2022届高考生物二轮复习大题集训 现代生物科技专题（Word版含解析）
文档属性
| 名称 | 2022届高考生物二轮复习大题集训 现代生物科技专题（Word版含解析） |  | |
| 格式 | doc | ||
| 文件大小 | 549.3KB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-04-16 00:35:44 | ||
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文档简介
现代生物科技 专题集训
1.乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种
2.中国甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员构建了质粒A和质粒G（如图1、图2所示），利用酵母菌进行了相关实验探究。请据图回答下列问题：
（1）启动子位于基因首端，是________的位点，启动子区域还存在着许多调控蛋白的结合位点，可影响基因的转录水平。PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行________。
（2）利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。质粒G上的AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，因此需获得待测蛋白与AD蛋白的融合蛋白用于后续筛选。科研人员从中国甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种________与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点________（填序号1～5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（3）重组酵母Y187与Y1H能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图3阐述作出该推测的理由________。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于________工程，该工程的起点是________。
3.植物基因工程中，往往用光诱导型启动子（PrbcS）使目的基因表达，其结合T基因后能使目的基因更高水平表达。下图中①和②都为基因表达载体构建过程中的中间载体，请分析重组载体的部分构建过程，并回答下列问题：
（1）对双子叶植物进行基因工程改造最常用的方法是_____，还需结合_____技术才能获得具有新性状的植株。
（2）中间载体通常用_____法导入微生物中扩增，含有中间载体②-PrbcS-*T的微生物与含有中间载体①-PrbcS-*T的微生物相比，区别两者的方法是_____。
（3）经酶切后进行凝胶电泳，测得2B片段为0.4kb，由图示信息分析，PrbcS-*T的长度约为_____。写出中间载体②-PrbcS-*T图中问号处限制酶的酶切位点：_____。
（4）如何在T基因前“点突变引入NCoⅠ”酶切位点？_____。
4.Cre-loxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。科学家把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建如图2所示的表达载体T，在Cre酶的帮助下，一部分荧光蛋白基因会被随机地“剪掉”，而剩下的部分得以表达，这样就可以随机呈现不同的颜色。这种利用荧光蛋白“点亮”神经元的大脑成像技术被称为“脑彩虹”，能帮助科学家了解大脑。
（1）构建表达载体T需要用到_____酶，常用_____法将表达载体T导人小鼠的_____中，获得细胞中含一个表达载体T的转基因小鼠a（不含Cre酶）。小鼠a的脑组织细胞和其他组织细胞的色彩分别是_____和_____。
（2）已知两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次。研究者将Cre酶基因与病毒基因重组构建Cre病毒，然后将Cre病毒注入小鼠A体内，出现“脑彩虹”现象，小鼠A的一个脑细胞的色彩为_____。
（3）利用上述技术可以培育能够在一个细胞内随机出现两种颜色的“脑彩虹”小鼠，请依据题目信息，简要写出设计思路：_____。
5.基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。结合图示回答问题。
注：neor是新霉素抗性基因；tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡。
（1）将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到__________上，构建打靶载体（基因表达载体）。
（2）打靶载体测序验证正确后，利用__________酶，将之线性化，以提高重组率。通过__________技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组。
（3）为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入__________。最后还需要通过__________技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过__________培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存。
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、__________的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的__________（选填“体细胞”、“生殖细胞”）恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。
6.花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。
据图回答下列问题：
(1)过程①所需的酶是____________________。
(2)诱导原生质体融合的方法除了用PEG诱导融合，还有______________(至少写2项)等方法。原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是_______
