选修三 现代生物科技专题 单元复习学案（含解析）
文档属性
| 名称 | 选修三 现代生物科技专题 单元复习学案（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 5.2MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2021-10-25 23:56:52 | ||
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文档简介
选修三 现代生物科技专题
第一讲 基因工程
,考纲要求)1.基因工程的诞生 Ⅰ
2．基因工程的原理及技术(含PCR技术) Ⅰ
3．基因工程的应用 Ⅱ
4．蛋白质工程 Ⅰ
5．实验：DNA的粗提取与鉴定
考点一 基因工程的操作工具
, )
1．基因工程的概念理解
(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内表达。
(7)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
①种类：
常用类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
②作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两段DNA片段。
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒特点
, )
易错整合，判断正误。
(1)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(2)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(3)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × )
(5)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点( √ )
, )
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和Sma Ⅰ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
(2)以上实例说明限制酶有何特性？
[提示](1)EcoR Ⅰ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
(2)说明限制酶具有专一性。
重 难 精 讲
1．基因工程的理论基础
2．基因工程的工具酶
(1)几种酶的比较
比较项目 限制酶 DNA连 接酶 DNA 聚合酶 解旋酶 DNA(水 解)酶
作用底物 DNA分子 DNA分 子片段 脱氧核 苷酸 DNA分子 DNA分子
作用部位 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 碱基对间 的氢键 磷酸二 酯键
作用结果 产生黏性 末端或 平末端 形成重组 DNA分子 形成新的 DNA分子 形成单链 DNA分子 形成游离 的脱氧核 苷酸
(2)限制酶与DNA连接酶的关系
[易错警示]
关于工具酶的五个注意点
(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(2)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(5)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)载体种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(3)作为载体的条件
条件 适应性
稳定存在并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA的鉴定和选择
[易错警示]
(1)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(2)载体上标记基因的标记原理：
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
精 准 命 题
例1 下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( C )
A．Hind Ⅲ B．EcoR Ⅰ
C．EcoB D．Pst Ⅰ
[解析] A处有3处(BamH Ⅰ、EcoB、Cla Ⅰ)限制酶的切点，只有使用EcoB限制酶切割时，才能让目的基因插入到A处且使原有基因失活。
技巧点拨
确定限制酶种类的两种方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
〔对应训练〕
1．(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙，不能表达的原因是甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coli_DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
[解析] (1)由图(a)可知，尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，所以这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端。
考点二 基因工程的操作过程与应用和PCR技术
, )
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。
②获取方法：
a．直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或部分基因文库中获取。
b．人工合成：
ⅰ.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
ⅱ.以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。
③扩增目的基因：利用PCR技术扩增目的基因。
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
a．启动子
ⅰ.位置：位于基因的首端。
ⅱ.作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
b．终止子
ⅰ.位置：位于基因的尾端。
ⅱ.作用：使转录在所需要的地方停止下来。
②构建目的
a．使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；
b．使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)将目的基因导入受体细胞
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②常用方法(连线)
(4)目的基因的检测与鉴定
方法 检测或鉴定目的 水平
DNA分子杂交技术 检测目的基因的有无 分子 水平
分子杂交技术 目的基因是否转录
抗原—抗体杂交技术 目的基因是否翻译
生物性状的表达与否 目的基因是否表达 个体水平
2.基因工程的应用
(1)转基因植物
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
(2)转基因动物
动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。
(3)基因工程药物
①来源：转基因的工程菌。
②成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
③作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
(4)基因治疗
①方法：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。
②效果：治疗遗传病的最有效的手段。
③分类：体内基因治疗和体外基因治疗。
3．蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：满足人类的生产和生活的需求。
(2)操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
, )
易错整合，判断正误。
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( × )
(2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达( √ )
(3)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术( √ )
(4)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达( × )
(5)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( √ )
(6)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
, )
据图分析抗虫棉的培养过程
(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？
(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
[提示](1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。
(2)采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
重 难 精 讲
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①直接分离
②人工化学合成：适用于分子较小的基因。
[易错警示]
细胞内DNA的复制与PCR扩增DNA的比较
比较项目 细胞内复制DNA PCR扩增DNA
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分双链解开 加热至90℃以上时，双链全部解开，不需要解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
特点 边解旋边复制 体外迅速扩增
Taq DNA 聚合酶 不需要(只需DNA聚合酶) 需要
循环次数 受生物体自身控制 30多次
相同点 两者都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲液中进行，都是半保留复制
(2)基因表达载体的构建
①基因表达载体的组成
(3)将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
(5)基因治疗与基因诊断
原理 操作过程 进展
基因 治疗 基因 表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗 临床实验
基因 诊断 碱基互 补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况 临床应用
[易错警示]
关于基因工程的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
(2)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象：第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在分子水平杂交检测。
(3)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器：操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。
(4)DNA复制、PCR技术与基因克隆
DNA复制 PCR技术 基因克隆
场所 细胞核 生物体外 细胞内
酶 解旋酶、 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 限制酶、 DNA连接酶
载体 不需要 不需要 需要
遵循原则 碱基互补配对 碱基互补配对 碱基互补配对
结果 DNA分子 DNA分子片段 DNA分子片段
2.蛋白质工程与基因工程的关系
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
联 系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
[易错警示]
二者都属于分子水平的操作，蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程。
3．基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
构建基 因文库 的过程
文库大小 小 大
基因中 启动子 无 有
基因中 内含子 无 有
基因多少 某种生物的 部分基因 某种生物的 全部基因
物种间的 基因交流 可以 部分基因可以
说明 基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
4.利用PCR技术扩增目的基因
(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。
(3)原理：DNA双链复制。
(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
(5)过程
第一步：加热至90～95℃，DNA解链为单链；
第二步：冷却至55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
精 准 命 题
例2 (2017·全国卷Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
[解析] (1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原——抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
〔对应训练〕
2．(2016·全国卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制(能稳定遗传)、具有标记基因(答出两点即可)，而
作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
[解析] (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件：具有一个或多个限制酶切位点，具有标记基因，能够在宿主细胞中复制表达等。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
3．(2018·湖北八校第一次联考)北极比目鱼中有抗冻基因，下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，请回答：
(1)利用过程①的方法构建的基因文库是部分基因文库(填“基因组文库”或“部分基因文库”)。
(2)过程②中常需要使用限制酶和DNA连接酶，既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是T4DNA连接酶。
(3)为使过程①获取的目的基因在番茄细胞中能够表达，在构建表达载体时，需在目的基因的两端加入启动子、终止子。
(4)将重组质粒导入农杆菌，并通过农杆菌的转化作用，可以将目的基因导入番茄体细胞中染色体的 DNA上，其原理是目的基因随农杆菌中Ti质粒上的T—DNA转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
(5)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中成功表达，应检测转基因番茄植株中该基因的表达产物是否呈阳性。
考点三 DNA的粗提取与鉴定
, )
1．实验原理
2．操作流程
, )
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
(3)操作③中的粘稠物是如何获取的？加入2 mol/LNaCl的目的是什么？
[提示](1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。
(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
重 难 精 讲
1．DNA和蛋白质在不同NaCl溶液中的溶解度比较
2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 溶解规律
DNA 溶解 析出
蛋白质 部分发生 盐析沉淀 溶解 NaCl溶液浓度从 2 mol/L降低过程 中，溶解度逐渐增大
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏 水2次 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破； ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布 过滤4次 ①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl 溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
精 准 命 题
例3 下列关于DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是( A )
选项 试剂 操作 作用
A 柠檬酸 钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固
B 蒸馏水 与鸡血细胞混合 保持细胞形状
C 蒸馏水 加入到溶解有 DNA的NaCl 溶液中 析出蛋白质
D 冷却的 酒精 加入到过滤后含 DNA的NaCl溶液中 产生特定的 颜色反应
[解析] 蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B项错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C项错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D项错误。
〔对应训练〕
4．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管 序号 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？溶液颜色基本不变。
(3)在沸水浴中加热的目的是加快颜色反应速度，同时说明DNA对高温有较强的耐受性。
(4)A试管在实验中的作用是对照。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA(丝状物)的多少有关。
[解析] B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。
3．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵，培育转基因植物时的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
