江苏省南京航空航天大学苏州附属中学2021-2022学年高二下学期期中（线上）生物试卷
一、单选题
1．（2022高二下·南京期中）某同学用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌纯化培养。下列说法正确的是（ ）
A．牛肉膏蛋白胨培养基需经高压蒸汽灭菌后调节pH
B．蛋白胨可为大肠杆菌生长提供氮源、碳源和维生素
C．倒平板操作中，平板未凝固时迅速将平板倒过来放置
D．为区分恒温培养箱中不同的培养皿，应该在其皿盖做好标记
2．（2022高二下·南京期中）下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述中，错误的是（ ）
A．用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B．平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C．稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D．用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大
3．（2022高二下·南京期中）为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，下图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如下图2。下列相关叙述正确的是（ ）
A．为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②
B．图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C．图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
4．（2022高二下·南京期中）从某污水处理系统中分离出多种细菌，经进一步筛选获得具有高效降低污水中有机污染物（COD为有机污染物分解时化学需氧量）能力的菌株，过程如下图所示。下列相关说法错误的是（ ）
A．牛肉膏蛋白胨培养基可用高压蒸汽灭菌法灭菌
B．若采用题目中分离纯化方法进行计数，计数结果比实际值小
C．图中平板划线法获得的菌落具有不同的菌落特征
D．挑取单菌落后接种到液体培养基中培养，目的是扩大化培养菌株
5．（2022高二下·南京期中）图表示利用铁皮石斛新生营养芽诱导培育出的拟原球茎(简称PLBs)，在不同条件下生产生物碱的实验结果。下列叙述正确的是（ ）
A．通常在培养基中添加葡萄糖用于调节渗透压
B．选取的新生营养芽外植体需灭菌后再诱导培育
C．黑暗条件不利于叶绿素的合成，光合作用无法进行
D．光照条件下PLBs的重量与生物碱含量成正相关
6．（2022高二下·南京期中）如下图所示为农作物新品种的育种方式，相关叙述错误的是（ ）
A．②③过程分别称为脱分化和再分化，开辟了植物繁殖的新途径
B．⑤过程中若连接的是黏性末端，则可使用E·coliDNA连接酶
C．①过程为植物体细胞杂交技术，可通过是否再生细胞壁鉴定杂种细胞
D．若要获得耐盐突变体，可对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理
7．（2022高二下·南京期中）Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，可以利用PCR技术检测其转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。如图为克隆猪的培育及Bcl-2基因转录水平检测流程，下列说法错误的是（ ）
A．图中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示体细胞
B．在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的
C．图中过程X表示逆转录，获得的cDNA可用于克隆猪基因组的测序
D．在PCR过程中，（Bcl-2 cDNA）/cDNA的比值反映Bcl-2基因的转录水平
8．（2022高二下·南京期中）人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图。相关叙述正确的是（ ）
A．①过程所用的促融方法与植物体细胞杂交完全相同
B．③过程以抗HCG单克隆抗体为抗原进行检测
C．应给小鼠多次注射HCG，以获得较多的记忆细胞
D．④过程需要添加抗生素等物质，以防止病毒污染
9．某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行培养，下列叙述正确的是( )
A．制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理
B．肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸
C．为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的干扰素
D．用血球计数板计数的方法，可推断乙细胞比甲细胞增殖周期长
10．（2022高二下·南京期中）下图是用基因工程技术培育抗棉铃虫的转基因棉花过程，有关该过程叙述错误的是 （ ）
A．抗虫基因的表达产物为多肽
B．抗虫基因的插入不会改变受体细胞的染色体结构
C．受体细胞除去细胞壁更利于基因的导入
D．通过Ti质粒上的抗性基因筛选试管苗
11．（2017高三上·丰台期末）土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T﹣DNA片段转入植物的基因组．利用农杆菌以Ti质粒作为运载体进行转基因，下列相关叙述正确的是（ ）
A．目的基因应插入T﹣DNA片段外，以防止破坏T﹣DNA
B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T﹣DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体
12．（2022高二下·南京期中）科学家通过转入四种基因，可使体细胞形成诱导性多能干细胞（iPS细胞），并将其注射到无法发育到成体阶段的四倍体囊胚中，最终获得克隆鼠，经鉴定证实克隆鼠是由iPS细胞发育而来并可繁殖后代，实验流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．可用显微注射法或用经过修饰的病毒导入四种基因
B．克隆鼠的体色为黑色且染色体组数与黑鼠相同
C．灰鼠受精卵第一次卵裂生成的子细胞经电激诱导两两融合后可发育成四倍体囊胚
D．该实验过程中使用到的技术有体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
13．（2021·南京模拟）下列与果酒、果醋和泡菜制作有关的叙述，正确的是（ ）
A．制作果醋的前提是制作果酒，因为醋酸菌可将酒精氧化为醋酸
B．通常情况下，泡菜制作1~2天即可食用，并需偶尔进行排气操作
C．使用的菌种通常取自于自然环境，若要提高产品品质，可接种优良菌种
D．所用制作原料和器具都需要进行严格灭菌，且发酵全过程都需在无菌环境
14．（2018·南通模拟）下图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是 （ ）
A．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
B．过程②用Ca2+处理可提高转化成功率
C．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
D．筛选得到的A是无农杆菌附着的转化愈伤组织
二、多选题
15．（2022高二下·南京期中）运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作运载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的相符的是（ ）
A．用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体
B．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌
C．可用PCR技术大量扩增目的基因
D．用Ca2﹢处理大肠杆菌使其易于转化
16．（2022高二下·南京期中）日前微信传言手机屏幕细菌比马桶按钮上的多。两个兴趣小组分别展开如下图的实验过程。下列分析正确的是（ ）
A．通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物
B．以上两组实验在接种过程中均需要用到酒精灯、接种环等
C．两组实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同，原因可能是取样部位不同
D．该实验对照组可以设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养
17．（2021·苏州模拟）从红豆杉属植物中提取分离出的紫杉醇是一种有效的抗癌药物，自然状态下红豆杉生长慢，紫杉醇含量低，通过植物细胞悬浮培养技术可获得大量紫杉醇。植物细胞悬浮培养是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中，用摇床或转床进行大规模培养的方法。通过不断的继代培养筛选出疏松性均匀一致、分散性良好、大小大致相同的细胞和细胞团，建立悬浮培养细胞系。据图叙述正确的是（ ）
A．离体的红豆杉组织细胞通过果胶酶分散处理后直接进行悬浮培养
B．悬浮培养液中大多数细胞在形态上呈等径形，核-质比率大，胞质浓厚，液泡化程度高
C．植物细胞悬浮培养培养液中一般细胞分裂素与生长素含量比值小于1
D．植物细胞悬浮培养中植物细胞生长没有接触抑制，因此只要空间足够大，就可以扩大培养。
18．（2022高二下·南京期中）下列有关“基因污染”叙述中，正确的是（ ）
A．转基因生物有可能成为“外来物种”，影响生态系统的稳定性
B．转基因生物的外源基因本身来源于自然界，故不存在“基因污染”的问题
C．抗除草剂基因有可能通过花粉传播进入杂草，从而产生“超级杂草”
D．“基因污染”有可能会从一种生物扩散到其它多种生物物种