____________________。原生质体经过______________再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
(3)过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的______________存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
(4)将生长良好的愈伤组织转接到_________________培养基上，培养基中由于含有不同的_____________成分，诱导愈伤组织再分化为胚状体或_______，进而形成完整的小植株。
(5)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和__________________植株的根尖，制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。
(6)对杂种植株进行__________________接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
7.新冠肺炎疫情暴发以来，在党中央的关怀下，全国人民共同努力，疫情防控取得重大战略成果，很多新冠肺炎患者康复，这些康复者的血清中含有相应的抗体，可帮助患者更快地清除病毒，是治疗新冠肺炎的有效方法。但目前康复者的血清来源较少，不能满足临床需求，理论上可采用基因工程或动物细胞工程的方法获得相应抗体。请回答下列有关问题。
（1）传统抗体的制备是向生物体内反复注射某种抗原，使生物体产生抗体，从动物的_________中分离所需抗体，但用这种方法提取的抗体，具有___________（至少写出两点）等缺点，现在逐步被单克隆抗体取代。
（2）单克隆抗体具有__________（至少写出两点）等优点。制备时需要从康复者的脾脏中分离出B淋巴细胞在体外将其与骨髓瘤细胞进行融合，常见的融合方法有电激、聚乙二醇、_________等，然后再经筛选、培养等步骤大量获得。
（3）科学家不断探索寻求制备新冠病毒抗体的方法，某科研小组欲利用基因工程技术制备新冠病毒抗体，其大致流程如下图：
①抗体基因确定后，可通过PCR技术特异性地快速扩增，PCR技术扩增目的基因的前提条件是__________。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有__________以及标记基因等。
②人体合成的抗体需要膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，与大肠杆菌作为受体细胞相比，选择酵母菌作为受体细胞的优势是__________。
8.针对肿瘤细胞可设计和研制靶向药物，特异性杀伤肿瘤细胞。
（1）如下图所示，细胞通过转铁蛋白(Tf)与转铁蛋白受体(TfR)特异性结合来摄取铁元素。肿瘤细胞由于增殖快速，需要更多的铁元素：其细胞表面TfR的表达量______(“上升”或“下降”)。利用单克隆抗体技术，可研制抗TfR的抗体，它们通过____从而可以抑制肿瘤细胞增殖。
（2）请写出用小鼠制备TfR的单克隆抗体的流程。_____________。
（3）由于在本实验中单独使用鼠源抗体效果不佳，考虑利用抗体介导杀伤细胞来裂解癌细胞，该过程如图2所示。若无论何种抗体，杀伤细胞都可与之结合，最终使靶细胞裂解死亡，则说明抗体Fc段在不同种类的抗体中_____(“相同”或“不同”)。
（4）人的杀伤细胞无法识别鼠源单克隆抗体的Fc段，科学家用基因工程的方法获得了人(Fc)-鼠(Fab)嵌合抗体，请补充该基因工程的基本步骤。
①从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，____________；
②构建含_____________________的表达载体；
③将其导入真核细胞中进行表达；
④_________________。
9.科研人员在杂交瘤细胞的基础上，获得了双杂交瘤细胞，能够产生双特异性抗体，该抗体可以同时结合两种抗原。
（1）科研人员将抗原α、β分别注射到小鼠体内，引起机体的_____免疫，_____分泌相应抗体。
（2）科研人员获得上述小鼠的脾脏细胞，制备两种杂交瘤细胞。每种杂交瘤细胞产生的抗体结构、与抗原结合的情况如图1所示。
①制备杂交瘤细胞时，需将上述小鼠的脾脏组织，用_____处理获得单细胞后，再与小鼠的骨髓瘤细胞融合，筛选得到两种杂交瘤细胞。将两种杂交瘤细胞用_____试剂处理促进其融合，细胞培养时需在培养基中加入_____（天然成分）。如果两种细胞成功融合，则会同时表达出抗体的重链A、B和轻链a、b，这种细胞称作双杂交瘤细胞。
②抗体由两条重链和两条轻链组成，重链和轻链均分为恒定区和可变区，两条重链依赖于A1或B1进行组装（A1与B1相同），重链与轻链的组装依赖于恒定区A2、a或B2、b（a与b相同）。因此，双杂交瘤细胞产生的抗体种类较多，其中有一种抗体能同时与抗原α、β结合，称为双特异性抗体，如图2.请将A1、A2、B1、B2、a、b、α、β等字符填入下面的表格中。
1 2 3 4 5 6
A2 α
③为使双杂交瘤细胞只产生图2所示双特异性抗体，降低纯化分离成本，科研人员对重链、轻链的结构进行改造。改造思路是在A、B、a、b的恒定区通过改变_____，进而改变蛋白质的空间结构，实现“榫卯”式互补组装的唯一性，这种改造属于现代生物技术中的_____工程。
（3）结合双特异性抗体的特点，请分析其在肿瘤治疗方面的应用前景：_____。
10.某城市近年来一直强调走“绿色发展”之路，争创“绿色城市”。“绿色”的含义除了包括城市绿化、绿色生活方式与消费理念外，还包括尊重自然、保持生态平衡、高效利用资源等等。实现垃圾的“减量化、资源化和无害化”是绿色城市的重要标志之一。下图是垃圾资源化、无害化处理的一种方案:
(1)生态工程应在经济、社会、生态环境等方面取得最佳效果并达到预期目标。图示的生态工程能充分利用废弃物中的能量，形成“无废弃物农业”，这主要是遵循生态工程的_________原理。
(2)在充分利用能量，减少环境污染的同时，通过燃烧发电、生产动物蛋白饲料等，提高人们收入，使保护环境和发展经济协调起来，体现了生态工程的_________原理。
(3)该方案中④⑤过程利用的生物属于生态系统中的何种成分 ________。该生态系统与一般的自然生态系统相比较，________稳定性较低，所以需要人们不断输入物质与能量。
答案以及解析
1.答案：（1）细胞质基质
（2）①包含BamHI的识别序列；将GTG改为ATG；②原核生物复制原点；不能；③缺失尿嘧啶
（3）B
解析：（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
（2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
