基因工程
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课件37张PPT。基 因 工 程什么叫基因工程？ 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过在生物体外进行DNA 重组等技术，赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术.（一）基因工程的概念基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品切割→拼接→导入→表达基因重组▲基因工程的若干问题:1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来的。能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间(此处叫“切点”)的磷酸二酯键断开(注意:不是氢键).（二）DNA重组技术的基本工具及其作用注意: 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在一个特定的切点上切割DNA分子。即：特异性. (注意:特异性表现在两个方面.)▲限制性内切酶的特异性表现在:
特定的核苷酸序列-----是“回文序列”(?).
特定的切点.AATTGCCTTAAGDNA双链及“磷酸二酯键”磷酸二酯键 1.大肠杆菌(EcoRΙ)的一种限制酶能识别的脱氧核苷酸序列是(用碱基表示)_____________ ;切点在________之间。限制酶▲看图回答:GAATTCG和A2.若从切点处切开,形成的两个DNA片断是怎样的? 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端.注意:
切口处的两条单链一长一短.伸出来的那一条长链叫黏性末端限制酶▲在G和A之间被限制酶切断的是化学键是___________________.▲“黏性末端”和“平末端” 当限制酶在它识别序列的中心轴线的两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端.
而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。2.DNA连接酶——“分子缝合针”▲DNA连接酶的种类(根据来源分)及其在功能上的异同.
----见课文P5.来源功能同异名称E.Coli
DNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体形成磷酸二酯键只能:互补的黏性末端黏性末端和平末端均可 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口(注意位置)连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了.▲思考:
DNA连接酶的作用是使断口处的相邻的两个脱氧核苷酸之间形成____________键. 异:
DNA连接酶:是将几个DNA片段连接起来;不需DNA模板.
DNA聚合酶:则是将脱氧核苷酸连接(聚合)成DNA;需以DNA的一条链为模板.▲提示:
注意比较基因工程中的DNA连接酶和DNA复制中的DNA聚合酶的作用有何异同? 同:两种酶都是形成磷酸二酯键.3.基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”. 常用的运载体主要有两类：
1）质粒:一些细菌细胞质里的质粒.
2）病毒:噬菌体(即细菌病毒)或某些动、植物病毒.▲什么是质粒? 是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体(即原核的DNA)之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.
质粒是基因工程最常用的载体.
绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个.▲小结:
质粒是小型、环状的DNA分子. 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。▲质粒的一种:大肠杆菌的质粒▲注意:能充当载体的是大肠杆菌的质粒,而不是大肠杆菌.▲作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。
3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;
5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.(三)基因工程的基本操作程序1）目的基因的获取
2）“基因表达载体”的构建
3）将目的基因导入受体细胞(即“转化”)
4）目的基因的检测与鉴定步骤一：目的基因的获取▲什么叫目的基因?
主要是指编码蛋白质的结构基因.▲获取目的基因的途径有哪些?1.从“基因文库”中获取.
2.利用“PCR技术”扩增.
3.直接人工合成(适合于基因较小且已知其核苷酸顺序)▲从基因文库中获取“目的基因”：什么叫“基因文库”?分为:
1.基因组文库:
基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.
2.部分基因文库:
基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.如cDNA文库. 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 类似从图书馆里取书.▲利用PCR技术扩增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶链式反应”,是一种在生物体外复制特定DNA片断的技术.
2.原理:DNA的半保留复制.
3.过程:
4.优点:大量获取目的基因.(指数式扩增, 近2n)▲人工合成目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。1.通过反转录法合成:又分为:目的基因的mRNA(已知)单链DNA双链DNA
(即目的基因)反转录合成2.直接合成. 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成步骤二：基因表达载体的构建.▲什么是“基因表达载体”? 就是已经装上了(含有)目的基因的载体. 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。
2）用同一种限制酶切取目的基因，使其产生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）▲目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程▲基因表达载体的构建步骤.
▲提示与思考:
1.“基因表达载体”就是已插入目的基因的载体.2.看左图回答:
基因表达载体由哪些部分组成?___________.3.启动子:是有特殊结构的DNA片断,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的识别和结合的部位.有它才能驱动目的基因转录出MRNA.最终获得蛋白质. (不是复制!)
4.终止子:位于目的基因的端尾端.作用是终止转录.
5.标记基因:是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来.如“抗生素基因”、“荧光标记基因”等. (醒目的,特别的标记) ▲什么叫转化?
