高考分类练&模考预测：7.1基因工程和细胞工程（含解析）
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| 名称 | 高考分类练&模考预测：7.1基因工程和细胞工程（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.4MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-02-26 21:08:19 | ||
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文档简介
高考分类练+模考预测（明考向|强能力）
第1讲 基因工程和细胞工程
题组一 高考分类练 明考向
类型1 翻阅教材，原味品高考非选择题
1．[2021·全国卷甲]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与
__________________________________________________________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________________________________
__________________________________________________________
________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
高考VS教材
小题号 相关教材原文 教材页码
(2) [选修3] P10
(3) [选修3] P10
(4) [选修3] P10
2.[2020·全国卷Ⅰ，38]为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。
回答下列问题：
(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是__________________________________________________________。
(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于________，使用该培养基进行细胞培养的结果是________________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是____________________。
(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有______________________________________________________(答出2点即可)。
高考VS教材
[人教选修3]P44
[人教选修3]P54
3．[2019·全国卷Ⅱ]植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。回答下列问题。
(1)植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有____________________________________________________________________(答出2点即可)。
(2)通过组织培养技术，可把植物组织细胞培养成胚状体，再通过人工种皮(人工薄膜)包装得到人工种子(如图所示)，这种人工种子在适宜条件下可萌发生长。人工种皮具备透气性的作用是____________________________________。人工胚乳能够为胚状体生长提供所需的物质，因此应含有植物激素、__________________和________________等几类物质。
(3)用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物的________________进行组织培养。
(4)植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是________________________________________________________________(用流程图表示)。
高考VS教材
[人教选修3]P38
[人教选修3]P40
[人教选修3]P39
[人教选修3]P42
4．[2019·全国卷Ⅲ]培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。
回答下列问题。
(1)利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。用分化的植物细胞可以培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有__________________________________________________________。
(2)步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是________________________________________。
(3)从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是____________________________________________________________________。在新的培养基上愈伤组织通过细胞的________________过程，最终可形成试管苗。
(4)步骤⑥要进行照光培养，其作用是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(5)经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的________________，这种繁殖方式属于________________繁殖。
高考VS教材
[人教选修3]P33
[人教选修3]P35
[人教选修3]P38
【借题发挥】理清教材，突破高考的瓶颈——长句描述类题型
问题1：启动子与起始密码、终止子与终止密码有何区别？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
问题2：切割目的基因和载体必须均使用同一种限制酶切割吗？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
问题3：为何用未受精卵母细胞作细胞核移植的受体细胞？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
问题4：细胞融合后，融合细胞中的染色体数、染色体组数应如何计算？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
类型2 整体对比历年同类题，找共性和趋势
5．[2017·全国卷Ⅱ]几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________________________________________。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________________________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________________________________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是__________________________________________________________。
6. [全国卷Ⅰ，40]某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________；并且__________和__________________________________________________________
的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自__________。
类型3 它山之石——亦可攻玉
7．[2021·广东卷]非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有______________________。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有______________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备________________________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是______________________。在分子水平上，可以通过改变__________________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
8．[2021·山东卷]人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是________________________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于____________________________________________，理由是
__________________________________________________________
____________________________。
9．[2020·江苏卷，33]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得________；Taq DNA聚合酶的作用是催化__________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′－AACTATGCG?????? AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG??????CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT??????TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC??????CGAGTAC－3′
10．[2020·江苏卷，28]新型冠状病毒可通过表面的刺突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题：