4．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
5．利用基因工程技术产生的目的基因产物均为自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程产生的蛋白质均已被改造，为新蛋白质。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2018·全国卷Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
[解析] (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。
(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
2．(2018·全国卷Ⅱ，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1 GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析] (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1 GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1 GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1 GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
3．(2018·江苏， 32)为生产具有特定性能的α 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α 淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定与引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α 淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。
(5)获得工程菌表达的α 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4 KH2PO4 50 mmol/L Tris HCl 50 mmol/L Gly NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相对 活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
根据上述实验结果，初步判断该α 淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_Tris HCl。
[解析] (1)利用 PCR 技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。
(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。
(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共16种可能性。题干表明控制α 淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13种可能性。
(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris HCl。
4．(2017·全国卷Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
[解析] (1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是相对于老叶而言嫩叶组织细胞更容易被破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需启动子。(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
第二讲 细胞工程
,考纲要求)1.植物组织培养 Ⅱ
2．动物细胞培养与体细胞克隆 Ⅱ
3．细胞融合与单克隆抗体 Ⅱ
考点一 植物细胞工程
, )
1．细胞工程的概念理解
(1)原理和方法
细胞生物学和分子生物学。
(2)操作水平
细胞水平或细胞器水平。
(3)工程目的
按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。
(4)根据操作对象的不同分类
植物细胞工程和动物细胞工程。
2．植物细胞工程
(1)理论基础——细胞的全能性
①概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。
②物质基础：细胞中具有本物种全部遗传信息。
③表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。
(2)植物组织培养技术
①概念理解
a．培养对象：离体的植物器官、组织、细胞。
b．培养条件：无菌、人工配制的培养基、相关激素等人工控制条件。
c．培养结果：产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
②操作流程
外植体愈伤组织根、芽或胚状体―→试管苗
(3)植物体细胞杂交技术
①概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
②操作流程
③流程分析
a．过程a为去除细胞壁获得具有活力的原生质体，用到的酶是纤维素酶和果胶酶。
b．过程b是原生质体的融合，其原理是细胞膜具有一定的流动性。
c．诱导b融合的两种方法
物理法包括离心、振动、电激等；
化学法一般用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。
d．过程c是原生质体融合后再生出细胞壁。
e．过程d是植物组织培养技术，其原理是细胞的全能性。
④意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
3．植物细胞工程的实际应用
(1)微型繁殖：优点是能够保持亲本的优良性状。
(2)作物脱毒：利用茎尖、根尖等无毒组织进行微型繁殖。
(3)培育人工种子：可以解决某些植物结实率低、繁殖困难的问题。
(4)作物新品种的培育
(5)细胞产物的工厂化生产：即利用植物组织培养技术生产蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料和生物碱等。
, )
易错整合，判断正误。
(1)愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的( × )
(2)经植物组织培养得到的胚状体用人工薄膜包装后可得到人工种子( √ )
(3)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合( × )
(4)用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性( × )
(5)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志( √ )
, )
据图分析植物体的细胞杂交过程
(1)植物体细胞杂交依据的生物学原理是什么？
(2)如何根据细胞膜表面荧光判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的？
(3)若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞内有n条染色体，则“番茄——马铃薯”细胞在有丝分裂后期含有多少条染色体？
(4)若杂种细胞培育成的“番茄——马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于几倍体植株？
[提示](1)细胞膜的流动性、植物细胞的全能性。
(2)融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光。
(3)2(m＋n)条。
(4)单倍体植株。
重 难 精 讲
1．植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
名称 植物组织培养 植物体细胞杂交
原理 细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性
过程
选材 选取根尖、茎尖、形成层部位最容易诱导脱分化 不同的植物细胞
技术 操作 脱分化、再分化等 除脱分化、再分化外，还要用酶解法去除细胞壁，用一定的方法诱导细胞融合
关系 植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂
2.脱分化和再分化的比较
内容 脱分化 再分化
过程 外植体→愈伤组织 愈伤组织→胚状体
形成体特点 排列疏松、无规则、高度液泡化的薄壁细胞 有根、芽
条件 a.离体 b．适宜的营养 c．生长素/细胞分裂素的比例适中 d．不需要光照 a.离体 b．适宜的营养 c．生长素和细胞分裂素 d．光照
3.激素比例与分化的关系
适当提高生长素与细胞分裂素的比例容易生根，适当提高细胞分裂素与生长素的比例容易生芽，比例适中诱导产生愈伤组织。(如图所示)：
4．植物体细胞杂交过程中杂种细胞类型及检测方法
(1)诱导产物(假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B)：
①未融合的细胞：A和B。
②两两融合的细胞：AA、BB和AB。
③多细胞融合体。
(2)检测方法：对诱导产物中的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判断。
①若只表现出一种植物的性状，说明是未融合细胞。
②若得到的是具有两种亲本性状的植物，说明是杂种植株。
③若得到的是具有两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强，则是多细胞融合体。
④若只表现出一种植物的性状且效果得到加强，则是同种细胞融合的结果。
5．单倍体育种和突变体的利用的不同点
项目 原理 优点 成果
单倍体 育种 染色体 变异 明显缩短 育种年限 单育1号烟草品种，中花8号、11号水稻和京花1号小麦品种等
突变体 的利用 基因突变 产生新基因，大幅度改良某些性状 抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的野生烟草等
[易错警示]
有关细胞全能性及细胞培养的四个注意点
(1)具有全能性≠体现(实现)全能性
①具有全能性：理论上，活细胞都具有全能性。
②体现全能性：只有发育成完整个体，才能说明实现了细胞的全能性。
(2)细胞全能性的大小比较
①植物细胞>动物细胞。
②受精卵>生殖细胞>体细胞。
③分化程度低的细胞>分化程度高的细胞；幼嫩细胞>衰老细胞；分裂能力强的细胞>分裂能力低的细胞。
精 准 命 题
例1 (2018·甘肃重点中学协作体第一次联考)选取A、B植株的细胞进行如图所示操作，请回答问题：
(1)实现图中的①过程最常用的方法是酶解法。
(2)②过程的发生，必须进行诱导融合，其方法有物理法和化学法。
(3)若细胞A内含a条染色体，细胞B内含b条染色体，则“杂种细胞”内含a＋b条染色体；若A、B植株采用常规杂交育种方法培育成功的话，得到的后代含(a＋b)/2条染色体，必须用秋水仙素来处理幼苗，才能得到可育的杂种植株，其中含有a＋b条染色体。这两种方法相比，体细胞杂交方法的优点是克服远缘杂交不亲和的障碍。
(4)如果原生质体A为小鼠的浆细胞，原生质体B为小鼠的骨髓瘤细胞，诱导二者融合时，独特的方法是用灭活的病毒处理。
〔对应训练〕
1．(2017·广东广州二模，38)研究人员利用植物组织培养技术，通过图一所示的流程进行育种实验，培育出具有耐盐性的植株。
回答下列问题：
(1)图一所示的实验流程中，再分化发生在④(填“①”“②”“③”或“④”)过程；用γ射线照射愈伤组织的目的是诱发其基因突变(提高突变率)。实验过程应注意无菌操作，对所用的培养基要进行灭菌处理，对外植体进行消毒处理。
(2)将经γ射线照射和不经照射处理的愈伤组织，分别转移到含不同浓度NaCl的分化培养基中培养，愈伤组织再分化出幼苗的比例如图二所示，据图分析：
①本实验的两个自变量分别是NaCl浓度、是否照射γ射线。用剂量为10Gy的γ射线照射愈伤组织后，获得耐盐性幼苗的比例升高(填“升高”“不变”或“降低”)。
②通过本实验不能(填“能”或“不能”)确定在分化培养基中NaCl浓度大于1.0%时，不经γ射线照射愈伤组织不能分化出幼苗。判断的理由是未获取NaCl浓度为1.0%～1.5%的实验数据，因此不能确定。
考点二 动物细胞培养与体细胞克隆
, )
1．动物细胞培养——动物细胞工程技术的基础
(1)原理：细胞增殖。
(2)培养条件
①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，添加抗生素，定期更换培养液以清除代谢产物。
②营养：除正常的有机和无机营养外，加入血清、血浆等一些天然成分。
③适宜的温度和pH：温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)，pH为7.2～7.4。
④气体环境：含95%空气加5%CO2的混合气体，其中后者的作用是维持培养液的pH。
(3)动物细胞的培养过程
(4)应用
生物制品的生产、检测有毒物质、医学研究。
2．动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)原理：动物体细胞核具有全能性。
(2)动物体细胞核移植技术的过程
代孕母体―→出生与供体遗传物质基本相同的个体
(3)结果：产生新个体。
(4)应用
①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。
②保护濒危物种。
③生产医用蛋白。
④作为异种移植的供体。
⑤用于组织器官的移植。
, )
易错整合，判断正误。
(1)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞( × )
(2)克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变( × )
(3)二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的( × )
(4)动物细胞核移植的受体细胞必须是卵细胞( × )
(5)克隆动物的性状与供体动物完全相同( × )
, )
如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线，图中B、E两点表示经筛选、分装后继续培养。据图分析：
(1)原代培养和传代培养的分界点是哪个？
(2)AB和DE段繁殖速度缓慢的原因是什么？
(3)E点后的细胞大多数具有异倍体核型，这样的细胞有什么特点？
[提示](1)B点之前的培养称为原代培养，之后的培养称为传代培养。
(2)发生了接触抑制。
(3)E点后的细胞属于细胞系，能无限增殖。
重 难 精 讲
1．植物组织培养与动物细胞培养的比较
技术 内 项目 容 植物组织培养 动物细胞培养
原理 细胞的全能性 细胞的增殖
培养基 成分 矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加剂(如甘氨酸、琼脂等)，属于固体培养基 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等，属于液体培养基
取材 较幼嫩的细胞、组织、器官 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
培养过程
培养结果 可以获得植株，也可以获得大量细胞 只能获得大量细胞，不能得到生物个体
应用 ①植物快速繁殖与脱毒植物培养 ②生产细胞产品 ③制造人工种子 ④用于转基因植物的培育 ①生产蛋白质生物制品 ②培养皮肤移植的材料 ③检测有毒物质 ④用于生理、病理、药理等的研究
相同点 ①都需人工条件的无菌操作 ②都是合成培养基 ③都需适宜的温度、pH等条件
2.动物细胞培养与动物体细胞核移植的比较
项目 动物细胞培养 动物体细胞核移植
原理 细胞增殖 动物细胞核的全能性
过程
结果 获得细胞群 获得与供体遗传物质基本相同的个体
3.核移植时应注意的几个问题
(1)核移植时应选MⅡ中期卵母细胞的原因
①此类细胞体积大，易于操作；②卵黄多，营养物质丰富，可为发育提供充足的营养；③卵母细胞的细胞质中存在激发细胞核全能性表达的物质。
(2)克隆动物是由重组的细胞经培养而来的，该重组细胞的细胞质基因来源于受体细胞，细胞核基因来源于提供细胞核的亲本，其遗传物质来自2个亲本。
(3)核移植中供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
(4)动物体细胞核移植技术(克隆)从生殖方式的角度看属无性生殖，重组细胞相当于受精卵，需要动物细胞培养和胚胎工程技术的支持。
[易错警示]
(1)原代培养和传代培养
①原代培养：可有两种表述：a.细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。两种表述没有本质区别。
②传代培养：同样有两种表述：a.细胞悬液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养，统称为传代培养。
(2)细胞株和细胞系
①细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右会出现生长停滞，衰老死亡，少数度过“危机”的细胞能传50代左右，形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发生改变。
②细胞系：细胞株传至50代以后，会出现第二次危机，少数度过第二次危机的细胞能够无限传代下去，形成细胞系。 细胞系的遗传物质发生了改变，带有癌变细胞的特点。
精 准 命 题
例2 (2018·内蒙古包头九中期中)转基因猪在异种器官移植、生物反应器和疾病模型等方面有广泛应用。下图为转基因猪的培育过程，请分析回答：
(1)体外培养猪胎儿成纤维细胞，需定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害。当细胞贴满瓶壁时，可分瓶进行传代培养，让其继续增殖，通常选用10代以内的细胞进行核移植，目的是保持细胞正常的二倍体核型。
(2)为便于检测与筛选，用红色荧光蛋白基因作为标记基因参与构建基因表达载体，将其导入猪胎儿成纤维细胞中，筛选发红色荧光的细胞与MⅡ(或减Ⅱ)中期的去核卵母细胞融合，使供体核进入受体卵母细胞，利用物理或化学的方法激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育进程形成重组胚胎。采用机械方法进行胚胎分割使代孕猪产下同卵双胎或多胎。
(3)与成年动物细胞相比，用胚胎细胞克隆动物的成功率较高，原因是胚胎细胞的分化程度低于成年动物的体细胞，恢复其全能性相对容易。
〔对应训练〕
2．(2018·辽宁辽南协作体二模，40)美国威斯康星州的一个奶牛场有一头奶牛，年产奶量达30.8 t，我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。某人用该高产奶牛的耳朵细胞，采用核移植技术获得高产奶牛(如下图)。回答下列问题：