（3）A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。故选B。
2.答案：
（1）RNA聚合酶识别和结合 DNA连接酶 PCR
（2）尿嘧啶 cDNA 2
（3）接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性
（4）蛋白质 预期蛋白质的功能
解析：（1）启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点，直接决定转录起始。该操作为目的基因和运载体的酶切和连接，限制酶切制后需要在DNA连接酶的作用下连接；已知接头片段连接在PDC基因的上游，且已知序列信息，则可以按照PDC基因启动子上游的接头片段与PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增。
（2）由质粒A的图谱可知带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则在选择培养基配制时不加尿嘧啶。从中国甜柿中提取的RNA可以通过逆转录形成各种cDNA，将各种cDNA片段与质粒G连接后导入酵母菌，插入时不能破坏其他蛋白质基因的表达，而且需要插入到启动子和终止子之间才能保证表达，因此选择2作为cDNA的插入位点。
（3）依据题干，重组酵母Y187与YIH接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒：质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于蛋白质工程，蛋白质工程的设计流程为预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列（基因），所以起点是预期蛋白质的功能。
3.答案：(1)农杆菌转化法；植物组织培养技术
(2)感受态细胞法；含有中间载体②PrbcS*T的微生物能在含有卡那霉素的培养基中生长，而①PrbcS*T的微生物不能在该培养基中生长
(3)1.7kb；SphⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ
(4)设计包含NcoⅠ识别序列的引物，然后用PCR技术扩增
解析：（1）将目的基因导入双子叶植物常利用农杆菌转化法。要想获得转基因植物，还需要对导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养。
（2）将中间载体导入微生物时，常先用钙离子处理微生物使其成为感受态，易于吸收中间载体，该种方法为感受态细胞法。由图可知，中间载体②上含卡那霉素抗性基因，而不含氨苄青霉素抗性基因，故含有中间载体②-PrbcS-*T的微生物能在含有卡那霉素的培养基中生长，而不能在含有氨苄青霉素的培养基中生长。
（3）由图可知，中间载体②的长度为2.7kb，经酶切后凝胶电泳，测得2B片段为0.4kb，设Prbcs-*T的长度为y，则2.7-0.4+y=4kb，解得y=1.7kb。根据图示中中间载体①-PrbcS-*T右侧的酶切位点和中间载体②-2B右侧的酶切位点可知，中间载体②-Prbcs-*T图中问号处限制酶的酶切位点可为SphⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ的酶切位点。
（4）可设计包含NcoⅠ识别序列的引物，然后用PCR技术扩增，即可在T基因前“点突变引入NcoⅠ”酶切位点。
4.答案：（1）限制酶和DNA连接；显微注射；受精卵；红色；无色
（2）红色或黄色或蓝色
（3）设法使小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成
解析：（1）本题考查基因工程的相关知识。基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理。将目的基因导入动物细胞，常用显微注射法。由图2中提示仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因可知，含图2的表达载体T的小鼠a（不含Cre酶）的脑组织细胞色彩为红色，其他组织细胞色彩为无色。
（2）小鼠A有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，loxP1、loxP2位置如图二黑、白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色；也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色；有可能敲除两个loxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色。因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因。
（3）在一个细胞内随机出现两种或两种以上颜色叠加，依据题目信息，可设计思路：设法使小鼠脑组织细胞内有2个相同的表达载体T，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内多个荧光蛋白的颜色叠加而成。
5.答案：（1） 载体（或质粒）
（2）限制 显微注射
（3）新霉素和丙氧鸟苷 DNA分子杂交 液氮（或冷冻）
（4）生理状态相同（或经同期发情处理） 生殖细胞
解析：（1）分析题图可知，将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到载体（或质粒）上，构建打靶载体（基因表达载体）。
（2）打靶载体测序验证正确后，利用限制酶，将之线性化，以提高重组率。通过显微注射技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组。
（3）neor是新霉素抗性基因，tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡，因此为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。最后还需要通过DNA分子杂交技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过动物细胞（或克隆）培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存。
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同（或经同期发情）的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。
6.答案：(1)纤维素酶和果胶酶
(2)离心，振荡，电刺激 保持原生质体完整性 细胞壁
