(共61张PPT)
课题1 微生物的实验室培养
课程标准
进行微生物的分离和培养。
课标解读
1.知道培养基的基础知识，进行无菌技术的操作。
2.进行微生物培养。
1．培养基
(1)培养基概念
按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。
培养基的成分及无菌操作技术
营养物质
生长繁殖
(2)培养基种类
包括 培养基和 培养基等。
(3)培养基的化学成分
一般都含有 、 、 和 四类营养成分。还需要满足微生物生长对 、 及 等的要求。
固体
液体
水
碳源
氮源
无机盐
pH
特殊营养物质
氧气
2．无菌技术
(1)无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下四个方面
①对实验操作的 、操作者的 ，进行清洁和 ；
②将用于微生物培养的器皿、 和 等进行 ；
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行；
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 相接触。
空间
衣着和手
消毒
接种用具
培养基
灭菌
酒精灯火焰
周围的物品
(2)消毒和灭菌
①消毒：消毒是指使用 方法仅杀死物体表面或内部一部分 的微生物， (包括；不包括)芽孢和孢子，常用的方法有 消毒法、 消毒法、 消毒法。
②灭菌：灭菌是指使用 杀死物体内外 ， (包括，不包括)芽孢和孢子，常用的方法有 灭菌、 ＿＿＿灭菌和 灭菌。
较为温和的物理或化学
对人体有害
不包括
煮沸
巴氏
化学药剂
强烈的理化因素
所有的
微生物
包括
灼烧
高压蒸汽
干热
[思维激活1] 用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭菌？70%与95%的酒精，哪一种效果更好？为什么？
提示 酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。
1．碳源、氮源及生长因子的来源与功能归纳
营养要素 来源 功能
碳源 无机碳源 CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物 ①构成细胞物质和一些代谢产物；
②有机碳既是碳源又是能源
有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等
氮源 无机氮源 无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等 将无机氮合成含氨的代谢产物
有机氮源 牛肉膏、蛋白胨、
核酸、尿素、氨基酸 合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
生长因子 维生素、氨基酸、碱基 ①酶和核酸的组成成分；②参与代谢过程中的酶促反应
2.培养基类型划分
划分
标准 培养基种类 特 点 用 途
物理
性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
半固体培养基 加凝固剂，如
琼脂 观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学
成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 分类、鉴定
用
途 选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐)
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红－美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈现黑
色，并带有金属光泽)
3.无菌技术
(1)消毒和灭菌的区别
条件 结果 常用的方法
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
(2)无菌技术主要操作要求
①实验前应对操作空间、操作人员消毒，对所用器具和培养基灭菌。
②实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。
特别提示 (1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。
(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机物既是碳源，又是氮源、能源。
(3)大凡对生长因子不能合成或合成能力有限的微生物，其培养基中均需额外添加生长因子，而许多微生物能自行合成生长因子，其培养基中不需再添加。
【巩固1】 下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是 ( )。
原料 ① ② ③ ④
蛋白胨/g 10 10 10 10
乳糖/g 5 5 5 5
蔗糖/g 5 5 5 5
KH2PO4/g 2 2 2 2
伊红/g 0.4
美蓝/g 0.065
琼脂/g 10 20
NaCl/g 20
蒸馏水/mL 1 000 1 000 1 000 1 000
A.①③ B．②① C．②④ D．③①
解析 高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。
答案 D
1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：
→称量→ → →倒平板。
(2)倒平板的过程：
①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手 。
②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过 。
③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，左手立刻 。
④待平板冷却凝固后，将平板 放置，使皿盖在下、皿底在上。
培养基的制备与大肠杆菌的纯化技术
计算
溶化
灭菌
拔出棉塞
火焰
盖上皿盖
倒过来
2．纯化大肠杆菌
(1)微生物接种的最常用方法是 和 。
(2)平板划线法：通过 在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种 。
(3)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别 ，进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得 。
平板划线法
稀释涂布平板法
接种环
连续
划线
逐步稀释分散到培养基的表面
梯度稀释
涂布到琼脂固体培养基的表面
单个细菌形成的菌落
3．菌种的保存
为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用 法；对于需要长期保存的菌种，可以采用 法。
临时保藏
甘油管藏
[思维激活2] 除平板划线法与稀释涂布平板法外，还有哪些接种方法？微生物接种技术中最核心的内容是什么？
提示 微生物接种方法还有斜面接种及穿刺接种等方法，所有微生物接种方法中最核心的内容是“防止杂菌污染，保证培养物的纯度”。
1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例，计算配制100 mL 的培养基时，各种成分的用量
称量：牛肉膏比较黏稠，可用称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都 易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖
2．微生物分离与纯化技术
(1)原理
微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。
(2)方法步骤
微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤
①梯度稀释操作(如图1)
图1 微生物分离操作流程图
a．将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
b．用移液管吸取1 mL已培养的菌悬液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌悬液与水充分混匀。
