(共17张PPT)
专题5 DNA和蛋质技术专题整合
提取DNA利用的是DNA、RNA、蛋白质和脂质的理化性质的差异。具体地说，DNA与其他物质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，再通过冷酒精进一步去除其他杂质。另外DNA对高温和洗涤剂的耐受性较高，不易被破坏。鉴定时可采用二苯胺试剂沸水浴加热呈蓝色来判断DNA的存在。
DNA与蛋白质的提取
提取与分离蛋白质是根据蛋白质的分子形状和大小，所带电荷的性质和多少，溶解度、吸附性质以及对其他分子的亲和力等理化性质，将不同种类的蛋白质分离开。凝胶色谱法可以将相对分子质量不同的蛋白质有效分离。
DNA与蛋白质的提取技术比较
电泳法可将带有不同电荷的蛋白质分离。
DNA 血红蛋白
材料
选取 鸡血细胞等DNA含量相对较高的生物组织 哺乳动物的成熟红细胞
细胞
破碎 加蒸馏水、加洗涤剂和食盐搅拌、研磨 加蒸馏水和甲苯充分搅拌
去除
杂质 ①用不同浓度的NaCl溶液处理
②用酒精溶液处理
③用蛋白酶处理 ①透析处理
②纯化处理
鉴定 加入二苯胺，沸水浴 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量
PCR技术与凝胶色谱法的比较
PCR 凝胶色谱法
过程 变性：90 ℃以上高温解旋
↓
复性：50 ℃左右引物与单链结合
↓
延伸：72 ℃合成子链 凝胶色谱柱的制作
↓
装填：凝胶装填均匀，无气泡
↓
纯化
酶 需要热稳定性高的TaqDNA聚合酶 不需要酶
温度 高温 常温
DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途
及原理比较
试剂 质量浓度 用途 原理
NaCl
溶液 2 mol/L 溶解
DNA DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在质量浓度为2 mol/L时最大、在质量浓度为0.14 mol/L时最小
0.14
mol/L 析出
DNA
2 mol/L 鉴定时
的溶剂
酒精 95%
(体积
分数) 除去杂
质以提
纯DNA DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精
二苯
胺 / 鉴定
剂 DNA遇二苯胺(沸水浴)会变蓝色
柠檬
酸钠 0.03 g/mL 抗凝剂 除去血液中的钙离子，防止血液凝固
【典例1】 下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是 ( )。
试剂 操作 作用
A 柠檬酸钠 与鸡血混合 溶解细胞
中DNA
B 蒸馏水 与鸡血细胞混合 保持细
胞形状
C 蒸馏水 加入到溶解有DNA的
NaCl溶液中 析出DNA
丝状物
D 冷却的酒精 加入到过滤后含DNA
的NaCl溶液中 产生特定
的颜色反应
解析 在DNA的粗提取与鉴定实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在质量浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(水浴加热)产生蓝色反应。
答案 C
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(2)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
(3)所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
PCR技术操作注意事项
(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。
(5)PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。
【典例2】 PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 ( )。
A．反复洗涤 B．用酒精擦洗
C．高压灭菌 D．在－20 ℃储存
解析 为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。
答案 C
【例1】 (2011·广东理综，5)下列关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是 ( )。
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
解析 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放出血红蛋白。分离提纯血红蛋白时用凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速度较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。故D不正确。
答案 D
【例2】 (江苏高考)下列叙述中错误的是 ( )。
A．改变NaCl溶液的浓度只能使DNA溶解而不能使其析出
B．在沸水浴中，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
C．用电泳法可分离带电性质、分子大小和形状不同的蛋白质
D．用透析法可去除蛋白质样品中的小分子物质
解析 提取DNA的原理，是DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同。DNA在质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小，因此如果将NaCl浓度调至质量浓度为0.14 mol/L会使DNA溶解度变小而呈析出状态。
答案 A
考情分析：本专题内容包括DNA粗提取与鉴定、多聚酶链式反应扩增DNA、血红蛋白的提取与分离等，高考对本专题内容的考查多集中于DNA粗提取原理、DNA鉴定、PCR技术原理及其与体内DNA复制的比较，血红蛋白的提取与分离、凝胶色谱法等题目难度相对较大。(共36张PPT)
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
课程标准
尝试PCR技术的基本操作和应用。
课标解读
1.理解PCR技术的基本原理。
2.知道PCR技术的基本操作过程。
3.讨论PCR技术的应用。
1．生物体内DNA分子复制的条件
(1)四种 是合成子链的原料。
(2) 提供了DNA复制的模板。
(3) 打开了DNA双链。
(4) 催化合成DNA子链。
(5) 使DNA聚合酶能够从 开始连接脱氧核苷酸。
PCR技术的原理及反应过程
脱氧核苷酸
DNA母链
解旋酶
DNA聚合酶
引物
引物的3′端
2．PCR扩增的原理及条件
(1)概念
PCR即 ，是一种 迅速 的技术。它能以极少量的 为模板，在短时间内复制出上百万份的 。
(2)原理
①DNA的热变性：在 的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为 。当温度缓慢 后，两条彼此分离的DNA链又会重新 。
②子链的合成：a.需要 ；b.合成方向总是从子链的 端向 端延伸。
多聚酶链式反应
体外
扩增DNA片段
DNA
DNA拷贝
80～100℃
变性
降低
结合成双链
引物
5′
3′
(3)条件
① 模板。
②分别与模板DNA两条模板链相结合的两种 。
③A、T、G、C四种 。
④耐热DNA聚合酶，一般用 。
⑤需要一定的 和能严格控制 的温控设备。
DNA
引物
脱氧核苷酸
耐高温的TaqDNA聚合酶
缓冲溶液
温度
3．PCR反应过程
PCR一般要经历 次循环，每次循环可以分为 、