19．（2021·南京模拟）下图为单克隆抗体制备过程示意图。下列有关叙述正确的是（ ）
A．X细胞是从脾脏中提取的已免疫的B淋巴细胞
B．Y细胞是杂交瘤细胞，通常取用培养10代以内的细胞
C．图中筛选过程至少两次且方法不同，最终保留抗体检测呈阳性的细胞
D．图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象
三、综合题
20．（2022高二下·南京期中）花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病。野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。据图回答下列问题：
（1）过程①所需的酶是 。
（2）过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的 存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是 。原生质体经过 再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
（4）脱分化形成的愈伤组织在 、 两种植物激素的作用下，经 过程形成再生植株。
（5）采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果。据下图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有 。
（6）对杂种植株进行 接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
21．（2022高二下·南京期中）某研究小组分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌时，选取了从自然界中采集到的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中进行培养。回答下列问题：
（1）配制酵母菌培养液时，需控制培养液的浓度，浓度过高则会导致另需加入一定剂量的青霉素等抗生素，其目的是 ，对培养液进行灭菌时，切断高压蒸汽灭菌锅热源后，须待观察到 时，才能打开放气阀以释放锅内余气，最后开启锅盖取出培养液。
（2）该研究小组成功分离出某品种的酵母菌后，用等量菌液分别接种于3个盛有等量液体培养基的锥形瓶中，并分别置于转速为150r/min、200r/min、250r/min的摇床上培养，检测结果如图1所示，摇床转速为250r/min的酵母菌种群密度最大的原因是 。
（3）图2是采用血细胞计数板直接计数和稀释涂布平板法计数两种方法计数培养液中酵母菌数量时得到的结果，其中采用稀释涂布平板法计数得到的是曲线 ，下列判断依据中正确的有 。
①稀释涂布平板法只计数活的酵母细胞，死细胞无法形成菌落
②采用血细胞计数板直接计数时，可能会将死细胞与活细胞一起计数
③采用稀释涂布平板法计数时，两个或多个细胞连在一起长成一个菌落
④采用稀释涂布平板法计数时，因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
（4）通过如图3所示的方法进行纯化培养时，用移液枪取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基表面，然后将沾有少量酒精的涂布器 后再进行涂布。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的4个平板上菌落数分别为69个、52个、44个、26个，则可以推测原酵母菌液中每毫升含菌数为 个。
22．（2022高二下·南京期中）下图1表示利用生物技术制备抗X的单克隆抗体的过程；图2表示培育优质奶牛的过程。请据图回答下列问题：
（1）图1所示过程所用的生物技术有 ，将特定的抗原注入小鼠，需在一定时间内间隔注射3次以上，其目的是 。
（2）将经免疫处理后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得能分泌抗X的单克隆抗体的杂交瘤细胞的过程中，至少要进行两次筛选，一次是通过 培养基，筛选出杂交瘤细胞，另一次是通过 检测，筛选出能分泌抗X的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
（3）通过上述方法得到的单克隆抗体可快速准确地识别抗原X，其原因是该抗体具有 的特点。
（4）培养杂交瘤细胞的培养基中需加入动物血清，原因是 ，提供气体条件CO2的作用 ，杂交瘤细胞体外培养过程中，为避免细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，常采取的措施是 。
（5）图2中的早期胚胎发育到 阶段才可以移植，在移植之前，需要进行质量检查，用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，发现活胚胎细胞不能被染色，其原因是 。为了获得多个基因型相同的优质奶牛，可采用的技术手段是 。
23．（2022高二下·南京期中）为培育转固氮基因的小麦新品种，科研人员利用土壤农杆菌的Ti质粒和普通质粒按下图构建了双元载体系统（Ti辅助质粒和T-DNA给体质粒），图中vir基因编码产物能激活T-DNA转移，ori为复制原点，tmr和tms为致瘤基因，LB和RB为T-DNA两端的重复序列，kan为卡那霉素抗性基因，ter 为四环素抗性基因。下表是几种限制酶识别序列及切割位点。请回答下列问题：
限制酶 EcoR I BamH I Sau3A I BclI SmaI Xmal
识别序列及切糖粒点 - G↓AATTC- - G↓GATOC- -↓GATC- -T↓GATCA- - CCC↓GGG- -C↓CCGGG-
（1）研究发现T-DNA的RB序列相当保守，是由于该序列的突变类型在 过程中被淘汰。
（2）双子叶植物受到损伤时，伤口处的细胞分泌大量酚类化合物会吸引农杆菌移向这些细胞。农杆菌一般难以感染小麦等单子叶植物，若想提高农杆菌转化小麦的成功率，可采取的方法是 。·T-DNA转移至植物细胞可使植物患“肿瘤”，研究发现“肿瘤”的发生与植物激素有关，据此推测T-DNA中致瘤基因tmr、tms 可能与 等植物激素的合成有关。
（3）为防止植物形成“肿瘤”，研究人员按上图构建了双元载体系统。图中过程①需先用 制酶处理Ti质粒以去除致瘤基因，再用 酶将经过处理的固氮基因接入Ti质粒，以构建重组质粒；过程②用 限制酶处理重组质粒，获得含vir基因的DNA片段和含固氮基因的T-DNA，再经过程③、④分别构建Ti辅助质粒和T-DNA给体质粒。
（4）科研人员用限制酶EcoRI和SauBAI处理T-DNA给体质粒，完全酶切后可以得到含 条带的凝胶电泳图谱。
（5）将构建的Ti辅助质粒和T-DNA给体质粒通过 方法同时导入土壤农杆菌内，选择在含有 的培养基上能形成菌落的土壤农杆菌去感染小麦细胞。该过程中T-DNA给体质粒并不含有vir基因，但仍能将转化成功的原因是 。
（6）种植转基因固氮小麦，在环境保护上的重要意义有 。
24．（2022高二下·南京期中）科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如下图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题。
限制酶 识别序列
ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
HindⅢ 5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′
KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′
SacⅠ 5′GAGCT↓C3′
（1）以RNA为模板，通过RT-PCR技术可获取P基因。进行RT–PCR时一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）而不是脱氧核苷酸，其原因是 ，同时需加入的酶有 。为了特异性扩增P基因序列，需根据 设计特异性引物。
（2）在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T-DNA的 特性，最终使P基因 。
（3）将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
（4）对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有 。
答案解析部分
1．【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、牛白胨培养基应先调pH再经高压蒸汽灭菌，A错误；
B、蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，可为大肠杆菌的生长提供氮源、碳源和维生素等营养，B正确；
C、倒平板操作中，待平板冷却凝固后将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，防止冷凝水滴在培养基表面造成污染，C错误；
D、对培养皿做标记应在皿底，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
2、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。
2．【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】纤维素是纤维素分解菌的碳源，因此常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌，A正确；平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散然后培养，但不能用于微生物的计数，B错误；稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散并计数，C正确；用血细胞计数板计数微生物时，会将死的微生物计数在内，导致实验结果往往偏大，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