(1)图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被________细胞表面的受体识别后激活该细胞。
(2)B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的________，形成________细胞。
(3)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的________；采集血液样本主要用于血清学检查，检测__________。
(4)据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射________免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得________细胞。因为同一种抗原可能激活________细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。
11．[2020·山东卷，25]水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_____________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是__________________________。
12．[2019·海南卷]人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经__________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
13．[2019·天津卷]B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________(单选)。
A.含B基因的染色体缺失
B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变
D．B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能)，然后构建重组表达载体。
(3)在过程①、②转化筛选时，过程______________中T－DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程________________在培养基中应加入卡那霉素。
(4)获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是__________(多选)。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明______________________________。
14．[2019·江苏卷]图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________、________________________。
菌落类型 平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
[命题揭秘]
从近五年高考统计看，对基因工程考查明显多于其他工程技术，考查角度侧重于基因工程的工具及其特点，基因工程操作程序尤其是基因表达载体的构建与目的基因检测、鉴定。对细胞工程的考查仅次于基因工程，考查内容多涉及动物细胞培养与融合技术，体细胞核移植技术(常渗透考查胚胎工程技术)及植物组织培养和体细胞杂交技术。
[命题趋势]
预计2022年高考试题对选修3的考查很可能结合科研实践或科学实践情境，分层设置问题，考查基因工程的基础知识，预计对考生分析问题、解决问题的能力考查将在未来受到重视；细胞工程可能会结合科研实践情境，将本部分知识与其他模块内容相结合，分层设置问题，仍会以细胞培养为基础，与基因工程等其他知识相结合命题的可能性比较大，体现高考试题的综合性和应用性，答题关键语句均源自教材，故精准记忆教材相关内容是解题关键。另外，生态农业、胚胎工程在医疗方面的应用等知识要引起考生关注。
题组二 模考预测练 强能力
预测一 聚焦基因工程
1．[2021·江西省六校高三3月联考]研究人员利用小鼠的单倍体ES细胞(只有一个染色体组)，成功培育出转基因小鼠。其主要技术流程如图所示，请分析回答下列问题：
注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四种限制酶。箭头指向的位置为限制酶的切割位点：Ampr 是氨苄青霉素抗性基因，Neor是 G418 抗性基因。
(1)利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含 dATP、dCTP、 dGTP、dTTP)、引物外，还应含有____________________________；引物应选用下图中的________(填图中字母)，至少需经过________次循环，才能分离得到所需要的 DNA 区段。
注： A、B、C、D是引物，箭头是延伸方向。
(2)在基因工程操作步骤中，过程①②称为________________________。已知氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞， 而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neor的小鼠细胞。结合上图推测，过程①选用的2种限制酶是________(填图中的编号)，③处的培养液应添加____________(填“氨苄青霉素”或“G418”)。
(3)图中桑椹胚需通过____________技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行______________处理。
2．[2021·山西省临汾市高三3月考试]基因X的表达产物可保护损伤的神经细胞。科学家构建了含X的基因表达载体(图1)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请据此回答下列问题：
(1)构建含X的基因表达载体时，应选择图1中的________限制酶。
(2)酶切后的载体和基因X进行连接，可产生3种连接产物：单个载体自连，基因X与载体正向连接、基因X与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种产物，选择EcoRⅠ酶和HindⅢ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是____________、____________、____________。
(3)在培养大鼠神经干细胞的过程中，可使用____________________酶将细胞分散开。分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为________。
(4)将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，可用________技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
3．[2021·河北省武邑中学高三质检]人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。口服α 干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______________________________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了________和________序列，以便于后续的剪切和连接。
(2)过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，过程③中需先用________处理根瘤农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)过程④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________过程获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(4)科研人员认为，将转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好，其依据是__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
[易错警示]
1．使用限制酶的注意点
(1)一般用同种限制酶切割载体和目的基因。
(2)不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。
2．DNA连接酶≠DNA聚合酶
DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
3．限制酶≠DNA酶≠解旋酶
限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶是将DNA水解为脱氧核苷酸；解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
4．启动子、终止子
(1)启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)。
(2)终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。
预测二 聚焦细胞工程
4．[经典高考]某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题：
(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有__________________________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)杂交瘤细胞中有________个细胞核，染色体数目最多是________条。
(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是__________________________。
5．[2021·云南省昆明市高三二模]玉米和高粱均为二倍体，染色体数目均为20条。科研人员经过长期实验，培育出“玉米—高粱”杂种植株。回答下列问题：
(1)科研人员尝试利用________________技术，获得“玉米—高粱”杂种植株。此过程中常用____________________去除细胞壁，获取原生质体。