和 三步。
(1) ：当温度上升到 以上时，双链DNA解聚为单链。
(2) ：温度下降到 左右， 通过 与两条单链DNA结合。
(3) ：温度上升到 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在
的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA
链。
三十多
变性
复性
延伸
变性
90℃
复性
50℃
两种引物
碱基互补配对
延伸
72℃
DNA聚合酶
[思维激活1] DNA复制缘何必须有引物？
提示 DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3′延伸DNA链，故DNA合成时，必须加入引物(其3′游离)以作为延长DNA子链的“引子”。
1．细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的比较(见下表)
项目 DNA复制 PCR扩增
不
同
点 场所 细胞内 细胞外
能量 ATP提供能量 不需ATP提供能量
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐热的TaqDNA聚合酶
是否有转录 伴有转录、产生引物 无转录、需加入两种引物
特点 边解旋边复制，
半保留复制 体外迅速扩增
循环次数 受生物体自身控制 30多次
缓冲液 不需要 需要人为控制
设备 无 需要严格控制温度
变化的温控设备
相
同
点 原料 四种脱氧核苷酸
复制原理 严格遵循碱基互补配对原则
模板 DNA为模板
引物 都需要与模板相结合的引物
2.PCR过程
(1)变性
当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
(2)复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(3)延伸
温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
特别提醒 (1)72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸。
(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。
【巩固1】 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是 ( )。
A．94 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、55 ℃、94 ℃
C．55 ℃、94 ℃、72 ℃ D．80 ℃、55 ℃、72 ℃
解析 当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
答案 A
1．实验用具
(1)PCR仪：该仪器能自动调控 ，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个 代替，操作时按程序在3个 中 PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管：总容积为 ，实际上是进行 的场所。
(3)微量移液器：用于 。
PCR技术的实验操作及评价
温度
恒温水浴锅
水浴锅
来回转移
0.5mL
多聚酶链式反应
转移PCR配方中的液体
2．操作步骤
准备→ →混合→ →反应。
3．操作提示
(1)为避免 等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行 。
(2)所用的 和 应分装成小份，并在 储存。
(3)在 中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须 。
加入组分
设置PCR的循环程序
外源DNA
高压灭菌
缓冲液
酶
－20℃
微量离心管
更换
[思维激活2] PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋转酶吗？
提示 PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不是DNA解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在80～100 ℃温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。
1．PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。
循环数 变 性 复 性 延伸
第1次 94 ℃，10 min － －
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后一次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在离心管底部)
3．实验中DNA含量的测定
DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：
①稀释：2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
↓
②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
↓
③测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值
↓
④计算：DNA含量(μg)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数
特别提醒 若没有PCR仪，可进行水浴扩增DNA
设置3个恒温水浴锅，温度分别为94 ℃、55 ℃和72 ℃，在3个水浴锅中依据PCR仪的处理时间来回转移PCR反应的微量离心管即可。
【巩固2】 聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是( )。
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
解析 PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。
答案 C
【例1】 (2011江苏)请回答有关问题。
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
PCR技术的原理
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。
②在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
①第1组：________________；②第2组：________________。
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_________________。
思维导图：
[归纳提升]PCR技术特点：
(1)PCR不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；
(2)PCR需要耐热的DNA聚合酶，而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性；
(3)PCR一般需经三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制。
【例2】 使用PCR仪具体实验操作顺序应为 ( )。
