高中生物苏教版（2019）选择性必修3第三章 第一节　第3课时　目的基因的获取、DNA的粗提取和鉴定、基因表达载体的构建（98张PPT）

(共98张PPT)
第3课时　目的基因的获取、DNA的
粗提取和鉴定、基因表达
载体的构建
1.简述目的基因的获取方法。
2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
3.概述DNA的粗提取和鉴定的原理及过程。
学习目标
1.科学思维：归纳基因表达载体构建对限制酶的选择
依据。
2.科学探究：尝试进行DNA的粗提取和鉴定。
素养要求
内容索引
网络构建
课时对点练
一、目的基因的获取
二、DNA的粗提取和鉴定
三、基因表达载体的构建
一、目的基因的获取
1.基因工程的基本操作程序
包括 、 、___________________
，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
2.目的基因的获取
(1)通过化学合成法直接合成目的基因
①比较小的目的基因：在明确 后，可以通过DNA合成仪直接人工合成。
教材梳理
预习新知　夯实基础
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体
细胞
脱氧核苷酸序列
②全基因或较大基因
a.方法：使用 的方法。
b.合成过程
ⅰ.合成基因的部分_________
片段。
ⅱ.适当条件下退火得到 复合体。
ⅲ.在 存在的条件下，通过 酶将双链DNA的突出5′端补平，合成相应的互补链，再用相应的 修复缺口，获得两条完整的互补双链。
半合成
寡核苷酸
模板—引物
dNTP
Klenow
DNA连接酶
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库
a.概念：含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
b.构建过程
将提纯的原核生物或者真核生物的基因组DNA ―→随机片段
体外 得到一组含有不同DNA片段的____
分子群体。
c.筛选：一般采用 的方法，将某基因的 作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。
酶解
重组
重组
DNA
核酸探针杂交
已知片段
②cDNA文库
a.构建：从组织细胞中提取 ， 成cDNA，与适当载体连接后_____宿主。
b.概念：包含着某种细胞全部 信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
c.构建合适的cDNA文库已成为获取 目的基因的常用方法。
mRNA
逆转录
转化
mRNA
真核生物
(3)获得基因组DNA或mRNA的基本过程
细胞使核酸分子释放出来
↓
从释放出来的细胞成分中 核酸分子
↓
获得核酸分子
(4)质粒DNA的提取：先用 获取质粒，再提取质粒DNA。
(5)纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在_____
方面的差异。
裂解
分离
纯化
碱裂解法
理化
性质
(1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成
(　　)
(2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶(　　)
(3)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因(　　)
(4)cDNA文库含有该生物的所有基因(　　)
判断正误
√
√
√
×
核心探讨
根据提供的资料和所学内容，讨论并回答下列问题。
资料　真核生物的基因结构及转录和加工过程图。
突破重难　强化素养
(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？
提示　由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库仅(cDNA文库)含该生物的部分基因。
(2)根据提供的资料，推测cDNA文库与基因组文库相比，得到的基因中不含有哪些结构？
提示　不含有启动子、终止子、内含子等结构。
核心归纳
1.目的基因的获取方法
(1)化学合成法
①基因比较小且已知其序列用化学合成法直接人工合成。
②全基因或较大基因使用半合成的方法，可以降低成本，有利于普及采用。
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库(含某生物的全部基因)
供体生物→全部DNA→DNA片段→体外重组→受体菌群。
②cDNA文库(含某生物的部分基因)
供体生物→mRNA→cDNA→体外重组→受体菌群。
2.基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子(具有启动作用的DNA片段) 无 有
基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段) 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间的基因交流 可以 部分基因可以
典题应用
1.(2021·南京月考)甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是
A.甲方法可建立该细菌的
基因组文库
B.乙方法可建立该细菌的
cDNA文库
C.甲方法中的b过程要以脱氧核苷酸为原料
D.乙方法需要逆转录酶参与
及时反馈　知识落实
√
乙图表示用逆转录法获得的DNA分子，只包含该生物的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B正确；
甲方法中，只要利用限制性内切核酸酶将其原有的DNA切断即可，不需要脱氧核苷酸为原料，C错误；
乙方法中d为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。
解析　甲图获取的是该细菌的全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A正确；
2.(2021·青岛质检)下列关于基因工程及应用的叙述，正确的是
A.从cDNA文库中能获取某种生物的全部基因
B.一种核酸探针能从基因组文库中筛选出多种基因
C.利用半合成法合成全基因时只需要DNA连接酶的作用
D.构建cDNA文库需要用到逆转录酶
√
解析　从cDNA文库中只能获取某种生物的部分基因，从基因组文库中才能获取某种生物的全部基因，A错误；
一种核酸探针只能筛选出一种基因，B错误；
利用半合成法合成全基因时需要Klenow酶和DNA连接酶的作用，C错误。
二、DNA的粗提取和鉴定
1.DNA的粗提取
教材梳理
预习新知　夯实基础
柠檬酸钠
蒸馏水
蒸馏水
DNA
2.DNA的鉴定
(1)原理：在 条件下，DNA与 发生反应，溶液呈 。
(2)步骤：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol·L－1的 溶液中，使其溶解，再加入 ， 加热数分钟，溶液出现 。
酸性
二苯胺
蓝色
二苯胺试剂
NaCl
沸水浴
蓝色
(1)在DNA提取液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，可以使DNA析出(　　)
(2)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色(　　)
判断正误
√
×
核心探讨
根据DNA粗提取和鉴定的过程及提供的资料，讨论并回答下列问题。