(2)杂种细胞通过脱分化过程形成____________，继续进行培养，通过________过程形成杂种植株。此过程中杂菌污染会导致培养物死亡，原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________
(答出2点即可)。杂种植株体细胞中最多有________条染色体。
(3)“玉米—高粱”植株的一个体细胞同时具备了玉米和高粱的全部基因，但因为______________________，基因不一定都能够表达。
(4)玉米和高粱染色体数目相同，自然条件下，它们能否________(填“能”或“不能”)相互杂交产生可育后代，理由是________________________________。
第1讲 基因工程和细胞工程
题组一
1．解析：(1)用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。(2)利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是Taq酶。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。(3)要扩增病原菌DNA，设计的引物就应该能和病原菌DNA特异性结合。(4)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。
答案：(1)④②③① (2)热稳定性DNA聚合酶(Taq酶) 延伸 两种引物分别与两条单链DNA模板结合 (3)病原菌DNA (4)一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能在短时间内大量扩增目的基因
2．解析：(1)实验前给小鼠甲注射病毒A，其目的是刺激机体发生免疫反应，从而产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。(2)制备单细胞悬液的主要实验步骤：从健康动物体内取出组织块，剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞，然后用培养液将分散的细胞稀释制成单细胞悬液。(3)图中筛选1采用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)才能生存。图中筛选2含多次筛选，利用抗原与抗体特异性结合的原理，就可获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。(4)要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
答案：(1)诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
(2)取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液 (3)选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性 (4)将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养
3．解析：(1)植物微型繁殖可以保持优良品种的遗传特性，还可以高效、快速、大量繁殖。(2)人工种皮具备透气性，可以保证胚状体进行有氧呼吸时对氧的需求；人工胚乳应该含有植物激素、矿质元素和糖等物质，保证胚状体的正常生长。(3)植物分生区附近(如茎尖)的病毒极少，可以切取茎尖进行组织培养，获得脱毒苗。(4)获得转基因植株，首先要通过细胞的脱分化过程，培养出愈伤组织，再对愈伤组织继续培养，诱导分化形成小植株。
答案：(1)能保持植物原有的遗传特性，繁殖速度快 (2)有利于胚状体进行呼吸作用 矿质元素 糖 (3)茎尖 (4)含目的基因的细胞愈伤组织小植株
4．解析：(1)植物细胞具有全能性，利用已分化的植物细胞通过植物组织培养可以培养成完整植株。(2)形成层细胞分化程度低，全能性较高，更容易诱导形成愈伤组织，进而获得完整植株。(3)愈伤组织的形成和试管苗的分化需要不同的生长素与细胞分裂素比例，因此诱导愈伤组织的形成阶段到分化阶段需要不同的培养基。愈伤组织通过再分化过程，最终可形成试管苗。(4)叶绿素的形成需要光，试管苗的发育也需要光，因此试管苗的诱导阶段需要光照。(5)通过植物组织培养获得植株，属于无性繁殖的一种，可以保持原品种的遗传特性。
答案：(1)全能性(或答：形成完整植株所需的全部基因)
(2)形成层容易诱导形成愈伤组织
(3)诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同 分化(或答：再分化)
(4)诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用
(5)遗传特性 无性
【借题发挥】
问题1：答案：启动子、终止子分别位于目的基因首端与尾端，它们均为DNA片段，而起始密码、终止密码均位于mRNA上，它们是由DNA转录而来，为RNA序列。
问题2：答案：不一定。目的基因和载体可以使用同一种限制酶，也可使用不同限制酶，只要切割后产生的黏性末端能够发生“互补配对”即可。
问题3：答案：①营养丰富。
②体积大，易操作。
③含有使细胞核表达全能性的物质。
问题4：答案：体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管是染色体数、基因型还是染色体组数都采用直接相加的方法。
5．解析：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常
6．解析：(1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具有一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在该培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr，因而能在该培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的培养基上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞(受体细胞)才能完成DNA复制。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
7．解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
8．解析：(1)由题意可知，为了扩增出γ基因上游调控序列及启动子的不同长度的片段，在调控序列及启动子的读取方向上(题图上图中从左至右)需要设计F1～F7多个引物，反向上只需同一个引物R即可。根据图示可知，荧光蛋白基因的终止子位于其左侧，为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物需要插入到荧光蛋白基因的上游(题图下图中荧光蛋白基因右侧)才能发挥作用，结合图中限制酶的作用位置可知，EcoRⅠ能够破坏荧光蛋白基因，NheⅠ位于终止子的下游，二者不能用来切割载体，所以只能用MunⅠ和XhoⅠ来切割载体。由于γ基因上游的调控序列及启动子中也含有MunⅠ和XhoⅠ的识别序列，所以在F1～F7末端不能添加其相应序列。比较图中几种限制酶的识别序列及切割位点可知，MunⅠ和EcoRⅠ切割后所产生的黏性末端相同，XhoⅠ和SalⅠ切割后所产生的黏性末端也相同，所以在F1～F7末端添加限制酶SalⅠ所对应的序列，在R末端添加限制酶EcoRⅠ所对应的序列，这样可将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达。本实验中，产物扩增需要Taq酶，载体构建过程中需要MunⅠ和XhoⅠ来切割载体，需要SalⅠ和EcoRⅠ来切割扩增后的产物，还需要DNA连接酶连接切口，故共需要6种酶。解析：(2) F1～F7与R作为引物扩增的产物可能含有启动子，也可能不含有，受体细胞中含F1～F6与R扩增产物的载体能够表达出荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明这些扩增产物包含完整的启动子部分，而含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，说明该扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。解析：(3)向培养液中添加适量的雌激素后，P启动子能够启动BCL11A基因的表达，产生BCL11A蛋白，若受体细胞中含有BCL11A蛋白结合位点，BCL11A蛋白与该结合位点结合后，会抑制荧光蛋白基因的表达。含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，据此可推测BCL11A蛋白结合位点位于F1～F4的共同部分，即F4所对应调控序列的下游，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，据此可推测F5～F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白结合位点，即BCL11A蛋白结合位点应位于F5所对应调控序列的上游，而γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，所以BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)SalⅠ EcoRⅠ 6
(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
9．解析：(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′(引物②)和5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′(引物④)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
10．解析：(1)图1中，抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒抗原呈递给T细胞，后者识别抗原后被激活，分泌淋巴因子。(2)B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的增殖、分化，形成浆细胞和记忆细胞。(3)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子用于病原学检查时，检测的是病毒的核酸；采集血液样本用于血清学检查时，检测的是抗新冠病毒抗体。(4)为了诱导小鼠产生能够分泌抗S蛋白抗体的B淋巴细胞，实验时需先给小鼠注射S蛋白，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选可获得杂交瘤细胞。因为同一种抗原可能激活多种B淋巴细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。