(1)动物细胞培养的原理是细胞增殖，在此过程中为了防止培养液被污染，还需在培养液中添加一定量的抗生素，此外还应定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(2)用于核移植的供体细胞，一般都选用10代以内的细胞，原因是10代以内的细胞一般能保证正常的二倍体核型。传至50代以后，少数细胞会克服细胞自然寿命的极限，获得不死性，与正常细胞相比，其遗传物质已发生突变。
考点三 动物细胞融合与单克隆抗体的制备
, )
1．动物细胞融合
(1)原理：细胞膜的流动性。
(2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
(3)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．单克隆抗体
(1)制备过程
(2)优点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
(3)用途：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物。
, )
易错整合，判断正误。
(1)植物原生质体融合与动物细胞融合原理是相同的( √ )
(2)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体( × )
(3)小鼠骨髓瘤细胞的染色体数为40，B淋巴细胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分子数为86( × )
(4)杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得能产生单克隆抗体的胚胎( × )
(5)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经细胞融合后有三种细胞类型(若仅考虑两两融合的情况)( √ )
, )
如图为制备单克隆抗体和多克隆抗体的示意图。请据图思考：
(1)单克隆抗体相比多克隆抗体，其优点有哪些？
(2)图中第一次筛选和第二次筛选的目的有何不同？
(3)注射抗原的目的是什么？
(4)杂交瘤细胞有什么特点？
[提示](1)单克隆抗体的优点是：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
(2)第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生所需单克隆抗体的杂交瘤细胞。
(3)刺激机体发生免疫反应，从而产生浆细胞。
(4)既能无限增殖，又能产生所需抗体。
重 难 精 讲
1．植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合(单克隆抗体制备)
理论基础(原理) 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性、细胞增殖
融合前处理 酶解法(纤维素酶、果胶酶)去除细胞壁 注射特定抗原使正常小鼠产生免疫反应
促融方法 ①物理法：离心、振动、电刺激等； ②化学法：聚乙二醇(PEG) ①物化法：与植物细胞融合相同； ②生物法：灭活的病毒
过程 第一步 原生质体的 制备(酶解法) 正常小鼠 免疫处理
第二步 原生质体融 合(物化法) 动物细胞融合
第三步 杂种细胞的 筛选与培养 杂交瘤细胞的 筛选与培养
第四步 杂种植株 诱导与鉴定 单克隆抗体的提纯
图 解
2.单克隆抗体制备过程的几个问题分析
(1)对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以，与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。
(2)在单克隆抗体制备过程中，一般认为有两次筛选过程，第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基)，第二次是进一步筛选出能产生人们所需抗体的杂交瘤细胞。
(3)杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，从而可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，而大量生产单克隆抗体。
精 准 命 题
例3 (2018· 湖北四校联考)动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。
回答下列问题：
(1)动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入血清(或血浆)等天然成分。细胞培养所需气体主要有O2和CO2，CO2的主要作用是维持培养液的pH。细胞体外培养的适宜温度一般与动物的体温相近。
(2)动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制，此时，瓶壁上形成的细胞层数是单层。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用胰蛋白酶进行处理。
(3)诱导动物细胞融合常用的化学试剂是聚乙二醇(PEG)。单克隆抗体最主要的优点是特异性强、灵敏度高，并可大量制备。
〔对应训练〕
3．(2017·云南昆明二模)艾滋病病毒(HIV)外壳的包膜上有多种蛋白质，其中包膜糖蛋白(env)基因编码的gp160蛋白，可进一步加工成gp120蛋白，gp120蛋白具有较强的抗原性。制备抗HIV gp120的单克隆抗体，为艾滋病的治疗带来希望。请回答下列问题：
(1)若利用动物细胞工程制备抗HIV gp120的单克隆抗体。涉及的技术手段主要有动物细胞培养技术、动物细胞融合技术。
(2)细胞融合常用的生物诱导剂是灭活的病毒。融合后需要用特定的选择性培养基筛选，只有融合的杂种细胞才能生长，这种细胞的特点是既能大量繁殖，又能产生抗HIV_gp120抗体。
(3)科研人员设想用基因工程制备能表达抗HIVgp120抗体的重组细胞，获得目的基因可利用PCR技术扩增，需要在反应体系中添加的有机物有引物和模板DNA、Taq酶和4种脱氧核苷酸。利用显微注射法将目的基因导入骨髓瘤细胞。基因工程的核心是基因表达载体的构建。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整个体的潜能，即细胞的全能性。
2．植物体细胞杂交需要用酶解法制备原生质体，所用的酶包括纤维素酶和果胶酶。
3．动物细胞工程常用技术手段包括动物细胞培养，动物细胞核移植，动物细胞融合等，其中动物细胞培养技术为其他各技术的基础。
4．动物细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个去核卵母细胞中，构建重组细胞并使后者发育为新个体。
5．单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高、并可大量制备等优点。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2018·全国卷Ⅲ，38)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目不变(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度小于(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目相同(填“相同”或“不同”)，性染色体组合不同(填“相同”或“不同”)。
[解析] (1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。重组细胞形成的早期胚胎可移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞的染色体数目与提供细胞核的个体的体细胞相同。
(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。
(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。
2．(2017·全国卷Ⅲ，38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)先要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为模板，加入了dNTP作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是进行细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是维持培养液的pH。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少C(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
[解析] (1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、dNTP作为原料。(3)T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中有、而丙种蛋白中没有的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
第三讲 胚胎工程与生物技术的安全性和伦理
问题及生态工程
,考纲要求)1.动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础 Ⅰ
2．胚胎干细胞的移植 Ⅰ
3．胚胎工程的应用 Ⅱ
4．转基因生物的安全性 Ⅰ
5．生物武器对人类的威胁 Ⅰ
6．生物技术中的伦理问题 Ⅰ
7．简述生态工程的原理 Ⅱ
8．生态工程的实例 Ⅰ
考点一 体内受精和早期胚胎发育
, )
1．胚胎工程的概念
(1)操作对象：动物的早期胚胎或配子。
(2)技术：体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。
2．精子和卵子的发生
(1)精子的发生
①场所：睾丸的曲细精管。
②时间：初情期→生殖机能衰退。
③过程
(2)卵子的发生
①场所：卵巢。
②时间：胎儿期和初情期后。
3．受精
(1)场所：输卵管。
(2)过程：
①准备阶段
②受精阶段
4．早期胚胎发育
, )
易错整合，判断正误。
(1)成熟的精子并不具有受精能力，必须获能后才具备受精能力( √ )
(2)卵子受精的标志是在卵细胞和透明带的间隙出现两个极体( √ )
(3)透明带反应和卵细胞膜反应是防止多精入卵的两道屏障( √ )
(4)卵裂球细胞的体积随分裂次数增加而不断增大( × )
(5)卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加( × )
, )
如图表示哺乳动物发育过程的几个阶段，请据图分析：
(1)A、B、C的名称分别是什么？
(2)图中的4和7两个空腔是同一个结构吗？
(3)细胞分化开始出现于哪个时期？1部分的细胞将来形成什么结构？
(4)早期胚胎的发育过程中，卵裂时细胞的体积和所有的细胞体积之和有何变化？
[提示](1)桑椹胚、囊胚、原肠胚。
(2)不是，分别是囊胚腔和原肠腔。
(3)细胞分化开始出现于B(囊胚)时期，l部分的细胞将来形成胎膜和胎盘。
(4)卵裂过程中，细胞只分裂而不生长，所以每个细胞的体积越来越小，总的体积基本不变。
重 难 精 讲
1．精子和卵子的发生
项目 精子的发生 卵子的发生
不同点 场所 睾丸的曲细精管 卵巢(减数第一次分裂)、输卵管(减数第二次分裂)
时间 初情期到生殖机能衰退 ①卵泡的形成和在卵巢内的储备：出生前(即胎儿时期) ②排卵：初情期
过程
特点 ①减数第一次分裂和减数第二次分裂连续 ②需要变形 ①减数第一次分裂和减数第二次分裂不连续 ②不需要变形
相同点 ①原始生殖细胞的增殖为有丝分裂 ②生殖细胞的成熟为减数分裂；成熟过程均经一次复制和两次分裂，子细胞中染色体数目减半
2.受精
第一步：精子穿越放射冠和透明带。顶体反应使顶体内的酶释放出来并溶解放射冠内的卵丘细胞之间的物质；透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障。
第二步：精子进入卵细胞膜。卵细胞膜反应是防止多精入卵受精的第二道屏障。
第三步：原核形成。雄原核和雌原核形成。
第四步：配子结合。雌、雄原核融合形成合子(受精卵)。
3．胚胎发育
[易错警示]
关于体内受精的五点提醒
(1)精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量。
(2)排卵是指卵子从卵泡中排出，而不是卵泡从卵巢中排出。
(3)防止多精入卵的机制包括：第一道屏障：透明带反应；第二道屏障：卵细胞膜反应。
(4)受精标志和受精完成的标志
受精的标志是在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体；而受精过程完成的标志是雌、雄原核的融合。
(5)卵裂期细胞体积、数量及胚胎总体积的变化
细胞体积缩小，细胞数量增加，胚胎总体积不变或略有缩小。
精 准 命 题
例1 关于体内受精的顺序，正确的是( D )
①第一次卵裂开始 ②释放第二极体 ③顶体反应 ④穿越透明带 ⑤雌、雄原核的形成 ⑥核膜消失
A．①②③④⑤⑥ B．③②④⑤⑥①
C．④⑤②①③⑥ D．③④②⑤⑥①
[解析] 受精过程包括精、卵相遇，发生顶体反应，精子穿越放射冠；精子接触透明带；精子穿越透明带，接触卵细胞膜；精子头膨胀，同时卵子完成减数第二次分裂，释放第二极体；雌、雄原核形成，核膜消失，两个原核融合；第一次卵裂即将开始。
〔对应训练〕
1．如图表示哺乳动物发育过程的几个阶段，请据图回答问题：
(1)写出各个阶段的名称：
A：桑椹胚，B：囊胚，C：原肠胚。
(2)写出图中各标号的名称：
[2]内细胞团，[4]囊胚腔，[5]外胚层，[7]原肠腔，[8]内胚层。
(3)A时期的细胞具有发育上的全能性，B时期开始出现细胞分化，C时期开始出现胚层分化。
(4)[2]将来发育成胎儿的各种组织。
(5)动物胚胎是由合子经有丝分裂形成的，合子只由一个精子和卵子结合，防止多精入卵受精的两道屏障分别是透明带反应、卵细胞膜反应。
[解析] (1)图中A是桑椹胚，B是囊胚，C是原肠胚。(2)图B中[1]是滋养层，[2]是内细胞团，[3]是透明带，[4]是囊胚腔；图C中[5]是外胚层，[6]是滋养层，[7]是原肠腔，[8]是内胚层。(3)桑椹胚细胞具有全能性；囊胚开始出现细胞分化，已分化为滋养层细胞和内细胞团；原肠胚已有胚层分化，分化为外胚层、内胚层，在内、外胚层之间将形成中胚层。(4)内细胞团将发育为胎儿的各种组织，滋养层将发育为胎儿的胎膜和胎盘。(5)受精时的透明带反应和卵细胞膜反应是防止多精入卵的两道屏障。
考点二 体外受精和胚胎工程的应用
, )
1.体外受精
(1)卵母细胞的采集和培养
(2)精子的采集和获能
(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵子在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精作用。
2．胚胎的早期培养
(1)目的：检查受精状况和受精卵的发育能力。
(2)培养液成分巧记
(3)胚胎处理：受体移植或冷冻保存。
3．胚胎工程的应用及前景
(1)胚胎移植
①概念剖析
A．供体：能提供早期胚胎的雌性动物。
B．受体：同种的、生理状态相同的其他雌性动物。
②基本程序
③意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。
④生理学基础
A．移入：排卵后，供、受体生殖器官的生理变化是相同的。
B．收集：早期胚胎处于游离状态。
C．存活：受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。
D．遗传性：供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性不受任何影响。
(2)胚胎分割
①概念
A．方法：机械方法；
B．分割份数：将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等；
C．目的：获得同卵双胎或多胎。
②特点：动物无性繁殖或克隆的方法之一。
③材料：发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。
④要求：将内细胞团均等分割。
(3)胚胎干细胞(ES或EK细胞)
①来源：早期胚胎或原始性腺。
②特点
, )
易错整合，判断正误。
(1)利用胚胎分割技术可以获得两个基因型完全相同的胚胎( √ )
(2)胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割( × )
(3)在对囊胚进行分割时，要将滋养层细胞均等分割( × )
(4)胚胎干细胞在体外培养条件下具有增殖而不发生分化的特点( √ )
(5)胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点( × )
, )
请仔细分析下图，并回答：
(1)试管婴儿与设计试管婴儿培育程序分别包含上面的哪些序号？
(2)试管婴儿与设计试管婴儿在技术环节上的主要差异是什么？
(3)在胚胎移植时下列①～④中哪一项没有必要进行？
①对供体动物和受体动物进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应。
②用激素对供体动物做超数排卵处理。
③对供体、受体动物进行选择，并用激素进行同期发情处理。
④冲卵后，对胚胎进行质量检查。
[提示](1)、(2)图示过程中①②③是试管婴儿的培育过程，①②④⑤是设计试管婴儿培育的过程。后者比前者多了胚胎移植前的“遗传学诊断”。
(3)①胚胎移植时，经同期发情处理后，受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，故①不必进行。
重 难 精 讲
1．胚胎分割
2．胚胎干细胞
[易错警示] (1)滋养层≠饲养层
①滋养层：囊胚时期沿透明带内壁扩展和排列的、个体较小的细胞，滋养层最终发育成胎膜和胎盘。
②饲养层：饲养层细胞一般为输卵管上皮细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。
(2)不同动物胚胎移植的时间不同
①牛、羊要培养到桑椹胚或囊胚阶段。
②小鼠、家兔在桑椹胚前。
③几乎所有动物都不能到原肠胚阶段移植，因为此时分化程度高，移植成功率很低。
3．试管动物与克隆动物的比较
比较项目 试管动物 克隆动物
技术基础 体外受精、胚胎移植 核移植技术、细胞培 养、胚胎(分割)移植
实例 试管牛 多利羊
过程
生殖方式 有性生殖 无性无殖
遗传物质 遗传物质来自两个个体 遗传物质大部分来自供核生物体
意义 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期 加速家畜遗传改良进程、挽救濒危物种等
精 准 命 题
例2 (2016·江苏卷，11)印度沙漠猫是一种珍稀猫科动物，通过胚胎工程技术，可以让家猫代孕而繁育，主要步骤如图所示。下列相关叙述正确的是( B )
A．步骤甲、乙分别是指精子获能、胚胎分割
B．诱导超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞
C．受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于营养液
D．步骤甲使用的培养液和早期胚胎培养液成分基本相同