资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线
突破重难　强化素养
资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。
(1)能否选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？为什么？
提示　不能；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和各种细胞器，无DNA分子。
(2)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用相同吗？如不相同，分别分析其目的。
提示　实验中两次加入蒸馏水的目的不相同；第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。
(3)根据资料2中DNA和蛋白质在酒精中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？
提示　向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量的、冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。
核心归纳
1.实验材料的选取
(1)一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
(2)该实验中不能选用猪血等哺乳动物的血，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器。
2.DNA的粗提取和鉴定的实验操作流程
步骤 图示 具体操作 讨论
破碎细胞 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌 搅拌时应该沿一个方向搅拌，且不能太猛烈，防止破坏DNA分子
提取核物质 纱布过滤、取滤液 滤液中含有DNA、蛋白质
溶解细胞核内的DNA 在含DNA的滤液中加入物质的量浓度为2 mol·L－1的NaCl，搅拌均匀，并过滤除去不溶的杂质 在物质的量浓度为2 mol·L－1的NaCl溶液中DNA分子的溶解度大，能充分溶解DNA且能除去部分不溶杂质
析出含DNA的黏稠物 缓慢加入蒸馏水，并用玻璃棒轻轻搅拌，当黏稠物不再增加时，停止加水 当黏稠物不再增加时，此时的NaCl溶液的物质的量浓度应该接近0.14 mol·L－1，在0.14 mol·L－1的NaCl溶液中，DNA溶解度最小
3.DNA的粗提取和鉴定实验中的注意事项
(1)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
(2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。
(4)在鸡血中加入柠檬酸钠防止血液凝固。
(5)提取含有杂质较少的DNA时，应加入冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，因为DNA不溶于乙醇，细胞中某些蛋白质可溶于乙醇，进一步提纯DNA，且冷却的乙醇可以防止DNA降解，易形成沉淀，增加DNA的柔韧性，减少断裂。
典题应用
3.下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验原理的叙述，正确的是
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的升高而减小
B.利用DNA不溶于乙醇的性质，可除去细胞中溶于乙醇的物质而得到较
纯的DNA
C.DNA是大分子有机物，易溶于水也溶于某些有机溶剂
D.在沸水浴中，DNA遇二苯胺试剂会出现紫色反应
及时反馈　知识落实
√
解析　随NaCl溶液浓度的升高，DNA的溶解度先降低后升高；DNA不溶于乙醇等有机溶剂；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂后呈现蓝色。
4.在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，实验原理是DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。DNA的溶解和析出与图中所示曲线的对应点符合的是
A.a点浓度最适合析出DNA
B.b点浓度最适合析出DNA
C.c点浓度最适合溶解DNA
D.d点浓度最适合析出DNA
√
解析　用高浓度的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质，用低浓度的NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质，因此，反复溶解、析出DNA能除去与DNA溶解度不同的杂质。从题图可知，DNA在物质的量浓度为0.14 mol·L－1的NaCl溶液中(b点)的溶解度最小，因此最适合析出DNA，但是随着NaCl溶液浓度的增大或减小，DNA溶解度均逐渐增大。
三、基因表达载体的构建
1.基因表达载体构建的目的
(1)使目的基因进入受体细胞并 。
(2)使目的基因能稳定存在且 给后代。
教材梳理
预习新知　夯实基础
有效表达
遗传
2.基因表达载体的组成
启动子
终止子
标记
上游
RNA聚合酶
下游
转录
筛选
受体细胞
复制并遗传
3.载体的种类
(2)有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。
克隆
表达
调控元件
(1)构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶(　　)
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　)
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　)
判断正误
√
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√
核心探讨
1.结合基因表达载体模式图分析以下问题：
(1)图中a、b、c分别代表什么结构？
突破重难　强化素养
提示　a为启动子、b为终止子、c为复制原点。
(2)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？
提示　不是一回事，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分。而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
(3)为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？
提示　启动子位于目的基因的首端使转录开始，是RNA聚合酶识别、结合的部位；终止子位于目的基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
2.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序列及切割位点
(1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？
提示　不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
(2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
提示　可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