3、实验室中筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养的目的是增加目的菌的浓度，以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应；当纤维素被纤维素酶水解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此可筛选出纤维素分解菌。用稀释涂布平板法测定同一样品中的细菌数时，为了保证结果准确，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，确定对照组无菌后，选择菌落数在30~300的平板进行记数，求其平均值。
3．【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中①酒精灯（操作需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌）、③培养基和④涂布器（接种工具）；②是接种环，是平板划线法接种时需要使用的接种工具，A错误；
B、图2中II处透明圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；
C、突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误；
D、不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果中抑菌圈的大小 ，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
3、抑菌圈越大，对抗生素的抗性越强，则对抗生素IV的抗性最强，但其中出现了菌落，可能是发生了突变。
4．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、牛肉膏蛋白胨培养基是常用的细菌基础培养基，可用高压蒸汽灭菌法灭菌，A正确；
B、用稀释涂布平板法对细菌进行计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落往往比活菌的实际数目偏小，B正确；
C、用稀释涂布平板法法获得的菌落具有不同的菌落特征，C错误；
D、挑取单菌落后接种到液体培养基中培养，目的是增大菌株的数量（扩大培养），D正确。
故答案为：C。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
5．【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A.通常在培养基中添加蔗糖的目的是，一方面用于调节渗透压，另一方面可以提供营养，A错误；
B.选取的新生营养芽外植体需消毒后再诱导培育，B错误；
C.光合作用必须在有光的条件下才能进行，叶绿素的合成需要光，因此黑暗条件不利于叶绿素的合成，光合作用无法进行，C正确；
D.光照条件下，在15～50天的时间段内，PLBs重量与生物碱含量均随培养时间的递增而增加，但在50～60天的时间段内，PLBs重量略有增加，生物碱含量却逐渐下降，说明光照条件下PLBs的重量与生物碱含量不成正相关，D错误。
故答案为：C。
【分析】选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
6．【答案】C
【知识点】植物体细胞杂交的过程及应用；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、②③过程分别称为脱分化（由杂交细胞脱分化得到愈伤组织）和再分化（由愈伤组织分化得到胚状体），开辟了植物繁殖的新途径，A正确；
B、E·coliDNA连接酶来自于大肠杆菌，可以连接黏性末端，B正确；
C、①过程为植物体细胞杂交技术中的一个环节，不是完整的植物体细胞杂交技术，且通过是否再生细胞壁也不能鉴定杂种细胞，因为两个相同的原生质体融合也可以再生出细胞壁，C错误；
D、对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理，提高了突变的频率，可能可以获得耐盐突变体，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
2、DNA连接酶：①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
7．【答案】C
【知识点】动物细胞核移植技术
【解析】【解答】A、图中A细胞为核移植的受体细胞，应该为去核的卵母细胞，B为提供细胞核的体细胞，A正确；
B、由于基因的选择性表达，因此在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的，B正确；
C、mRNA→cDNA的过程表示逆转录过程，该过程获得的cDNA中没有启动子、内含子等，不能用于克隆猪基因组的测序，C错误；
D、在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl-2cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl-2mRNA的分子数，从而反映出Bcl-2基因的转录水平，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、 体细胞核移植技术 ：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理是动物细胞核的全能性。
2、体细胞核移植过程：
3、体细胞核移植的应用：a、加速家畜的遗传改良进程，促进优良种群繁育；b、转基因克隆动物做生物反应器，生产珍贵的医用蛋白；c、克隆动物的组织、器官做移植的供体；d、研究克隆动物和克隆细胞可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。
4、体细胞核移植技术存在的问题：（1）胚胎成活率低；（2）动物健康存在问题；（3）克隆动物食品的安全性问题。
8．【答案】B
【知识点】动物细胞培养技术；单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、①过程为诱导动物细胞融合，所用的促融方法不同植物体细胞杂交，用灭活的病毒作为诱导剂诱导动物细胞融合，A错误；
B、③过程的目的是筛选出能产生抗HCG抗体的杂交瘤细胞，需以抗HCG单克隆抗体为抗原进行检测，B正确；
C、给小鼠注射HCG的目的是获得免疫的B淋巴细胞，C错误；
D、④过程为采用动物细胞培养技术在体外生产抗HCG单克隆抗体，需要添加抗生素等物质，以防止杂菌（主要是细菌，而不是病毒）污染，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、动物培养条件：①无菌、无毒的环境：a、消毒、灭菌；b、添加一定量的抗生素；c、定期更换培养液，以清除代谢废物。②营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。③温度和pH。④气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。为了防止杂菌污染，需要添加抗生素。
9．【答案】D
【知识点】动物细胞培养技术
【解析】【解答】制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2维持培养液pH。为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素。
故答案为：D
【分析】血球计数板：
10．【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】抗虫基因转录和翻译的产物是多肽，A正确；抗虫基因的插入不会改变受体细胞的染色体结构，B正确；受体细胞除去细胞壁更利于基因的导入，C正确；用虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性，D错误
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
11．【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】解：A、在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入但T﹣DNA片段上，A错误；
B、农杆菌转化法中不需要用Ca2+处理农杆菌，应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；
C、Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，C错误；
D、T﹣DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体，D正确．
故选：D．
【分析】农杆菌转化法（约80%的转基因植物都是用这种方法获得的）1、农杆菌转化法的具体过程：（1）利用土壤的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上．（2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内．（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内．（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因.2、原理：农杆菌中的Ti质粒上的T﹣DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上．根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T﹣DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上.3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的T﹣DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上.4、转化：目的基因插人Ti质粒的T﹣DNA上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达．
12．【答案】D
