课件16张PPT。分解纤维素的微生物的分离阅读课本27页基础知识部分第一、二段，回答下列问题：1、纤维素在生物圈的分布状况？2、纤维素酶的组成及作用？纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。一、纤维素和纤维素酶二、纤维素分解菌的筛选阅读课本课本28页相关部分，回答下列问题：1、纤维素分解菌的筛选方法2、纤维素分解菌的筛选方法的原理刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接
对微生物进行筛选 三、实验操作土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落土壤取样取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？ 选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。
生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境选择培养1、选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物2、制备选择培养基参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具 有，是如何进行选择的？ c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用是液体培养基，原因是配方中无凝固剂有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照3、操作方法：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养思考：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用梯度稀释 按照课题1 的稀释操作方法，将选择培
养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数
到106将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上1、制备培养基:参照旁栏中的比例
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养挑选产生透明圈的菌落参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时就加入刚果红思考：这两种方法各有哪些优点与不足? 方法一 缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发 生混杂；优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
方法二 优点是操作简便，不存在菌落混杂问题
缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分观看录像四、结果分析与评价（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落（二）分离的结果是否一致 设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。如果不同，分析产生不同结果的原因。五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。练一练：1、下列关于纤维素酶的说法，错误的是A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种
B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖
C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁
D、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是A、刚果红能与纤维素形成红色复合物
B、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物
C、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物
D、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌练一练3、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（ ）
A、生物结构与功能相适应的观点 B、生物结构与功能整体性观点
C、生物与环境相适应的观点 D、生物发展进化的观点4、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（ ）
①土壤取样 ②梯度稀释 ③选择培养 ④菌悬液涂布平板 ⑤挑选出单个菌落
A、 ①②③④⑤ B、①③②④⑤
C、 ①②④③⑤ D、①④②③⑤5、有关选择培养正确的叙述是（ ）A、可以增加纤维素分解菌的浓度
B、可以减少纤维素分解菌的浓度
C、所用培养基是固体培养基
D、所用培养基是平板培养基CBA课件11张PPT。课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 背景知识一、筛选菌种
1.在自然界寻找目的菌株时，要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中寻找。
2.在实验室菌种的筛选，用人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
选用选择培养基 背景知识二、测定微生物数量的方法：
1.直接计数法：最常用的显微镜直接计数法。
先将待测样品制成悬液，然后取 一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。
优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。
缺点：难以计数微小的细菌。
一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
2.间接计数法：最常用稀释平板计数法。
（常用来统计样品中活菌的数目）理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌选择菌落数在30—300的平板进行计数通常，统计的菌落数比活菌的实际数目低 背景知识三、设置对照
主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度实践案例 土壤中分离尿素的细菌的分离和计数 测定土壤中的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。
活动程序：
1、制备土壤稀释液
①取土壤表层土样
②称取1g土样，放入99ml无菌水锥形瓶中，振荡20min，即成100倍稀释液。
③移液、稀释
1ml无菌移液管吸取100倍稀释液0.5，移入装有4.5ml无菌水试管中，配制成1000倍稀释液。
用同样方法可制成 的系列稀释菌液。 2、取样及倒平板 ①培养皿编号： 各编号三个培养皿。
②培养皿中加入土壤稀释液：用移液管按照编号分别加入不同浓度土壤稀释液各0. 2ml。
③每个培养皿加入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml，转动培养皿，使土壤稀释液与培养基混合均匀。
3、培养 将平板冷却倒置放入28~30摄氏度的恒温培养箱中培养。
4、观察记录
有些细菌含有尿素分解酶，能将尿素琼脂培养基中的尿素分解生成氨，氨溶于水变成氢氧化铵，导致培养基变成碱性，使酚红指示剂呈现红色。
每克土壤样品菌数= 某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数÷涂布时所用的稀释液体积5、观看录像 下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水
D. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
练一练A某同学在稀释倍数为 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） ( ) A.2.34× B.2.34× C.234 D.23.4 B用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低B探究活动 测定特定样品中的微生物数量 检测天然水源中细菌总数和大肠菌群数
人的粪便中含有致病菌，但是因数量少而不易检测。大肠杆菌是生存于人体肠道中的正常菌群，且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌。因而常将大肠杆菌数量作为食品卫生的检测指标之一。
大肠菌群是指在37摄氏度条件下，24小时内能发酵乳糖，产酸产气的一类兼性厌氧型革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。大肠菌群数的检测，使用乳糖胆盐蛋白胨培养基、EMB培养基、乳糖发酵管。活动背景课件61张PPT。课题1 微生物的实验室培养专题2 :微生物的培养与应用微生物主要包括：病毒
细菌
放线菌
真菌
原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界 原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识细菌细菌：单细胞不分枝的原核微生物。
细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察 A.球菌 B.杆菌 C.弧菌
图1-1 常见的三种细菌典型形态1.外形与大小 细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。2.细菌的构造图1-3 细菌的结构3.细胞壁结构特点：坚韧且有弹性
主要由肽聚糖组成细胞壁有哪些功能？
①固定细胞外形；
②保护细胞免受外力的损伤；③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对
噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.4.芽孢5.菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异 6.细菌的营养类型 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。
自养菌（autotroph）
异养菌（heterotroph）
腐生菌
寄生菌 大部分病原菌
放线菌1、结构：
单细胞原核
分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
2.应用:
可生产链霉素、土霉素、四环素、
氯霉素、红霉素、庆大霉素等 微生物中发现了几千种抗生素，
其中2/3是由放线菌产生的 病毒1.外形与大小：无细胞结构SARS病毒、 禽流感病毒朊病毒（蛋白质病毒）2、病毒的增殖：真菌电子显微镜下的酵母菌酵母菌和霉菌青霉生殖：直立菌丝 营养菌丝腐生生活孢子生殖一、基础知识：（一）培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基可用于菌种分离、鉴定菌落等。
（2）按用途来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。
（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附录内容)3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。 选择培养基加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对
固定;成本低
缺点：缺少某些成分，不能完全满足
体外细胞生长需要。 合成培养基: 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）
②多种金属离子；
③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、
胶原等。
⑤各种生长因子
⑥转移蛋白
⑦不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然物质（如血清）。液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基：菌落半固体培养基：无动力 有动力(弥散)(是否运动) （二）无菌技术1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。 （１）消毒定义：
使用较温和的化学或物理方法，仅杀
死物体表面或内部一部分对人体有害
的微生物（不包括芽孢和孢子）2.消毒与灭菌的概念及两者的区别 （2）灭菌的定义： 使用强烈的化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或
80℃下煮15min
3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁
尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线消毒
……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌
2、干热灭菌：
160-170℃下加
热1-2h。
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法： 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过
而培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌
2、培养基的配制
3、培养基的灭菌
4、倒平板
5、微生物接种
6、恒温箱中培养
7、菌种的保存1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考二、实验操作 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）1．计算、称量
2．溶化
3．调pH： pH7．6
4．过滤：这一步可以省去。
5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
6．加塞
7．包扎操作步骤 8．灭菌:
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
9．倒平板:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.
10．无菌检查：
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板技术1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。2、纯化大肠杆菌接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术问题讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。问题讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养菌种的保存 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2、长期保存：甘油冷冻管藏法观看录像四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（二）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（三）是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录就会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。【典例解析】 例1．关于微生物营养物质的叙述中，正确的是
A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌
D.灭菌必须在接种前答案：B 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
如不想浪费此培养基，可再加入 .自养型微生物 含碳有机物 （3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。固氮微生物 3 调整pH 依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂） 本课题知识小结:
