课件33张PPT。微生物的培养与应用土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(一)筛选分离分解尿素的细菌 （1）实验方法:选择培养 人为提供有利于目的微生物生长的条件(包括营养物质、温度、PH值等),同时抑制其它微生物的生长.即微生物的选择培养。 选择培养基:在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基. （2）实验原理加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌
不加含碳有机物的培养基:分离自养微生物
不含碳、氮源的培养基：分离自养固氮微生物改变某种条件:如温度、PH值等(3)培养基成分分析 在该培养基的配方中，葡萄糖是C源也是能源;尿素是培养基中的惟一氮源.
因此，原则上该培养基只有能够利用尿素的微生物才能够生长。具有选择作用,能够将利用尿素的微生物选择出来分析（二）微生物生长量的测定方法：1、直接计数法:参见必修3
注意：接种一种微生物，在液体培养基培养，定期取样计数。2、间接计数法:是根据微生物在培养基上所形成的菌落数来推测样品液中活细菌的数目。 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。（1）理论依据：说明：
1）间接计数中，恰当的稀释度是成功统计的菌落数目的关键（参见实验设计部分）；
2）间接计数统计的菌落数往往比活细菌数目低。（2）操作：1)设置重复组:增强实验的说服力与准确性（至少2个平板);
2)选择菌落数在30-300的平板计数。（3）计算公式：C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)
M代表稀释倍数思考题 1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。 A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有三种。
一是由于土样不同；
二是由于培养基污染或操作失误;
三是实验组太少，缺乏可重复性。 （三）设置对照对照实验是指除了被测条件(实验变量或自变量),其它条件(无关变量)完全相同的实验.
分为:空白对照、条件对照、相互对照和标准对照等. 另一种方案(空白对照)：
将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染(做四个平板)。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验方案有两种 一种方案(相互对照)：
可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验,增加实验组数(每同学做四个平板)，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。四、实验案例 实验的具体操作步骤如下:
1.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装（事先要灭菌）入准备好的信封中。土壤中某样品细菌的分离与计数 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。 2.制备培养基? 将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。 3.微生物的培养与观察?
将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。
例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。思考题4.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 五、操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。附：鉴别大肠杆菌培养基大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 七、例题解析 例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是
A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：A 例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是
A．调整期 B．对数期
C．稳定期 D．衰亡期 解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。答案：C 例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。
⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的 代谢产物。
⑵在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 比较稳定。
⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型次级对数个体的形态生理特性称菌体的湿重（称烘干后的重量） 解析：
青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。课件19张PPT。专题2 微生物的培养与应用课题2:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【课题目标】 研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。 【研究对象】 土壤中能分解尿素的细菌【达到目的】（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这
样的细菌课题背景 尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氮之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
尿素最初是从人的尿液中发现的。
1828年，德国化学家维勒成功地通过无机物的化学反映合成了尿素，揭开了历史上人工合成有机物的新篇章。尿素课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【研究思路】 （一）筛选菌株原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。有选择作用，回答：
1、在该配方中，为微生物生长提供碳源和氮源的是什么物质？
2、绝大多数的微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，请分析该培养基是否对微生物有选择作用？如果有，是如何进行选择的？葡萄糖、尿素选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。【统计菌落数目】常用方法：稀释涂布平板法、显微镜直接计数法， 还可以用过滤膜法1、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②为了保证结果的准确，一般选择菌落数在30—300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。 计算公式：
每克样品中的菌落数=（某一稀释度下平板上生长的平均菌落数／涂布平板所用稀释液体积）×稀释倍数①设置重复组，目的是增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1ml接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为是结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布培养，计算出菌落平均数操作2、显微镜直接计数法（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
（2）方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。（3）操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4~5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
（4）计算公式
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍数
（5）缺点：不能区分死菌与活菌。
3过滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。思考题 1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。 A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。
一是由于土样不同；
二是由于培养基污染或操作失误。 （三）设置对照究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 另一种方案：
将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验方案有两种 一种方案：
可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。四、实验案例 实验的具体操作步骤如下:
1.土壤取样?