答案：(1)T (2)增殖、分化 浆细胞和记忆 (3)核酸 抗新型冠状病毒抗体 (4)刺突蛋白(或S蛋白) 杂交瘤 多种B
11．解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
12．解析：(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，T－DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T－DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
答案：(1)mRNA 逆转录酶 PCR
(2)T－DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
13．解析：(1)B基因的启动子无法启动转录，会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取的总RNA，经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程①需将基因表达载体导入农杆菌，所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程②农杆菌感染水稻愈伤组织，农杆菌Ti质粒的T－DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因，正常植株也会出现杂交带，故A错误；B、D选项是检测Luc基因及其产物，B、D正确；C选项检测对象是卵细胞中mRNA，基因的表达具有选择性，故正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA，C正确。(5)一般情况下，水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚，而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚，说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
答案：(1)D (2)精子 cDNA (3)② ① (4)BCD (5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
14．解析：(1)EcoR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，切割后产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
答案：(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接
题组二
1．解析：(1)利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、四种脱氧核苷酸和引物以外，还应含有热稳定性的DNA聚合酶；根据引物的延伸方向可知，应该选择引物A和D，可以扩增2种引物之间的序列。PCR技术操作流程的三个重要步骤是变性、退火、延伸。根据PCR过程特点绘制PCR过程示意图：
由图分析可知：X基因第一次复制得到两个两种：①和②；X基因第二次复制得到四个四种：①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第三次复制得到八个五种：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到十六个五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤，两个⑤得到4个⑤；从上面的推测可知，第三轮循环产物中才能开始出现独立且完整的X基因。即至少需经过三次循环才能分离得到所需要的DNA区段。
解析：(2)过程①②即构建基因表达载体的过程。已知氨芐青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neor的小鼠细胞。故应保留G418抗性基因，过程1应该选用Ⅰ、Ⅱ进行切割，③处的培养液应添加G418，对目的基因进行筛选。(3)图中桑椹胚需通过胚胎移植移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行胚胎移植前需对受体小鼠进行同期发情处理，让供受体处于相同的生理状态。
答案：(1)热稳定性的DNA聚合酶(或Taq酶) A和D 3 (2)基因表达载体的构建 Ⅰ和Ⅱ G418 (3)胚胎移植 同期发情
2．解析：(1)为了让限制酶切出的目的基因和载体切口能发生碱基互补配对而连接起来，通常应选择相同的限制酶对二者进行切割，所以分析图1可知，在构建含基因X的表达载体时，需选择图1中的BamHⅠ限制酶进行酶切。(2)由分析可知，图中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是载体自连、反向连接、正向连接。(3)进行动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。在适宜环境中培养，细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上，称为贴壁生长。(4)分子杂交技术将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，可用分子杂交技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时产生接触抑制，换瓶后进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
答案：(1)BamHⅠ (2)载体自连 反向连接 正向连接 (3)胰蛋白酶或胶原蛋白 细胞贴壁(生长) (4)分子杂交 传代
3．解析：(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列。由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接。(2)基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，因此过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点；微生物细胞作为受体细胞时，需要钙离子处理使其变为感受态细胞，即过程③中需先用Ca2＋处理根瘤农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。(3)在利用反转录法合成目的基因时，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录过程获得DNA，再进行PCR扩增。干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录，这会导致通过该方法不能检测出干扰素基因。(4)科研人员认为，药物既有干扰素的治疗作用，又有人参的滋补作用，因此将转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好。
答案：(1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC (2)复制原点 Ca2＋ (3)逆转录 干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞(或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录) (4)将干扰素的治疗作用与人参的滋补作用相结合，能在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等方面发挥协同作用
4．解析：(1)据图分析，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗体效价均达到16 000以上，其中小鼠Y的B淋巴细胞产生抗体效价最高，最适用于制备单克隆抗体。(2)融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外，还有骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞，由于细胞膜具有流动性，且诱导之后的细胞融合不具有特异性，故体系中会出现多种类型的细胞。(3)杂交瘤细胞形成后，小鼠的免疫B淋巴细胞核与其骨髓瘤细胞核会融合形成一个新的细胞核。小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)和骨髓瘤细胞(染色体数目60条)融合过程中染色体可能丢失，所以染色体数目最多可达100条。(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后，仍然不是能恶性增殖的细胞，同时正常细胞的分裂次数也是有限的。
答案：(1)四 Y Y小鼠的抗体效价最高 (2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100% (3)1 100 (4)不能无限增殖
5．解析：(1)玉米和高粱是两个物种，不能进行杂交，而植物体细胞杂交技术能将不同种的植物体细胞原生质体融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整的植物体，故科研人员尝试利用植物体细胞杂交技术，获得“玉米—高粱”杂种植株，此过程中常用酶解法去除细胞壁，即用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获取原生质体。(2)杂种细胞形成愈伤组织的过程属于植物组织培养过程中的脱分化，愈伤组织形成杂种植株的过程属于再分化；植物组织培养要在无菌条件下进行，因为杂菌和培养物竞争获得营养的能力更强，同时杂菌生长过程中可能会产生对培养物有害的物质，而导致培养物死亡。杂种植株体细胞的染色体数为融合前两种细胞染色体数之和，为40条；在体细胞有丝分裂的后期，着丝点分裂，染色单体分开成为子染色体，细胞中染色体数最多，为80条。(3)“玉米—高粱”植株的一个体细胞虽然同时具备了玉米和高粱的全部基因，但由于基因的选择性表达，玉米和高粱的基因不一定都能够表达。(4)玉米和高粱体细胞中的染色体数目相同，但不是同一个物种，且不同物种之间存在生殖隔离，因此在自然条件下，这两个物种间不能通过有性杂交的方式产生可育后代。
答案：(1)植物体细胞杂交 纤维素酶和果胶酶