(3)叶绿体
(4)分化 植物激素 丛芽
(5)双亲(或花椰菜和黑芥)
(6)黑腐病菌
解析：(1)①过程为原生质体的制备，需要去掉细胞壁，细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，酶具有专一性等特点，故用纤维素酶和果胶酶。
(2)诱导原生质体融合的方法包括物理法和化学法，物理法包括离心，振荡，电刺激等，化学法一般用聚乙二醇(PEG)诱导融合；原生质体没有细胞壁的保护，需要加入适宜浓度的甘露醇以保证渗透压的稳定，以避免原生质体吸水或失水破坏原生质体的完整性；原生质体通过细胞壁再生形成杂种细胞，进而形成愈伤组织。
(3)用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。
(4)杂种细胞具有全能性，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成愈伤组织。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而形成完整植株。
(5)分析再生植株染色体变异类型，需要将再生植株细胞染色体和黑芥苗与花椰菜细胞中的染色体制片观察进行比较，制片的基本程序是解离、漂洗、染色、制片。
(6)对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。
7.答案：(1)血清；产量低、纯度低、特异性差(至少写两点给分)
(2)特异性强、灵敏度高、可大量制备(至少写两点给分)；灭活的病毒
(3)①有一段已知目的基因的核苷酸序列；启动子、终止子(写全给分)；②酵母菌是真核生物，具有内质网、高尔基体等复杂的生物膜系统，能对初始形成的抗体进行加工、修饰，形成具有生物活性的抗体
解析：（1）传统抗体的制备是向生物体内反复注射某种抗原，使生物体产生抗体，再从动物的血清中分离所需抗体，但用这种方法提取的抗体，具有产量低、纯度低、特异性差等缺点，所以现在逐步被单克隆抗体取代。
（2）单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、可大量制备等优点。制备时需要从康复者的脾脏中分离出B淋巴细胞，在体外将其与骨髓瘤细胞融合，常见的融合方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒等，然后再经筛选、培养等步骤大量获得。
（3）①利用PCR技术扩增目的基因的前提条件是有一段已知目的基因的核苷酸序列。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。②人体合成的抗体需要膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，大肠杆菌是原核生物，其内没有内质网、高尔基体等生物膜系统，不能对细胞内形成的初始蛋白质进行加工、修饰，因此以大肠杆菌作为受体细胞生产的抗体不具有生物活性。而酵母菌是真核生物，具有内质网、高尔基体等生物膜系统，能对细胞内形成的初始蛋白质进行加工、修饰，因此以酵母菌作为受体细胞生产的抗体具有生物活性。
8.答案：（1）上升；与TfR特异性结合，阻止Tf与TfR结合，抑制铁元素的摄取
（2）将免疫接种过TfR的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的杂交瘤细胞，大量培养获得相应抗体
（3）相同
（4）①逆转录获得Fab基因编码区；②人-鼠嵌合抗体基因；④对基因的表达产物进行鉴定
解析：(1)铁元素的摄取是通过转铁蛋白(Tf)与转铁蛋白受体(TfR)特异性结合来实现的，肿瘤细胞由于增殖快速，需要更多的铁元素其细胞表面TfR的表达量会上升，以满足铁元素的摄取需求；TfR抗体与TfR通过特异性免疫作用，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
(2)向实验小鼠体内注射TfR，使小鼠体内产生相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞，制备该小鼠的脾细胞悬液，将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合制成杂交瘤细胞，再将杂交的细胞放入含有TfR抗体的培养基中进行筛选，最后得到TfR的单克隆抗体。
(3)无论何种抗体，杀伤细胞都可与之结合，说明抗体Fe段在不同的细胞中都是相同的，才能与所有抗体结合。
(4)基因工程的基本步骤是获取目的基因、基因表达载体的建构、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与坚定四步，因此从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA后，需要利用反转录酶获得目的基因的DNA序列，然后构建含有目的基因的表达载体，再将表达载体导入真核细胞进行表达，最后通过筛选坚定目的基因是否表达成功。
9.答案：（1）体液；浆细胞
（2）①胰蛋白酶；PEG（或聚乙二醇）；动物血清；
②
1 2 3 4 5 6
B2 a b β
③氨基酸种类（或“序列”）；蛋白质
（3）研制与肿瘤细胞和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，特异性杀死肿瘤细胞
解析：本题考查应用单克隆抗体的方法制备双特异性抗体及蛋白质工程的知识。
（1）注射抗原α、β引起机体产生体液免疫时浆细胞分泌相应抗体。
（2）①制备杂交瘤细胞时，需用胰蛋白酶处理小鼠的脾脏组织获得单细胞，再与小鼠的骨髓瘤细胞融合。用PEG试剂处理可促进两种杂交瘤细胞的融合。②图乙中抗体是双杂交瘤细胞产生的双特异性抗体，能同时与抗原α、β结合，结合图甲信息可确定表格中2、3、4、6分别对应B2、a、b、β。③欲改变此蛋白质的空间结构，往往是在A、B、a、b的恒定区通过改变氨基酸的种类实现，这种改造属于现代生物技术中的蛋白质工程。
（3）双特异性抗体在肿瘤治疗方面的应用前景：研制既能和肿瘤细胞结合又能和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，特异性杀死肿瘤细胞。
10.答案：(1)物质循环再生
(2)整体性
(3)分解者；抵抗力
解析：（1）图示的生态工程主要利用“无法回收的有机废物”进行物质和能量的高效多级利用，从而形成“无废弃物农业”，减少了污染，实现物质循环往复、多级利用，主要遵循生态工程的物质循环再生原理。
（2）由题意可知，此生态工程建设中，不仅考虑到了自然生态系统的规律，还考虑到了经济系统和社会系统的影响力，在充分利用能量，减少环境污染的同时，提高人们收入，使“社会一经济一自然”
这一复合生态系统良好发展，体现了生态工程的整体性原理。