c．从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。以此类推，直到完成最后一支试管的稀释。
注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
②划线或涂布
平板划线分离法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。
图2 划线示意图
涂布分离法：取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5和10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌悬液吸附进培养基(图3)。
③培养
将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中37 ℃培养16～24 h，即可长出单菌落(图4)
图3 涂布法示意图 图4 斜面接种法
(3)结果分析
①确认培养基制备是否合格
为确认培养基制备是否合格，需设置对照实验，即接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱中，培养12 h和24 h，观察现象并记录——如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则实验失败需要重新制备。
②接种操作成功的标准
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合该菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中无菌操作还未达到要求，实验失败，需要分析原因，再次制备。
特别提醒 (1)进行划线时最后一区和第一区不可接触。
(2)平板划线各次灼烧接种环的目的。
平板划线操作第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的不同。
(3)灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 灼烧杀死上次划线结束后接种环上残留的菌
种，使每 次划线的菌种来自上次划线末端 划线结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
【巩固2】 下列有关平板划线操作的叙述不正确的是 ( )。
A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种
C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
解析 平板划线操作中，接种环取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物，以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种。划线结束仍需灼烧接种环，是为了能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。
答案 C
【例1】 氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如表1。
微生物的营养与培养基类型
图1
表1 培养基的组成
(1)配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成分外，还应添加1%的______。
(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是______。
(3)从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于______培养基和______培养基。在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是______。
(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为______。
(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养液中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2可知，SP1菌在______培养条件下最早停止生长，其原因是_________________________________。
图2
思维导图：
深度剖析 本题考查培养基的配制原则以及微生物的实验室培养过程，意在考查考生的图表信息转换与分析能力。(1)固体培养基中需加入琼脂作为凝固剂。(2)先配制培养基后灭菌，调pH属于培养基的配制过程，故先调pH后灭菌。(3)从用途上看，Ⅰ号培养基为通用培养基(基本培养基)；Ⅱ号培养基是选择培养基，以氯苯为唯一的碳源，其中为SP1菌提供氮源的成分是硝酸铵。(4)芽孢是在细胞质内高度浓缩脱水形成的抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。(5)由图示可知SP1菌在20 mg/L氯苯培养条件下最早停止生长，20 mg/L氯苯可提供的碳源较少，碳源最早耗尽，影响菌体的生长繁殖。
答案 (1)琼脂 (2)先调pH，后灭菌 (3)通用 选择 硝酸铵 (4)芽孢 (5)20 mg/L氯苯 碳源最早耗尽
[误区警示](1)琼脂是最常用的凝固剂，但固体培养基未必均加琼脂，如棉子壳培养基也属固体培养基。
(2)牛肉膏、蛋白胨等天然物质既可提供碳源，也可提供氮源及生长因子。
【例2】 培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是 ( )。
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线灭菌 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥
C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤
无菌操作技术
思维导图：
深度剖析 培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。
答案 A
[思维深化]几种常用灭菌方法比较(见下表)
方法 灭菌操作 适用对象
灼烧
灭菌 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 对接种环、接种针或其他金属工具灭菌，也可以对试管口、瓶口灭菌
干热
灭菌 在干热灭菌箱内，160～170 ℃条件下，加热1～2 h 耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等
高压
蒸汽
灭菌 在高压蒸汽灭菌锅内，121 ℃，100 kPa，灭菌15～30 min 培养基、发酵设备等
紫外
线灭
菌 30 W照射30 min 小型接种室、接种箱等
【例3】 如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是 ( )。
A．操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌
B．划线操作须在火焰上进行
C．在5区域中才可以得到所需菌落
D．在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌
微生物纯化培养
深度剖析 本题考查平板划线的操作方法。在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰边进行。在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。
答案 D
[归纳提升](1)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。
(2)平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(3)两种纯化方法的比较
项目 优点 缺点 适用范围
平板划
线法 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 不能计数 适用于好氧菌