(2)愈伤组织 再分化 杂菌和培养物竞争获得营养的能力更强；杂菌生长过程中可能会产生对培养物有害的物质 80
(3)基因的选择性表达
(4)不能 不同物种之间存在生殖隔离
第1讲 基因工程和细胞工程
题组一 高考分类练 明考向
类型1 翻阅教材，原味品高考非选择题
1．[2021·全国卷甲]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与
__________________________________________________________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________________________________
__________________________________________________________
________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
高考VS教材
小题号 相关教材原文 教材页码
(2) [选修3] P10
(3) [选修3] P10
(4) [选修3] P10
2.[2020·全国卷Ⅰ，38]为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。
回答下列问题：
(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是__________________________________________________________。
(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于________，使用该培养基进行细胞培养的结果是________________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是____________________。
(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有______________________________________________________(答出2点即可)。
高考VS教材
[人教选修3]P44
[人教选修3]P54
3．[2019·全国卷Ⅱ]植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。回答下列问题。
(1)植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有____________________________________________________________________(答出2点即可)。
(2)通过组织培养技术，可把植物组织细胞培养成胚状体，再通过人工种皮(人工薄膜)包装得到人工种子(如图所示)，这种人工种子在适宜条件下可萌发生长。人工种皮具备透气性的作用是____________________________________。人工胚乳能够为胚状体生长提供所需的物质，因此应含有植物激素、__________________和________________等几类物质。
(3)用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物的________________进行组织培养。
(4)植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是________________________________________________________________(用流程图表示)。
高考VS教材
[人教选修3]P38
[人教选修3]P40
[人教选修3]P39
[人教选修3]P42
4．[2019·全国卷Ⅲ]培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。
回答下列问题。
(1)利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。用分化的植物细胞可以培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有__________________________________________________________。
(2)步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是________________________________________。
(3)从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是____________________________________________________________________。在新的培养基上愈伤组织通过细胞的________________过程，最终可形成试管苗。
(4)步骤⑥要进行照光培养，其作用是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(5)经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的________________，这种繁殖方式属于________________繁殖。
高考VS教材
[人教选修3]P33
[人教选修3]P35
[人教选修3]P38
【借题发挥】理清教材，突破高考的瓶颈——长句描述类题型
问题1：启动子与起始密码、终止子与终止密码有何区别？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
问题2：切割目的基因和载体必须均使用同一种限制酶切割吗？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
问题3：为何用未受精卵母细胞作细胞核移植的受体细胞？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
问题4：细胞融合后，融合细胞中的染色体数、染色体组数应如何计算？
__________________________________________________________
__________________________________________________________
类型2 整体对比历年同类题，找共性和趋势
5．[2017·全国卷Ⅱ]几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________________________________________。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________________________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________________________________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是__________________________________________________________。
6. [全国卷Ⅰ，40]某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________；并且__________和__________________________________________________________
的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自__________。
类型3 它山之石——亦可攻玉
7．[2021·广东卷]非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有______________________。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有______________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备________________________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是______________________。在分子水平上，可以通过改变__________________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
8．[2021·山东卷]人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是________________________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于____________________________________________，理由是
__________________________________________________________
____________________________。
9．[2020·江苏卷，33]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得________；Taq DNA聚合酶的作用是催化__________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′－AACTATGCG?????? AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG??????CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT??????TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC??????CGAGTAC－3′
10．[2020·江苏卷，28]新型冠状病毒可通过表面的刺突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题：
(1)图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被________细胞表面的受体识别后激活该细胞。
(2)B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的________，形成________细胞。