[解析] 图中步骤甲是指体外受精，步骤乙是指胚胎移植，A项错误；诱导超数排卵所注射的激素是促性腺激素，促性腺激素只能作用于性腺，B项正确；受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于受精卵中的细胞质，C项错误；体外受精可以在获能溶液或专用的受精溶液中进行，与早期胚胎培养液成分并非基本相同，D项错误。
技巧点拨
早期胚胎培养液与动物细胞培养液成分的比较
项目 早期胚胎培养液 动物细胞培养液
盐类 无机盐、有机盐 无机盐、微量元素
营养物质 氨基酸、核苷酸 糖、氨基酸
调节物质 维生素、激素 促生长因子
特有成分 血清 血清、血浆
〔对应训练〕
2．(2015·安徽卷)科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ医用蛋白，其技术路线如图。
(1)由过程①获得的A为含目的基因的表达载体_。
(2)在核移植之前，必须先去掉受体卵母细胞的核，目的是保证核遗传物质来自含目的基因的成纤维细胞。受体应选用MⅡ中期卵母细胞。
(3)进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。
(4)采用胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆，理论上可获得无限个转基因绵羊，这是因为整合有目的基因的成纤维细胞可进行传代培养。
[解析] (1)目的基因导入受体细胞前，需通过过程①形成含目的基因的表达载体。(2)核移植前，去掉卵母细胞核的目的是使核移植动物的核遗传物质全部来自含目的基因的成纤维细胞。受体应选用减数第二次分裂中期的卵母细胞。(3)胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。(4)整合有目的基因的成纤维细胞可以进行传代培养，所以理论上可获得无限个转基因绵羊。
3．(2018·四川巴蜀中学适应性月考)曾经分布于肯尼亚等东、中非地区的北部白犀牛数量已仅存五头，世界上最后一只幸存的雄性北部白犀牛“苏丹”已经被切除犀角由4名全副武装的警察24小时守护起来。雌性北部白犀牛每3年生产一次，每胎仅产1仔。为使这一种群数量恢复，可采用现代生物工程技术提高北部白犀牛的生育效率。请回答：
(1)首先对供体雌白犀牛和受体雌兽进行选择，并用激素进行同期发情处理。用促性腺激素处理供体雌白犀牛，然后从输卵管中冲取卵子。
(2)体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养。
(3)为取得同卵双胎或多胎，可以在胚胎发育的桑椹胚或囊胚期用机械方法将胚胎分割。具体操作时，用分割针将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明带中。
考点三 生物技术的安全性和伦理问题
, )
1．转基因生物的安全性
(1)
(2)
(3)理性看待生物技术
①正视转基因技术可能带来的安全性问题，要趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大限度保证转基因技术和产品的安全性。
2．关注生物技术的伦理问题
反对 支持
克隆人 伦理 方面 违反了人类的伦理道德观念，中国禁止生殖性克隆 中国不反对治疗性克隆
克隆人 技术 方面 技术不成熟，流产率高、畸形率高、出生后死亡率高 可通过胚胎分级、基因诊断、染色体检查等方法解决技术问题
设计试 管婴儿 胚胎也是生命，杀死胚胎无异于“谋杀” 提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤
基因 检测 技术 方面 很难用在具体医疗中 有一些遗传性疾病可以通过基因检测后在早期采取预防措施
道德 方面 可能引起基因歧视 通过正确的科学知识传播、伦理道德教育和立法，解决基因歧视现象
3.禁止生物武器
(1)生物武器的种类(连线)
种类 实例
①致病菌、病毒 a．重组流感病毒、新型鼠痘病毒
②生化毒剂 b．鼠疫菌、炭疽杆菌
③基因重组的致病菌 c．肉毒杆菌毒素
①—b__②—c__③—a
(2)我国政府观点
在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
重 难 精 讲
1．试管婴儿与克隆人的比较
一般过程 实质 说明
试管婴儿 体外受精、体外一定程度的胚胎发育、胚胎移植到子宫内继续发育 有性生殖 与人类正常生殖情况相比，主要是改变了受精和初期发育的场所
克隆人 将体细胞的核物质移到去核的卵细胞中，将重组胚胎移植到子宫内，逐渐发育为新个体 体细胞繁殖，属于无 性生殖 克隆过程证明了动物细胞核的全能性
2.治疗性克隆与生殖性克隆的比较
类型 项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 从胚胎中取出干细胞用于医学研究和治疗 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞水平 个体水平
联系 都属无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同
3.设计试管婴儿技术与试管婴儿技术的比较
设计试管婴儿 试管婴儿
技术 手段 多了胚胎移植前进行遗传学诊断这一环节 不需进行遗传学诊断
实践 应用 用于白血病、贫血病等疾病的治疗 解决不孕不育
二者都是体外受精、体外早期胚胎发育，再进行胚胎移植，从生殖方式上都为有性生殖
[易错警示]
(1)设计试管婴儿和基因检测在应用方面并非完全不同，两者都可用于避免遗传病患儿的出生，从而降低人类遗传病发病率。
(2)试管婴儿和克隆人的形成过程并不相同：前者进行减数分裂和受精作用，而后者只进行有丝分裂。
精 准 命 题
例3 (2018·山西太原重点中学检测)下列关于生物技术安全性和伦理问题的叙述，错误的是( C )
A．可设计试管婴儿，但单纯选择胎儿性别是违法的
B．克隆人会冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念
C．如果转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
D．利用试管婴儿提供骨髓造血干细胞救治病人是合乎道德规范的
[解析] 可设计试管婴儿，但单纯选择胎儿性别是违法的，A正确；克隆人可冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念，B正确；转基因植物的抗除草剂基因来源于自然界，但可能通过花粉传播而进入杂草中，存在安全性问题，C错误；利用试管婴儿提供骨髓造血干细胞救治病人是合乎道德规范的，D正确。
〔对应训练〕
4．(2018·河南部分示范高中模拟)现代生物技术在造福人类的同时，也可能引起一系列的安全和伦理问题，下列说法错误的是( D )
A．对于转基因生物，公众在食物安全、生物安全和环境安全方面产生了争论
B．生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等
C．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
D．我国对于“克隆人”这一技术总体来说是禁止生殖性克隆和治疗性克隆
[解析] 对于转基因生物，公众在食物安全、生物安全和环境安全方面产生了争论，A正确；生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等，B正确；我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度，C正确；我国对于“克隆人”这一技术总体来说是禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆，D错误。
考点四 生态工程的基本原理和实例
, )
1．建设目的
遵循自然界物质循环的规律，充分发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益和生态效益的同步发展。
2．特点
少消耗、多效益、可持续的工程体系。
3．基本原理
(1)物质循环再生原理：物质在生态系统中循环往复、分层分级利用。
(2)物种多样性原理：物种繁多而复杂的生态系统具有较高的抵抗力稳定性。
(3)协调与平衡原理：处理好生物与环境的协调与平衡，需要考虑环境承载力。
(4)整体性原理：进行生态工程建设时，不但要考虑自然生态系统的规律，还要考虑到经济和社会等系统的影响力。
(5)系统学和工程学原理：包括系统的结构决定功能原理和系统整体性原理。
4．生态工程的实例(连线)
, )
易错整合，判断正误。
(1)生态工程是无消耗、多效益的工程( × )
(2)设计良性循环的农业生态系统时，应遵循的基本原则是追求经济效益的最大化( × )
(3)某草原牧区，在进行草场建设时，既注重不同牧草种类的搭配种植，又对单位面积内的放牧量做了一定控制，体现了物种多样性原理和协调与平衡原理( √ )
(4)建立生态农业时巧设、增设食物链的目的是使食物链延长，消耗能量环节增多，系统总能量利用率降低( × )
(5)“无废弃物农业”遵循的是物种多样性原理( × )
, )
如图为生态工程的相关原理示意图。请据图思考下列问题：
(1)以上两图所体现的生态工程的原理分别是什么？
(2)以下几种做法分别能体现哪种生态工程原理？
①单一人工林比天然混合林稳定性低，易爆发虫害；
②草原确定合理载畜量，不能过度放牧；引种考虑适应环境；
③林业生态工程建设，既考虑种树又考虑生活问题。
[提示](1)甲图体现的是物质循环再生原理，乙图体现的是整体性原理。
(2)①物种多样性原理；②协调与平衡原理；③整体性原理。
重 难 精 讲
1．生态工程所遵循的基本原理
基本原理
项目 理论基础 意义 实例
物质循环 再生原理 物质循环 可避免环境污染及其对系统稳定和发展的影响 无废弃物农业
物种多样 性原理 生态系统的稳定性 生物多样性程度高，可提高系统的抵抗力稳定性，提高系统的生产力 “三北”防护林建设中的问题，珊瑚礁生态系统的生物多样性问题
协调与平 衡原理 生物与环境的协调与平衡 生物数量不超过环境承载力，可避免系统的失衡和破坏 太湖富营养化问题
整体性 原理 社会、经济、自然复合系统 统一协调各种关系，保障系统的平衡与稳定 林业建设中自然系统与社会、经济系统的关系问题
系统学 和工程 学原理 系统的结构决定功能原理：分布式优于集中式和环式 改善和优化系统的结构以改善功能 桑基鱼塘
系统整体性原理：整体大于部分 保持系统很高的生产力 珊瑚礁藻类和珊瑚虫的关系
2.生态工程的实例和原理
实例 原理 重点注意问题
农村综合发展型生态工程 物质循环再生原理、整体性原理、物种多样性原理 ①核心：沼气工程为中心 ②优点：农、林、牧、副、渔全面发展；开发可更新资源，减少环境污染
小流域综合治理生态工程 整体性原理、协调与平衡原理、因地制宜原理 ①“综合”表现在同时考虑到生态效益和经济效益 ②不同气候带、不同自然条件和不同经济发展水平的地区，生态工程模式应各具特色
大区域生态系统恢复工程 协调与平衡原理、整体性原理 “三北”防护林工程建设中应注意的问题： ①考虑树种生态适应性问题，种植适宜品种 ②考虑树种多样性，保证防护林体系稳定性 ③不同地区应根据当地情况采取不同策略
湿地生态恢复工程 协调与平衡原理、整体性原理 ①湿地被誉为地球的“肾脏” ②退耕还湖，还要解决迁出居民的生活和就业问题
矿区废弃地生态恢复工程 系统学和工程学原理、协调与平衡原理 植被恢复措施是植树种草
城市环境生态工程 协调与平衡原理、整体性原理 ①城市大气污染主要来源是汽车尾气。禁止使用含铅汽油，鼓励使用电力、天然气等无污染能源的新型汽车 ②减少或禁止工厂污水排放 ③节水，使用无磷洗涤剂
精 准 命 题
例4 (2018·山东泰安期中)如图是我国南方开始尝试的农业生态系统的结构模式图，它利用雏鸭旺盛的杂食性，吃掉稻田里的杂草和害虫，用作物养猪、养鸭，用秸秆培育蘑菇、生产沼气，用猪鸭粪、沼渣肥田，生产出无公害的大米与蛋肉类。请据图回答下列问题：
(1)该生态系统建设过程中利用的主要生态工程原理是物质循环再生原理；该生态系统的抵抗力稳定性有了明显提高，这是利用了物种多样性原理。
(2)在实际操作过程中，该地区考虑到了养鸭场和养猪场的规模，这利用了生态工程建设的协调与平衡原理。该地区还应考虑哪些方面的问题生产者的产量；土地对粪肥的承载力；对粪肥的加工和利用情况；外地调运饲料的饲养成本。(答两项即可)
(3)我国人口较多，人均土地、水资源和能源占有量少，所以在进行生态工程时，一定要注重生态效益、社会效益和经济效益的统一。
(4)“生物圈2号”生态工程的实验给你的启示是什么？请用简短的文字进行描述：生物圈仍是人类和其他生物的唯一家园，人类与自然应和谐共处。
〔对应训练〕
5．(2018·广东江门调研测试)阅读有关我国水稻育种的新成果：
材料甲：中国工程院院士、“杂交水稻之父”袁隆平宣布了一项剔除水稻中重金属镉的新成果。该技术通过把水稻亲本中促进吸镉的基因“敲掉”，从而减少水稻种子中的镉含量。此项技术培育的新型水稻将扭转我国部分农作物重金属含量超标的趋势。
材料乙：中科院夏新界培育的巨型稻生长周期与青蛙、泥鳅生长周期同步，可同时管理，节约人力与资金成本，通过采取“巨型稻＋青蛙＋泥鳅＋鱼”的生态种养新模式，实现一亩多收，粮渔共赢。
回答下列问题：
(1)材料甲中采用的技术与传统基因工程有所区别，但是也需要在构建表达载体后采用农杆菌转化法将载体导入水稻愈伤组织，愈伤组织再经再分化过程形成新型水稻植株。经检测，新型水稻的稻米镉含量不但比对照组稻米镉含量低_，而且远低于稻米镉含量的国际和国内安全标准。
(2)材料乙中的青蛙在该生态系统的成分属于消费者。建设该类生态种养新模式的目的是遵循自然界物质循环的规律，发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益和生态效益的同步发展。生态工程的基本原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理，整体性原理、系统学和工程学原理等。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．防止多精入卵的两道屏障是：透明带反应和卵细胞膜反应。
2．胚胎发育过程：受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→组织器官分化→幼体。囊胚开始出现细胞分化，原肠胚出现胚层分化。
3．胚胎移植的基本程序：对供、受体的选择和处理→配种或进行人工授精→对胚胎的收集、检查、培养或保存→胚胎移植→移植后检查。
4．胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良动物的繁殖潜力。
5．胚胎移植过程中两次使用激素，第一次常用孕激素对受、供体进行同期发情处理；第二次用促性腺激素处理供体使其超数排卵。
6．与传统工程相比，生态工程是一类少消耗、多效益、可持续的工程体系。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2017·江苏卷，14)下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述，错误的是( C )
A．精子在获能液中于37℃、5% CO2条件下培养的目的是使精子获能
B．小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射相关激素有促进超数排卵的作用
C．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，因此发育成的个体没有形态学差异
D．注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育
[解析] 精子在获能液中于适宜条件下培养可以使精子获能，A项正确；小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射促性腺激素能促进其超数排卵，B项正确；分割的胚胎细胞虽有相同的遗传物质，但由于生物的性状还受环境等因素的影响，故发育成的个体会存在形态学差异，C项错误；胚胎干细胞可以发育成组织、器官，注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育，D项正确。
2．(2015·重庆卷，8)某课题组为解决本地种奶牛产奶量低的问题，引进了含高产奶基因但对本地适应性差的纯种公牛。
(1)拟进行如下杂交：
♂A(具高产奶基因的纯种)×♀B(具适宜本地生长基因的纯种)→C
选择B作为母本，原因之一是胚胎能在母体内正常生长发育或胚胎发育。若C中的母牛表现为适宜本地生长，但产奶量并未提高，说明高产奶是隐性性状。为获得产奶量高且适宜本地生长的母牛，根据现有类型，最佳杂交组合是♂A×♀C，后代中出现这种母牛的概率是1/8(假设两对基因分别位于不同对常染色体上)。
(2)用以上最佳组合，按以下流程可加速获得优良个体。
精子要具有受精能力，需对其进行获能或增强活力处理；卵子的成熟在过程③中完成。在过程④的培养基中含有葡萄糖，其作用是供能。为筛选出具有优良性状的母牛，过程⑤前应鉴定胚胎的性别、高产奶和适应生长的基因。子代母牛的优良性状与过程②的基因重组有关。
(3)为了提高已有胚胎的利用率，可采用胚胎分割技术。
[解析](1)由于B是具有适宜本地生长基因的纯合子，故选择B作为母本，可使胚胎在母体内正常生长发育。让B与纯合的具有高产奶基因的A杂交得到C，C牛的产奶量并未提高，可推知高产奶是隐性性状，而C为杂合子。因引进的是含高产奶基因的纯种公牛，故可选用♂A×♀C杂交组合，后代中高产奶且适宜本地生长的母牛的概率为1/4×1/2＝1/8。
(2)精子受精前需进行获能处理，卵子的减Ⅱ分裂在受精作用即过程③中才得以完成；体外培养胚胎时，需在培养液中提供葡萄糖等物质以保证充足的能量供应。为筛选出具有优良性状的母牛，过程⑤前应鉴定胚胎的性别，以及是否具有高产奶和适应生长等优良基因，子代母牛的优良性状与过程②的基因重组有关。
(3)利用胚胎分割和胚胎移植技术，可同时获得多个基因型相同的后代，提高了已有胚胎的利用率。
3．(2015·浙江卷自选，18(4))下面是关于植物克隆和生态工程的问题。请回答：
某农业生态工程基地按照生态和经济规律，对种植业和养殖业进行了优化设计。通过套种、间种和轮种等技术的应用，使种植的农作物为该生态系统组成成分中的消费者提供更多的食物。在农业生产中尽量不施用农药，其目的是C。
A．减少水土流失 B．减少土壤肥力
C．减少环境污染 D．减少生物多样性
[解析] 构建农业生态工程基地需遵循生态和经济规律，对种植业和养殖业进行优化设计。如种植业中采用套种、间种和轮种等技术，可使农作物为消费者提供更多的食物。另外，为减少环境污染，农业生态工程要求尽量不施用农药。
考能提升(九) 现代生物科技专题
〔易 错 清 零〕
易错点1 误认为目的基因的插入是“随机”的
点拨：目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去原功能。
易错点2 混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子，不明确标记基因的作用
点拨：启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
(2)终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。
(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)，从而将含目的基因的细胞筛选出来。
易错点3 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”
点拨：(1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。
易错点4 误认为植物组织培养均需“再分化至幼苗”，误认为“人工种子”即平常所说的“种子”