(3)用合适的限制酶切割完质粒和含目的基因的DNA片段后，怎样处理才能将目的基因和质粒重组在一起？
提示　用DNA连接酶处理酶切产物。
(4)请概括基因表达载体的构建过程。
提示　如图所示
核心归纳
1.如何选择限制酶
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。
(3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达，即酶切位点应位于启动子与终止子之间。
2.基因表达载体的构建过程
典题应用
5.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是
A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B.具有启动子，作为核糖体识别、结合的部位
C.具有标记基因，有利于重组DNA的鉴定和选择
D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
及时反馈　知识落实
√
解析　基因表达载体具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增，A正确；
基因表达载体具有启动子，是RNA聚合酶识别、结合的部位，B错误；
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因。所以基因表达载体具有标记基因，有利于重组DNA的鉴定和选择，C正确；
基因表达载体具有目的基因，以获得特定的基因表达产物，D正确。
6.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和
HindⅢ切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中
全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向
连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
解析　切割目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；
在酶切过程中，不能破坏质粒中全
部的标记基因，至少需保留其中的
一个，B正确；
用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
网络构建
课时对点练
题组一　目的基因的获取
1.从人的胰岛B细胞中提取出总RNA，经逆转录后得到cDNA，以cDNA为模板，利用PCR扩增目的基因，无法得到的是
A.胰岛素基因 B.呼吸酶基因
C.RNA聚合酶基因 D.生长激素基因
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对点训练
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解析　胰岛素基因、呼吸酶基因和RNA聚合酶基因在胰岛B细胞中都会表达，因此胰岛B细胞中有这些基因的mRNA，经过题干步骤可获得这三种基因，A、B、C错误；
生长激素基因在胰岛B细胞中不表达，因此胰岛B细胞中没有该基因的mRNA，经过题干步骤不能获得该基因，D正确。
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2.观察分析右图，该图表示的过程是
A.构建基因组文库
B.构建cDNA文库
C.构建基因表达载体
D.构建转基因工程菌
√
解析　由图可知，该过程利用的是某种生物的基因组DNA，用限制酶切割后，与载体连接注入到受体菌中，该过程是构建基因组文库，故A正确。
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3.下列关于基因文库的说法中，正确的是
A.cDNA文库中的基因也有启动子
B.一种生物的cDNA文库只有一种
C.基因组文库的基因都可以在物种间进行基因交流
D.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因
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解析　cDNA文库中的基因都没有启动子，只包含基因中的外显子，A错误；
由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误、D正确；
由于生殖隔离，基因组文库的基因在不同物种之间不能进行基因交流，C错误。
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4.(2021·福建南平市高三二模)为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是
A.用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取
B.逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料
C.经逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子
D.逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则
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解析　胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此只能从胰岛B细胞中获取，A正确；
逆转录过程是以RNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误；
真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了内含子和启动子，因此逆转录得到的基因不含启动子和内含子，C正确；
逆转录获取目的基因是利用碱基互补配对原则获得DNA链，D正确。
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5.(2021·黑龙江双鸭山市一中高二月考)下列有关基因工程基本操作程序的叙述正确的是
A.核酸探针杂交的方法不遵循碱基互补配对原则
B.所有的目的基因都可以从基因文库中直接获得
C.若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过人工合成的方法获取
D.抗生素合成基因作为标记基因，可鉴别目的基因是否导入受体细胞
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解析　核酸探针杂交方法的原理是碱基互补配对原则，A错误；
不是所有的基因都可以从基因文库中直接获得，B错误；
若目的基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成，C正确；
载体上的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞，D错误。
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题组二　DNA的粗提取和鉴定
6.(2021·山东济宁高二期中)多种实验材料都可以用于DNA的粗提取和鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果，下列操作正确的是
