课件26张PPT。课题3 血红蛋白的提取和分离思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：2、凝胶： 一些微小的多孔球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 1、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法 当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快3、原理：4、具体过程相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 能够抵制（ )对溶液的（ ）的影响，维持PH 基本不变。㈡ 缓冲溶液：1、作用：外界的酸或碱PH值2、缓冲溶液的配制通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内3.为什么在本实验中实用缓冲溶液? 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）思考：人体血液中缓冲液? NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3（三） 电泳：1.概念：带电离子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、
聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（ ）通常用 SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少 B 分子的大小
C 肽链的多少 D 分子形状的差异
二 实验操作----蛋白质的提取和分离：样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定蛋白质的提取和分离：（1）样品处理洗涤红细胞血红蛋白释放分离血红蛋白溶液。（2）粗分离（透析）
目的步骤a过程：
b目的：c原理：除去样品中分子量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。(3)纯化：（4）纯度鉴定：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。血液血浆水分其他：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细
胞白细胞血小板红细胞
（最多）血红蛋白
（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好用哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取。
人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。分离血红蛋白溶液有机溶剂 （无色透明的甲苯层）脂类物质 （白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液 （红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是______________________________。
②血红蛋白有什么特点？__________。
这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 下列操作正确的是（ ）
A. 分离红细胞时采用低速长时间离心
B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12hD下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ( )多
A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞
B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。
C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白
D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来 BCD在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是
A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C洗涤过程选用0.1%的生理盐水
D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质D凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1．6 cm，有关说法中，正确的是 多
A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果
B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果
C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度
D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大ＡＣＤ样品的加入和洗脱的操作不正确的是
A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A课件33张PPT。每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，
此基团可携带一分子氧或一分子二
氧化碳，血红蛋白因含有血红素而
呈红色。血红蛋白的特点： 本课题学习目标1、主要概念：
①凝胶色谱法
②电泳法
③缓冲溶液
④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
③缓冲溶液的组成和作用机理
（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或
琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;
②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,
其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液 （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，
可以在凝胶中加入SDS。
2.原理： SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。 二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的
分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。(2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次(4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。透析过程动画演示2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：3.方法步骤：（略） 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：
①样品的处理
②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2.提问：血液有哪些成分？ 1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，
此基团可携带一分子氧或一分子二
氧化碳，血红蛋白因含有血红素而
呈红色。血红蛋白的特点：1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。
A分子的大小 B相对分子质量的大小
C带电荷的多少 D溶解度
2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。
A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。
A相同 B相反 C相对 D相向
4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。
A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白BBBA5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。
A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞
6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。
A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠
7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ）
A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层
C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物CDC课件36张PPT。 本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：
①样品的处理
②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;
②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强
酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混
合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，
维持PH基本不变。2.作用: 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证
血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科
学研究(活性)磷酸缓冲液3.缓冲溶液的配制:其目的是: （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正 电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。影响蛋白质分子运动速度的因素√√√√√√√3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、测定蛋白质分子量:常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。2.原理： SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。 二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。2.提问：血液有哪些成分？ 1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，
此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而
呈红色。血红蛋白的特点：(1)红细胞的洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.1、采集血样
2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细
胞等一同沉淀，达不到分离的效果）
3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。
4、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9％
的NaCl溶液洗涤，搅拌10min
5、低速短时间离心：
6、重复3、4、5步骤三次
上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。①目的:②操作：洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，加40％体积的甲苯 （溶解细胞膜）置于磁力搅拌器搅拌10min（加速细胞破裂）红细胞破裂，释放出血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。
②试管中溶液层次：
第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；
第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；
第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；
第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：
滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，
分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液体。甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次(4)透 析：①过程：
取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h②目的：
除去样品中分子量较小的杂质和离子。
或用于更换样品的缓冲液。透析过程动画演示2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。
②底塞的制作：
打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：
A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度
及分离范围。
75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨
胀时吸水7.5克。
②凝胶的前处理：
配置凝胶悬浮液：
计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中
充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：
A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。
B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱
内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀
注意：
1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。
2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④洗涤平衡：
连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。
注意：
1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果
2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：
打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，
注意： 1、不要触及并破坏凝胶面。
2、贴壁加样
3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样
③样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，
样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
④洗脱：加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，
连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出
液，每5ml收集一试管，连续收集。
（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序包括：
样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、
离心等操作收集到血红蛋白溶液，
样品的粗分离:透析→去除分子量较小的杂质
样品的纯化：凝胶色谱法→除去相对分子质量较大
的杂质蛋白
纯度鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：3.方法步骤：（略） 观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。
此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？1、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。
2、加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。
3、色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；说明凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确
红色区带：歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？课件19张PPT。课题3 血红蛋白的提取与分离教学目标
教学重点
教学难点理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理
了解缓冲液的组成及其作用
血红蛋白的分离－－样品处理
凝胶色谱法的原理
电泳法分离大分子的原理分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶：是由多糖类化合物分子（如葡聚糖或琼脂糖）在一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体（凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量
较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，
移动速度较慢;
②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通
道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较
快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 凝胶色谱法分离蛋白质的原理
凝胶色谱柱洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 凝胶电泳法电泳带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。2. 血液有哪些成分？ 1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的
分离纯化。②洗涤操作： 1、采集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血液凝固。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。(2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以
2000r/min的速度离心10 min。
②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色
透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白
色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶
液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉
淀层（暗红色）。
③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏
斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 二、实验操作2、血红蛋白的粗分离----透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透
析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的
磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 实验操作原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。透析过程动画演示3、分离纯化血红蛋白---凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：（2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高装配好的凝胶柱（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
。课件32张PPT。课题3 血红蛋白的提取和分离专题5 DNA和蛋白质技术2003年4月14日宣布人类基因组序列图
完成这标志着进入了后基因组时代和蛋
白质组时代。对蛋白质的研究和应用，
首先要得到纯净的蛋白质。在本课堂中，
我们就一起来学校蛋白质的提取和分离。蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考一、基础知识：㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离的方法。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡ 缓冲溶液： 2、作用：
能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值 3、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发
生迁移的过程。 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） 2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）
移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度一定的PH分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人
的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定蛋白质的提取和分离一般分为四步：
二 实验操作1.样品血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐
磷脂
葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞
（最多）血红蛋白
（ ）两个a－肽链两个β一肽链共四条肽链90％每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：
目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤，重复三次直至上清液不再呈现黄色。
2、血红蛋白的释放：
3、分离血红蛋白溶液：
4、透析：红细胞的洗涤（一）样品处理1、红细胞的洗涤：
目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：
离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。
4、透析：分离血红蛋白溶液有机溶剂 无色透明的甲苯层脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液 红色透明液体红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物（一）样品处理1、红细胞的洗涤：
目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：
离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。
4、透析：
装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
透析过程视频（3.38’~）（二）凝胶色谱操作 （1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。视频（2.14’~） ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、使吸管管口沿管壁环绕移动。视频（6.30’~）（三）纯度鉴定使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：
（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。
（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。
（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。
（4）纯度鉴定：通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
视频（2.14’~）练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是
A 弄清各种蛋白质的空间结构
B 弄清各种蛋白质的功能
C 弄清各种蛋白质的合成过程
D 获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是
A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质
B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质
C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质
D 二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少 B 分子的大小
C 肽链的多少 D 分子形状的差异
4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是
A 调节pH B 维持红细胞的能量供应
C 防止微生物生长 D 防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数或者CO2分子数分别是
A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1
6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：
有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀课件33张PPT。课题3 血红蛋白的提取和分离专题5 DNA和蛋白质技术2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成
这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指DNA分子所携带的全部
遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究
新华网首尔１２月２９日电（记者 干玉兰）韩国浦项工业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。
浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期《分子细胞》杂志上。
2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩＭ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。
我国对蛋白质的现阶段研究
我国独立主持国际“人类肝脏蛋白质组计划”，参加国际人类蛋白质组研究计划中的“大规模抗体制备”项目
思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质
的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人
的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。一、基础知识：㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡ 缓冲溶液： 2、作用：
能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值 3、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发
生迁移的过程。 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） 2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）
移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度一定的PH分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以对其鉴定。 说明：电泳检测结果（四）血红蛋白在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个α—肽链和两个β—肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：
（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。
（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。
（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。
（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
二 实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：
1.样品处理血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐
磷脂
葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞
（最多）血红蛋白
（ ）两个a－肽链两个β一肽链样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定共四条肽链90％（一）样品处理1、红细胞的洗涤：
目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：
离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。
4、透析：
装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。红细胞的洗涤分离血红蛋白溶液有机溶剂 无色透明的甲苯层脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液 红色透明液体红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是
A 弄清各种蛋白质的空间结构
B 弄清各种蛋白质的功能
C 弄清各种蛋白质的合成过程
D 获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是
A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质
B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质
C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质
D 二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少 B 分子的大小
C 肽链的多少 D 分子形状的差异
4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是
A 调节pH B 维持红细胞的能量供应
C 防止微生物生长 D 防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是
A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1
6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：
有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀课件56张PPT。 本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
③缓冲溶液的组成和作用机理
本课题学习重点和难点 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：
①样品的预处理
②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。2.提问：血液有哪些成分？ 1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，
此基团可携带一分子氧或一分子二
氧化碳，血红蛋白因含有血红素而
呈红色。血红蛋白的特点：1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离3.高温灭菌和酒精灭菌的结果： 使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或
琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强
酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混
合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，
维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水
中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,
其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证
血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科
学研究(活性)磷酸缓冲液 缓冲溶液的组成及分类①弱酸及其对应的盐：②弱碱及其对应的盐：③多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:H2CO3→NaHCO3 ；CH3COOH→CH3COONaNH3?H2O→NH4CL ; NH4OH→NH4CLNaHCO3→Na2CO3 ；NaH2PO4→Na2HPO4 缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸；
能对抗外来强酸的称为共轭碱。
这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。
常见的缓冲对主要有如下三种类型： （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，
可以在凝胶中加入SDS。
2.原理： SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。 二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的
分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。采集得到血液柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果(2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 二、实验操作磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次(4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 二、实验操作透析过程动画演示利用透析袋透析2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装配好的凝胶柱 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：3.方法步骤：（略） 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的： ①丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的贮存液。②十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双 丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。⑦样品处理液：? 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。⑧染色液：? 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。
2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。
3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。②分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备：3、电泳方法步骤（3）样品处理：在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100 ℃温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。（9）脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。3、电泳方法步骤 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？三、实验结果分析与评价本课题作业;1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?
2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?
3.电泳的作用及其原理是什么?
4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?
5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行
蛋白质的分离有什么意义? 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。 1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?练习2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。
缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。练习3.电泳的作用及其原理是什么? 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。练习4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 练习5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行
蛋白质的分离有什么意义? 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。
A分子的大小 B相对分子质量的大小
C带电荷的多少 D溶解度
2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。
A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。
A相同 B相反 C相对 D相向
4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。
A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白BBBA5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。
A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞
6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。
A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠
7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ）
A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层
C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物CDC下课了！