(3)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的________；采集血液样本主要用于血清学检查，检测__________。
(4)据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射________免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得________细胞。因为同一种抗原可能激活________细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。
11．[2020·山东卷，25]水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_____________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是__________________________。
12．[2019·海南卷]人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经__________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
13．[2019·天津卷]B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________(单选)。
A.含B基因的染色体缺失
B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变
D．B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能)，然后构建重组表达载体。
(3)在过程①、②转化筛选时，过程______________中T－DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程________________在培养基中应加入卡那霉素。
(4)获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是__________(多选)。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明______________________________。
14．[2019·江苏卷]图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________、________________________。
菌落类型 平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
[命题揭秘]
从近五年高考统计看，对基因工程考查明显多于其他工程技术，考查角度侧重于基因工程的工具及其特点，基因工程操作程序尤其是基因表达载体的构建与目的基因检测、鉴定。对细胞工程的考查仅次于基因工程，考查内容多涉及动物细胞培养与融合技术，体细胞核移植技术(常渗透考查胚胎工程技术)及植物组织培养和体细胞杂交技术。
[命题趋势]
预计2022年高考试题对选修3的考查很可能结合科研实践或科学实践情境，分层设置问题，考查基因工程的基础知识，预计对考生分析问题、解决问题的能力考查将在未来受到重视；细胞工程可能会结合科研实践情境，将本部分知识与其他模块内容相结合，分层设置问题，仍会以细胞培养为基础，与基因工程等其他知识相结合命题的可能性比较大，体现高考试题的综合性和应用性，答题关键语句均源自教材，故精准记忆教材相关内容是解题关键。另外，生态农业、胚胎工程在医疗方面的应用等知识要引起考生关注。
题组二 模考预测练 强能力
预测一 聚焦基因工程
1．[2021·江西省六校高三3月联考]研究人员利用小鼠的单倍体ES细胞(只有一个染色体组)，成功培育出转基因小鼠。其主要技术流程如图所示，请分析回答下列问题：
注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四种限制酶。箭头指向的位置为限制酶的切割位点：Ampr 是氨苄青霉素抗性基因，Neor是 G418 抗性基因。
(1)利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含 dATP、dCTP、 dGTP、dTTP)、引物外，还应含有____________________________；引物应选用下图中的________(填图中字母)，至少需经过________次循环，才能分离得到所需要的 DNA 区段。
注： A、B、C、D是引物，箭头是延伸方向。
(2)在基因工程操作步骤中，过程①②称为________________________。已知氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞， 而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neor的小鼠细胞。结合上图推测，过程①选用的2种限制酶是________(填图中的编号)，③处的培养液应添加____________(填“氨苄青霉素”或“G418”)。
(3)图中桑椹胚需通过____________技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行______________处理。
2．[2021·山西省临汾市高三3月考试]基因X的表达产物可保护损伤的神经细胞。科学家构建了含X的基因表达载体(图1)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请据此回答下列问题：
(1)构建含X的基因表达载体时，应选择图1中的________限制酶。
(2)酶切后的载体和基因X进行连接，可产生3种连接产物：单个载体自连，基因X与载体正向连接、基因X与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种产物，选择EcoRⅠ酶和HindⅢ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是____________、____________、____________。
(3)在培养大鼠神经干细胞的过程中，可使用____________________酶将细胞分散开。分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为________。
(4)将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，可用________技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
3．[2021·河北省武邑中学高三质检]人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。口服α 干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______________________________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了________和________序列，以便于后续的剪切和连接。
(2)过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，过程③中需先用________处理根瘤农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)过程④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________过程获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(4)科研人员认为，将转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好，其依据是__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
[易错警示]
1．使用限制酶的注意点
(1)一般用同种限制酶切割载体和目的基因。
(2)不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。
2．DNA连接酶≠DNA聚合酶
DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
3．限制酶≠DNA酶≠解旋酶
限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶是将DNA水解为脱氧核苷酸；解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
4．启动子、终止子
(1)启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)。
(2)终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。
预测二 聚焦细胞工程
4．[经典高考]某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题：
(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有__________________________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(3)杂交瘤细胞中有________个细胞核，染色体数目最多是________条。
(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是__________________________。
5．[2021·云南省昆明市高三二模]玉米和高粱均为二倍体，染色体数目均为20条。科研人员经过长期实验，培育出“玉米—高粱”杂种植株。回答下列问题：
(1)科研人员尝试利用________________技术，获得“玉米—高粱”杂种植株。此过程中常用____________________去除细胞壁，获取原生质体。
(2)杂种细胞通过脱分化过程形成____________，继续进行培养，通过________过程形成杂种植株。此过程中杂菌污染会导致培养物死亡，原因是__________________________________________________________