稀释涂
布平板
法 可以计数，可以观察菌落特征 吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
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旁栏思考题
1．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
解析 许多微生物对人类是有害的，因此实验室中无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
答案 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
(1)培养细菌用的培养基与培养皿。
(2)玻璃试管、烧瓶和吸管。
(3)实验操作者的双手。
解析 消毒和灭菌是无菌技术的两项基本技术，实践中需要根据无菌操作的对象合理地选择使用。原则是既要考虑使用的效果，又要考虑无菌操作对象的承受能力。
答案 (1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。
倒平板操作讨论题
1．培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答案 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答案 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答案 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
平板划线操作讨论题
1．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2．在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答案 以免接种环温度太高，杀死菌种。
3．在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答案 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
涂布平板操作讨论题
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
练习
1．提示 可以通过保持干燥、真空的条件，以及冷藏等方法来阻止微生物的生长。
解析 可以从微生物生长需要哪些条件的角度来思考。例如，微生物的生长需要水、空气、适宜的温度等。
2．提示 相同点：三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养。
不同点：无土栽培技术的操作并不需要保证无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。
解析 可以从这三种培养技术的原理、操作步骤等方面分别进行总结归纳。
3．提示 巴斯德设计了一个鹅颈瓶(曲颈瓶)，现称巴斯德烧瓶。烧瓶有一个弯曲的长管与外界空气相通。瓶内的溶液加热至沸点，冷却后，空气可以重新进入，但因为有向下弯曲的长管，空气中的尘埃和微生物不能与溶液接触，使溶液保持无菌状态，溶液可以较长时间不腐败。如果瓶颈破裂，溶液就会很快腐败变质，并有大量的微生物出现。实验得到了令人信服的结论：腐败物质中的微生物是来自空气中的微生物，这个实验也导致了巴斯德创造了一种有效的灭菌方法——巴氏灭菌法。巴氏灭菌法又称低温灭菌法，先将要求灭菌的物质加热到65 ℃ 30 min钟或72 ℃ 15 min，随后迅速冷却到10 ℃以下。这样既不破坏营养成分，又能杀死细菌的营养体，巴斯德发明的这种方法解决了酒质变酸的问题，拯救了法国酿酒业。现代的食品工业多采取间歇低温灭菌法进行灭菌。
解析 这是一道开放性的问题，答案并不唯一，重点在于鼓励学生积极参与，从不同的角度思考问题。例如，正是由于证明了微生物不是自发产生的，微生物学才可能发展成为一门独立的学科；巴斯德实验中用到的加热灭菌的方法导致了有效的灭菌方法的出现，而这一灭菌原理也适用于食品的保存等。(共19张PPT)
专题2 微生物培养与应用专题整合
常见的消毒灭菌方法归纳
方 法 操作过程 应用范围
煮沸
消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 日常生活中广泛使用
巴氏
消毒法 在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温消毒的液体
化学药物
消毒法 用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
紫外线
消毒法 30 W紫外灯照射30 min 接种室空间消毒
灼烧
灭菌法 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或锥形瓶口等
干热
灭菌法 干热灭菌箱160～170 ℃加热1～2 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸
汽灭菌
法 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基及多种器材、物品
尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与
鉴定比较
项目
内容 尿素分解菌 纤维素分解菌
条件 尿素为唯一氮源 纤维素为唯一碳源
鉴定方法
及现象 培养基中加入酚红指示剂，变红色 在培养基上应用刚果红染色
法，出现透明圈
鉴定原理 细菌等微生物生成脲酶，使尿素中肽键断裂产生NH3，使pH升高，加入酚红变红色 微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使纤维素—刚果红复合物降解而出现透明圈
步骤差异 土壤取样→制备培养基→样品梯度稀释→涂布平板→培养观察 土壤取样→制备培养基→选择培养→梯度稀释→涂布培养→刚果红染色→挑取菌落→进一步鉴定
自养微生物和异养微生物的营养比较
微生物
营养型 碳源 氮源 生长因子 举例
自养型
微生物 CO2、NaHCO3 NH3、铵盐硝酸盐等 一般需要不 硝化细菌
异养型
微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸
盐、蛋白质等 有些种类需要 乳酸菌
【典例1】 下表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是
( )。
A.此培养基可用来培养自养型生物
B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C．若除去①，此培养基可培养圆褐固氮菌
D．培养基若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量/g 0.4 4.0 0.5 0.5 100 mL
解析 由题知，该培养基成分中含有水、无机盐、氮源，但不含含碳有机物，可用来培养自养型微生物，选项A、B均对；圆褐固氮菌同化类型为异养型，培养基中必须含含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌，C错。
答案 C
区分选择培养基与鉴别培养基
概念 用途 实例
选择
培养
基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定的微生物 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉
素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度的食盐
鉴别
培养
基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物 用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
【典例2】 (2011·郑州质检)请回答下列与大肠杆菌有关的问题。
(1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于____________，它的同化作用类型是____________。