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④① B．①⑤③②④
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
思维导图：
PCR技术实验操作及注意事项
深度剖析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)—移液—混合—离心—反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。
答案 C
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教材P63
1．提示 绘图可参考教科书中图5－9。PCR反应中的DNA片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段(2n＝230＝1 073 741 824)。
解析 PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。
2．提示 根据已知DNA序列设计引物，因为PCR扩增的是两种引物之间的特定DNA序列。
解析 PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实践的经验。(共43张PPT)
课题1 DNA的粗提取与鉴定
课程标准
本课题在课标中没有明确要求，但本部分内容与PCR技术和蛋白质的提取有一定联系。
课标解读
1.了解DNA分子的理化性质。
2.理解DNA粗提取与鉴定的原理。
3.掌握DNA粗提取技术。
1．提取生物大分子的基本思路
选用一定的 或 方法分离具有不同 的生物大分子。
2．提取DNA的思路：利用DNA与 、 和 等在 和 性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
提取DNA的方法
物理
化学
物理或化学性质
RNA
蛋白质
脂质
物理
化学
3．原理
(1)DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 溶液中溶解度不同。利用这一特点，选择适当的 就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。
(2)DNA不溶于 ，但是细胞中的某些蛋白质则溶于此溶液。
(3) 能水解蛋白质，但对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受 的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能瓦解 ，但对DNA没有影响。
NaCl
盐浓度
酒精
蛋白酶
60～80℃
80℃
细胞膜
4．DNA的鉴定
在 的条件下，DNA遇二苯胺会染成 。注意二苯胺试剂要 。
[思维激活1] 为提取到DNA，曾先后使用不同浓度的NaCl溶液，则在质量浓度为2 mol/L NaCl溶液及0.14 mol/L NaCl溶液中应取滤液，还是滤得的固体物？
提示 在质量浓度为2 mol/L NaCl溶液中DNA呈溶解状态，应取滤液，在质量浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中DNA溶解度极低，易析出，应取固体物。
沸水浴
蓝色
现配现用
1．利用DNA的溶解特性粗提取DNA
①DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
溶解特性 质量浓度为2 mol/L
NaCl溶液 质量浓度为0.14 mol/L
NaCl溶液
DNA 在NaCl溶液中，质量浓度为0.14 mol/L时溶解度最小 溶解 析出
蛋白质 NaCl的质量浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析 溶解
②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。
NaCl溶液 酒精(体积分数为
95%的冷酒精)
DNA
不溶
蛋白质 NaCl溶液质量浓度从2 mol/L逐渐稀释的过程中溶解度逐渐增大 某些蛋白质可溶
2.利用DNA对酶、高温及洗涤剂的耐受性提取DNA(见下表)
DNA 蛋白质
蛋白酶 没影响 水 解
高温 80 ℃以上才会变性 60～80 ℃会变性
洗涤剂 没影响 瓦解细胞膜
特别提醒 (1)甲基绿可将DNA染成绿色，且不需水浴加热。二苯胺鉴定DNA属于颜色反应，需要水浴加热5 min，可使DNA呈蓝色。
(2)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。
【巩固1】 蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来。下列药品可达到上述同一目的的是 ( )。
A．蒸馏水 B．NaCl溶液
C．NaOH溶液 D．盐酸
解析 蛋白酶是利用酶的专一性将DNA和蛋白质分离，而NaCl溶液则是利用DNA和蛋白质在该溶液中的溶解度不同将其分离。
答案 B
1．实验材料的选取
选用 含量相对较高的生物组织。
2．破碎细胞，获取含DNA的滤液
(1)动物细胞的破碎——以鸡血为例
在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集 即可。
DNA粗提取实验流程
DNA
蒸馏水
滤液
(2)植物细胞的破碎——以洋葱为例
先将洋葱切碎，然后加入一定的 和 ，进行充分 和 ，过滤后收集研磨液。
3．去除滤液中的杂质
(1)方案一：通过控制 的浓度去除 。
(2)方案二：直接向滤液中加入 ，反应10 ～15 min，添加物中的 能够分解蛋白质。
(3)方案三：将滤液放在 的恒温水浴箱中保温10～15 min，注意严格控制温度范围，使 沉淀析出而 分子还未变性，可以将DNA与蛋白质分离。
洗涤剂
食盐
搅拌
研磨
NaCl溶液
杂质
嫩肉粉
木瓜蛋白酶
60～75℃
蛋白质
DNA
4．DNA的进一步提纯
利用DNA不溶于冷却的 这一原理，可从溶液中析出较纯净的DNA，此时DNA的状态为 。
5．DNA的鉴定
将呈丝状物的DNA溶解于5 mL质量浓度为 溶液中，再加入4 mL的 试剂， 加热5 min，冷却后观察溶液的颜色。注意要同时设置 实验。
酒精溶液
白色丝状物
2mol/L的NaCl
二苯胺
沸水
对照
[思维激活2] 用猪的血液与鸡的血液提取DNA哪个效果更好？
提示 用鸡的血液；因为鸡血细胞核DNA含量丰富，材料易得，而猪的红细胞无细胞核DNA含量少。
1．实验材料的选取
本实验用鸡血细胞作实验材料有两个原因：一是因为鸡血细胞的核DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水涨破，而用动物肝脏细胞等作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
2．提取DNA的具体步骤
↓
(2)溶解核内DNA：滤液＋质量浓度为2 mol/L NaCl溶液
↓
(3)过滤：除去不溶的杂质，得滤液
↓
(4)析出含DNA的黏稠物：向滤液中缓缓加入蒸馏水，并用玻璃棒轻轻沿一个方向不停地搅拌，直到丝状物不再增加时，停止加水(此时NaCl质量浓度约为0.14 mol/L)
↓
(5)过滤：用多层纱布过滤，含DNA的黏稠物被留在纱布上
↓
(6)DNA的黏稠物再溶解：将其溶解在质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中
↓
(7)过滤：用两层纱布滤得含DNA的滤液
↓