（3）该方案中④利用微生物的分解作用，⑤利用营腐生生活的蚯蚓、苍蝇等分解有机废物，两个过程利用的生物属于生态系统中的分解者。由于绿色城市中生物成分和营养结构较自然生态系统更为单一，即抵抗力稳定性较低，为维持其结构和功能的稳定性，还需人类不断输入物质和能量。
1.乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种
2.中国甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员构建了质粒A和质粒G（如图1、图2所示），利用酵母菌进行了相关实验探究。请据图回答下列问题：
（1）启动子位于基因首端，是________的位点，启动子区域还存在着许多调控蛋白的结合位点，可影响基因的转录水平。PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行________。
（2）利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。质粒G上的AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，因此需获得待测蛋白与AD蛋白的融合蛋白用于后续筛选。科研人员从中国甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种________与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点________（填序号1～5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（3）重组酵母Y187与Y1H能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图3阐述作出该推测的理由________。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于________工程，该工程的起点是________。
3.植物基因工程中，往往用光诱导型启动子（PrbcS）使目的基因表达，其结合T基因后能使目的基因更高水平表达。下图中①和②都为基因表达载体构建过程中的中间载体，请分析重组载体的部分构建过程，并回答下列问题：
（1）对双子叶植物进行基因工程改造最常用的方法是_____，还需结合_____技术才能获得具有新性状的植株。
（2）中间载体通常用_____法导入微生物中扩增，含有中间载体②-PrbcS-*T的微生物与含有中间载体①-PrbcS-*T的微生物相比，区别两者的方法是_____。
（3）经酶切后进行凝胶电泳，测得2B片段为0.4kb，由图示信息分析，PrbcS-*T的长度约为_____。写出中间载体②-PrbcS-*T图中问号处限制酶的酶切位点：_____。
（4）如何在T基因前“点突变引入NCoⅠ”酶切位点？_____。
4.Cre-loxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。科学家把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建如图2所示的表达载体T，在Cre酶的帮助下，一部分荧光蛋白基因会被随机地“剪掉”，而剩下的部分得以表达，这样就可以随机呈现不同的颜色。这种利用荧光蛋白“点亮”神经元的大脑成像技术被称为“脑彩虹”，能帮助科学家了解大脑。
（1）构建表达载体T需要用到_____酶，常用_____法将表达载体T导人小鼠的_____中，获得细胞中含一个表达载体T的转基因小鼠a（不含Cre酶）。小鼠a的脑组织细胞和其他组织细胞的色彩分别是_____和_____。
（2）已知两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次。研究者将Cre酶基因与病毒基因重组构建Cre病毒，然后将Cre病毒注入小鼠A体内，出现“脑彩虹”现象，小鼠A的一个脑细胞的色彩为_____。
（3）利用上述技术可以培育能够在一个细胞内随机出现两种颜色的“脑彩虹”小鼠，请依据题目信息，简要写出设计思路：_____。
5.基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。结合图示回答问题。
注：neor是新霉素抗性基因；tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡。
（1）将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到__________上，构建打靶载体（基因表达载体）。
（2）打靶载体测序验证正确后，利用__________酶，将之线性化，以提高重组率。通过__________技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组。
（3）为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入__________。最后还需要通过__________技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过__________培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存。
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、__________的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的__________（选填“体细胞”、“生殖细胞”）恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。
6.花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。
据图回答下列问题：
(1)过程①所需的酶是____________________。
(2)诱导原生质体融合的方法除了用PEG诱导融合，还有______________(至少写2项)等方法。原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是_______
____________________。原生质体经过______________再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
(3)过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的______________存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