(2)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。
成分 含量/g
蛋白胨 10.0
乳糖 5.0
蔗糖 5.0
K2HPO4 2.0
显色剂 0.2
琼脂 12.0
溶质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
根据用途划分该培养基属于__________(选择、鉴别)培养基。该培养基中的碳源是____________。
(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________(消毒、灭菌)，操作者的双手需要进行清洗和____________。静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能______________。通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________。培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是___________________。若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过________处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
解析 (1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于分解者，其同化作用类型是异养型。(2)由于该培养基中含有显色剂，属于鉴别培养基；该培养基中的碳源是乳糖、蔗糖、蛋白胨。(3)注意灭菌和消毒的区别，在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌，操作者的双手需要进行清洗和消毒；紫外线不仅能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构；对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定(分类)；对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生；使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
答案 (1)分解者 异养型 (2)鉴别 乳糖、蔗糖、蛋白胨
(3)灭菌 消毒 损伤DNA的结构 鉴定(分类) 将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 灭菌
【例1】 (2011·重庆理综)下列有关细菌培养的叙述，正确的是
( )
A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌
B．在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长
C．向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长
D．在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动
解析 单个菌落中只含有一种细菌；青霉素能抑制细菌生长，而对真菌没有影响；破伤风杆菌是厌氧型细菌，通入氧气会抑制其生长。
答案 D
【例2】 (2011·课标全国理综，39)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于____________培养基。
(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________和________。
(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力______。
(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。无菌技术要求实验操作应在
酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
解析 (1)要获得分解原油的细菌，只有在以原油为唯一碳源的培养基中，这种细菌可以大量繁殖，而其他细菌不能生存。此种培养基属于选择培养基。
(2)纯化菌种常用平板划线法和稀释涂布平板法。
(3)在以原油为唯一碳源的培养基上，在菌落周围的原油被分解而形成分解圈，分解圈越大，说明该菌株降解能力越强。
(4)实验室灭菌有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，实验操作要在酒精灯火焰附近的无菌区进行。
答案 (1)原油 选择
(2)平板划线法 稀释涂布平板法
(3)强
(4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰
考情分析：微生物的利用在生物技术实践中占有比较重要的地位，包括微生物的分离和培养技术、特定微生物的数量的测定、培养基对微生物的选择作用和微生物的实验室培养等内容。
近年课标试题中，对微生物的纯化培养操作与应用考查最为突出，共出现8次，如2011课标卷39题、2010山东理综34题等。(共38张PPT)
课题3 分解纤维素的微生物的分离
课程标准
1.研究培养基对微生物的选择作用。
2.探讨微生物的利用。
课标解读
1.简述纤维素酶的组成及作用。
2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。
纤维素分解菌的筛选
复合
C1酶
Cx酶
葡萄糖苷酶
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶
2．纤维素分解菌的筛选
(1)筛选方法： 法。
(2)筛选原理：刚果红可以与纤维素形成 ，当纤维素被 分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现 ，我们可以通过 来筛选纤维素分解菌。
刚果红染色
红色复合物
纤维素酶
以纤维素分解菌为中心的透明圈
是否产生透明圈
[思维激活1] 纤维素分解菌的选择培养基中“选择因子”是什么？
提示 纤维素分解菌中唯一的碳源是“纤维素粉”，唯有能利用纤维素的微生物方可在该培养基上生存，其他微生物将因缺乏碳源而无法生存，以此，可筛选到纤维素分解菌。
1．纤维素分解菌的筛选原理
即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
2．筛选过程中涉及的两种培养基
(1)纤维素分解菌的选择培养基
①配方：
组分 含量/g 提供的主要营养
纤维素粉 5 碳源、能源
NaNO3 1 无机盐
Na2HPO4·7H2O 1.2
KH2PO4 0.9
MgSO4·7H2O 0.5
KCl 0.5
酵母膏 0.5 生长因子、碳源、氮源
水解酪素 0.5 氮源、生长因子
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
②该培养基为液体培养基，利用液体选择培养基可增加纤维素分解菌的浓度。
(2)鉴别纤维素分解菌的培养基
①配方：
组分 含量 提供的主要营养
CMC－Na 5～10 g 碳源
酵母膏 1 g 碳源、氮源、生长因子
KH2PO4 0.25 g 无机盐
琼脂 15 g 凝固剂
土豆汁 100 mL 碳源
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
②此培养基为固体培养基——在其中加入刚果红可形成以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此可筛选到纤维素分解菌。
【巩固1】 分析下面培养基的配方，请回答下面的问题。
纤维素分解菌的选择培养基：
纤维素粉 5 g
NaNO3 1 g
Na2HPO4·7H2O 1.2 g
KH2PO4 0.9 g
MgSO4·7H2O 0.5 g
KCl 0.5 g
酵母膏 0.5 g
水解酪素 0.5 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。
(1)此培养基配方中为微生物提供碳源和氮源的分别是______、______。
(2)此配方为______培养基(根据物理状态)。