【知识点】胚胎干细胞及其应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、由于受体细胞是动物体细胞，可以选择用显微注射法，也可以用经过修饰的病毒导入，因为病毒对于宿主细胞具有感染性，利用病毒这一特点，可以用经过修饰的病毒将目的基因导入受体细胞，A 正确；
B、由题干信息可知，将筛选获得的iPS细胞注射到无法发育到成体阶段的四倍体囊胚中，最终获得克隆鼠，经鉴定证实克隆鼠是由iPS细胞发育而来并可繁殖后代。iPS细胞是由黑鼠提供的体细胞转入四种基因后筛选所得，细胞核中染色体数与黑鼠相同，体色最可能为黑色，B正确；
C、灰鼠受精卵为二倍体，第一次卵裂（有丝分裂）后生成的子细胞也含有两个染色体组，经电激诱导细胞两两融合，融合后的细胞含有4个染色体组，经进一步发育获得的囊胚为四倍体，C正确；
D、该实验过程中使用到的技术有基因工程、动物细胞培养、动物细胞融合、早期胚胎培养、胚胎移植等技术。该过程不涉及体外受精，D错误；
故答案为：D。
【分析】1、多能干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。人或者动物都是二倍体，在胚胎发育到2-细胞阶段的时候，可用电融合的方法使两个细胞融合为一个细胞，这样就获得了四倍体胚胎，四倍体胚胎是不能正常发育的，但是可以形成胎盘，如果将一种多能干细胞注入四倍体囊胚，可以获得一个完整的动物个体，那证明移进去的干细胞是全能的干细胞。
2、将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
13．【答案】C
【知识点】果酒果醋的制作；泡菜的制作
【解析】【解答】A、当氧气和糖原充足时醋酸菌将糖分解成醋酸，因此，制作果醋的前未必需要制作果酒，A错误；
B、通常情况下，泡菜制作一般10天后即可食用，不需进行排气操作，因为泡菜制作过程所需的菌种乳酸菌无氧呼吸的产物是乳酸，没有气体生成，B错误；
C、果酒、果醋和泡菜制作使用的菌种通常取自于自然环境，也可接种优良菌种，以提高产品品质，C正确；
D、所用制作原料和器具不需要进行严格灭菌，发酵全过程无需在无菌环境，D错误。
故答案为：C。
【分析】果酒制作菌种是酵母菌，代谢类型是兼性厌氧型真菌，属于真核细胞，条件是18～25℃、前期需氧，后期不需氧；果醋制作的菌种是醋酸菌，代谢类型是需氧型细菌，属于原核细胞，条件是30～35℃、一直需氧；腐乳的制作原理：参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉，其代谢类型为异养需氧型，适宜温度为15℃～18℃；毛霉能够产生蛋白酶和脂肪酶，将蛋白质和脂肪分别水解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸。
14．【答案】B,C
【知识点】基因工程的应用
【解析】【解答】若过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的粘性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，A不符合题意；过程②用Ca
2+处理可增大农杆菌细胞膜的通透性，从而提高转化成功率，B符合题意；过程③培养基中加入除草剂筛选出来的是无农杆菌附着的转化愈伤组织、农杆菌附着的转化愈伤组织、农杆菌附着的未转化愈伤组织，加入Ｋ物质筛选出来的是无农杆菌附着的转化愈伤组织和农杆菌附着的转化愈伤组织，C符合题意，D不符合题意。
故答案为：BC
【分析】解答A选项，要注意同一种限制酶产生的粘性末端能发生碱基互补，因此，过程①使用两种限制酶，切割产生的粘性末端不同，可以防止产物自身环化。
15．【答案】A,C,D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、限制酶不能破坏目的基因，也不能破坏质粒上的所有标记基因，且应该用不同的限制酶进行切割，以防止质粒和目的基因自身的黏性末端连接或防止目的基因与载体反向连接，据图可知，目的基因内部含EcoRI限制酶切点，故不能选该酶切割。构建图示的重组质粒的酶切位点应该选BamHI、PstI，并用DNA连接酶将重组基因连接，A正确；
B、根据A项分子可知，运载体的抗四环素基因被破坏，但抗氨苄青霉素基因没有被破坏，可用含氨苄青霉素的培养基筛选导入目的基因的细菌，但由于含目的基因的载体和不含目的基因的载体上都存在氨苄青霉素抗性基因，因此不能依此来确定筛选出的即为导入目的基因的细菌，B错误；
C、可用PCR技术大量扩增目的基因，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，C正确；
D、用Ca2+处理大肠杆菌可增加细菌细胞壁的通透性，使其成为感受态细胞，易于转化，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】1、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
16．【答案】A,C,D
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、据图可知，通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物，A正确；
B、微生物的接种最常用的是平板划线法和稀释涂布法，只有平板划线法会用到接种环，而根据图示中菌落的分布特点可知，本实验采用的是稀释涂布平板法，需用涂布器，B错误；
C、通过观察菌落的形态、大小可以看出，两组实验操作均正确，但结果截然不同，原因可能是手机的取样部位和马桶的取样部位都不相同，C正确；
D、该实验缺少对照实验，可以设置取相同培养基接种等量无菌水的组进行培养作为对照组，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】1、菌落是指由一个微生物细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等，每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。不同种或同种在不同的培养条件下，菌落特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义。
2、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
17．【答案】B,C
【知识点】植物细胞工程的应用
【解析】【解答】A、离体的红豆杉组织细胞通过纤维素酶和果胶酶分散处理后直接进行悬浮培养，A错误；
B、悬浮培养液中细胞脱分化形成愈伤组织，大多数细胞在形态上大小相差不大，细胞的核-质比率大，胞质浓厚，液泡化程度高，B正确；
C、脱分化过程一般细胞分裂素与生长素含量比值小于1，C正确；
D、植物细胞悬浮培养中植物细胞生长没有接触抑制，但是不可能无限扩大培养，D错误。
故答案为：BC。
【分析】 1、去除高等植物细胞壁，需要用果胶酶和纤维素酶。
2、愈伤组织细胞高度泡状化，大多数细胞在形态上大小相差不大，已经脱去分化。
3、脱分化过程中，一般细胞分裂素与生长素含量比值小于1；再分化过程中，一般细胞分裂素与生长素含量比值大于1。
18．【答案】A,C,D
【知识点】转基因生物的安全性问题
【解析】【解答】A. 转基因植物竞争能力强，可能成为“入侵的外来物种”，影响生态系统的稳定性，A正确；
B. 基因污染”会通过花粉等扩散到其他物种，所以转基因植物存在“基因污染”问题，B错误；
C. 转基因作物的抗除草剂基因可通过花粉散落到杂草上，从而污染生物基因库，产生“超级杂草”，C正确；
D. “基因污染”会通过花粉等扩散到其他物种，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】转基因生物的安全性问题有：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）等；其中生物安全主要体现在：①转基因植物扩散到种植区外变成野生种或杂草，②转基因植物竞争能力强，可能成为“入侵的外来物种”，③转基因植物的外源基因与细菌或病毒杂交，重组出有害的病原体，④可能使杂草成为有抗除草剂基因“超级杂草”。
19．【答案】A,C,D
【知识点】单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、单克隆抗体的制备是用经过免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞，所以X细胞是从脾脏中提取的已免疫的B淋巴细胞，A正确；
B、Y细胞是骨髓瘤细胞，B错误；
C、图中筛选过程至少两次且方法不同，第一次筛选是选择杂交瘤细胞，需要抑制同种细胞的融合体、以及未融合的细胞的增殖，第二次筛选是用抗体检测的方法选择能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，最终保留抗体检测呈阳性的细胞，C正确；
D、由于杂交瘤细胞即保留了骨髓瘤细胞无限增殖的特点，又有浆细胞产生特异性抗体的作用，所以图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】分析图示可知，给小鼠注射抗原后，从小鼠体内收集经过免疫的细胞（X细胞），与体外培养的Y（骨髓瘤细胞）细胞融合，经过培养后筛选能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
20．【答案】（1）纤维素酶和果胶酶
（2）叶绿体
（3）保持原生质体完整性；细胞壁
（4）生长素；细胞分裂素；再分化
（5）1、2、4
（6）黑腐病菌
【知识点】植物组织培养的过程；植物体细胞杂交的过程及应用
【解析】【解答】 (1)图中①表示采用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁的过程。
(2)用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，因此可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。
(3)原生质体没有细胞壁的保护，需要加入适宜浓度的甘露醇以保证渗透压的稳定，以避免原生质体吸水或失水破坏原生质体的完整性；原生质体通过再生细胞壁形成杂种细胞，进而形成愈伤组织。
(4)愈伤组织在含合适浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上再分化形成再生植株。