(4)将生长良好的愈伤组织转接到_________________培养基上，培养基中由于含有不同的_____________成分，诱导愈伤组织再分化为胚状体或_______，进而形成完整的小植株。
(5)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和__________________植株的根尖，制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。
(6)对杂种植株进行__________________接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
7.新冠肺炎疫情暴发以来，在党中央的关怀下，全国人民共同努力，疫情防控取得重大战略成果，很多新冠肺炎患者康复，这些康复者的血清中含有相应的抗体，可帮助患者更快地清除病毒，是治疗新冠肺炎的有效方法。但目前康复者的血清来源较少，不能满足临床需求，理论上可采用基因工程或动物细胞工程的方法获得相应抗体。请回答下列有关问题。
（1）传统抗体的制备是向生物体内反复注射某种抗原，使生物体产生抗体，从动物的_________中分离所需抗体，但用这种方法提取的抗体，具有___________（至少写出两点）等缺点，现在逐步被单克隆抗体取代。
（2）单克隆抗体具有__________（至少写出两点）等优点。制备时需要从康复者的脾脏中分离出B淋巴细胞在体外将其与骨髓瘤细胞进行融合，常见的融合方法有电激、聚乙二醇、_________等，然后再经筛选、培养等步骤大量获得。
（3）科学家不断探索寻求制备新冠病毒抗体的方法，某科研小组欲利用基因工程技术制备新冠病毒抗体，其大致流程如下图：
①抗体基因确定后，可通过PCR技术特异性地快速扩增，PCR技术扩增目的基因的前提条件是__________。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有__________以及标记基因等。
②人体合成的抗体需要膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，与大肠杆菌作为受体细胞相比，选择酵母菌作为受体细胞的优势是__________。
8.针对肿瘤细胞可设计和研制靶向药物，特异性杀伤肿瘤细胞。
（1）如下图所示，细胞通过转铁蛋白(Tf)与转铁蛋白受体(TfR)特异性结合来摄取铁元素。肿瘤细胞由于增殖快速，需要更多的铁元素：其细胞表面TfR的表达量______(“上升”或“下降”)。利用单克隆抗体技术，可研制抗TfR的抗体，它们通过____从而可以抑制肿瘤细胞增殖。
（2）请写出用小鼠制备TfR的单克隆抗体的流程。_____________。
（3）由于在本实验中单独使用鼠源抗体效果不佳，考虑利用抗体介导杀伤细胞来裂解癌细胞，该过程如图2所示。若无论何种抗体，杀伤细胞都可与之结合，最终使靶细胞裂解死亡，则说明抗体Fc段在不同种类的抗体中_____(“相同”或“不同”)。
（4）人的杀伤细胞无法识别鼠源单克隆抗体的Fc段，科学家用基因工程的方法获得了人(Fc)-鼠(Fab)嵌合抗体，请补充该基因工程的基本步骤。
①从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，____________；
②构建含_____________________的表达载体；
③将其导入真核细胞中进行表达；
④_________________。
9.科研人员在杂交瘤细胞的基础上，获得了双杂交瘤细胞，能够产生双特异性抗体，该抗体可以同时结合两种抗原。
（1）科研人员将抗原α、β分别注射到小鼠体内，引起机体的_____免疫，_____分泌相应抗体。
（2）科研人员获得上述小鼠的脾脏细胞，制备两种杂交瘤细胞。每种杂交瘤细胞产生的抗体结构、与抗原结合的情况如图1所示。
①制备杂交瘤细胞时，需将上述小鼠的脾脏组织，用_____处理获得单细胞后，再与小鼠的骨髓瘤细胞融合，筛选得到两种杂交瘤细胞。将两种杂交瘤细胞用_____试剂处理促进其融合，细胞培养时需在培养基中加入_____（天然成分）。如果两种细胞成功融合，则会同时表达出抗体的重链A、B和轻链a、b，这种细胞称作双杂交瘤细胞。
②抗体由两条重链和两条轻链组成，重链和轻链均分为恒定区和可变区，两条重链依赖于A1或B1进行组装（A1与B1相同），重链与轻链的组装依赖于恒定区A2、a或B2、b（a与b相同）。因此，双杂交瘤细胞产生的抗体种类较多，其中有一种抗体能同时与抗原α、β结合，称为双特异性抗体，如图2.请将A1、A2、B1、B2、a、b、α、β等字符填入下面的表格中。
1 2 3 4 5 6
A2 α
③为使双杂交瘤细胞只产生图2所示双特异性抗体，降低纯化分离成本，科研人员对重链、轻链的结构进行改造。改造思路是在A、B、a、b的恒定区通过改变_____，进而改变蛋白质的空间结构，实现“榫卯”式互补组装的唯一性，这种改造属于现代生物技术中的_____工程。
（3）结合双特异性抗体的特点，请分析其在肿瘤治疗方面的应用前景：_____。
10.某城市近年来一直强调走“绿色发展”之路，争创“绿色城市”。“绿色”的含义除了包括城市绿化、绿色生活方式与消费理念外，还包括尊重自然、保持生态平衡、高效利用资源等等。实现垃圾的“减量化、资源化和无害化”是绿色城市的重要标志之一。下图是垃圾资源化、无害化处理的一种方案:
(1)生态工程应在经济、社会、生态环境等方面取得最佳效果并达到预期目标。图示的生态工程能充分利用废弃物中的能量，形成“无废弃物农业”，这主要是遵循生态工程的_________原理。
(2)在充分利用能量，减少环境污染的同时，通过燃烧发电、生产动物蛋白饲料等，提高人们收入，使保护环境和发展经济协调起来，体现了生态工程的_________原理。
(3)该方案中④⑤过程利用的生物属于生态系统中的何种成分 ________。该生态系统与一般的自然生态系统相比较，________稳定性较低，所以需要人们不断输入物质与能量。
答案以及解析
1.答案：（1）细胞质基质
（2）①包含BamHI的识别序列；将GTG改为ATG；②原核生物复制原点；不能；③缺失尿嘧啶
（3）B
解析：（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
（2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
（3）A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。故选B。
2.答案：
（1）RNA聚合酶识别和结合 DNA连接酶 PCR
（2）尿嘧啶 cDNA 2
（3）接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性
