋白能被蛋白酶体识别和降解,是细胞内短寿命蛋白和异常蛋白降解的普遍途径。
Destruction Box in Cyclins
26S蛋白酶体是大型的蛋白酶,可将泛素化的蛋白质分解成短肽。
M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。
结合cyclin B的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性,使CDK/cyclin不断积累。
在M期,Wee1的活性下降,cdc25使CDK去磷酸化,去除了CDK活化的障碍。
CDK的激活需要Thr161的磷酸化,它是在CDK激酶(CDK activating kinase CAK)的作用下完成的。
五、M期CDK的激活
CDK ACTIVATING
六、细胞周期检验点(check point)
组成:感受器、信号传导通路、效应器。
主要检验点:
G1/S检验点:DNA是否损伤?细胞外环境是否适宜?细胞体积是否足够大?在酵母中称start点,在哺乳动物中称R点(restriction point)。
S期检验点:DNA复制是否完成?
G2/M检验点:DNA是否损伤?细胞体积是否足够大?
中-后期检验点:纺锤体组装检验点。
FOUR CHECKPOINTS
ATM(ataxia telangiectasia-mutated gene)
最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者,人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子,表现出对电离辐射敏感和易患癌症。
ATM编码一个蛋白激酶,结合在损伤的DNA上,其信号通路有两条。
①激活Chk1(checkpoint kinase), 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性,抑制M-CDK的活性,中断细胞周期。
②激活Chk2,使P53被磷酸化而激活,然后P53作为转录因子,导致P21表达,P21抑制G1-S期CDK的活性,中断细胞周期。
七、生长因子对细胞增殖的影响
生长因子是与细胞增殖有关的信号物质,已知几十种,多数能促进细胞增殖。
作用方式:旁分泌。
信号通路:ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。
如通过ras途径,激活MAPK,MAPK进入细胞核内,激活c-myc,myc作为转录因子促进cyclin D、SCF、E2F等G1-S有关的基因表达,细胞进入G1期。
蛋白名称或类别 在细胞周期中的作用
CDK 激酶,使底物磷酸化,调节底物活性。
Cyclin 与CDK结合,激活CDK,并引导CDK作用于特定的底物。
CAK 磷酸化CDK的激活位点,激活CDK。
Wee 1 磷酸化CDK的抑制位点,抑制CDK1的活性。
CDC 25 属于磷脂酶,去除CDK抑制位点的磷酸化修饰。
p27 抑制G1/S和S期CDK的活性,当细胞进入终末分化时,使其退出细胞周期。
p21 当DNA损伤时,抑制G1/S和S期CDK的活性。
p16 抑制G1期CDK的活性。
APC/C 属于泛素连接酶,参与securin和S、M期周期蛋白的降解,触发中期向后期的转变。
CDC 20 APC/C的激活因子,引导APC/C作用于特定的底物。
Cdh 1 APC/C的激活因子,维持从后期到G1期APC/C的活性。
SCF 属泛素连接酶,负责将泛素连接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上。
主要的细胞周期调节蛋白
See you!