(3)此培养基选择出的微生物主要是_________________________。
解析 该培养基的唯一碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为唯一碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。
答案 (1)纤维素粉 NaNO3、酵母膏 (2)液体 (3)纤维素分解菌
1．分离纤维素分解菌的实验设计
(1)实验流程：土壤取样→ (此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别 的培养基上→挑选产生 的菌落。
(2)土壤取样
采集土样时，可以选择 的环境。
分离土壤中纤维素分解菌实验操作
选择培养
纤维素分解菌
透明圈
纤维素丰富
(3)选择培养
①目的：增加纤维素分解菌的 ，确保能够从样品中分离到所需要的 。
②选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在 上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变 。也可重复选择培养。
浓度
微生物
摇床
混浊
③挑选菌落
a．刚果红染色法，挑选 的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。
b．常用的刚果红染色法包括两种，一种是先 ，再加入 进行 反应，另一种是在 时就加入刚果红。
产生透明圈
培养微生物
刚果红
颜色
倒平板
2．课题延伸
(1)为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行 的实验，纤维素酶的发酵方法有 和
两种。
(2)纤维素酶的测定方法
一般采用 。
发酵产纤维素酶
液体发酵
固体发酵
对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖
进行定量测定
[思维激活2] 由“选择培养”实验操作过程请你推测纤维素分解菌的异化类型是需氧型还是厌氧型？
提示 由选择培养操作中“将锥形瓶置于摇床上”可推测纤维素分解菌的异化类型为需氧型。
1．土壤中纤维素分解菌的分离流程
2．两种刚果红染色法比较
优点 显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 操作简便，不存在菌落混杂问题
缺点 操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂 ①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性反应；②有些微生物具有降解色素的能力，它们会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分
特别提醒 (1)本实验方案中应设置普通培养基(或牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照实验。
(2)分离纤维素分解菌先经选择培养，其目的是增加纤维素分解菌的浓度；然后经梯度稀释后，再涂布到鉴别培养基上。
【巩固2】 下列关于分离纤维素分解菌实验的叙述，错误的是
( )。
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少
C．经稀释培养后，用刚果红染色
D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
解析 经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。
答案 A
【例1】 微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是( )。
A．C1酶和Cx酶 B．C1酶和葡萄糖苷酶
C．Cx酶和葡萄糖苷酶 D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶
深度剖析 纤维素酶包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，能将纤维素分解为纤维二糖的是C1酶和Cx酶。
答案 A
纤维素和纤维素酶
[查漏补缺](1)纤维素、纤维素酶、控制纤维素酶合成的基因，其基本单位依次为：葡萄糖、氨基酸、脱氧核苷酸。
(2)纤维素酶是复合酶，它并非一种单一酶。
【例2】 生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙醇，其技术流程为：纤维素酶解→酵母发酵→蒸馏→成品。纤维素酶的成本能否下降，是能否实现乙醇工业化生产的关键因素。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌的实验流程。
土壤取样→选择培养→梯度稀释→鉴别培养。
土壤中纤维素分解菌的分离与检测
结合所学知识回答下列问题。
(1)最好选择怎样的环境采集土样？
___________________________________________________。
(2)下面是一种培养基配方：纤维素粉5 g、NaNO3 1 g、Na2HPO4·7H2O 1.2 g、KH2PO4 0.9 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪素0.5 g(蒸馏水定容到1 000 mL)。该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原理是____________________________________________________
___________________________________________。
(3)为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基上加入______染液，将筛选获得的菌液稀释后用______的方法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生______的菌落作为菌种进行扩大培养。
(4)纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢？请设计实验进行检测。__________________________________________。
深度剖析 本题考查土壤中纤维素分解菌的分离与鉴定的相关知识。富含纤维素的土壤中，含有以纤维素为碳源的纤维素分解菌，且数量较多；题目中给出的培养基能够为产生纤维素酶的微生物提供碳源，不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源而不能正常生长繁殖，因此该培养基具有选择作用；纤维素量一定时，在一定范围内，纤维素酶产量与分解产生的葡萄糖量成正比。
答案 (1)纤维素丰富的土壤环境 (2)培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌生长，同时抑制其他微生物生长 (3)刚果红 涂布平板 透明圈 (4)向纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素，定时测定葡萄糖产量的变化
[归纳提升](1)经选择培养后，再经梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。(2)富集培养可省略。(3)经稀释培养后，用刚果红染色。(4)设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。
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旁栏思考题
1．本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
解析 本课题的选择培养可以提供目的微生物繁殖所需的条件，增加选择培养可以使实验的成功率更高。
答案 本实验流程与课题2的流程的区别如下：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。
2．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