(8)对DNA进一步提纯：向滤液中加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精，静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物，即粗提取的DNA
↓
(9)DNA的鉴定
比较 加入物质 结果 图示
实
验
组 均加入：①4 mL二苯胺试剂
②质量浓度为2 mol/L NaCl溶液5 mL 丝状物
(DNA) 溶液
逐渐
变蓝
对
照
组 —— 不
变
蓝
特别提醒 (1)动、植物细胞在获取DNA滤液方面的比较(见下表)
(2)制备鸡血细胞液时，要在取鸡血的同时加入柠檬酸钠，静置后上层是血浆，下层为所需要的血细胞。
原 理 方 法
动物细胞
(鸡血细胞) 在低渗溶液中会吸水涨破 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液
植物细胞
(洋葱) 洗涤剂能够溶解细胞膜 在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液
【巩固2】 下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作。这些操作目的正确的是 ( )。
A．①是洗涤红细胞，去除血细胞表面的杂质
B．②是溶解DNA，去除不溶于酒精的杂质
C．③是溶解DNA，去除不溶于质量浓度为2 mol/L NaCl溶液的杂质
D．④是稀释NaCl溶液，去除不溶于低浓度NaCl溶液的杂质
解析 ①是使鸡血细胞吸水胀破释放出核物质；②是析出DNA，去除溶于酒精的杂质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
答案 C
【例1】 (2011·江苏)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，下列相关叙述正确的是 ( )。
A．用蒸馏水将NaCl溶液质量浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物
B．调节NaCl溶液质量浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质
C．将丝状物溶解在质量浓度为2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色
D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同
DNA粗提取的原理
思维导图：
深度剖析 当NaCl质量浓度为0.14 moL/L时，DNA溶解度最小，析出物中含有大量的DNA。将丝状DNA溶解在质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺沸水浴加热后呈蓝色。菜花替代鸡血作实验材料，实验操作步骤不完全相同，处理菜花时，先用洗涤剂处理细胞膜。
答案 B
[归纳提升]DNA的粗提取原理及目的归纳
基本原理 方法 目的
DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低 溶于NaCl溶
液中并稀释 ①NaCl溶液质量浓度为2 mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质
②当NaCl溶液稀释至质量浓度为0.14 mol/L时，DNA析
出，过滤可除去溶于NaCl中的部分蛋白质和其他杂质
DNA不被蛋白酶所水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质
DNA不溶于酒精溶液 加入冷却酒
精(体积分
数为95%) DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质
【例2】 下图为“DNA的粗提取与鉴定”的实验装置，请回答下列相关的问题。
DNA粗提取实验操作
(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血细胞液中有较高含量的________。
(2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水的目的是________，通过图B所示的步骤取得滤液，再在溶液中加入质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液的目的是____________________________________
(3)图C所示实验步骤中加蒸馏水的目的是___________________。
思维导图：
深度剖析 题图A、B、C所示为本实验的三个关键步骤。图A通过添加蒸馏水，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于低渗的环境之中，细胞因大量吸水而最终破裂，并释放出胞内物。图B通过纱布过滤使血细胞释放出的DNA滤入收集的滤液中(将大量胶状物滤出)，再在滤液中加入质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液使DNA的溶解度增加。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，如在质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度只有水中的1%，而在质量浓度为1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度为水中的2倍。图C在DNA浓盐溶液中加入蒸馏水(大量)，可使溶液的NaCl浓度降至较低，由于DNA在较低浓度的NaCl溶液中溶解度很低(在质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，浓度再变小则DNA溶解度将增大)，使DNA低渗析出，经过滤等手段可以收集到DNA。
答案 (1)DNA (2)使血细胞破裂 使滤液中的DNA溶于浓NaCl溶液 (3)使DNA析出
易错提醒 DNA粗提取操作中两次加入蒸馏水及三次过滤的目的分析：
(1)实验过程中两次加入蒸馏水，操作目的各不相同：第一次加蒸馏水，目的是使血细胞通过吸水涨破，释放出核内的DNA；第二次加蒸馏水，目的是稀释氯化钠溶液，使其浓度降至质量浓度为0.14 mol/L，最终使大量DNA析出。
(2)在DNA粗提取中三次过滤时，DNA存在的部分及所用的纱布层数不同：
第一次过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液，是为了得到含DNA的滤液，使用的纱布为1～2层。
第二次过滤含有黏稠物的NaCl溶液，是为了得到从低浓度的NaCl溶液中析出的附着在纱布上的含DNA的黏稠物，所用的纱布为多层。
第三次过滤溶解有DNA的NaCl溶液，目的是为了使DNA再溶解，所以只要用两层纱布即可。
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旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
解析 鸡血细胞与外界溶液相当于一个渗透系统，在蒸馏水中会发生渗透吸水，使细胞胀裂。
答案 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答案 洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答案 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