__________________________________________________________
(答出2点即可)。杂种植株体细胞中最多有________条染色体。
(3)“玉米—高粱”植株的一个体细胞同时具备了玉米和高粱的全部基因，但因为______________________，基因不一定都能够表达。
(4)玉米和高粱染色体数目相同，自然条件下，它们能否________(填“能”或“不能”)相互杂交产生可育后代，理由是________________________________。
第1讲 基因工程和细胞工程
题组一
1．解析：(1)用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。(2)利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是Taq酶。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。(3)要扩增病原菌DNA，设计的引物就应该能和病原菌DNA特异性结合。(4)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。
答案：(1)④②③① (2)热稳定性DNA聚合酶(Taq酶) 延伸 两种引物分别与两条单链DNA模板结合 (3)病原菌DNA (4)一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能在短时间内大量扩增目的基因
2．解析：(1)实验前给小鼠甲注射病毒A，其目的是刺激机体发生免疫反应，从而产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。(2)制备单细胞悬液的主要实验步骤：从健康动物体内取出组织块，剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞，然后用培养液将分散的细胞稀释制成单细胞悬液。(3)图中筛选1采用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)才能生存。图中筛选2含多次筛选，利用抗原与抗体特异性结合的原理，就可获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。(4)要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
答案：(1)诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
(2)取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液 (3)选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性 (4)将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养
3．解析：(1)植物微型繁殖可以保持优良品种的遗传特性，还可以高效、快速、大量繁殖。(2)人工种皮具备透气性，可以保证胚状体进行有氧呼吸时对氧的需求；人工胚乳应该含有植物激素、矿质元素和糖等物质，保证胚状体的正常生长。(3)植物分生区附近(如茎尖)的病毒极少，可以切取茎尖进行组织培养，获得脱毒苗。(4)获得转基因植株，首先要通过细胞的脱分化过程，培养出愈伤组织，再对愈伤组织继续培养，诱导分化形成小植株。
答案：(1)能保持植物原有的遗传特性，繁殖速度快 (2)有利于胚状体进行呼吸作用 矿质元素 糖 (3)茎尖 (4)含目的基因的细胞愈伤组织小植株
4．解析：(1)植物细胞具有全能性，利用已分化的植物细胞通过植物组织培养可以培养成完整植株。(2)形成层细胞分化程度低，全能性较高，更容易诱导形成愈伤组织，进而获得完整植株。(3)愈伤组织的形成和试管苗的分化需要不同的生长素与细胞分裂素比例，因此诱导愈伤组织的形成阶段到分化阶段需要不同的培养基。愈伤组织通过再分化过程，最终可形成试管苗。(4)叶绿素的形成需要光，试管苗的发育也需要光，因此试管苗的诱导阶段需要光照。(5)通过植物组织培养获得植株，属于无性繁殖的一种，可以保持原品种的遗传特性。
答案：(1)全能性(或答：形成完整植株所需的全部基因)
(2)形成层容易诱导形成愈伤组织
(3)诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同 分化(或答：再分化)
(4)诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用
(5)遗传特性 无性
【借题发挥】
问题1：答案：启动子、终止子分别位于目的基因首端与尾端，它们均为DNA片段，而起始密码、终止密码均位于mRNA上，它们是由DNA转录而来，为RNA序列。
问题2：答案：不一定。目的基因和载体可以使用同一种限制酶，也可使用不同限制酶，只要切割后产生的黏性末端能够发生“互补配对”即可。
问题3：答案：①营养丰富。
②体积大，易操作。
③含有使细胞核表达全能性的物质。
问题4：答案：体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管是染色体数、基因型还是染色体组数都采用直接相加的方法。
5．解析：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常
6．解析：(1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具有一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在该培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr，因而能在该培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的培养基上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞(受体细胞)才能完成DNA复制。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
7．解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
8．解析：(1)由题意可知，为了扩增出γ基因上游调控序列及启动子的不同长度的片段，在调控序列及启动子的读取方向上(题图上图中从左至右)需要设计F1～F7多个引物，反向上只需同一个引物R即可。根据图示可知，荧光蛋白基因的终止子位于其左侧，为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物需要插入到荧光蛋白基因的上游(题图下图中荧光蛋白基因右侧)才能发挥作用，结合图中限制酶的作用位置可知，EcoRⅠ能够破坏荧光蛋白基因，NheⅠ位于终止子的下游，二者不能用来切割载体，所以只能用MunⅠ和XhoⅠ来切割载体。由于γ基因上游的调控序列及启动子中也含有MunⅠ和XhoⅠ的识别序列，所以在F1～F7末端不能添加其相应序列。比较图中几种限制酶的识别序列及切割位点可知，MunⅠ和EcoRⅠ切割后所产生的黏性末端相同，XhoⅠ和SalⅠ切割后所产生的黏性末端也相同，所以在F1～F7末端添加限制酶SalⅠ所对应的序列，在R末端添加限制酶EcoRⅠ所对应的序列，这样可将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达。本实验中，产物扩增需要Taq酶，载体构建过程中需要MunⅠ和XhoⅠ来切割载体，需要SalⅠ和EcoRⅠ来切割扩增后的产物，还需要DNA连接酶连接切口，故共需要6种酶。解析：(2) F1～F7与R作为引物扩增的产物可能含有启动子，也可能不含有，受体细胞中含F1～F6与R扩增产物的载体能够表达出荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明这些扩增产物包含完整的启动子部分，而含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，说明该扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。解析：(3)向培养液中添加适量的雌激素后，P启动子能够启动BCL11A基因的表达，产生BCL11A蛋白，若受体细胞中含有BCL11A蛋白结合位点，BCL11A蛋白与该结合位点结合后，会抑制荧光蛋白基因的表达。含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，据此可推测BCL11A蛋白结合位点位于F1～F4的共同部分，即F4所对应调控序列的下游，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，据此可推测F5～F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白结合位点，即BCL11A蛋白结合位点应位于F5所对应调控序列的上游，而γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，所以BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)SalⅠ EcoRⅠ 6
(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
9．解析：(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′(引物②)和5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′(引物④)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
10．解析：(1)图1中，抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒抗原呈递给T细胞，后者识别抗原后被激活，分泌淋巴因子。(2)B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的增殖、分化，形成浆细胞和记忆细胞。(3)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子用于病原学检查时，检测的是病毒的核酸；采集血液样本用于血清学检查时，检测的是抗新冠病毒抗体。(4)为了诱导小鼠产生能够分泌抗S蛋白抗体的B淋巴细胞，实验时需先给小鼠注射S蛋白，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选可获得杂交瘤细胞。因为同一种抗原可能激活多种B淋巴细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。