点拨：(1)组织培养的目的不同，培养的阶段不同。如：生产细胞代谢产物，只需培养至愈伤组织时期；生产人工种子，则需要培养至胚状体时期；获得植株就需培养至幼苗时期。
(2)人工
第一讲 基因工程
,考纲要求)1.基因工程的诞生 Ⅰ
2．基因工程的原理及技术(含PCR技术) Ⅰ
3．基因工程的应用 Ⅱ
4．蛋白质工程 Ⅰ
5．实验：DNA的粗提取与鉴定
考点一 基因工程的操作工具
, )
1．基因工程的概念理解
(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内表达。
(7)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
①种类：
常用类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
②作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两段DNA片段。
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒特点
, )
易错整合，判断正误。
(1)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(2)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(3)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × )
(5)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点( √ )
, )
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和Sma Ⅰ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
(2)以上实例说明限制酶有何特性？
[提示](1)EcoR Ⅰ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
(2)说明限制酶具有专一性。
重 难 精 讲
1．基因工程的理论基础
2．基因工程的工具酶
(1)几种酶的比较
比较项目 限制酶 DNA连 接酶 DNA 聚合酶 解旋酶 DNA(水 解)酶
作用底物 DNA分子 DNA分 子片段 脱氧核 苷酸 DNA分子 DNA分子
作用部位 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 碱基对间 的氢键 磷酸二 酯键
作用结果 产生黏性 末端或 平末端 形成重组 DNA分子 形成新的 DNA分子 形成单链 DNA分子 形成游离 的脱氧核 苷酸
(2)限制酶与DNA连接酶的关系
[易错警示]
关于工具酶的五个注意点
(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(2)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(5)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)载体种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(3)作为载体的条件
条件 适应性
稳定存在并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA的鉴定和选择
[易错警示]
(1)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(2)载体上标记基因的标记原理：
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
精 准 命 题
例1 下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( C )
A．Hind Ⅲ B．EcoR Ⅰ
C．EcoB D．Pst Ⅰ
[解析] A处有3处(BamH Ⅰ、EcoB、Cla Ⅰ)限制酶的切点，只有使用EcoB限制酶切割时，才能让目的基因插入到A处且使原有基因失活。
技巧点拨
确定限制酶种类的两种方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
〔对应训练〕
1．(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙，不能表达的原因是甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coli_DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
[解析] (1)由图(a)可知，尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，所以这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端。
考点二 基因工程的操作过程与应用和PCR技术
, )
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。
②获取方法：
a．直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或部分基因文库中获取。
b．人工合成：
ⅰ.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
ⅱ.以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。
③扩增目的基因：利用PCR技术扩增目的基因。
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
a．启动子
ⅰ.位置：位于基因的首端。
ⅱ.作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
b．终止子
ⅰ.位置：位于基因的尾端。
ⅱ.作用：使转录在所需要的地方停止下来。
②构建目的
a．使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；
b．使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)将目的基因导入受体细胞
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②常用方法(连线)
(4)目的基因的检测与鉴定
方法 检测或鉴定目的 水平
DNA分子杂交技术 检测目的基因的有无 分子 水平
分子杂交技术 目的基因是否转录
抗原—抗体杂交技术 目的基因是否翻译
生物性状的表达与否 目的基因是否表达 个体水平
2.基因工程的应用
(1)转基因植物
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
(2)转基因动物
动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。
(3)基因工程药物
①来源：转基因的工程菌。
②成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
③作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
(4)基因治疗
①方法：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。
②效果：治疗遗传病的最有效的手段。
③分类：体内基因治疗和体外基因治疗。
3．蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：满足人类的生产和生活的需求。
(2)操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
, )
易错整合，判断正误。
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( × )
(2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达( √ )
(3)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术( √ )
(4)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达( × )
(5)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( √ )
(6)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
, )
据图分析抗虫棉的培养过程
(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？
(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
[提示](1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。
(2)采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
重 难 精 讲
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①直接分离
②人工化学合成：适用于分子较小的基因。
[易错警示]
细胞内DNA的复制与PCR扩增DNA的比较
比较项目 细胞内复制DNA PCR扩增DNA
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分双链解开 加热至90℃以上时，双链全部解开，不需要解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
特点 边解旋边复制 体外迅速扩增
Taq DNA 聚合酶 不需要(只需DNA聚合酶) 需要
循环次数 受生物体自身控制 30多次
相同点 两者都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲液中进行，都是半保留复制
(2)基因表达载体的构建
①基因表达载体的组成
(3)将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
(5)基因治疗与基因诊断
原理 操作过程 进展
基因 治疗 基因 表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗 临床实验
基因 诊断 碱基互 补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况 临床应用
[易错警示]
关于基因工程的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
(2)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象：第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在分子水平杂交检测。
(3)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器：操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。
(4)DNA复制、PCR技术与基因克隆
DNA复制 PCR技术 基因克隆
场所 细胞核 生物体外 细胞内
酶 解旋酶、 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 限制酶、 DNA连接酶
载体 不需要 不需要 需要
遵循原则 碱基互补配对 碱基互补配对 碱基互补配对
结果 DNA分子 DNA分子片段 DNA分子片段
2.蛋白质工程与基因工程的关系
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
联 系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
[易错警示]
二者都属于分子水平的操作，蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程。
3．基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
构建基 因文库 的过程
文库大小 小 大
基因中 启动子 无 有
基因中 内含子 无 有
基因多少 某种生物的 部分基因 某种生物的 全部基因
物种间的 基因交流 可以 部分基因可以
说明 基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
4.利用PCR技术扩增目的基因
(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。
(3)原理：DNA双链复制。
(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
(5)过程
第一步：加热至90～95℃，DNA解链为单链；
第二步：冷却至55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
精 准 命 题
例2 (2017·全国卷Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
[解析] (1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原——抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
〔对应训练〕
2．(2016·全国卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制(能稳定遗传)、具有标记基因(答出两点即可)，而
作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
[解析] (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件：具有一个或多个限制酶切位点，具有标记基因，能够在宿主细胞中复制表达等。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
3．(2018·湖北八校第一次联考)北极比目鱼中有抗冻基因，下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，请回答：
(1)利用过程①的方法构建的基因文库是部分基因文库(填“基因组文库”或“部分基因文库”)。
(2)过程②中常需要使用限制酶和DNA连接酶，既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是T4DNA连接酶。
(3)为使过程①获取的目的基因在番茄细胞中能够表达，在构建表达载体时，需在目的基因的两端加入启动子、终止子。
(4)将重组质粒导入农杆菌，并通过农杆菌的转化作用，可以将目的基因导入番茄体细胞中染色体的 DNA上，其原理是目的基因随农杆菌中Ti质粒上的T—DNA转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
(5)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中成功表达，应检测转基因番茄植株中该基因的表达产物是否呈阳性。
考点三 DNA的粗提取与鉴定
, )
1．实验原理
2．操作流程
, )
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
(3)操作③中的粘稠物是如何获取的？加入2 mol/LNaCl的目的是什么？
[提示](1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。
(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
重 难 精 讲
1．DNA和蛋白质在不同NaCl溶液中的溶解度比较
2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 溶解规律
DNA 溶解 析出
蛋白质 部分发生 盐析沉淀 溶解 NaCl溶液浓度从 2 mol/L降低过程 中，溶解度逐渐增大
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏 水2次 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破； ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布 过滤4次 ①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl 溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
精 准 命 题
例3 下列关于DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是( A )
选项 试剂 操作 作用
A 柠檬酸 钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固
B 蒸馏水 与鸡血细胞混合 保持细胞形状
C 蒸馏水 加入到溶解有 DNA的NaCl 溶液中 析出蛋白质
D 冷却的 酒精 加入到过滤后含 DNA的NaCl溶液中 产生特定的 颜色反应
[解析] 蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B项错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C项错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D项错误。
〔对应训练〕
4．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管 序号 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？溶液颜色基本不变。
(3)在沸水浴中加热的目的是加快颜色反应速度，同时说明DNA对高温有较强的耐受性。
(4)A试管在实验中的作用是对照。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA(丝状物)的多少有关。
[解析] B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。
3．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵，培育转基因植物时的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
4．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
5．利用基因工程技术产生的目的基因产物均为自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程产生的蛋白质均已被改造，为新蛋白质。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2018·全国卷Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