(5)根据图谱，花椰菜含有碱基对为300和600的DNA片段，黑芥还有碱基对为1000、1300和1500的片段，再生植株3，只含有长度为300和600的片段，与花椰菜一致，1、2、4 既含有花椰菜DNA 片段，又含有黑芥DNA片段，为杂种植株。
(6)对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。
【分析】1、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
2、植物组织培养
（1）原理是植物细胞的全能性。嫩枝或分化程度较低的部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，故外植体一般选用嫩枝或分化程度较低的部位成功率更高。
（2）植物组织培养过程是：离体的植物器言、组织或细胞（外植体）脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养的流程为：制备MS培养基→外植体消毒→接种→培养→移裁→栽培。
（3）植物组织培养的注意事项：①接种时应注意的事项：a、接种室要消毒；b、无菌操作；接种时要防止交叉污染；c、接种完立刻盖好瓶口。②外植体接种前，需要将接种室、接种箱灭菌和对外植体消毒的操作：a、接种前一天，将接种室的四个角落用甲醛溶液和高锰酸钾重蒸。b、接种前1小时，在接种室内用喷雾器喷洒来苏水；桌椅也用来苏水擦拭；接种箱内用甲醛溶液和高锰酸钾重蒸。c、将灭菌室和接种箱内用紫外灯灭菌。d、接种前，操作者用肥皂清洗双手，擦干，再用酒精棉球擦拭双手。e、用次氯酸钠溶液将外植体消毒。
（4）在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
（5）影响植物组织培养的因素：①培养基配制；②外植体选取；③激素的运用；④消毒；⑤温度、pH、光照。
（6）植物组织培养中植物激素使用：物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。
初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，初线代谢物有糖类、脂质、蛋白质、核酸等。次生代谢物指植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本生命活动所必需的产物，一类小分子有机化合物（如酚类、菇类和含氨化合物等）。
21．【答案】（1）抑制细菌的生长；压力表指针降至“0”点
（2）摇床转速越高，提供的氧气越充足，酵母菌代谢旺盛，增殖快
（3）乙；①和②
（4）灼烧冷却；5.5×107
【知识点】微生物的分离和培养；灭菌技术
【解析】【解答】（1）分离野生酵母菌时需要加入青霉素等抗生素的原因是酵母菌对青霉素不敏感，而细菌、放线菌对抗生素敏感，所以培养基中加入青霉素可以抑制细菌的生长。切断高压蒸汽灭菌锅热源后，须待观察到压力表指针降至“0”点，才能打开放气阀以释放锅内余气。
（2）根据题意可知，摇床转速越高，提供的氧气越充足，从图中可看出摇床转速越高，酵母菌代谢旺盛，增殖快，因此繁殖的速度和总量越高，种群密度最大。
（3）根据图2可知，由于稀释涂布平板法只计数活的酵母菌，血细胞计数板直接计数会将死细胞一起计数，稀释涂布平板法获得的菌落数目比血细胞计数法计数时微生物数目少，因此采用稀释涂布平板法计数的是曲线乙。
因此判断依据有①和②。
（4）在培养基上进行涂布时，要将涂布器灼烧冷却后才能进行操作；根据图解可知菌液被稀释了105倍（M），同时选择菌落数目在30-300的进行计数，所以每毫升含菌数为个。
【分析】1、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
22．【答案】（1）动物细胞融合技术和动物细胞培养技术；加强免疫，刺激小鼠机体产生更多的淋巴细胞
（2）选择；抗体（抗体阳性）
（3）特异性强、灵敏高度
（4）补充细胞生长所需的未知营养物质；维持培养液的pH；定期更换培养液
（5）桑葚胚或囊胚；活细胞的细胞膜具有选择透过性；胚胎分割
【知识点】动物细胞核移植技术；单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】（1）图1所示过程中，需要用动物细胞培养技术培养已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，需要运用动物细胞融合技术诱导已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，再通过动物细胞培养技术培养杂交瘤细胞获得单克隆抗体。相同抗原再次入侵机体时，初次免疫产生的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量新的效应B细胞（浆细胞）和新的记忆细胞，效应B细胞进而产生抗体消灭抗原，因此二次免疫反应较初次免疫强而快 可见，将特定的抗原注入小鼠，需在一定时间内间隔注射3次以上，其目的是加强免疫，刺激小鼠机体产生更多的淋巴细胞。
（2）在抗X的单克隆抗体制备过程中，至少需要进行两次筛选，第一次是通过选择培养基，将所有的杂交瘤细胞筛选出来；第二次是对第一次筛选出来的杂交瘤细胞进行克隆化培养与抗体检测，筛选出能分泌抗X的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
（3）单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏高度，因此可快速准确地识别抗原。
（4）培养杂交瘤细胞需采用动物细胞培养技术，由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此培养杂交瘤细胞的培养基中需加入动物血清，以补充细胞生长所需的未知营养物质。提供气体条件CO2的作用是维持培养液的pH。杂交瘤细胞体外培养过程中，为避免细胞代谢产物积累对细胞自身造成的危害，需要定期更换培养液。
（5）在进行胚胎移植时，一般选择发育到桑葚胚或囊胚阶段的早期胚胎进行移植。用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，染料分子不能通过细胞膜，因此活胚胎细胞不能被染色。为了获得多个基因型相同的优质奶牛，可采用胚胎分割技术。
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、体细胞核移植技术
（1）将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理是动物细胞核的全能性。
（2）体细胞核移植过程：
（3）体细胞核移植的应用：a、加速家畜的遗传改良进程，促进优良种群繁育；b、转基因克隆动物做生物反应器，生产珍贵的医用蛋白；c、克隆动物的组织、器官做移植的供体；d、研究克隆动物和克隆细胞可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。
（4）体细胞核移植技术存在的问题：①胚胎成活率低；②动物健康存在问题；③克隆动物食品的安全性问题。
23．【答案】（1）自然选择
（2）在小麦伤口处加入酚类化合物；细胞分裂素和生长素
（3）SmaI 和 BamHI；T4DNA 连接酶；EcoRI
（4）3
（5）感受态细胞法（或 Ca2+处理）；卡那霉素；Ti 辅助质粒含有 vir 基因，其编码的产物能促进T-DNA 给体质粒中的 T-DNA 转化成功
（6）减少氮肥的使用，减轻环境污染
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核苷酸序列（如 RNA 或 DNA 序列），蛋白质中氨基酸序列，蛋白质结构或糖类中的序列。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。很多科学家认为， 保守序列的基因区域发生突变会导致生命体无法存活或被自然选择所淘汰。
（2）将目的基因导入单子叶植物常用的方法是农杆菌转化法，转化前可将小麦伤口处加入酚类化合物；T-DNA 转移至植物细胞可使植物患“肿瘤”，植物的“肿瘤”实际上是植物创伤组织的生长与分裂造成。题干暗示了“肿瘤”的发生与植物激素有关，促进植物组织生长与分裂 有关的激素包括生长素与细胞分裂素等。据此可以推测 T-DNA 中致瘤基因 tmr、tms 可能与生长素、细胞分裂素等植物激素的合成有关。
（3）图中过程①需先用 Sma I 和 BamH I 限制酶处理 Ti 质粒以去除致瘤基因。具体分析如下：BamH I 限制酶识别序列中包含了 Sau3AI 限制酶识别序列。因此选用 BamH I 限制酶就可以选用 Sau3AI 限制酶。因为要去除致瘤基因（tmr 和 tms），应该选择 Xma I 和 BamHI 两种限制酶，同时需要 酶切后将目的基因固氮基因插入其中。观察固氮基因的两端，一端为平末端，一端为黏性末端（-CTAG），BamHI 酶切后的黏性末端可以与固氮基因的黏性末端相配对，但 Xma I 酶 切后为黏性末端，无法与固氮基因的平末端相连。而所提供的 Sma I 限制酶的识别序列与Xma I 限制酶的识别序列相同，但切出的为平末端。因此选择 Sma I 和 BamH I 限制酶处理 Ti 质粒以去除致瘤基因。在此过程中不能选择 Sau3AI 限制酶，因为不仅 BamH I 限制酶识别序列中包含 Sau3AI 限制酶识别序列，BclI 限制酶中也包含包含 Sau3AI 限制酶识别序列。如果选择 Sau3AI 限制酶，有可能不能剔除tms基因。因为 T4DNA 连接酶既可以连接平末端，也可以连接黏性末端，故酶切后再用 T4DNA 连接酶将经过处理的固氮基因接入 Ti 质粒，以构建重组质粒。要从重组质粒中获得含 vir 基因的 DNA 片段和含固氮基因的 T-DNA，必须再进行酶切。观察重组质粒，其中 LB 和 RB 两侧分别含有 EcoRI 的酶切位点，因此用 EcoR I 限制酶处理重组质粒，获得含 vir 基因的 DNA 片段和含固氮基因的 T-DNA。
（4）经过③获得的给体质粒上含有这几种酶的酶切位点：两个 EcoR I 限制酶酶切位点（因为是用 EcoR I 来酶切 T-DNA 与普通质粒后拼接而得给体质粒）、一个 Sma I 和一个 BamH I 限制酶酶切位点（因为是用这两种酶构建重组质粒的）。其中 BamH I 限制酶的识别序列中包含 GATC 也能为 Sau3A I 限制酶识别。因此用限制酶 EcoR I 和 Sau3A I 处理 T-DNA 给体 质粒，完全酶切后可以得到含 3 个条带的凝胶电泳图谱。