A.向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA
B.经研磨过滤后，将研磨液离心5分钟，取沉淀物进行下一步操作
C.冷却的体积分数为95%的乙醇溶液可以溶解某些蛋白质，得到粗提取
的DNA
D.将DNA溶于NaCl溶液后，加入现配的二苯胺试剂，混合均匀即可出现
蓝色
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解析　香蕉果肉组织细胞有细胞壁保护，因此加蒸馏水搅拌不会破坏细胞，不能将DNA释放出来，A错误；
经研磨过滤后，将研磨液离心5分钟，取上清液进行下一步操作，B错误；
DNA不溶于乙醇，因此可用体积分数为95%的冷乙醇溶解某些蛋白质析出DNA，获得较纯净的DNA，C正确；
在沸水浴中，DNA遇二苯胺会出现蓝色反应，D错误。
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7.如图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是
A.图①的原理是DNA不溶
于乙醇，而某些蛋白质
可溶于酒精
B.图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并
保持结构完整
C.若图③操作后接图②操作，则DNA会留在滤液中
D.若图④操作后接图②操作，则DNA会留在纱布上
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解析　DNA不溶于乙醇，95%的冷乙醇凝集效果最佳，所以图①的原理是DNA不溶于乙醇，某些蛋白质可溶于乙醇，以便除去溶于乙醇的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；
图①玻璃棒逆时针方向搅拌，目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒顺时针方向搅拌，目的是加速细胞吸水破裂，B错误；
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图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；
图④操作是去除滤液中的杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。
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解析　基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的首端，所以X最可能是启动子，B正确。
题组三　基因表达载体的构建
8.如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是
A.目的基因插入位点 B.启动子
C.标记基因 D.DNA聚合酶识别位点
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9.在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要
①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶　③RNA聚合酶　④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸
A.③⑥ B.②④ C.①⑤ D.①②④
解析　构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。
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10.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是
A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶
B.抗虫基因表达载体中要有起始密码子
C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的
受体细胞
D.抗虫基因的表达开始于复制原点
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√
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解析　切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A项错误；
抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，起始密码子位于mRNA上，B项错误；
基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C项正确；
抗虫基因的表达开始于启动子，D项错误。
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选择题11～12题为单选题，13～16题为多选题。
11.蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。近期，中国科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。
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综合强化
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A.为防止目的基因自身环化，可以用限
制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
B.构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的
启动子利于目的基因在家蚕丝腺细胞
中表达
C.启动子是RNA聚合酶识别、结合的部位，可以驱动遗传信息的复制和
转录
D.基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体
细胞
√
下列有关说法错误的是
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为能从蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在蚕丝腺细胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于目的基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；
启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误。
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解析　用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止目的基因自身环化，A正确；
18
12.在基因工程中利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建基因表达载体。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是
A.构建基因表达载体时，可用BglⅡ
和Sau3AⅠ切割目的基因所在片
段和P1噬菌体载体