答案 由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
3．将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
答案 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10 cm左右腐殖土壤中。
4．想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？
解析 两种方法各有优缺点，实践中可以根据需要选择不同的方法进行实验。
答案 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。
但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
5．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
解析 这里的选择培养的实质是富集培养，也就是提供了目的微生物生长繁殖的条件。
答案 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
练习
1．略。(开放性题目，答案合理即可)
2．提示 土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→挑选单菌落→发酵培养。(共43张PPT)
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课程标准
测定某种微生物的数量。
课标解读
1.利用选择培养基分离细菌。
2.运用活菌计数法测定土壤中尿素细菌的数量。
1．筛选菌株
(1)自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。
(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 或 其他微生物生长。
微生物的分离与计数
生存环境
目的菌株
抑制
阻止
(3)选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目
(1)常用方法： 法。
(2)统计依据：当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌。
(3)平板选择菌落计数时一般选菌落数在 的平板，计数公式为 。
特定
抑制
阻止
稀释涂布平板
稀释度
活菌
30～300
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
3．设置对照
(1)对照实验：是指除了 以外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验的可信度。例如为了确认培养基是否被杂菌污染，需以 培养基培养作为空白对照。
被测试因素
非测试因素
牛肉膏蛋白胨
[思维激活1] 上述的对照组培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)是否也需接种？如何确认所制备的选择培养基的确起到了选择作用？
提示 为确认培养基是否被杂菌污染时，对照组的牛肉膏蛋白胨培养基不需接种。欲确认所制备的选择培养基是否起到了选择作用，应同时对对照组的牛肉膏蛋白胨培养基进行接种——若对照组培养基中菌落种类明显复杂于实验组，则可确认选择培养基的确起到了选择作用。
1．选择培养基的制作方法
(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。
(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。
(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。
(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。
2．结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污
染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
培养物中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基
的筛选作用 牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释
操作 得到三个或三个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
特别提示 (1)不同细菌的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，可以作为菌种鉴定的重要依据。
(2)进行活菌计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(3)选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。
【巩固1】 苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题。
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入______作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基______(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于____________________；使用____________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是________________________________________________
________________________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
___________________________________________________。
解析 根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长，抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落，再接种培养即可获得纯目的菌。为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长，所以要将培养皿倒置。在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则，操作中要严格进行无菌操作。
答案 (1)苯酚 A 稀释涂布平板 (2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入苯酚作为碳源 稀释涂布平板法或平板划线 以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作
1．实验设计
(1)土壤取样
①土壤微生物大约70%～90%是 。
②细菌适宜在酸碱度 的 土壤中生长，绝大多数分布在距地表 的土壤层。
土壤中分解尿素的细菌的分离计数实
验操作与评价
细菌
接近中性
潮湿
3～8 cm
(2)样品处理
样品的 直接影响平板上生长的 ，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数在 之间，便于计数。
(3)微生物的培养与观察
将培养基平板放置于 温室中培养1～2d，每隔 统计一次 数目，最后选取数目 时的记录作为结果。
(4)细菌的计数
当菌落数目稳定时，取同一条件下的至少 个平板进行计数，求出 ，并根据所对应的 计算出样品中细菌的数目。
稀释程度
菌落数目
30～300
30～37 ℃
24h
菌落
稳定
3
平均值
稀释度
2．操作提示
(1)无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要 。
②应在 旁称取土壤。并在 附近将土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在 旁操作。
