植物组织培养

课件51张PPT。推荐教材及参考书周吉源主编：植物细胞工程
李志勇主编：细胞工程
潘瑞炽主编: 植物细胞工程
肖尊安,祝扬 译: 植物组织培养导论 主要学术刊物Biotechnology
Biotechnology advances
Biotechnology and bioengineering
Biotechnology letters
Journal of biotechnology
Plant biotechnology
Plant biotechnology journal
Plant biotechnology reports
Plant cell, tissue and organ culture
Plant cell reports
Plant tissue culture
In vitro cellular and developmental biology-plant基本概念: 愈伤组织原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。
在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞 。基本概念: 外植体用来进行离体无菌培养的离体材料:
器官:根、茎、叶、花、果实、种子等；
组织：
细胞：
原生质体：离体培养中存在着两种形态发生途径形态发生：植物个体发育或再生过程中，植物器官或机体形态结构的发生与形成过程。
离体培养中的形态发生途径：
?器官发生途径：
?胚胎发生途径（胚状体途径）：外植体愈伤组织芽根植株器官发生途径愈伤组织在不同条件下诱导下分别形成芽和根，成为再生植株；
外植体可以不经过愈伤组织直接形成芽。诱导诱导诱导诱导外植体愈伤组织胚状体植株胚状体途径愈伤组织在一定的诱导条件下胚状体，由胚状体发育成再生植株；
外植体可以不经过愈伤组织直接形成胚状体。诱导诱导诱导胚状体概念：
?植物离体培养中；
?起源于一个非合子细胞；
?经过胚胎发生和胚胎发育过程；
?具有双极性的胚状结构。
发育过程类似合子胚：球形胚状体、心形胚状体、鱼雷形胚状体。 Muruganantham 等2010 Black gram 的胚状体途径植物细胞工程的应用无性系快速繁殖：
生产无病毒植株：
遗传操作：无性系变异、单倍体诱导、体细胞杂交、遗传转化。
种质资源保存：
次生代谢产物生产：
发育生物学等方面的基础研究：植物细胞工程实验室简介 准备室 接种室 培养室主要设备基本功能配制培养基
初步处理实验材料
实验观察与分析接种等无菌操作无菌离体培养实验台、试剂柜、冰箱、天平、磁力搅拌器、酸度计、高压灭菌锅、分装设备等（常规生物学实验室）超净工作台
紫外灯等培养架、控温控湿系统、照明系统、暗培养箱、摇床等其它空间洗涤室
灭菌室
组织与细胞学分析室如果有条件，这些区域应从准备室分离出来。基本操作培养基配制
外植体选择与处理
接种
培养
炼苗与移栽
观察与记载培养基常用培养基简介
培养基的主要成分
培养基的配制
培养基的成分无机营养成分（以无机盐的形式提供）：
大量元素: N, P, K, Ca, Mg, S。需要量大于0.5mM。
微量元素: Fe, Mn, Zn, B, Cu, Mo, Cl。需要量小于0.5mM。
非必须元素: I, Co, Ni, Ti, Be, Al。常被列在微量元素中。
有机营养成分：
碳源: 蔗糖等。
维生素类：B族维生素（盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸等），叶酸、肌醇等。
氨基酸：Gly, Gln, Asn, Cys, Arg, 水解乳蛋白、水解酪蛋白。
其它附加物：椰子汁，酵母提取物等。培养基成分：植物生长调节物质生长素类：IAA, NAA, 2,4-D, IBA, 2,4,5-T。
愈伤组织诱导、胚状体产生；
诱导不定芽、不定根形成（与细胞分裂素协同作用）。
细胞分裂素类: KT, 6-BA, ZT, 2iP, TDZ。
促进细胞分裂、器官分化；
延缓衰老；
抑制顶端优势、促进侧芽生长；
与生长素协同作用，诱导不定芽、不定根形成。
赤霉素类: GA3。培养基成分：附加成分及凝固剂附加成分：
活性炭: 吸附有害物质，防止培养物褐化。
渗透剂：蔗糖、甘露醇。
硝酸银：抑制乙烯活性。
抗生素： 防止内生菌引起的污染。