B.构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬
菌体载体
C.图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
D.用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，
只能产生一种重组DNA
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解析　由题图可知，BglⅡ、Sau3AⅠ及EcoRⅠ三种酶在目的基因和P1噬菌体上都有酶切位点，且Sau3AⅠ的酶切位点在EcoRⅠ的左侧，故可用BglⅡ和Sau3AⅠ或EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，A、B项正确；
从图乙知P1噬菌体载体为环状DNA，只用EcoRⅠ切割后产生两条反向双螺旋链状DNA，含有2个游离的磷酸基团，C项正确；
用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，能产生不止一种重组DNA，D项错误。
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13.下表关于DNA粗提取和鉴定实验的表述，正确的是
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选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA
B 物质的量浓度为2 mol· L－1 NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA
C 冷却的、体积分数为95%的乙醇 加入到离心后的上清液中 溶解DNA
D 二苯胺试剂 加入到溶解有DNA的NaCl溶液中 鉴定DNA
√
√
√
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解析　DNA粗提取的第一步就是加入研磨液充分研磨，A正确；
DNA在不同浓度的NaCl溶液中DNA溶解度不同，DNA在物质的量浓度为2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度较大，使用物质的量浓度为2 mol·L－1的 NaCl溶液能溶解DNA，B正确；
DNA不溶于乙醇溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于乙醇，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C错误；
在沸水浴加热条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，D正确。
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14.下图是基因文库的构建和获取目的基因的示意图。下列叙述不正确的是
A.通过该途径只能获得
该生物的部分基因
B.①过程通常只用一种
DNA酶切割全部DNA
C.②过程需要DNA连接酶的作用
D.④过程可用相应抗体，利用核酸分子杂交技术获取目的基因
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解析　该过程为基因组文库的构建过程，基因组文库包含该生物的所有基因，A错误；
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①过程使用限制酶，其识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列，B错误；
②需用到DNA连接酶，C正确；
④过程可用特定的基因探针，利用核酸分子杂交技术获取目的基因，D错误。
18
15.如图是利用基因工程技术生产某动物疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列有关说法正确的是
A.表达载体构建时需要用到EcoRⅠ、
PstⅠ限制性内切核酸酶
B.一种限制性内切核酸酶只能识别
一种特定的核糖核苷酸序列
C.除图示标注的结构外，表达载体
中还应有启动子和终止子等
D.在含有卡那霉素抗性基因的培养基上可筛选出含有抗原基因的受体细胞
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图中含有目的基因、抗性基因，在基因表达载体中还需要启动子和终止子等结构，C正确；
在含有卡那霉素的培养基上可筛选出含有抗原基因的受体细胞，D错误。
解析　目的基因上只有三种限制酶的切点，SmaⅠ会破坏目的基因，故构建表达载体时需要用到EcoRⅠ、PstⅠ限制性内切核酸酶，A正确；
一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核糖核苷酸序列，B错误；
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16.(2021·江苏淮安市高二月考)下图为某种cDNA基因的制作流程图，下列相关叙述错误的是
A.催化①②过程的酶都能促进
双链间氢键的形成
B.核酸酶H能催化杂交双链上
的磷酸二酯键断裂
C.该双链DNA上不含与RNA聚合酶结合的碱基序列
D.该双链DNA在PCR仪中扩增时需要核酸酶H
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据图可知，核酸酶H能催化杂交双链转变成单链DNA，作用的是氢键，B错误；
RNA聚合酶结合位点在DNA的非编码序列上，而cDNA的制作过程是以RNA为模板形成的，不含非编码序列，所以该双链DNA上不含与RNA聚合酶结合的碱基序列，C正确；
该双链DNA在PCR仪中扩增时需要Taq酶，但是不需要核酸酶H，D错误。
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解析　催化①②过程的酶分别是逆转录酶和DNA聚合酶，作用都是催化形成磷酸二酯键，A错误；
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17.(2021·江苏苏州市高二期中)科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p—B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p—B质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶
识别序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是AG↓CT、T↓CTAGA、AAT↓ATT、C↓AATTG。请分析并回答下列问题：
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(1)为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取________。再通过_______合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是_________________________________
______________________。
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AH基因在其他组织细胞中不表达，提
mRNA
逆转录
取不到AH基因的mRNA