(2)做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就 。
灭菌
火焰
火焰
火焰
做好标记
3．课题延伸
细菌合成的 将尿素分解成 ，使培养基的 增强。在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂培养细菌，若指示剂变 ，可确定该种细菌能够 。
脲酶
氨
碱性
尿素
酚红
红
分解尿素
[思维激活2] 分离尿素细菌的培养基为何能起到选择作用？
提示 微生物的生长需要氮源，大多数微生物不能直接利用尿素作氮源，但尿素细菌却可以尿素作氮源，因此，在以尿素为唯一氮源的培养基中，唯有能利用尿素的微生物方可生长繁殖，其他微生物则不能生长繁殖而被淘汰，因而该培养基可起到筛选尿素细菌的作用。
1．土壤中分解尿素的细菌的分离
(1)分离的原理
①土壤中的细菌之所以能够分解尿素，是因为它们体内能合成脲酶。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。
②实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
③分离分解尿素的细菌的培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。
(2)尿素细菌分离与计数的实验流程：
土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数
2．统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
②方法：用计数板计数。
③缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作
a．设置重复组：同一稀释度下，至少涂布3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果明显不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝C/V×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积/mL，M代表稀释倍数。
【巩固2】 分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是
( )。
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
解析 土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中只加尿素，分解尿素的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培养基；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖作为碳源。
答案 C
【巩固3】 用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是 ( )。
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
解析 将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。
答案 C
【例1】 尿素是一种重要的农业肥料，但若不经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题。
微生物的分离
(1)培养基中加入尿素的目的是筛选________，这种培养基属于________培养基。
琼脂 15 g
尿素 1 g
葡萄糖 10 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
Na2HPO4 2.1 g
KH2PO4 1.4 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_______和_____，实验需要振荡培养，原因是______________。
(3)转为固体培养基时，常采用________的方法接种，获得单菌落后继续筛选。
(4)下列材料或用具：①培养细菌用的培养基与培养皿；②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；③实验操作者的双手。其中需要灭菌的是________；需要消毒的是________。(填序号)
(5)在进行分离分解尿素的细菌的实验时，A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有______。(填序号)
①由于土样不同 ②由于培养基污染
③由于操作失误 ④没有设置对照
思维导图：
深度剖析 (1)培养基中加入尿素的目的是筛选尿素细菌。
(2)尿素可为尿素细菌提供氮源，震荡可为目的菌株提供氧气。
(3)在固体培养基中接种常用稀释涂布平板法和平板划线法。
(4)操作器械需灭菌，操作者双手需消毒。
(5)土样不同、培养基污染、操作失误均可能导致计数误差。
答案 (1)目的菌 选择
(2)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气
(3)稀释涂布平板(平板划线)
(4)①和② ③ (5)①②③
[思维拓展](1)利用选择培养基设计实验分离纯化微生物。
①真菌：用含青霉素的培养基分离。
②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。
③固氮微生物：用无氮培养基分离。
④自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。
⑤光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。
⑥厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。
⑦乳酸菌：用乳酸含量较高，pH较低的普通培养基分离。
⑧假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。
(2)微生物分离与计数中两种对照组的作用：
①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。
【例2】 下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，错误的是 ( )。
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48h
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
微生物的计数
思维导图：
深度剖析 确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的平板进行计数，D错；A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法，A、B、C三个选项均是正确的。
答案 D
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旁栏思考题
1．想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
答案 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。
2．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
答案 这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不相同。
练习(教材P26)
1．提示 菌落是单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞的群落。可以通过稀释涂布平板法计算活菌的数目，其原理是培养基上的一个菌落来源于一个活菌。
2．提示 利用以尿素为唯一氮源的选择培养基在无氧环境中培养牛瘤胃提取物，选择能够正常生长的菌落即为分解尿素的微生物。
解析 反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