[解析] (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。
(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
2．(2018·全国卷Ⅱ，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1 GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析] (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1 GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1 GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1 GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
3．(2018·江苏， 32)为生产具有特定性能的α 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α 淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定与引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α 淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。
(5)获得工程菌表达的α 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4 KH2PO4 50 mmol/L Tris HCl 50 mmol/L Gly NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相对 活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
根据上述实验结果，初步判断该α 淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_Tris HCl。
[解析] (1)利用 PCR 技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。
(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。
(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共16种可能性。题干表明控制α 淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13种可能性。
(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris HCl。
4．(2017·全国卷Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
[解析] (1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是相对于老叶而言嫩叶组织细胞更容易被破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需启动子。(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
第二讲 细胞工程
,考纲要求)1.植物组织培养 Ⅱ
2．动物细胞培养与体细胞克隆 Ⅱ
3．细胞融合与单克隆抗体 Ⅱ
考点一 植物细胞工程
, )
1．细胞工程的概念理解
(1)原理和方法
细胞生物学和分子生物学。
(2)操作水平
细胞水平或细胞器水平。
(3)工程目的
按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。
(4)根据操作对象的不同分类
植物细胞工程和动物细胞工程。
2．植物细胞工程
(1)理论基础——细胞的全能性
①概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。
②物质基础：细胞中具有本物种全部遗传信息。
③表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。
(2)植物组织培养技术
①概念理解
a．培养对象：离体的植物器官、组织、细胞。
b．培养条件：无菌、人工配制的培养基、相关激素等人工控制条件。
c．培养结果：产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
②操作流程
外植体愈伤组织根、芽或胚状体―→试管苗
(3)植物体细胞杂交技术
①概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
②操作流程
③流程分析
a．过程a为去除细胞壁获得具有活力的原生质体，用到的酶是纤维素酶和果胶酶。
b．过程b是原生质体的融合，其原理是细胞膜具有一定的流动性。
c．诱导b融合的两种方法
物理法包括离心、振动、电激等；
化学法一般用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。
d．过程c是原生质体融合后再生出细胞壁。
e．过程d是植物组织培养技术，其原理是细胞的全能性。
④意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
3．植物细胞工程的实际应用
(1)微型繁殖：优点是能够保持亲本的优良性状。
(2)作物脱毒：利用茎尖、根尖等无毒组织进行微型繁殖。
(3)培育人工种子：可以解决某些植物结实率低、繁殖困难的问题。
(4)作物新品种的培育
(5)细胞产物的工厂化生产：即利用植物组织培养技术生产蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料和生物碱等。
, )
易错整合，判断正误。
(1)愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的( × )
(2)经植物组织培养得到的胚状体用人工薄膜包装后可得到人工种子( √ )
(3)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合( × )
(4)用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性( × )
(5)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志( √ )
, )
据图分析植物体的细胞杂交过程
(1)植物体细胞杂交依据的生物学原理是什么？
(2)如何根据细胞膜表面荧光判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的？
(3)若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞内有n条染色体，则“番茄——马铃薯”细胞在有丝分裂后期含有多少条染色体？
(4)若杂种细胞培育成的“番茄——马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于几倍体植株？
[提示](1)细胞膜的流动性、植物细胞的全能性。
(2)融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光。
(3)2(m＋n)条。
(4)单倍体植株。
重 难 精 讲
1．植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
名称 植物组织培养 植物体细胞杂交
原理 细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性
过程
选材 选取根尖、茎尖、形成层部位最容易诱导脱分化 不同的植物细胞
技术 操作 脱分化、再分化等 除脱分化、再分化外，还要用酶解法去除细胞壁，用一定的方法诱导细胞融合
关系 植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂
2.脱分化和再分化的比较
内容 脱分化 再分化
过程 外植体→愈伤组织 愈伤组织→胚状体
形成体特点 排列疏松、无规则、高度液泡化的薄壁细胞 有根、芽
条件 a.离体 b．适宜的营养 c．生长素/细胞分裂素的比例适中 d．不需要光照 a.离体 b．适宜的营养 c．生长素和细胞分裂素 d．光照
3.激素比例与分化的关系
适当提高生长素与细胞分裂素的比例容易生根，适当提高细胞分裂素与生长素的比例容易生芽，比例适中诱导产生愈伤组织。(如图所示)：
4．植物体细胞杂交过程中杂种细胞类型及检测方法
(1)诱导产物(假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B)：
①未融合的细胞：A和B。
②两两融合的细胞：AA、BB和AB。
③多细胞融合体。
(2)检测方法：对诱导产物中的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判断。
①若只表现出一种植物的性状，说明是未融合细胞。
②若得到的是具有两种亲本性状的植物，说明是杂种植株。
③若得到的是具有两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强，则是多细胞融合体。
④若只表现出一种植物的性状且效果得到加强，则是同种细胞融合的结果。
5．单倍体育种和突变体的利用的不同点
项目 原理 优点 成果
单倍体 育种 染色体 变异 明显缩短 育种年限 单育1号烟草品种，中花8号、11号水稻和京花1号小麦品种等
突变体 的利用 基因突变 产生新基因，大幅度改良某些性状 抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的野生烟草等
[易错警示]
有关细胞全能性及细胞培养的四个注意点
(1)具有全能性≠体现(实现)全能性
①具有全能性：理论上，活细胞都具有全能性。
②体现全能性：只有发育成完整个体，才能说明实现了细胞的全能性。
(2)细胞全能性的大小比较
①植物细胞>动物细胞。
②受精卵>生殖细胞>体细胞。
③分化程度低的细胞>分化程度高的细胞；幼嫩细胞>衰老细胞；分裂能力强的细胞>分裂能力低的细胞。
精 准 命 题
例1 (2018·甘肃重点中学协作体第一次联考)选取A、B植株的细胞进行如图所示操作，请回答问题：
(1)实现图中的①过程最常用的方法是酶解法。
(2)②过程的发生，必须进行诱导融合，其方法有物理法和化学法。
(3)若细胞A内含a条染色体，细胞B内含b条染色体，则“杂种细胞”内含a＋b条染色体；若A、B植株采用常规杂交育种方法培育成功的话，得到的后代含(a＋b)/2条染色体，必须用秋水仙素来处理幼苗，才能得到可育的杂种植株，其中含有a＋b条染色体。这两种方法相比，体细胞杂交方法的优点是克服远缘杂交不亲和的障碍。
(4)如果原生质体A为小鼠的浆细胞，原生质体B为小鼠的骨髓瘤细胞，诱导二者融合时，独特的方法是用灭活的病毒处理。
〔对应训练〕
1．(2017·广东广州二模，38)研究人员利用植物组织培养技术，通过图一所示的流程进行育种实验，培育出具有耐盐性的植株。
回答下列问题：
(1)图一所示的实验流程中，再分化发生在④(填“①”“②”“③”或“④”)过程；用γ射线照射愈伤组织的目的是诱发其基因突变(提高突变率)。实验过程应注意无菌操作，对所用的培养基要进行灭菌处理，对外植体进行消毒处理。
(2)将经γ射线照射和不经照射处理的愈伤组织，分别转移到含不同浓度NaCl的分化培养基中培养，愈伤组织再分化出幼苗的比例如图二所示，据图分析：
①本实验的两个自变量分别是NaCl浓度、是否照射γ射线。用剂量为10Gy的γ射线照射愈伤组织后，获得耐盐性幼苗的比例升高(填“升高”“不变”或“降低”)。
②通过本实验不能(填“能”或“不能”)确定在分化培养基中NaCl浓度大于1.0%时，不经γ射线照射愈伤组织不能分化出幼苗。判断的理由是未获取NaCl浓度为1.0%～1.5%的实验数据，因此不能确定。
考点二 动物细胞培养与体细胞克隆
, )
1．动物细胞培养——动物细胞工程技术的基础
(1)原理：细胞增殖。
(2)培养条件
①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，添加抗生素，定期更换培养液以清除代谢产物。
②营养：除正常的有机和无机营养外，加入血清、血浆等一些天然成分。
③适宜的温度和pH：温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)，pH为7.2～7.4。
④气体环境：含95%空气加5%CO2的混合气体，其中后者的作用是维持培养液的pH。
(3)动物细胞的培养过程
(4)应用
生物制品的生产、检测有毒物质、医学研究。
2．动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)原理：动物体细胞核具有全能性。
(2)动物体细胞核移植技术的过程
代孕母体―→出生与供体遗传物质基本相同的个体
(3)结果：产生新个体。
(4)应用
①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。
②保护濒危物种。
③生产医用蛋白。
④作为异种移植的供体。
⑤用于组织器官的移植。
, )
易错整合，判断正误。
(1)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞( × )
(2)克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变( × )
(3)二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的( × )
(4)动物细胞核移植的受体细胞必须是卵细胞( × )
(5)克隆动物的性状与供体动物完全相同( × )
, )
如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线，图中B、E两点表示经筛选、分装后继续培养。据图分析：
(1)原代培养和传代培养的分界点是哪个？
(2)AB和DE段繁殖速度缓慢的原因是什么？
(3)E点后的细胞大多数具有异倍体核型，这样的细胞有什么特点？
[提示](1)B点之前的培养称为原代培养，之后的培养称为传代培养。
(2)发生了接触抑制。
(3)E点后的细胞属于细胞系，能无限增殖。
重 难 精 讲
1．植物组织培养与动物细胞培养的比较
技术 内 项目 容 植物组织培养 动物细胞培养
原理 细胞的全能性 细胞的增殖
培养基 成分 矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加剂(如甘氨酸、琼脂等)，属于固体培养基 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等，属于液体培养基
取材 较幼嫩的细胞、组织、器官 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
培养过程
培养结果 可以获得植株，也可以获得大量细胞 只能获得大量细胞，不能得到生物个体
应用 ①植物快速繁殖与脱毒植物培养 ②生产细胞产品 ③制造人工种子 ④用于转基因植物的培育 ①生产蛋白质生物制品 ②培养皮肤移植的材料 ③检测有毒物质 ④用于生理、病理、药理等的研究
相同点 ①都需人工条件的无菌操作 ②都是合成培养基 ③都需适宜的温度、pH等条件
2.动物细胞培养与动物体细胞核移植的比较
项目 动物细胞培养 动物体细胞核移植
原理 细胞增殖 动物细胞核的全能性
过程
结果 获得细胞群 获得与供体遗传物质基本相同的个体
3.核移植时应注意的几个问题
(1)核移植时应选MⅡ中期卵母细胞的原因
①此类细胞体积大，易于操作；②卵黄多，营养物质丰富，可为发育提供充足的营养；③卵母细胞的细胞质中存在激发细胞核全能性表达的物质。
(2)克隆动物是由重组的细胞经培养而来的，该重组细胞的细胞质基因来源于受体细胞，细胞核基因来源于提供细胞核的亲本，其遗传物质来自2个亲本。
(3)核移植中供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
(4)动物体细胞核移植技术(克隆)从生殖方式的角度看属无性生殖，重组细胞相当于受精卵，需要动物细胞培养和胚胎工程技术的支持。
[易错警示]
(1)原代培养和传代培养
①原代培养：可有两种表述：a.细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。两种表述没有本质区别。
②传代培养：同样有两种表述：a.细胞悬液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养，统称为传代培养。
(2)细胞株和细胞系
①细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右会出现生长停滞，衰老死亡，少数度过“危机”的细胞能传50代左右，形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发生改变。
②细胞系：细胞株传至50代以后，会出现第二次危机，少数度过第二次危机的细胞能够无限传代下去，形成细胞系。 细胞系的遗传物质发生了改变，带有癌变细胞的特点。
精 准 命 题
例2 (2018·内蒙古包头九中期中)转基因猪在异种器官移植、生物反应器和疾病模型等方面有广泛应用。下图为转基因猪的培育过程，请分析回答：
(1)体外培养猪胎儿成纤维细胞，需定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害。当细胞贴满瓶壁时，可分瓶进行传代培养，让其继续增殖，通常选用10代以内的细胞进行核移植，目的是保持细胞正常的二倍体核型。
(2)为便于检测与筛选，用红色荧光蛋白基因作为标记基因参与构建基因表达载体，将其导入猪胎儿成纤维细胞中，筛选发红色荧光的细胞与MⅡ(或减Ⅱ)中期的去核卵母细胞融合，使供体核进入受体卵母细胞，利用物理或化学的方法激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育进程形成重组胚胎。采用机械方法进行胚胎分割使代孕猪产下同卵双胎或多胎。
(3)与成年动物细胞相比，用胚胎细胞克隆动物的成功率较高，原因是胚胎细胞的分化程度低于成年动物的体细胞，恢复其全能性相对容易。
〔对应训练〕
2．(2018·辽宁辽南协作体二模，40)美国威斯康星州的一个奶牛场有一头奶牛，年产奶量达30.8 t，我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。某人用该高产奶牛的耳朵细胞，采用核移植技术获得高产奶牛(如下图)。回答下列问题：
(1)动物细胞培养的原理是细胞增殖，在此过程中为了防止培养液被污染，还需在培养液中添加一定量的抗生素，此外还应定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(2)用于核移植的供体细胞，一般都选用10代以内的细胞，原因是10代以内的细胞一般能保证正常的二倍体核型。传至50代以后，少数细胞会克服细胞自然寿命的极限，获得不死性，与正常细胞相比，其遗传物质已发生突变。
考点三 动物细胞融合与单克隆抗体的制备
, )
1．动物细胞融合