（5）将目的基因导入微生物体内，常采用的方法是用一定浓度 CaCl2溶液处理微生物，提高细胞摄取外源治理 DNA 的能力，该方法为感受态细胞法；基因表达载体上含有卡那霉素标记基因，故可用卡那霉素进行培养选择，农杆菌体内给体质粒上的 T-DNA 片段具有可转移性，即能够从农杆菌中转移至植物细胞内，并整合到植物细胞的染色体 DNA 上，但这种转移需要 vir基因编码产物的激活。
（6）因为氮元素是生物体蛋白质组成的必需元素，也是生物生长必须的大量元素 之一，同时还参与多种生命活动。因此植物的生长需要大量的氮肥。为满足农作物的生长 需求，对于无法进行固氮的植物而言，就必须大量使用化肥。而种植转基因固氮小麦，在环境保护上的重要意义有减少氮肥使用，减轻环境污染 。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
24．【答案】（1）dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量)；逆转录酶和 Tag酶；P基因两端的碱基序列
（2）BamHI；Sac I；可转移；整合到玉米细胞染色体上
（3）潮霉素
（4）基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)多聚酶链式反应简称PCR技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术，需要能量和原料等，dNTP（dATP， dTTP， dGTP， dCTP） 能为子链延伸过程提供能量和原料，因此进行RT–PCR时一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）。以RNA为模板获取P基因属于逆转录过程，需要逆转录酶，PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，即Tag酶。引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，为了特异性扩增P基因序列，需根据P基因两端的碱基序列设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamHI切割，另一种酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在质粒中，KpnⅠ识别序列在BamHI识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用KpnⅠ切割，目的基因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamHI和Sac I。T-DNA是Ti质粒上的一个片段。利用农杆菌等微生物可将人工合成的目的基因（P基因）片段通过T-DNA载体转移到受体植物（玉米细胞）的基因组中，是基因工程的重要技术手段。
(3)据图可知，利用Ti质粒的T-DNA可将目的基因（P基因）转移到玉米细胞，T-DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，标记基因的作用检测受体细胞中是否含有目的基因，因此培养基中需加入潮霉素，能在此环境中生存的玉米即为转基因玉米。
(4)基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
1 / 1江苏省南京航空航天大学苏州附属中学2021-2022学年高二下学期期中（线上）生物试卷
一、单选题
1．（2022高二下·南京期中）某同学用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌纯化培养。下列说法正确的是（ ）
A．牛肉膏蛋白胨培养基需经高压蒸汽灭菌后调节pH
B．蛋白胨可为大肠杆菌生长提供氮源、碳源和维生素
C．倒平板操作中，平板未凝固时迅速将平板倒过来放置
D．为区分恒温培养箱中不同的培养皿，应该在其皿盖做好标记
【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、牛白胨培养基应先调pH再经高压蒸汽灭菌，A错误；
B、蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，可为大肠杆菌的生长提供氮源、碳源和维生素等营养，B正确；
C、倒平板操作中，待平板冷却凝固后将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，防止冷凝水滴在培养基表面造成污染，C错误；
D、对培养皿做标记应在皿底，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
2、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。
2．（2022高二下·南京期中）下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述中，错误的是（ ）
A．用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B．平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C．稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D．用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大
【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】纤维素是纤维素分解菌的碳源，因此常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌，A正确；平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散然后培养，但不能用于微生物的计数，B错误；稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散并计数，C正确；用血细胞计数板计数微生物时，会将死的微生物计数在内，导致实验结果往往偏大，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
3、实验室中筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养的目的是增加目的菌的浓度，以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应；当纤维素被纤维素酶水解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此可筛选出纤维素分解菌。用稀释涂布平板法测定同一样品中的细菌数时，为了保证结果准确，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，确定对照组无菌后，选择菌落数在30~300的平板进行记数，求其平均值。
3．（2022高二下·南京期中）为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，下图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如下图2。下列相关叙述正确的是（ ）
A．为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②
B．图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C．图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中①酒精灯（操作需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌）、③培养基和④涂布器（接种工具）；②是接种环，是平板划线法接种时需要使用的接种工具，A错误；
B、图2中II处透明圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；
C、突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误；
D、不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果中抑菌圈的大小 ，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
3、抑菌圈越大，对抗生素的抗性越强，则对抗生素IV的抗性最强，但其中出现了菌落，可能是发生了突变。
4．（2022高二下·南京期中）从某污水处理系统中分离出多种细菌，经进一步筛选获得具有高效降低污水中有机污染物（COD为有机污染物分解时化学需氧量）能力的菌株，过程如下图所示。下列相关说法错误的是（ ）
A．牛肉膏蛋白胨培养基可用高压蒸汽灭菌法灭菌
B．若采用题目中分离纯化方法进行计数，计数结果比实际值小
C．图中平板划线法获得的菌落具有不同的菌落特征
D．挑取单菌落后接种到液体培养基中培养，目的是扩大化培养菌株
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、牛肉膏蛋白胨培养基是常用的细菌基础培养基，可用高压蒸汽灭菌法灭菌，A正确；
B、用稀释涂布平板法对细菌进行计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落往往比活菌的实际数目偏小，B正确；
C、用稀释涂布平板法法获得的菌落具有不同的菌落特征，C错误；
D、挑取单菌落后接种到液体培养基中培养，目的是增大菌株的数量（扩大培养），D正确。
故答案为：C。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
5．（2022高二下·南京期中）图表示利用铁皮石斛新生营养芽诱导培育出的拟原球茎(简称PLBs)，在不同条件下生产生物碱的实验结果。下列叙述正确的是（ ）
A．通常在培养基中添加葡萄糖用于调节渗透压