解析 破碎的细胞通过过滤后，只能将体积较大的杂质除去，而与DNA体积相近的蛋白质、多糖和RNA等大分子物质都还存在。
答案 可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答案 用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
解析 分离蛋白质和DNA的方法无非是利用物理或化学方法将二者分离。
答案 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
练习
1．答案 提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。
2．解析 生物大分子的分离方法较多，但是对不同的生物大分子，应该选择不同的提取方法进行提取，一般地说，被提取的物质性质越稳定，分离的方法就越简单。
答案 提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。(共44张PPT)
课题3 血红蛋白的提取和分离
课程标准
尝试蛋白质的提取和分离。
课标解读
1.知道凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子技术的基本原理。
2.掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。
1．凝胶色谱法
(1)概念
也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。
(2)原理
①由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 。
血红蛋白提取和分离的基本原理
分配色谱法
相对分子质量的大小
多孔球体
通道
②当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 。
相对分子质量
较小
较长
较慢
较大
凝胶外部
较短
较快
分离
2．缓冲溶液
(1)作用
在一定范围内，抵制外界的 对溶液pH的影响，维持pH 。
(2)配制
由1～2种 溶解于水中配制而成，通过 就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。
酸和碱
基本不变
缓冲剂
调节缓冲剂
的比例
3．电泳
(1)概念
指 在电场的作用下发生 的过程。
(2)原理
在一定的 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在电场的作用下，这些带电分子会向着
的电极移动。
带电粒子
迁移
pH
正电
负电
与其所带电荷相反
(3)作用
电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 。
(4)方法
常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。
带电性质
大小
形状
迁移速度
各种分子的分离
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
[思维激活1] 凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同？
提示 凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小，形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。
蛋白质分离的依据
蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
(1)凝胶色谱法
相对分
子质量 直径大小 运动方式 运动
速度 运动
路程 洗脱
次序
大 大于凝胶颗粒
空隙直径、被
排阻在外面 垂直向
下移动 较快 较短 先从凝
胶柱洗
脱出来
小 小于凝胶颗粒
空隙直径，可以
进入颗粒内部 垂直向下移
动，无规则
扩散进入凝
胶颗粒 较慢 较长 后从凝
胶柱洗
脱出来
(2)电泳法
①含义：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
②原理：一些生物大分子具有可解离的基团，在一定pH下，会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。因各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，迁移速度不同，从而实现各种分子的分离。
③常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。在测定蛋白质的相对分子质量时，通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，此方法也可用来分离蛋白质混合组分(亚基)。
【巩固1】 凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是 ( )。
A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小
B．根据蛋白质相对分子质量的大小
C．根据蛋白质所带电荷的多少
D．根据蛋白质溶解度的大小
解析 凝胶色谱法所用的凝胶实际上是一些微小多孔的球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
答案 B
1．蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、
和 。
2．样品处理
(1)红细胞的洗涤
采集血样， ，吸取血浆后加 洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是 ，以利于后续步骤的分离纯化。
血红蛋白提取和分离的实验操作与评价
样品处理
粗分离
纯化
纯度鉴定
低速短时间离心
生理盐水
除去杂质
(2)血红蛋白的释放
将洗涤好的红细胞依次加入 至原血液体积、40%体积的 ，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水 ，血红蛋白释放出来。
(3)分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合液转移到 中，以2 000 r/min的速度 10 min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。
蒸馏水
甲苯
涨破
离心管
离心
(4)透析
取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的 中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。
3．凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工橡皮塞→安装 。
(2)凝胶色谱柱的装填。
(3)样品的 。
磷酸缓冲液
色谱柱
加入和洗脱
4．操作提示
(1)红细胞的洗涤
、 与 十分重要。洗涤次数过少，无法除去 ；离心速度 和时间 会使
等一同沉淀，达不到分离效果。
(2)色谱柱填料的处理
商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶 ，加速膨胀。
洗涤次数
离心速度
离心时间
血浆蛋白
过高
过长
白细胞
洗脱液
用沸水浴加热
(3)凝胶色谱柱的装填
在装填凝胶柱时，不得有 存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低分离效果。