(1)原理：细胞膜的流动性。
(2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
(3)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．单克隆抗体
(1)制备过程
(2)优点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
(3)用途：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物。
, )
易错整合，判断正误。
(1)植物原生质体融合与动物细胞融合原理是相同的( √ )
(2)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体( × )
(3)小鼠骨髓瘤细胞的染色体数为40，B淋巴细胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分子数为86( × )
(4)杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得能产生单克隆抗体的胚胎( × )
(5)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经细胞融合后有三种细胞类型(若仅考虑两两融合的情况)( √ )
, )
如图为制备单克隆抗体和多克隆抗体的示意图。请据图思考：
(1)单克隆抗体相比多克隆抗体，其优点有哪些？
(2)图中第一次筛选和第二次筛选的目的有何不同？
(3)注射抗原的目的是什么？
(4)杂交瘤细胞有什么特点？
[提示](1)单克隆抗体的优点是：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
(2)第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生所需单克隆抗体的杂交瘤细胞。
(3)刺激机体发生免疫反应，从而产生浆细胞。
(4)既能无限增殖，又能产生所需抗体。
重 难 精 讲
1．植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合(单克隆抗体制备)
理论基础(原理) 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性、细胞增殖
融合前处理 酶解法(纤维素酶、果胶酶)去除细胞壁 注射特定抗原使正常小鼠产生免疫反应
促融方法 ①物理法：离心、振动、电刺激等； ②化学法：聚乙二醇(PEG) ①物化法：与植物细胞融合相同； ②生物法：灭活的病毒
过程 第一步 原生质体的 制备(酶解法) 正常小鼠 免疫处理
第二步 原生质体融 合(物化法) 动物细胞融合
第三步 杂种细胞的 筛选与培养 杂交瘤细胞的 筛选与培养
第四步 杂种植株 诱导与鉴定 单克隆抗体的提纯
图 解
2.单克隆抗体制备过程的几个问题分析
(1)对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以，与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。
(2)在单克隆抗体制备过程中，一般认为有两次筛选过程，第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基)，第二次是进一步筛选出能产生人们所需抗体的杂交瘤细胞。
(3)杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，从而可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，而大量生产单克隆抗体。
精 准 命 题
例3 (2018· 湖北四校联考)动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。
回答下列问题：
(1)动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入血清(或血浆)等天然成分。细胞培养所需气体主要有O2和CO2，CO2的主要作用是维持培养液的pH。细胞体外培养的适宜温度一般与动物的体温相近。
(2)动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制，此时，瓶壁上形成的细胞层数是单层。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用胰蛋白酶进行处理。
(3)诱导动物细胞融合常用的化学试剂是聚乙二醇(PEG)。单克隆抗体最主要的优点是特异性强、灵敏度高，并可大量制备。
〔对应训练〕
3．(2017·云南昆明二模)艾滋病病毒(HIV)外壳的包膜上有多种蛋白质，其中包膜糖蛋白(env)基因编码的gp160蛋白，可进一步加工成gp120蛋白，gp120蛋白具有较强的抗原性。制备抗HIV gp120的单克隆抗体，为艾滋病的治疗带来希望。请回答下列问题：
(1)若利用动物细胞工程制备抗HIV gp120的单克隆抗体。涉及的技术手段主要有动物细胞培养技术、动物细胞融合技术。
(2)细胞融合常用的生物诱导剂是灭活的病毒。融合后需要用特定的选择性培养基筛选，只有融合的杂种细胞才能生长，这种细胞的特点是既能大量繁殖，又能产生抗HIV_gp120抗体。
(3)科研人员设想用基因工程制备能表达抗HIVgp120抗体的重组细胞，获得目的基因可利用PCR技术扩增，需要在反应体系中添加的有机物有引物和模板DNA、Taq酶和4种脱氧核苷酸。利用显微注射法将目的基因导入骨髓瘤细胞。基因工程的核心是基因表达载体的构建。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整个体的潜能，即细胞的全能性。
2．植物体细胞杂交需要用酶解法制备原生质体，所用的酶包括纤维素酶和果胶酶。
3．动物细胞工程常用技术手段包括动物细胞培养，动物细胞核移植，动物细胞融合等，其中动物细胞培养技术为其他各技术的基础。
4．动物细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个去核卵母细胞中，构建重组细胞并使后者发育为新个体。
5．单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高、并可大量制备等优点。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2018·全国卷Ⅲ，38)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目不变(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度小于(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目相同(填“相同”或“不同”)，性染色体组合不同(填“相同”或“不同”)。
[解析] (1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。重组细胞形成的早期胚胎可移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞的染色体数目与提供细胞核的个体的体细胞相同。
(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。
(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。
2．(2017·全国卷Ⅲ，38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)先要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为模板，加入了dNTP作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是进行细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是维持培养液的pH。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少C(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
[解析] (1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、dNTP作为原料。(3)T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中有、而丙种蛋白中没有的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
第三讲 胚胎工程与生物技术的安全性和伦理
问题及生态工程
,考纲要求)1.动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础 Ⅰ
2．胚胎干细胞的移植 Ⅰ
3．胚胎工程的应用 Ⅱ
4．转基因生物的安全性 Ⅰ
5．生物武器对人类的威胁 Ⅰ
6．生物技术中的伦理问题 Ⅰ
7．简述生态工程的原理 Ⅱ
8．生态工程的实例 Ⅰ
考点一 体内受精和早期胚胎发育
, )
1．胚胎工程的概念
(1)操作对象：动物的早期胚胎或配子。
(2)技术：体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。
2．精子和卵子的发生
(1)精子的发生
①场所：睾丸的曲细精管。
②时间：初情期→生殖机能衰退。
③过程
(2)卵子的发生
①场所：卵巢。
②时间：胎儿期和初情期后。
3．受精
(1)场所：输卵管。
(2)过程：
①准备阶段
②受精阶段
4．早期胚胎发育
, )
易错整合，判断正误。
(1)成熟的精子并不具有受精能力，必须获能后才具备受精能力( √ )
(2)卵子受精的标志是在卵细胞和透明带的间隙出现两个极体( √ )
(3)透明带反应和卵细胞膜反应是防止多精入卵的两道屏障( √ )
(4)卵裂球细胞的体积随分裂次数增加而不断增大( × )
(5)卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加( × )
, )
如图表示哺乳动物发育过程的几个阶段，请据图分析：
(1)A、B、C的名称分别是什么？
(2)图中的4和7两个空腔是同一个结构吗？
(3)细胞分化开始出现于哪个时期？1部分的细胞将来形成什么结构？
(4)早期胚胎的发育过程中，卵裂时细胞的体积和所有的细胞体积之和有何变化？
[提示](1)桑椹胚、囊胚、原肠胚。
(2)不是，分别是囊胚腔和原肠腔。
(3)细胞分化开始出现于B(囊胚)时期，l部分的细胞将来形成胎膜和胎盘。
(4)卵裂过程中，细胞只分裂而不生长，所以每个细胞的体积越来越小，总的体积基本不变。
重 难 精 讲
1．精子和卵子的发生
项目 精子的发生 卵子的发生
不同点 场所 睾丸的曲细精管 卵巢(减数第一次分裂)、输卵管(减数第二次分裂)
时间 初情期到生殖机能衰退 ①卵泡的形成和在卵巢内的储备：出生前(即胎儿时期) ②排卵：初情期
过程
特点 ①减数第一次分裂和减数第二次分裂连续 ②需要变形 ①减数第一次分裂和减数第二次分裂不连续 ②不需要变形
相同点 ①原始生殖细胞的增殖为有丝分裂 ②生殖细胞的成熟为减数分裂；成熟过程均经一次复制和两次分裂，子细胞中染色体数目减半
2.受精
第一步：精子穿越放射冠和透明带。顶体反应使顶体内的酶释放出来并溶解放射冠内的卵丘细胞之间的物质；透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障。
第二步：精子进入卵细胞膜。卵细胞膜反应是防止多精入卵受精的第二道屏障。
第三步：原核形成。雄原核和雌原核形成。
第四步：配子结合。雌、雄原核融合形成合子(受精卵)。
3．胚胎发育
[易错警示]
关于体内受精的五点提醒
(1)精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量。
(2)排卵是指卵子从卵泡中排出，而不是卵泡从卵巢中排出。
(3)防止多精入卵的机制包括：第一道屏障：透明带反应；第二道屏障：卵细胞膜反应。
(4)受精标志和受精完成的标志
受精的标志是在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体；而受精过程完成的标志是雌、雄原核的融合。
(5)卵裂期细胞体积、数量及胚胎总体积的变化
细胞体积缩小，细胞数量增加，胚胎总体积不变或略有缩小。
精 准 命 题
例1 关于体内受精的顺序，正确的是( D )
①第一次卵裂开始 ②释放第二极体 ③顶体反应 ④穿越透明带 ⑤雌、雄原核的形成 ⑥核膜消失
A．①②③④⑤⑥ B．③②④⑤⑥①
C．④⑤②①③⑥ D．③④②⑤⑥①
[解析] 受精过程包括精、卵相遇，发生顶体反应，精子穿越放射冠；精子接触透明带；精子穿越透明带，接触卵细胞膜；精子头膨胀，同时卵子完成减数第二次分裂，释放第二极体；雌、雄原核形成，核膜消失，两个原核融合；第一次卵裂即将开始。
〔对应训练〕
1．如图表示哺乳动物发育过程的几个阶段，请据图回答问题：
(1)写出各个阶段的名称：
A：桑椹胚，B：囊胚，C：原肠胚。
(2)写出图中各标号的名称：
[2]内细胞团，[4]囊胚腔，[5]外胚层，[7]原肠腔，[8]内胚层。
(3)A时期的细胞具有发育上的全能性，B时期开始出现细胞分化，C时期开始出现胚层分化。
(4)[2]将来发育成胎儿的各种组织。
(5)动物胚胎是由合子经有丝分裂形成的，合子只由一个精子和卵子结合，防止多精入卵受精的两道屏障分别是透明带反应、卵细胞膜反应。
[解析] (1)图中A是桑椹胚，B是囊胚，C是原肠胚。(2)图B中[1]是滋养层，[2]是内细胞团，[3]是透明带，[4]是囊胚腔；图C中[5]是外胚层，[6]是滋养层，[7]是原肠腔，[8]是内胚层。(3)桑椹胚细胞具有全能性；囊胚开始出现细胞分化，已分化为滋养层细胞和内细胞团；原肠胚已有胚层分化，分化为外胚层、内胚层，在内、外胚层之间将形成中胚层。(4)内细胞团将发育为胎儿的各种组织，滋养层将发育为胎儿的胎膜和胎盘。(5)受精时的透明带反应和卵细胞膜反应是防止多精入卵的两道屏障。
考点二 体外受精和胚胎工程的应用
, )
1.体外受精
(1)卵母细胞的采集和培养
(2)精子的采集和获能
(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵子在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精作用。
2．胚胎的早期培养
(1)目的：检查受精状况和受精卵的发育能力。
(2)培养液成分巧记
(3)胚胎处理：受体移植或冷冻保存。
3．胚胎工程的应用及前景
(1)胚胎移植
①概念剖析
A．供体：能提供早期胚胎的雌性动物。
B．受体：同种的、生理状态相同的其他雌性动物。
②基本程序
③意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。
④生理学基础
A．移入：排卵后，供、受体生殖器官的生理变化是相同的。
B．收集：早期胚胎处于游离状态。
C．存活：受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。
D．遗传性：供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性不受任何影响。
(2)胚胎分割
①概念
A．方法：机械方法；
B．分割份数：将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等；
C．目的：获得同卵双胎或多胎。
②特点：动物无性繁殖或克隆的方法之一。
③材料：发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。
④要求：将内细胞团均等分割。
(3)胚胎干细胞(ES或EK细胞)
①来源：早期胚胎或原始性腺。
②特点
, )
易错整合，判断正误。
(1)利用胚胎分割技术可以获得两个基因型完全相同的胚胎( √ )
(2)胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割( × )
(3)在对囊胚进行分割时，要将滋养层细胞均等分割( × )
(4)胚胎干细胞在体外培养条件下具有增殖而不发生分化的特点( √ )
(5)胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点( × )
, )
请仔细分析下图，并回答：
(1)试管婴儿与设计试管婴儿培育程序分别包含上面的哪些序号？
(2)试管婴儿与设计试管婴儿在技术环节上的主要差异是什么？
(3)在胚胎移植时下列①～④中哪一项没有必要进行？
①对供体动物和受体动物进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应。
②用激素对供体动物做超数排卵处理。
③对供体、受体动物进行选择，并用激素进行同期发情处理。
④冲卵后，对胚胎进行质量检查。
[提示](1)、(2)图示过程中①②③是试管婴儿的培育过程，①②④⑤是设计试管婴儿培育的过程。后者比前者多了胚胎移植前的“遗传学诊断”。
(3)①胚胎移植时，经同期发情处理后，受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，故①不必进行。
重 难 精 讲
1．胚胎分割
2．胚胎干细胞
[易错警示] (1)滋养层≠饲养层
①滋养层：囊胚时期沿透明带内壁扩展和排列的、个体较小的细胞，滋养层最终发育成胎膜和胎盘。
②饲养层：饲养层细胞一般为输卵管上皮细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。
(2)不同动物胚胎移植的时间不同
①牛、羊要培养到桑椹胚或囊胚阶段。
②小鼠、家兔在桑椹胚前。
③几乎所有动物都不能到原肠胚阶段移植，因为此时分化程度高，移植成功率很低。
3．试管动物与克隆动物的比较
比较项目 试管动物 克隆动物
技术基础 体外受精、胚胎移植 核移植技术、细胞培 养、胚胎(分割)移植
实例 试管牛 多利羊
过程
生殖方式 有性生殖 无性无殖
遗传物质 遗传物质来自两个个体 遗传物质大部分来自供核生物体
意义 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期 加速家畜遗传改良进程、挽救濒危物种等
精 准 命 题
例2 (2016·江苏卷，11)印度沙漠猫是一种珍稀猫科动物，通过胚胎工程技术，可以让家猫代孕而繁育，主要步骤如图所示。下列相关叙述正确的是( B )
A．步骤甲、乙分别是指精子获能、胚胎分割
B．诱导超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞
C．受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于营养液
D．步骤甲使用的培养液和早期胚胎培养液成分基本相同
[解析] 图中步骤甲是指体外受精，步骤乙是指胚胎移植，A项错误；诱导超数排卵所注射的激素是促性腺激素，促性腺激素只能作用于性腺，B项正确；受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于受精卵中的细胞质，C项错误；体外受精可以在获能溶液或专用的受精溶液中进行，与早期胚胎培养液成分并非基本相同，D项错误。
技巧点拨
早期胚胎培养液与动物细胞培养液成分的比较
项目 早期胚胎培养液 动物细胞培养液
盐类 无机盐、有机盐 无机盐、微量元素
营养物质 氨基酸、核苷酸 糖、氨基酸
调节物质 维生素、激素 促生长因子