（4）蛋白质 预期蛋白质的功能
解析：（1）启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点，直接决定转录起始。该操作为目的基因和运载体的酶切和连接，限制酶切制后需要在DNA连接酶的作用下连接；已知接头片段连接在PDC基因的上游，且已知序列信息，则可以按照PDC基因启动子上游的接头片段与PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增。
（2）由质粒A的图谱可知带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则在选择培养基配制时不加尿嘧啶。从中国甜柿中提取的RNA可以通过逆转录形成各种cDNA，将各种cDNA片段与质粒G连接后导入酵母菌，插入时不能破坏其他蛋白质基因的表达，而且需要插入到启动子和终止子之间才能保证表达，因此选择2作为cDNA的插入位点。
（3）依据题干，重组酵母Y187与YIH接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒：质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于蛋白质工程，蛋白质工程的设计流程为预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列（基因），所以起点是预期蛋白质的功能。
3.答案：(1)农杆菌转化法；植物组织培养技术
(2)感受态细胞法；含有中间载体②PrbcS*T的微生物能在含有卡那霉素的培养基中生长，而①PrbcS*T的微生物不能在该培养基中生长
(3)1.7kb；SphⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ
(4)设计包含NcoⅠ识别序列的引物，然后用PCR技术扩增
解析：（1）将目的基因导入双子叶植物常利用农杆菌转化法。要想获得转基因植物，还需要对导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养。
（2）将中间载体导入微生物时，常先用钙离子处理微生物使其成为感受态，易于吸收中间载体，该种方法为感受态细胞法。由图可知，中间载体②上含卡那霉素抗性基因，而不含氨苄青霉素抗性基因，故含有中间载体②-PrbcS-*T的微生物能在含有卡那霉素的培养基中生长，而不能在含有氨苄青霉素的培养基中生长。
（3）由图可知，中间载体②的长度为2.7kb，经酶切后凝胶电泳，测得2B片段为0.4kb，设Prbcs-*T的长度为y，则2.7-0.4+y=4kb，解得y=1.7kb。根据图示中中间载体①-PrbcS-*T右侧的酶切位点和中间载体②-2B右侧的酶切位点可知，中间载体②-Prbcs-*T图中问号处限制酶的酶切位点可为SphⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ的酶切位点。
（4）可设计包含NcoⅠ识别序列的引物，然后用PCR技术扩增，即可在T基因前“点突变引入NcoⅠ”酶切位点。
4.答案：（1）限制酶和DNA连接；显微注射；受精卵；红色；无色
（2）红色或黄色或蓝色
（3）设法使小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成
解析：（1）本题考查基因工程的相关知识。基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理。将目的基因导入动物细胞，常用显微注射法。由图2中提示仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因可知，含图2的表达载体T的小鼠a（不含Cre酶）的脑组织细胞色彩为红色，其他组织细胞色彩为无色。
（2）小鼠A有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，loxP1、loxP2位置如图二黑、白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色；也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色；有可能敲除两个loxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色。因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因。
（3）在一个细胞内随机出现两种或两种以上颜色叠加，依据题目信息，可设计思路：设法使小鼠脑组织细胞内有2个相同的表达载体T，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内多个荧光蛋白的颜色叠加而成。
5.答案：（1） 载体（或质粒）
（2）限制 显微注射
（3）新霉素和丙氧鸟苷 DNA分子杂交 液氮（或冷冻）
（4）生理状态相同（或经同期发情处理） 生殖细胞
解析：（1）分析题图可知，将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到载体（或质粒）上，构建打靶载体（基因表达载体）。
（2）打靶载体测序验证正确后，利用限制酶，将之线性化，以提高重组率。通过显微注射技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组。
（3）neor是新霉素抗性基因，tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡，因此为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。最后还需要通过DNA分子杂交技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过动物细胞（或克隆）培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存。
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同（或经同期发情）的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。
6.答案：(1)纤维素酶和果胶酶
(2)离心，振荡，电刺激 保持原生质体完整性 细胞壁
(3)叶绿体
(4)分化 植物激素 丛芽
(5)双亲(或花椰菜和黑芥)
(6)黑腐病菌
解析：(1)①过程为原生质体的制备，需要去掉细胞壁，细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，酶具有专一性等特点，故用纤维素酶和果胶酶。