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。土壤中某样品细菌的分离与计数2.设置重复组，目的是增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1ml接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为是结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布培养，计算出菌落平均数 计算公式：
每克样品中的菌落数=（某一稀释度下平板上生长的平均菌落数／涂布平板所用稀释液体积）×稀释倍数3.为了保证结果的准确，一般选择菌落数在30—300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。课件29张PPT。专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数两个主要目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样
的细菌专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数两个主要目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样
的细菌CO（NH2）2 + H2OCO2+2NH3脲酶一 研究思路（一）筛选菌株耐高温的DNA聚合酶一 研究思路（一）筛选菌株耐高温的DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克
1966年发现水生耐热细
菌Taq
分离到耐高温的Taq
DNA聚合酶一 研究思路（一）筛选菌株自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应的环境
中去寻找。一 研究思路（一）筛选菌株自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应的环境
中去寻找。实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包
括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止
其他微生物生长。一 研究思路（一）筛选菌株选择培养基：一 研究思路（一）筛选菌株选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物
生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生
长的培养基。目的是从众多微生物中分离
所需要的微生物。 一 研究思路（二）统计菌落数目1.显微镜直接计数：先将待测样品制成悬液，然后取一定量的
悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微
镜下观察到的微生物数目来计算出单位体
积内的微生物总数一 研究思路（二）统计菌落数目1.显微镜直接计数：先将待测样品制成悬液，然后取一定量的
悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微
镜下观察到的微生物数目来计算出单位体
积内的微生物总数优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：不能区分死菌和活菌。一 研究思路（二）统计菌落数目2.稀释涂布平板计数法: 应用：统计样品中活菌的数目原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生
长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一
个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能
推测出样品中大约含有多少活菌。注意：一般选择菌落数在30-300的平板进行记数。一 研究思路（二）统计菌落数目2.稀释涂布平板计数法: 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置
重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂
布了3个平板，但是，其中1个平板的计数
结果与另2个相差太远，说明在操作过程
中可能出现了错误，因此，不能简单地将
3个平板的计数值用来求平均值。一 研究思路（三）设置对照增强实验的说服力和准确性。将待测样品经过一系列的稀释，然后选择
三个稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然
后培养。注意：为了结果接近真实值，可将同一稀
释度菌液涂布到3个或3个以上的平板上，
经培养，计算出菌落的平均数。一 研究思路（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：对照培养基接种后培养观察菌落数目。计算公式：每克样品中的菌株数 =（C÷V）×M某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得
平板上菌落数的平均数为234，那么每克样
品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液
的体积为0.1ml）
A. 2.34×108
B. 2.34×109
C. 234
D. 23.4 每克样品中的菌株数 =（C÷V）×M某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得
平板上菌落数的平均数为234，那么每克样
品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液
的体积为0.1ml）
A. 2.34×108
B. 2.34×109
C. 234
D. 23.4 每克样品中的菌株数 =（C÷V）×M二 实验设计1. 实验设计的内容包括：实验方案、材料用具、实施步骤和时间
安排等。二 实验设计2. 实验流程：土壤取样样品系列稀释涂布平板与培养观察并记录结果 菌落计数二 实验设计2. 实验流程：（1）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层
土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准
备好的信封中。（2）样品的稀释因为不同微生物在土壤中含量不同，其目
的是保证获得菌落数在30～300之间。
不同。二 实验设计2. 实验流程：（3）微生物的培养与观察①培养皿编号：104、105、106各编号三个
培养皿。②每个培养皿加入牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
15ml。③用移液管按照编号分别加入不同浓度土壤稀释 ④冷却倒置放入30~37摄氏度的恒温培养箱中
培养。观察纪录。液各0. 1ml，转动培养皿，使土壤稀释液与培养基混合均匀。三 操作提示1. 无菌操作2. 做好标记3. 规划时间四 结果分析与评价五 课题延伸1. 对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要
借助生物化学的方法。2. 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合
成的脲酶将尿素分解成了氨 。氨会使培
养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们
可以通过检测培养基pH变化来判断该化学
反应是否发生。五 课题延伸3. 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚
红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，
指示剂将变红 ，说明该细菌能够分解尿素。练习1. 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的
数目，其结果与实际值相比
A. 比实际值高
B. 比实际值低
C. 和实际值一致
D. 比实际值可能高也可能低练习1. 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的
数目，其结果与实际值相比
A. 比实际值高
B. 比实际值低
C. 和实际值一致
D. 比实际值可能高也可能低练习2. 下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是
A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
葡萄糖、尿素、琼脂、水
B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
葡萄糖、琼脂、水
C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
尿素、琼脂、水
D. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水练习2. 下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是
A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
葡萄糖、尿素、琼脂、水
B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
葡萄糖、琼脂、水
C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
尿素、琼脂、水
D. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水课件29张PPT。土壤中分解尿素、纤维素的细菌的分离与计数 分离微生物的原理土壤中分解尿素的细菌的分离实验土壤中分解纤维素的细菌的分离实验2．纤维素分解菌的筛选原理课件17张PPT。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数不加含碳有机物的无碳培养基:常见的选择培养基分离自养微生物不加氮源的无氮培养基:分离固氮微生物加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌以纤维素作唯一碳源的培养基:分离纤维素的微生物1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦C2、已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。
（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。
方法： 。
原理：
。2加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖 培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞3、某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)( )
A 2.34×108 B．2.34×109