特有成分 血清 血清、血浆
〔对应训练〕
2．(2015·安徽卷)科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ医用蛋白，其技术路线如图。
(1)由过程①获得的A为含目的基因的表达载体_。
(2)在核移植之前，必须先去掉受体卵母细胞的核，目的是保证核遗传物质来自含目的基因的成纤维细胞。受体应选用MⅡ中期卵母细胞。
(3)进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。
(4)采用胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆，理论上可获得无限个转基因绵羊，这是因为整合有目的基因的成纤维细胞可进行传代培养。
[解析] (1)目的基因导入受体细胞前，需通过过程①形成含目的基因的表达载体。(2)核移植前，去掉卵母细胞核的目的是使核移植动物的核遗传物质全部来自含目的基因的成纤维细胞。受体应选用减数第二次分裂中期的卵母细胞。(3)胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。(4)整合有目的基因的成纤维细胞可以进行传代培养，所以理论上可获得无限个转基因绵羊。
3．(2018·四川巴蜀中学适应性月考)曾经分布于肯尼亚等东、中非地区的北部白犀牛数量已仅存五头，世界上最后一只幸存的雄性北部白犀牛“苏丹”已经被切除犀角由4名全副武装的警察24小时守护起来。雌性北部白犀牛每3年生产一次，每胎仅产1仔。为使这一种群数量恢复，可采用现代生物工程技术提高北部白犀牛的生育效率。请回答：
(1)首先对供体雌白犀牛和受体雌兽进行选择，并用激素进行同期发情处理。用促性腺激素处理供体雌白犀牛，然后从输卵管中冲取卵子。
(2)体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养。
(3)为取得同卵双胎或多胎，可以在胚胎发育的桑椹胚或囊胚期用机械方法将胚胎分割。具体操作时，用分割针将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明带中。
考点三 生物技术的安全性和伦理问题
, )
1．转基因生物的安全性
(1)
(2)
(3)理性看待生物技术
①正视转基因技术可能带来的安全性问题，要趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大限度保证转基因技术和产品的安全性。
2．关注生物技术的伦理问题
反对 支持
克隆人 伦理 方面 违反了人类的伦理道德观念，中国禁止生殖性克隆 中国不反对治疗性克隆
克隆人 技术 方面 技术不成熟，流产率高、畸形率高、出生后死亡率高 可通过胚胎分级、基因诊断、染色体检查等方法解决技术问题
设计试 管婴儿 胚胎也是生命，杀死胚胎无异于“谋杀” 提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤
基因 检测 技术 方面 很难用在具体医疗中 有一些遗传性疾病可以通过基因检测后在早期采取预防措施
道德 方面 可能引起基因歧视 通过正确的科学知识传播、伦理道德教育和立法，解决基因歧视现象
3.禁止生物武器
(1)生物武器的种类(连线)
种类 实例
①致病菌、病毒 a．重组流感病毒、新型鼠痘病毒
②生化毒剂 b．鼠疫菌、炭疽杆菌
③基因重组的致病菌 c．肉毒杆菌毒素
①—b__②—c__③—a
(2)我国政府观点
在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
重 难 精 讲
1．试管婴儿与克隆人的比较
一般过程 实质 说明
试管婴儿 体外受精、体外一定程度的胚胎发育、胚胎移植到子宫内继续发育 有性生殖 与人类正常生殖情况相比，主要是改变了受精和初期发育的场所
克隆人 将体细胞的核物质移到去核的卵细胞中，将重组胚胎移植到子宫内，逐渐发育为新个体 体细胞繁殖，属于无 性生殖 克隆过程证明了动物细胞核的全能性
2.治疗性克隆与生殖性克隆的比较
类型 项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 从胚胎中取出干细胞用于医学研究和治疗 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞水平 个体水平
联系 都属无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同
3.设计试管婴儿技术与试管婴儿技术的比较
设计试管婴儿 试管婴儿
技术 手段 多了胚胎移植前进行遗传学诊断这一环节 不需进行遗传学诊断
实践 应用 用于白血病、贫血病等疾病的治疗 解决不孕不育
二者都是体外受精、体外早期胚胎发育，再进行胚胎移植，从生殖方式上都为有性生殖
[易错警示]
(1)设计试管婴儿和基因检测在应用方面并非完全不同，两者都可用于避免遗传病患儿的出生，从而降低人类遗传病发病率。
(2)试管婴儿和克隆人的形成过程并不相同：前者进行减数分裂和受精作用，而后者只进行有丝分裂。
精 准 命 题
例3 (2018·山西太原重点中学检测)下列关于生物技术安全性和伦理问题的叙述，错误的是( C )
A．可设计试管婴儿，但单纯选择胎儿性别是违法的
B．克隆人会冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念
C．如果转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
D．利用试管婴儿提供骨髓造血干细胞救治病人是合乎道德规范的
[解析] 可设计试管婴儿，但单纯选择胎儿性别是违法的，A正确；克隆人可冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念，B正确；转基因植物的抗除草剂基因来源于自然界，但可能通过花粉传播而进入杂草中，存在安全性问题，C错误；利用试管婴儿提供骨髓造血干细胞救治病人是合乎道德规范的，D正确。
〔对应训练〕
4．(2018·河南部分示范高中模拟)现代生物技术在造福人类的同时，也可能引起一系列的安全和伦理问题，下列说法错误的是( D )
A．对于转基因生物，公众在食物安全、生物安全和环境安全方面产生了争论
B．生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等
C．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
D．我国对于“克隆人”这一技术总体来说是禁止生殖性克隆和治疗性克隆
[解析] 对于转基因生物，公众在食物安全、生物安全和环境安全方面产生了争论，A正确；生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等，B正确；我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度，C正确；我国对于“克隆人”这一技术总体来说是禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆，D错误。
考点四 生态工程的基本原理和实例
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1．建设目的
遵循自然界物质循环的规律，充分发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益和生态效益的同步发展。
2．特点
少消耗、多效益、可持续的工程体系。
3．基本原理
(1)物质循环再生原理：物质在生态系统中循环往复、分层分级利用。
(2)物种多样性原理：物种繁多而复杂的生态系统具有较高的抵抗力稳定性。
(3)协调与平衡原理：处理好生物与环境的协调与平衡，需要考虑环境承载力。
(4)整体性原理：进行生态工程建设时，不但要考虑自然生态系统的规律，还要考虑到经济和社会等系统的影响力。
(5)系统学和工程学原理：包括系统的结构决定功能原理和系统整体性原理。
4．生态工程的实例(连线)
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易错整合，判断正误。
(1)生态工程是无消耗、多效益的工程( × )
(2)设计良性循环的农业生态系统时，应遵循的基本原则是追求经济效益的最大化( × )
(3)某草原牧区，在进行草场建设时，既注重不同牧草种类的搭配种植，又对单位面积内的放牧量做了一定控制，体现了物种多样性原理和协调与平衡原理( √ )
(4)建立生态农业时巧设、增设食物链的目的是使食物链延长，消耗能量环节增多，系统总能量利用率降低( × )
(5)“无废弃物农业”遵循的是物种多样性原理( × )
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如图为生态工程的相关原理示意图。请据图思考下列问题：
(1)以上两图所体现的生态工程的原理分别是什么？
(2)以下几种做法分别能体现哪种生态工程原理？
①单一人工林比天然混合林稳定性低，易爆发虫害；
②草原确定合理载畜量，不能过度放牧；引种考虑适应环境；
③林业生态工程建设，既考虑种树又考虑生活问题。
[提示](1)甲图体现的是物质循环再生原理，乙图体现的是整体性原理。
(2)①物种多样性原理；②协调与平衡原理；③整体性原理。
重 难 精 讲
1．生态工程所遵循的基本原理
基本原理
项目 理论基础 意义 实例
物质循环 再生原理 物质循环 可避免环境污染及其对系统稳定和发展的影响 无废弃物农业
物种多样 性原理 生态系统的稳定性 生物多样性程度高，可提高系统的抵抗力稳定性，提高系统的生产力 “三北”防护林建设中的问题，珊瑚礁生态系统的生物多样性问题
协调与平 衡原理 生物与环境的协调与平衡 生物数量不超过环境承载力，可避免系统的失衡和破坏 太湖富营养化问题
整体性 原理 社会、经济、自然复合系统 统一协调各种关系，保障系统的平衡与稳定 林业建设中自然系统与社会、经济系统的关系问题
系统学 和工程 学原理 系统的结构决定功能原理：分布式优于集中式和环式 改善和优化系统的结构以改善功能 桑基鱼塘
系统整体性原理：整体大于部分 保持系统很高的生产力 珊瑚礁藻类和珊瑚虫的关系
2.生态工程的实例和原理
实例 原理 重点注意问题
农村综合发展型生态工程 物质循环再生原理、整体性原理、物种多样性原理 ①核心：沼气工程为中心 ②优点：农、林、牧、副、渔全面发展；开发可更新资源，减少环境污染
小流域综合治理生态工程 整体性原理、协调与平衡原理、因地制宜原理 ①“综合”表现在同时考虑到生态效益和经济效益 ②不同气候带、不同自然条件和不同经济发展水平的地区，生态工程模式应各具特色
大区域生态系统恢复工程 协调与平衡原理、整体性原理 “三北”防护林工程建设中应注意的问题： ①考虑树种生态适应性问题，种植适宜品种 ②考虑树种多样性，保证防护林体系稳定性 ③不同地区应根据当地情况采取不同策略
湿地生态恢复工程 协调与平衡原理、整体性原理 ①湿地被誉为地球的“肾脏” ②退耕还湖，还要解决迁出居民的生活和就业问题
矿区废弃地生态恢复工程 系统学和工程学原理、协调与平衡原理 植被恢复措施是植树种草
城市环境生态工程 协调与平衡原理、整体性原理 ①城市大气污染主要来源是汽车尾气。禁止使用含铅汽油，鼓励使用电力、天然气等无污染能源的新型汽车 ②减少或禁止工厂污水排放 ③节水，使用无磷洗涤剂
精 准 命 题
例4 (2018·山东泰安期中)如图是我国南方开始尝试的农业生态系统的结构模式图，它利用雏鸭旺盛的杂食性，吃掉稻田里的杂草和害虫，用作物养猪、养鸭，用秸秆培育蘑菇、生产沼气，用猪鸭粪、沼渣肥田，生产出无公害的大米与蛋肉类。请据图回答下列问题：
(1)该生态系统建设过程中利用的主要生态工程原理是物质循环再生原理；该生态系统的抵抗力稳定性有了明显提高，这是利用了物种多样性原理。
(2)在实际操作过程中，该地区考虑到了养鸭场和养猪场的规模，这利用了生态工程建设的协调与平衡原理。该地区还应考虑哪些方面的问题生产者的产量；土地对粪肥的承载力；对粪肥的加工和利用情况；外地调运饲料的饲养成本。(答两项即可)
(3)我国人口较多，人均土地、水资源和能源占有量少，所以在进行生态工程时，一定要注重生态效益、社会效益和经济效益的统一。
(4)“生物圈2号”生态工程的实验给你的启示是什么？请用简短的文字进行描述：生物圈仍是人类和其他生物的唯一家园，人类与自然应和谐共处。
〔对应训练〕
5．(2018·广东江门调研测试)阅读有关我国水稻育种的新成果：
材料甲：中国工程院院士、“杂交水稻之父”袁隆平宣布了一项剔除水稻中重金属镉的新成果。该技术通过把水稻亲本中促进吸镉的基因“敲掉”，从而减少水稻种子中的镉含量。此项技术培育的新型水稻将扭转我国部分农作物重金属含量超标的趋势。
材料乙：中科院夏新界培育的巨型稻生长周期与青蛙、泥鳅生长周期同步，可同时管理，节约人力与资金成本，通过采取“巨型稻＋青蛙＋泥鳅＋鱼”的生态种养新模式，实现一亩多收，粮渔共赢。
回答下列问题：
(1)材料甲中采用的技术与传统基因工程有所区别，但是也需要在构建表达载体后采用农杆菌转化法将载体导入水稻愈伤组织，愈伤组织再经再分化过程形成新型水稻植株。经检测，新型水稻的稻米镉含量不但比对照组稻米镉含量低_，而且远低于稻米镉含量的国际和国内安全标准。
(2)材料乙中的青蛙在该生态系统的成分属于消费者。建设该类生态种养新模式的目的是遵循自然界物质循环的规律，发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益和生态效益的同步发展。生态工程的基本原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理，整体性原理、系统学和工程学原理等。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔高考必背语句〕
1．防止多精入卵的两道屏障是：透明带反应和卵细胞膜反应。
2．胚胎发育过程：受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→组织器官分化→幼体。囊胚开始出现细胞分化，原肠胚出现胚层分化。
3．胚胎移植的基本程序：对供、受体的选择和处理→配种或进行人工授精→对胚胎的收集、检查、培养或保存→胚胎移植→移植后检查。
4．胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良动物的繁殖潜力。
5．胚胎移植过程中两次使用激素，第一次常用孕激素对受、供体进行同期发情处理；第二次用促性腺激素处理供体使其超数排卵。
6．与传统工程相比，生态工程是一类少消耗、多效益、可持续的工程体系。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2017·江苏卷，14)下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述，错误的是( C )
A．精子在获能液中于37℃、5% CO2条件下培养的目的是使精子获能
B．小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射相关激素有促进超数排卵的作用
C．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，因此发育成的个体没有形态学差异
D．注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育
[解析] 精子在获能液中于适宜条件下培养可以使精子获能，A项正确；小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射促性腺激素能促进其超数排卵，B项正确；分割的胚胎细胞虽有相同的遗传物质，但由于生物的性状还受环境等因素的影响，故发育成的个体会存在形态学差异，C项错误；胚胎干细胞可以发育成组织、器官，注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育，D项正确。
2．(2015·重庆卷，8)某课题组为解决本地种奶牛产奶量低的问题，引进了含高产奶基因但对本地适应性差的纯种公牛。
(1)拟进行如下杂交：
♂A(具高产奶基因的纯种)×♀B(具适宜本地生长基因的纯种)→C
选择B作为母本，原因之一是胚胎能在母体内正常生长发育或胚胎发育。若C中的母牛表现为适宜本地生长，但产奶量并未提高，说明高产奶是隐性性状。为获得产奶量高且适宜本地生长的母牛，根据现有类型，最佳杂交组合是♂A×♀C，后代中出现这种母牛的概率是1/8(假设两对基因分别位于不同对常染色体上)。
(2)用以上最佳组合，按以下流程可加速获得优良个体。
精子要具有受精能力，需对其进行获能或增强活力处理；卵子的成熟在过程③中完成。在过程④的培养基中含有葡萄糖，其作用是供能。为筛选出具有优良性状的母牛，过程⑤前应鉴定胚胎的性别、高产奶和适应生长的基因。子代母牛的优良性状与过程②的基因重组有关。
(3)为了提高已有胚胎的利用率，可采用胚胎分割技术。
[解析](1)由于B是具有适宜本地生长基因的纯合子，故选择B作为母本，可使胚胎在母体内正常生长发育。让B与纯合的具有高产奶基因的A杂交得到C，C牛的产奶量并未提高，可推知高产奶是隐性性状，而C为杂合子。因引进的是含高产奶基因的纯种公牛，故可选用♂A×♀C杂交组合，后代中高产奶且适宜本地生长的母牛的概率为1/4×1/2＝1/8。
(2)精子受精前需进行获能处理，卵子的减Ⅱ分裂在受精作用即过程③中才得以完成；体外培养胚胎时，需在培养液中提供葡萄糖等物质以保证充足的能量供应。为筛选出具有优良性状的母牛，过程⑤前应鉴定胚胎的性别，以及是否具有高产奶和适应生长等优良基因，子代母牛的优良性状与过程②的基因重组有关。
(3)利用胚胎分割和胚胎移植技术，可同时获得多个基因型相同的后代，提高了已有胚胎的利用率。
3．(2015·浙江卷自选，18(4))下面是关于植物克隆和生态工程的问题。请回答：
某农业生态工程基地按照生态和经济规律，对种植业和养殖业进行了优化设计。通过套种、间种和轮种等技术的应用，使种植的农作物为该生态系统组成成分中的消费者提供更多的食物。在农业生产中尽量不施用农药，其目的是C。
A．减少水土流失 B．减少土壤肥力
C．减少环境污染 D．减少生物多样性
[解析] 构建农业生态工程基地需遵循生态和经济规律，对种植业和养殖业进行优化设计。如种植业中采用套种、间种和轮种等技术，可使农作物为消费者提供更多的食物。另外，为减少环境污染，农业生态工程要求尽量不施用农药。
考能提升(九) 现代生物科技专题
〔易 错 清 零〕
易错点1 误认为目的基因的插入是“随机”的
点拨：目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去原功能。
易错点2 混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子，不明确标记基因的作用
点拨：启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
(2)终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。
(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)，从而将含目的基因的细胞筛选出来。
易错点3 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”
点拨：(1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。
易错点4 误认为植物组织培养均需“再分化至幼苗”，误认为“人工种子”即平常所说的“种子”
点拨：(1)组织培养的目的不同，培养的阶段不同。如：生产细胞代谢产物，只需培养至愈伤组织时期；生产人工种子，则需要培养至胚状体时期；获得植株就需培养至幼苗时期。
(2)人工