将目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定(如复制)和表达(即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程.▲受体细胞是指什么?它包括哪些细胞?步骤三：
转化----将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法. 将目的基因导入植物细胞的其他方法:
花粉管通道法
基因枪法.2.将目的基因导入动物细胞---显微注射法.3.将目的基因导入微生物细胞—感受态细胞法 1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。
2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。
3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。步骤四：目的基因的检测与鉴定▲怎样检测和鉴定?目的基因的检测与鉴定检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法--方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交▲DNA分子杂交原理： DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。基因探针： 基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
特定的核苷酸序列-----是“回文序列”(?).
特定的切点.AATTGCCTTAAGDNA双链及“磷酸二酯键”磷酸二酯键 1.大肠杆菌(EcoRΙ)的一种限制酶能识别的脱氧核苷酸序列是(用碱基表示)_____________ ;切点在________之间。限制酶▲看图回答:GAATTCG和A2.若从切点处切开,形成的两个DNA片断是怎样的? 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端.注意:
切口处的两条单链一长一短.伸出来的那一条长链叫黏性末端限制酶▲在G和A之间被限制酶切断的是化学键是___________________.▲“黏性末端”和“平末端” 当限制酶在它识别序列的中心轴线的两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端.
而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。2.DNA连接酶——“分子缝合针”▲DNA连接酶的种类(根据来源分)及其在功能上的异同.
----见课文P5.来源功能同异名称E.Coli
DNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体形成磷酸二酯键只能:互补的黏性末端黏性末端和平末端均可 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口(注意位置)连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了.▲思考:
DNA连接酶的作用是使断口处的相邻的两个脱氧核苷酸之间形成____________键. 异:
DNA连接酶:是将几个DNA片段连接起来;不需DNA模板.
DNA聚合酶:则是将脱氧核苷酸连接(聚合)成DNA;需以DNA的一条链为模板.▲提示:
注意比较基因工程中的DNA连接酶和DNA复制中的DNA聚合酶的作用有何异同? 同:两种酶都是形成磷酸二酯键.3.基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”. 常用的运载体主要有两类：
1）质粒:一些细菌细胞质里的质粒.
2）病毒:噬菌体(即细菌病毒)或某些动、植物病毒.▲什么是质粒? 是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体(即原核的DNA)之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.
质粒是基因工程最常用的载体.
绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个.▲小结:
质粒是小型、环状的DNA分子. 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。▲质粒的一种:大肠杆菌的质粒▲注意:能充当载体的是大肠杆菌的质粒,而不是大肠杆菌.▲作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。
3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;
5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.(三)基因工程的基本操作程序1）目的基因的获取
2）“基因表达载体”的构建
3）将目的基因导入受体细胞(即“转化”)
4）目的基因的检测与鉴定步骤一：目的基因的获取▲什么叫目的基因?
主要是指编码蛋白质的结构基因.▲获取目的基因的途径有哪些?1.从“基因文库”中获取.
2.利用“PCR技术”扩增.
3.直接人工合成(适合于基因较小且已知其核苷酸顺序)▲从基因文库中获取“目的基因”：什么叫“基因文库”?分为:
1.基因组文库:
基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.
2.部分基因文库:
基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.如cDNA文库. 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 类似从图书馆里取书.▲利用PCR技术扩增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶链式反应”,是一种在生物体外复制特定DNA片断的技术.
2.原理:DNA的半保留复制.
3.过程:
4.优点:大量获取目的基因.(指数式扩增, 近2n)▲人工合成目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。1.通过反转录法合成:又分为:目的基因的mRNA(已知)单链DNA双链DNA
(即目的基因)反转录合成2.直接合成. 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成步骤二：基因表达载体的构建.▲什么是“基因表达载体”? 就是已经装上了(含有)目的基因的载体. 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。
2）用同一种限制酶切取目的基因，使其产生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）▲目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程▲基因表达载体的构建步骤.
▲提示与思考:
1.“基因表达载体”就是已插入目的基因的载体.2.看左图回答:
基因表达载体由哪些部分组成?___________.3.启动子:是有特殊结构的DNA片断,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的识别和结合的部位.有它才能驱动目的基因转录出MRNA.最终获得蛋白质. (不是复制!)
4.终止子:位于目的基因的端尾端.作用是终止转录.
5.标记基因:是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来.如“抗生素基因”、“荧光标记基因”等. (醒目的,特别的标记) ▲什么叫转化?
将目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定(如复制)和表达(即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程.▲受体细胞是指什么?它包括哪些细胞?步骤三：
转化----将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法. 将目的基因导入植物细胞的其他方法:
花粉管通道法
基因枪法.2.将目的基因导入动物细胞---显微注射法.3.将目的基因导入微生物细胞—感受态细胞法 1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。
2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。
3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。步骤四：目的基因的检测与鉴定▲怎样检测和鉴定?目的基因的检测与鉴定检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法--方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交▲DNA分子杂交原理： DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。基因探针： 基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。