(4)蛋白质的分离
如果 ，说明色谱柱制作成功。
气泡
洗脱次序
红色区带均匀一致地移动
[思维激活2] 透析的目的是什么？依据了什么原理？
提示 透析的目的在于去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的蛋白质，透析依据的原理是半透膜只允许小分子透过，不允许大分子透过。
1．样品的处理
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除杂蛋白。
②方法
a．采集血样→b.低速短时间离心→c.吸取血浆→d.盐水洗涤→e.低速离心→重复d、e步骤三次。
(2)血红蛋白的释放
红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液
①将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况(从上往下)：第1层：无色透明的甲苯层；第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体；第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体；第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。
②将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
③目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。
(4)透析
①原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
③目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质；
b．用于更换样品的缓冲液。
2．凝胶色谱操作
3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4．结果分析与评价
血红蛋白
的分离 ①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功
②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽→分离效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关
特别提醒 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低，因此可从已知相对分子质量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的相对分子质量。
【巩固2】 在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是 ( )。
A．防止血红蛋白被氧化
B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和
C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
解析 利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于分离观察(红色)和研究(活性)。
答案 D
【例1】 下图中，可表示为相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的移动过程的是 ( )。
血红蛋白提取和分离的基本原理
思维导图：
深度剖析 本题考查凝胶色谱法原理。根据分子筛效应可知，相对分子质量较大的蛋白质分子通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量最小的分子最后流出，故选B。
答案 B
特别提醒 血红蛋白的分离方法及相关原理比较：
方法 原理
凝胶色谱法 根据相对分子质量的大小分离蛋白质
电泳法 根据各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同进行分离
【例2】 下图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是 ( )。
血红蛋白提取和分离的实验操作
A．首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质
B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质
C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集
D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动
思维导图：
深度剖析 用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。
答案 B
[归纳整合]蛋白质的提取和分离
步骤 操作
样品处理 通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集到血红蛋白溶液
粗分离 通过透析法去除血红蛋白溶液中的相对分子质量较小的杂质
纯化 通过凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质
纯度鉴定 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求
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旁栏思考题
你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？
答案 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。
因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。
练习
1．解析 本题考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理。该方法的原理的核心是利用了不同体积(大小)的蛋白质在凝胶中的迁移速度不同以达到分离的目的。
答案 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。
相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同相对分子质量的蛋白质分子可以获得分离。
2．答案 在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
缓冲溶液通常是由一或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内反应过程完全相同的pH。
3．解析 本题考查电泳法分离蛋白质的原理。此方法的核心是利用电场力使带电性质不同或体积不同的蛋白质分离。
答案 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
4．解析 从生物材料中分离生物大分子的方法较为复杂，因为生物材料中含有的成分非常复杂，需要逐一除去。
答案 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
5．答案 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