C．234 D．23.4B3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基C4．下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用自来水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在30~ 300之间的实验组平板进行计数A5．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A．以尿素为惟一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
B．以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂
C．以尿素为惟一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为惟一氮源的培养基中加入双缩脲试剂B小结：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①筛选菌株：利用 筛选菌株。 ②测定微生物数量的常用方 法： 和 直接 计数。 ③过程：土壤取样→ _________→ ________→微生物的培养与观察。选择培养基活菌计数法显微镜 样品的稀释涂布平板6．某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。实验的主要步骤如下。请分析回答问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选__________，这种培养基属于__________培养基。
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的__________，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是__________。目的菌选择化合物A异养厌氧型6．某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。实验的主要步骤如下。请分析回答问题：(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量__________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量__________。
(4)转为固体培养时，常采用__________的方法接种，获得单菌落后继续筛选。减少增加平板划线1．(2008·广东)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源苯酚1．(2008·广东)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用_____________法。A稀释涂布平板1．(2008·广东)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题： (2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于________；
使用________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？④含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚作为唯一碳源稀释涂布平板或平板划线分离避免培养过程产生的水分影响微生物的生长1．(2008·广东)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：(3)如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？________________________________________________________________________。用同样苯酚浓度的培养液培养不同菌株，一定时间后，测定培养液中苯酚含量1．(2008·广东)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：(4)实验过程中如何防止其它微生物的污染？_____________________________________________。培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作课件35张PPT。课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样
的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照 1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的
要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多
数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。什么是选择性培养基？3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、培养基选择分解尿素的微生物的原理6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为
唯一氮源
的培养基牛肉膏
蛋白胨
培养基?是分离
尿素
细菌判断该
培养基
有无选
择性只生长尿素细菌生长多种微生物是6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为
唯一氮源
的培养基牛肉膏
蛋白胨
培养基?是分离
尿素
细菌判断该
培养基
有无选
择性只生长尿素细菌生长多种微生物是1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌
落数目的实验时，A同学从对应的106
倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌
落，但是其他同学在同样的稀释度下
只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，
⑵培养基污染或操作失误
(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行[三]样品的稀释㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。㈣.取样涂布◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同
㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。微生物的培养与观察三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 本课题知识小结:六、例题解析 例1．对细菌群体生长规律测定正确的表述是
A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：A1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）
A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌
C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质
2.使用选择培养基的目的是（ ）
A.培养细菌
B.培养真菌
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素实践训练A CD4.下列说法不正确的是（ ）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐BC 练一练 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低B下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水
D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
1
下课了课件31张PPT。课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数专题2
微生物的培养与应用一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照 1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；
方法：
⑴抑制大多数微生物不能生长
⑵造成有利于该菌生长的环境，
结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、培养基选择分解尿素的微生物的原理1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。计数法直接计数法、
平板计数法、
比浊法、
膜过滤法例题：统计菌落数目的方法有 （ ）A.①②③⑥ B.③④⑤⑥
C.②③④⑥ D.①③④⑥D①涂布平板法 ②重量法 ③直接计数法 ④比浊法 ⑤ 生理指标法 ⑥ 膜过滤法设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板[三]样品的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。
选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。微生物的培养与观察三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 本课题知识小结:六、例题解析 例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是
A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：A 例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是
A．调整期 B．对数期
C．稳定期 D．衰亡期 解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。答案：C1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）
A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌
C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质
2.使用选择培养基的目的是（ ）
A.培养细菌
B.培养真菌
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素实践训练A CD4.下列说法不正确的是（ ）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐BC 例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。
⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的 代谢产物。
⑵在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 比较稳定。
⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型次级对数个体的形态生理特性称菌体的湿重
（称烘干后的重量）下课了