(2)诱导原生质体融合的方法包括物理法和化学法，物理法包括离心，振荡，电刺激等，化学法一般用聚乙二醇(PEG)诱导融合；原生质体没有细胞壁的保护，需要加入适宜浓度的甘露醇以保证渗透压的稳定，以避免原生质体吸水或失水破坏原生质体的完整性；原生质体通过细胞壁再生形成杂种细胞，进而形成愈伤组织。
(3)用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。
(4)杂种细胞具有全能性，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成愈伤组织。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而形成完整植株。
(5)分析再生植株染色体变异类型，需要将再生植株细胞染色体和黑芥苗与花椰菜细胞中的染色体制片观察进行比较，制片的基本程序是解离、漂洗、染色、制片。
(6)对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。
7.答案：(1)血清；产量低、纯度低、特异性差(至少写两点给分)
(2)特异性强、灵敏度高、可大量制备(至少写两点给分)；灭活的病毒
(3)①有一段已知目的基因的核苷酸序列；启动子、终止子(写全给分)；②酵母菌是真核生物，具有内质网、高尔基体等复杂的生物膜系统，能对初始形成的抗体进行加工、修饰，形成具有生物活性的抗体
解析：（1）传统抗体的制备是向生物体内反复注射某种抗原，使生物体产生抗体，再从动物的血清中分离所需抗体，但用这种方法提取的抗体，具有产量低、纯度低、特异性差等缺点，所以现在逐步被单克隆抗体取代。
（2）单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、可大量制备等优点。制备时需要从康复者的脾脏中分离出B淋巴细胞，在体外将其与骨髓瘤细胞融合，常见的融合方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒等，然后再经筛选、培养等步骤大量获得。
（3）①利用PCR技术扩增目的基因的前提条件是有一段已知目的基因的核苷酸序列。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。②人体合成的抗体需要膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，大肠杆菌是原核生物，其内没有内质网、高尔基体等生物膜系统，不能对细胞内形成的初始蛋白质进行加工、修饰，因此以大肠杆菌作为受体细胞生产的抗体不具有生物活性。而酵母菌是真核生物，具有内质网、高尔基体等生物膜系统，能对细胞内形成的初始蛋白质进行加工、修饰，因此以酵母菌作为受体细胞生产的抗体具有生物活性。
8.答案：（1）上升；与TfR特异性结合，阻止Tf与TfR结合，抑制铁元素的摄取
（2）将免疫接种过TfR的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的杂交瘤细胞，大量培养获得相应抗体
（3）相同
（4）①逆转录获得Fab基因编码区；②人-鼠嵌合抗体基因；④对基因的表达产物进行鉴定
解析：(1)铁元素的摄取是通过转铁蛋白(Tf)与转铁蛋白受体(TfR)特异性结合来实现的，肿瘤细胞由于增殖快速，需要更多的铁元素其细胞表面TfR的表达量会上升，以满足铁元素的摄取需求；TfR抗体与TfR通过特异性免疫作用，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
(2)向实验小鼠体内注射TfR，使小鼠体内产生相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞，制备该小鼠的脾细胞悬液，将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合制成杂交瘤细胞，再将杂交的细胞放入含有TfR抗体的培养基中进行筛选，最后得到TfR的单克隆抗体。
(3)无论何种抗体，杀伤细胞都可与之结合，说明抗体Fe段在不同的细胞中都是相同的，才能与所有抗体结合。
(4)基因工程的基本步骤是获取目的基因、基因表达载体的建构、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与坚定四步，因此从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA后，需要利用反转录酶获得目的基因的DNA序列，然后构建含有目的基因的表达载体，再将表达载体导入真核细胞进行表达，最后通过筛选坚定目的基因是否表达成功。
9.答案：（1）体液；浆细胞
（2）①胰蛋白酶；PEG（或聚乙二醇）；动物血清；
②
1 2 3 4 5 6
B2 a b β
③氨基酸种类（或“序列”）；蛋白质
（3）研制与肿瘤细胞和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，特异性杀死肿瘤细胞
解析：本题考查应用单克隆抗体的方法制备双特异性抗体及蛋白质工程的知识。
（1）注射抗原α、β引起机体产生体液免疫时浆细胞分泌相应抗体。
（2）①制备杂交瘤细胞时，需用胰蛋白酶处理小鼠的脾脏组织获得单细胞，再与小鼠的骨髓瘤细胞融合。用PEG试剂处理可促进两种杂交瘤细胞的融合。②图乙中抗体是双杂交瘤细胞产生的双特异性抗体，能同时与抗原α、β结合，结合图甲信息可确定表格中2、3、4、6分别对应B2、a、b、β。③欲改变此蛋白质的空间结构，往往是在A、B、a、b的恒定区通过改变氨基酸的种类实现，这种改造属于现代生物技术中的蛋白质工程。
（3）双特异性抗体在肿瘤治疗方面的应用前景：研制既能和肿瘤细胞结合又能和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，特异性杀死肿瘤细胞。
10.答案：(1)物质循环再生
(2)整体性
(3)分解者；抵抗力
解析：（1）图示的生态工程主要利用“无法回收的有机废物”进行物质和能量的高效多级利用，从而形成“无废弃物农业”，减少了污染，实现物质循环往复、多级利用，主要遵循生态工程的物质循环再生原理。
（2）由题意可知，此生态工程建设中，不仅考虑到了自然生态系统的规律，还考虑到了经济系统和社会系统的影响力，在充分利用能量，减少环境污染的同时，提高人们收入，使“社会一经济一自然”
这一复合生态系统良好发展，体现了生态工程的整体性原理。
（3）该方案中④利用微生物的分解作用，⑤利用营腐生生活的蚯蚓、苍蝇等分解有机废物，两个过程利用的生物属于生态系统中的分解者。由于绿色城市中生物成分和营养结构较自然生态系统更为单一，即抵抗力稳定性较低，为维持其结构和功能的稳定性，还需人类不断输入物质和能量。
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