B．选取的新生营养芽外植体需灭菌后再诱导培育
C．黑暗条件不利于叶绿素的合成，光合作用无法进行
D．光照条件下PLBs的重量与生物碱含量成正相关
【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A.通常在培养基中添加蔗糖的目的是，一方面用于调节渗透压，另一方面可以提供营养，A错误；
B.选取的新生营养芽外植体需消毒后再诱导培育，B错误；
C.光合作用必须在有光的条件下才能进行，叶绿素的合成需要光，因此黑暗条件不利于叶绿素的合成，光合作用无法进行，C正确；
D.光照条件下，在15～50天的时间段内，PLBs重量与生物碱含量均随培养时间的递增而增加，但在50～60天的时间段内，PLBs重量略有增加，生物碱含量却逐渐下降，说明光照条件下PLBs的重量与生物碱含量不成正相关，D错误。
故答案为：C。
【分析】选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
6．（2022高二下·南京期中）如下图所示为农作物新品种的育种方式，相关叙述错误的是（ ）
A．②③过程分别称为脱分化和再分化，开辟了植物繁殖的新途径
B．⑤过程中若连接的是黏性末端，则可使用E·coliDNA连接酶
C．①过程为植物体细胞杂交技术，可通过是否再生细胞壁鉴定杂种细胞
D．若要获得耐盐突变体，可对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理
【答案】C
【知识点】植物体细胞杂交的过程及应用；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、②③过程分别称为脱分化（由杂交细胞脱分化得到愈伤组织）和再分化（由愈伤组织分化得到胚状体），开辟了植物繁殖的新途径，A正确；
B、E·coliDNA连接酶来自于大肠杆菌，可以连接黏性末端，B正确；
C、①过程为植物体细胞杂交技术中的一个环节，不是完整的植物体细胞杂交技术，且通过是否再生细胞壁也不能鉴定杂种细胞，因为两个相同的原生质体融合也可以再生出细胞壁，C错误；
D、对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理，提高了突变的频率，可能可以获得耐盐突变体，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
2、DNA连接酶：①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
7．（2022高二下·南京期中）Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，可以利用PCR技术检测其转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。如图为克隆猪的培育及Bcl-2基因转录水平检测流程，下列说法错误的是（ ）
A．图中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示体细胞
B．在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的
C．图中过程X表示逆转录，获得的cDNA可用于克隆猪基因组的测序
D．在PCR过程中，（Bcl-2 cDNA）/cDNA的比值反映Bcl-2基因的转录水平
【答案】C
【知识点】动物细胞核移植技术
【解析】【解答】A、图中A细胞为核移植的受体细胞，应该为去核的卵母细胞，B为提供细胞核的体细胞，A正确；
B、由于基因的选择性表达，因此在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的，B正确；
C、mRNA→cDNA的过程表示逆转录过程，该过程获得的cDNA中没有启动子、内含子等，不能用于克隆猪基因组的测序，C错误；
D、在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl-2cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl-2mRNA的分子数，从而反映出Bcl-2基因的转录水平，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、 体细胞核移植技术 ：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理是动物细胞核的全能性。
2、体细胞核移植过程：
3、体细胞核移植的应用：a、加速家畜的遗传改良进程，促进优良种群繁育；b、转基因克隆动物做生物反应器，生产珍贵的医用蛋白；c、克隆动物的组织、器官做移植的供体；d、研究克隆动物和克隆细胞可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。
4、体细胞核移植技术存在的问题：（1）胚胎成活率低；（2）动物健康存在问题；（3）克隆动物食品的安全性问题。
8．（2022高二下·南京期中）人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图。相关叙述正确的是（ ）
A．①过程所用的促融方法与植物体细胞杂交完全相同
B．③过程以抗HCG单克隆抗体为抗原进行检测
C．应给小鼠多次注射HCG，以获得较多的记忆细胞
D．④过程需要添加抗生素等物质，以防止病毒污染
【答案】B
【知识点】动物细胞培养技术；单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、①过程为诱导动物细胞融合，所用的促融方法不同植物体细胞杂交，用灭活的病毒作为诱导剂诱导动物细胞融合，A错误；
B、③过程的目的是筛选出能产生抗HCG抗体的杂交瘤细胞，需以抗HCG单克隆抗体为抗原进行检测，B正确；
C、给小鼠注射HCG的目的是获得免疫的B淋巴细胞，C错误；
D、④过程为采用动物细胞培养技术在体外生产抗HCG单克隆抗体，需要添加抗生素等物质，以防止杂菌（主要是细菌，而不是病毒）污染，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、动物培养条件：①无菌、无毒的环境：a、消毒、灭菌；b、添加一定量的抗生素；c、定期更换培养液，以清除代谢废物。②营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。③温度和pH。④气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。为了防止杂菌污染，需要添加抗生素。
9．某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行培养，下列叙述正确的是( )
A．制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理
B．肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸
C．为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的干扰素
D．用血球计数板计数的方法，可推断乙细胞比甲细胞增殖周期长
【答案】D
【知识点】动物细胞培养技术
【解析】【解答】制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2维持培养液pH。为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素。
故答案为：D
【分析】血球计数板：
10．（2022高二下·南京期中）下图是用基因工程技术培育抗棉铃虫的转基因棉花过程，有关该过程叙述错误的是 （ ）
A．抗虫基因的表达产物为多肽
B．抗虫基因的插入不会改变受体细胞的染色体结构
C．受体细胞除去细胞壁更利于基因的导入
D．通过Ti质粒上的抗性基因筛选试管苗
【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】抗虫基因转录和翻译的产物是多肽，A正确；抗虫基因的插入不会改变受体细胞的染色体结构，B正确；受体细胞除去细胞壁更利于基因的导入，C正确；用虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性，D错误
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
11．（2017高三上·丰台期末）土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T﹣DNA片段转入植物的基因组．利用农杆菌以Ti质粒作为运载体进行转基因，下列相关叙述正确的是（ ）
A．目的基因应插入T﹣DNA片段外，以防止破坏T﹣DNA
B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T﹣DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体
【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】解：A、在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入但T﹣DNA片段上，A错误；
B、农杆菌转化法中不需要用Ca2+处理农杆菌，应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；
C、Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，C错误；
D、T﹣DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体，D正确．
故选：D．