答案：(1)T (2)增殖、分化 浆细胞和记忆 (3)核酸 抗新型冠状病毒抗体 (4)刺突蛋白(或S蛋白) 杂交瘤 多种B
11．解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
12．解析：(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，T－DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T－DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
答案：(1)mRNA 逆转录酶 PCR
(2)T－DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
13．解析：(1)B基因的启动子无法启动转录，会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取的总RNA，经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程①需将基因表达载体导入农杆菌，所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程②农杆菌感染水稻愈伤组织，农杆菌Ti质粒的T－DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因，正常植株也会出现杂交带，故A错误；B、D选项是检测Luc基因及其产物，B、D正确；C选项检测对象是卵细胞中mRNA，基因的表达具有选择性，故正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA，C正确。(5)一般情况下，水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚，而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚，说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
答案：(1)D (2)精子 cDNA (3)② ① (4)BCD (5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
14．解析：(1)EcoR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，切割后产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
答案：(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接
题组二
1．解析：(1)利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、四种脱氧核苷酸和引物以外，还应含有热稳定性的DNA聚合酶；根据引物的延伸方向可知，应该选择引物A和D，可以扩增2种引物之间的序列。PCR技术操作流程的三个重要步骤是变性、退火、延伸。根据PCR过程特点绘制PCR过程示意图：
由图分析可知：X基因第一次复制得到两个两种：①和②；X基因第二次复制得到四个四种：①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第三次复制得到八个五种：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到十六个五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤，两个⑤得到4个⑤；从上面的推测可知，第三轮循环产物中才能开始出现独立且完整的X基因。即至少需经过三次循环才能分离得到所需要的DNA区段。
解析：(2)过程①②即构建基因表达载体的过程。已知氨芐青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neor的小鼠细胞。故应保留G418抗性基因，过程1应该选用Ⅰ、Ⅱ进行切割，③处的培养液应添加G418，对目的基因进行筛选。(3)图中桑椹胚需通过胚胎移植移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行胚胎移植前需对受体小鼠进行同期发情处理，让供受体处于相同的生理状态。
答案：(1)热稳定性的DNA聚合酶(或Taq酶) A和D 3 (2)基因表达载体的构建 Ⅰ和Ⅱ G418 (3)胚胎移植 同期发情
2．解析：(1)为了让限制酶切出的目的基因和载体切口能发生碱基互补配对而连接起来，通常应选择相同的限制酶对二者进行切割，所以分析图1可知，在构建含基因X的表达载体时，需选择图1中的BamHⅠ限制酶进行酶切。(2)由分析可知，图中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是载体自连、反向连接、正向连接。(3)进行动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。在适宜环境中培养，细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上，称为贴壁生长。(4)分子杂交技术将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，可用分子杂交技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时产生接触抑制，换瓶后进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
答案：(1)BamHⅠ (2)载体自连 反向连接 正向连接 (3)胰蛋白酶或胶原蛋白 细胞贴壁(生长) (4)分子杂交 传代
3．解析：(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列。由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接。(2)基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，因此过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点；微生物细胞作为受体细胞时，需要钙离子处理使其变为感受态细胞，即过程③中需先用Ca2＋处理根瘤农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。(3)在利用反转录法合成目的基因时，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录过程获得DNA，再进行PCR扩增。干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录，这会导致通过该方法不能检测出干扰素基因。(4)科研人员认为，药物既有干扰素的治疗作用，又有人参的滋补作用，因此将转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好。
答案：(1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC (2)复制原点 Ca2＋ (3)逆转录 干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞(或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录) (4)将干扰素的治疗作用与人参的滋补作用相结合，能在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等方面发挥协同作用
4．解析：(1)据图分析，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗体效价均达到16 000以上，其中小鼠Y的B淋巴细胞产生抗体效价最高，最适用于制备单克隆抗体。(2)融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外，还有骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞，由于细胞膜具有流动性，且诱导之后的细胞融合不具有特异性，故体系中会出现多种类型的细胞。(3)杂交瘤细胞形成后，小鼠的免疫B淋巴细胞核与其骨髓瘤细胞核会融合形成一个新的细胞核。小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)和骨髓瘤细胞(染色体数目60条)融合过程中染色体可能丢失，所以染色体数目最多可达100条。(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后，仍然不是能恶性增殖的细胞，同时正常细胞的分裂次数也是有限的。
答案：(1)四 Y Y小鼠的抗体效价最高 (2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100% (3)1 100 (4)不能无限增殖
5．解析：(1)玉米和高粱是两个物种，不能进行杂交，而植物体细胞杂交技术能将不同种的植物体细胞原生质体融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整的植物体，故科研人员尝试利用植物体细胞杂交技术，获得“玉米—高粱”杂种植株，此过程中常用酶解法去除细胞壁，即用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获取原生质体。(2)杂种细胞形成愈伤组织的过程属于植物组织培养过程中的脱分化，愈伤组织形成杂种植株的过程属于再分化；植物组织培养要在无菌条件下进行，因为杂菌和培养物竞争获得营养的能力更强，同时杂菌生长过程中可能会产生对培养物有害的物质，而导致培养物死亡。杂种植株体细胞的染色体数为融合前两种细胞染色体数之和，为40条；在体细胞有丝分裂的后期，着丝点分裂，染色单体分开成为子染色体，细胞中染色体数最多，为80条。(3)“玉米—高粱”植株的一个体细胞虽然同时具备了玉米和高粱的全部基因，但由于基因的选择性表达，玉米和高粱的基因不一定都能够表达。(4)玉米和高粱体细胞中的染色体数目相同，但不是同一个物种，且不同物种之间存在生殖隔离，因此在自然条件下，这两个物种间不能通过有性杂交的方式产生可育后代。
答案：(1)植物体细胞杂交 纤维素酶和果胶酶
(2)愈伤组织 再分化 杂菌和培养物竞争获得营养的能力更强；杂菌生长过程中可能会产生对培养物有害的物质 80
(3)基因的选择性表达
(4)不能 不同物种之间存在生殖隔离
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