凝固剂：琼脂（0.8%左右），phytagel。基本培养基：无机营养、有机营养（不包括碳源）大量元素MgSO4.7H2O含量（mg/L）MS培养基的营养成分KH2PO4NH4NO3KNO3CaCl2.2H2O44016501900170370FeSO4.7H2ONa2EDTA.2H2O37.327.8微量元素之铁盐微量元素：其它H3BO3含量（mg/L）MS培养基的营养成分MnSO4.4H2ONa2Mo4.2H2OZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O0.0250.258.622.36.2CoCl2.6H2OKI0.830.025能源物质蔗糖含量（g/L）MS培养基的营养成分30有机添加物盐酸硫胺素含量（mg/L）MS培养基的营养成分盐酸吡哆醛烟酸0.50.50.5肌醇100甘氨酸2pH值 5.8培养基的配制：母液配制大量元素母液：10x 或者 20x。按一定顺序称量，依次溶解(避免产生沉淀)。最后定容。不可一次全部加入，再溶解
微量元素母液: 1000x。称量极小，可先配106x,再释成1000x。
铁盐母液（EDTA-Fe2+）: 200x。在两个分别溶解FeSO4和Na2-EDTA, 加热到50-60C， 在搅拌下将FeSO4缓慢倒入Na2-EDTA中，继续搅拌至室温，定容。否则保存过程中会出现结晶。培养基的配制：母液配制有机营养成分母液：1000x。
肌醇母液: 10x
植物激素母液: 0.1~1 mg/ml。
生长素类先用0.1M NaOH溶解，再用ddH2O定容。
细胞分裂素类：先用1M HCl溶解，再用ddH2O定容。
GA3：95%乙醇配制。
另外，部分生长调节剂也可用乙醇配制。大量元素MgSO4.7H2O配制1L 10x母液的用量（g）含量（mg/L）MS培养基的营养成分KH2PO4NH4NO3KNO3CaCl2.2H2O备注440165019001703704.4016.5019.001.703.70√√√√√微量元素H3BO3配制1L 1000x母液的用量（g）含量（mg/L）MS培养基的营养成分MnSO4.4H2ONa2Mo4.2H2OZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O备注0.0250.258.622.36.20.0250.258.6022.306.20√√√√√CoCl2.6H2OKI0.830.0250.830.025√√大量元素/FeFeSO4.7H2O配制1L 200x母液的用量（g）含量（mg/L）MS培养基的营养成分Na2EDTA.2H2O备注37.327.87.465.56√√注：微量元素中的Fe单独配制有机添加物盐酸硫胺素配制1L 1000x母液的用量（g）含量（mg/L）MS培养基的营养成分盐酸吡哆醛烟酸备注0.50.50.50.50.50.5√√√注：有机添加物中的肌醇和甘氨酸母液单独配制有机添加物肌醇配制1L 10x母液的用量（g）含量（mg/L）MS培养基的营养成分备注1001√有机添加物配制1L 1000x母液的用量（g）含量（mg/L）MS培养基的营养成分甘氨酸备注22√注：此处甘氨酸可以与前面1000x的有机添加物配在一起培养基的配制：工作培养基配制称量熔化琼脂：3/4体积的水，加热，搅拌。
称量、溶解蔗糖：搅拌。
按顺序加入所需要的大量、微量、铁盐、有机、肌醇、附加成分、激素母液。边加边搅拌。
调pH值：5.6-5.8。pH计, pH试纸均可。充分搅拌。
分装*：锥形瓶、培养瓶等。
包装：
灭菌：121C，20分钟。超过1升的大体积液体灭菌时间应延长,具体参见灭菌锅说明。注意：如果用培养皿倒平板分装，则最后一步进行。外植体预处理带菌的外植体需要预处理后才能进入接种室：挑选、清洗
接种接种准备
接种接种准备工作接种室与超净工作台的消毒：紫外照射、甲醛熏蒸、酒精喷雾等。
超净工作台内进行的消毒：
镊子、剪刀、解剖针、接种铲等用品消毒：70%乙醇浸泡、火焰灭菌。
人员消毒：洗手、酒精棉球擦拭等。
外植体消毒：0.5-10%次氯酸钠、0.1-1%HgCl2、70%酒精等。消毒后要用无菌水清洗外植体至少3次。用灭菌滤纸吸去多余水份。接种将外植体切成小块：灭菌培养皿中进行。
将外植体转移到培养基上。
封口。注意事项， 从进入超净工作台开始：
不要说话；
其他人员不要在超净台附近走动；
不要打开电扇等导致空气流动的设备；
不要接听手机等。培养无菌
恒温
恒湿
光照：
弱光。
有的材料培养需要避光：暗培养。
有的材料对光长、光质有要求。继代与扩增继代培养：对来自于外植体所增殖的培养物通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养。
目的是增加培养物的数量、改善培养物的质地、或者使培养物保持在某种状态。 炼苗与移栽炼苗：开盖、转入液体培养、水中培养。
移栽：锻炼过的苗移入土中培养。
从无菌到有菌
光照、温度 恒定到不恒定
湿度饱和到不饱和
异养到自养观察、记录1-10天内，每天检查，清除污染瓶；
定期观察外植体形态变化；
显微观察胚状体等发生。
记录下每次观察的结果。