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解析　AH基因的cDNA可以通过逆转录获得，因此需要先从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取mRNA，再逆转录合成出AH基因的cDNA。由于AH基因在其他组织细胞中是不表达的，因此若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功。
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(2)若已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5′－AACTATGCGC……
CGTAGCCTCT－3′，请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)，并标明5′端和3′端：_______________________、_________________________。一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为____个。
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5′－AACTATGCGC－3′
5′－AGAGGCTACG－3′
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解析　根据题意分析，已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5′－AACTATGCGC………CGTAGCCTCT－3′，则其在利用PCR技术进行扩增时需要两种不同的引物，且引物与目的基因(双链)两侧的碱基序列是互补的，因此两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)为5′－AACTATGCGC－3′、5′－AGAGGCTACG－3′。PCR技术的原理是
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双链DNA的复制，则一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量＝21＋22＋23＋24＝30(个)。
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(3)利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用限制酶__________
______双酶切质粒，再选用限制酶______________切割目的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经____________处理后，再与大肠杆菌混合培养。
AiuⅠ和
MfeⅠ
SspⅠ和MfeⅠ
DNA连接酶
解析　根据以上分析已知，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，切割质粒的酶应该是AiuⅠ和MfeⅠ，切割目的基因的酶应该是SspⅠ和MfeⅠ。
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18.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
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限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ
识别序列及切割位点
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(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有___个游离的磷酸基团。
2
解析　质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有2个游离的磷酸基团。
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(2)根据限制酶识别和切割的位点，应选择________________酶对质粒和含目的基因的外源DNA进行切割。用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能用BamHⅠ切割，原因是_________________________________
____________________________________。
EcoRⅠ、SmaⅠ
BamHⅠ会破坏外源DNA中目的基因
的结构和质粒中抗生素抗性基因的结构
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解析　由图1可知，质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因都含有BamHⅠ的切割位点，用BamHⅠ会破质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因，故根据限制酶识别和切割的位点，应选择EcoRⅠ、SmaⅠ酶对质粒和含目的基因的外源DNA进行切割。
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(3)通过PCR技术扩增目的基因时，加入的引物有A、B两种，引物A、B序列设计的依据是______________________________，若该目的基因扩增4代，则需要消耗引物A____个。
目的基因两端的部分核苷酸序列
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解析　通过PCR技术扩增目的基因时，加入的引物有A、B两种，引物A、B序列是依据目的基因两端的部分核酸序列来设计，若将1个含目标片段的DNA分子经PCR反应循环n次后，共需要消耗引物的数量为2×2n－2＝2(2n－1)，则若将1个目的基因扩增4代，则需要引物的数量为2(24－1)＝2×15＝30(个)，其中引物A和引物B各15个。
18
(4)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成____种环状DNA。重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了__________________
___________________________。
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鉴定和选择含有目的
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解析　在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，形成的含有2个酶切位点的片段有2种，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成3种环状DNA，重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了鉴定和选择含有目的基因(或重组质粒)的受体细胞。
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本课结束