【分析】农杆菌转化法（约80%的转基因植物都是用这种方法获得的）1、农杆菌转化法的具体过程：（1）利用土壤的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上．（2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内．（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内．（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因.2、原理：农杆菌中的Ti质粒上的T﹣DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上．根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T﹣DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上.3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的T﹣DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上.4、转化：目的基因插人Ti质粒的T﹣DNA上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达．
12．（2022高二下·南京期中）科学家通过转入四种基因，可使体细胞形成诱导性多能干细胞（iPS细胞），并将其注射到无法发育到成体阶段的四倍体囊胚中，最终获得克隆鼠，经鉴定证实克隆鼠是由iPS细胞发育而来并可繁殖后代，实验流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．可用显微注射法或用经过修饰的病毒导入四种基因
B．克隆鼠的体色为黑色且染色体组数与黑鼠相同
C．灰鼠受精卵第一次卵裂生成的子细胞经电激诱导两两融合后可发育成四倍体囊胚
D．该实验过程中使用到的技术有体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
【答案】D
【知识点】胚胎干细胞及其应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、由于受体细胞是动物体细胞，可以选择用显微注射法，也可以用经过修饰的病毒导入，因为病毒对于宿主细胞具有感染性，利用病毒这一特点，可以用经过修饰的病毒将目的基因导入受体细胞，A 正确；
B、由题干信息可知，将筛选获得的iPS细胞注射到无法发育到成体阶段的四倍体囊胚中，最终获得克隆鼠，经鉴定证实克隆鼠是由iPS细胞发育而来并可繁殖后代。iPS细胞是由黑鼠提供的体细胞转入四种基因后筛选所得，细胞核中染色体数与黑鼠相同，体色最可能为黑色，B正确；
C、灰鼠受精卵为二倍体，第一次卵裂（有丝分裂）后生成的子细胞也含有两个染色体组，经电激诱导细胞两两融合，融合后的细胞含有4个染色体组，经进一步发育获得的囊胚为四倍体，C正确；
D、该实验过程中使用到的技术有基因工程、动物细胞培养、动物细胞融合、早期胚胎培养、胚胎移植等技术。该过程不涉及体外受精，D错误；
故答案为：D。
【分析】1、多能干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。人或者动物都是二倍体，在胚胎发育到2-细胞阶段的时候，可用电融合的方法使两个细胞融合为一个细胞，这样就获得了四倍体胚胎，四倍体胚胎是不能正常发育的，但是可以形成胎盘，如果将一种多能干细胞注入四倍体囊胚，可以获得一个完整的动物个体，那证明移进去的干细胞是全能的干细胞。
2、将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
13．（2021·南京模拟）下列与果酒、果醋和泡菜制作有关的叙述，正确的是（ ）
A．制作果醋的前提是制作果酒，因为醋酸菌可将酒精氧化为醋酸
B．通常情况下，泡菜制作1~2天即可食用，并需偶尔进行排气操作
C．使用的菌种通常取自于自然环境，若要提高产品品质，可接种优良菌种
D．所用制作原料和器具都需要进行严格灭菌，且发酵全过程都需在无菌环境
【答案】C
【知识点】果酒果醋的制作；泡菜的制作
【解析】【解答】A、当氧气和糖原充足时醋酸菌将糖分解成醋酸，因此，制作果醋的前未必需要制作果酒，A错误；
B、通常情况下，泡菜制作一般10天后即可食用，不需进行排气操作，因为泡菜制作过程所需的菌种乳酸菌无氧呼吸的产物是乳酸，没有气体生成，B错误；
C、果酒、果醋和泡菜制作使用的菌种通常取自于自然环境，也可接种优良菌种，以提高产品品质，C正确；
D、所用制作原料和器具不需要进行严格灭菌，发酵全过程无需在无菌环境，D错误。
故答案为：C。
【分析】果酒制作菌种是酵母菌，代谢类型是兼性厌氧型真菌，属于真核细胞，条件是18～25℃、前期需氧，后期不需氧；果醋制作的菌种是醋酸菌，代谢类型是需氧型细菌，属于原核细胞，条件是30～35℃、一直需氧；腐乳的制作原理：参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉，其代谢类型为异养需氧型，适宜温度为15℃～18℃；毛霉能够产生蛋白酶和脂肪酶，将蛋白质和脂肪分别水解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸。
14．（2018·南通模拟）下图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是 （ ）
A．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
B．过程②用Ca2+处理可提高转化成功率
C．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
D．筛选得到的A是无农杆菌附着的转化愈伤组织
【答案】B,C
【知识点】基因工程的应用
【解析】【解答】若过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的粘性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，A不符合题意；过程②用Ca
2+处理可增大农杆菌细胞膜的通透性，从而提高转化成功率，B符合题意；过程③培养基中加入除草剂筛选出来的是无农杆菌附着的转化愈伤组织、农杆菌附着的转化愈伤组织、农杆菌附着的未转化愈伤组织，加入Ｋ物质筛选出来的是无农杆菌附着的转化愈伤组织和农杆菌附着的转化愈伤组织，C符合题意，D不符合题意。
故答案为：BC
【分析】解答A选项，要注意同一种限制酶产生的粘性末端能发生碱基互补，因此，过程①使用两种限制酶，切割产生的粘性末端不同，可以防止产物自身环化。
二、多选题
15．（2022高二下·南京期中）运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作运载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的相符的是（ ）
A．用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体
B．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌
C．可用PCR技术大量扩增目的基因
D．用Ca2﹢处理大肠杆菌使其易于转化
【答案】A,C,D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、限制酶不能破坏目的基因，也不能破坏质粒上的所有标记基因，且应该用不同的限制酶进行切割，以防止质粒和目的基因自身的黏性末端连接或防止目的基因与载体反向连接，据图可知，目的基因内部含EcoRI限制酶切点，故不能选该酶切割。构建图示的重组质粒的酶切位点应该选BamHI、PstI，并用DNA连接酶将重组基因连接，A正确；
B、根据A项分子可知，运载体的抗四环素基因被破坏，但抗氨苄青霉素基因没有被破坏，可用含氨苄青霉素的培养基筛选导入目的基因的细菌，但由于含目的基因的载体和不含目的基因的载体上都存在氨苄青霉素抗性基因，因此不能依此来确定筛选出的即为导入目的基因的细菌，B错误；
C、可用PCR技术大量扩增目的基因，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，C正确；
D、用Ca2+处理大肠杆菌可增加细菌细胞壁的通透性，使其成为感受态细胞，易于转化，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】1、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
16．（2022高二下·南京期中）日前微信传言手机屏幕细菌比马桶按钮上的多。两个兴趣小组分别展开如下图的实验过程。下列分析正确的是（ ）
A．通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物
B．以上两组实验在接种过程中均需要用到酒精灯、接种环等
C．两组实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同，原因可能是取样部位不同
D．该实验对照组可以设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养
【答案】A,C,D
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、据图可知，通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物，A正确；
B、微生物的接种最常用的是平板划线法和稀释涂布法，只有平板划线法会用到接种环，而根据图示中菌落的分布特点可知，本实验采用的是稀释涂布平板法，需用涂布器，B错误；
C、通过观察菌落的形态、大小可以看出，两组实验操作均正确，但结果截然不同，原因可能是手机的取样部位和马桶的取样部位都不相同，C正确；
D、该实验缺少对照实验，可以设置取相同培养基接种等量无菌水的组进行培养作为对照组，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】1、菌落是指由一个微生物细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等，每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。不同种或同种在不同的培养条件下，菌落特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义。
2、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
17．（2021·苏州模拟）从红豆杉属植物中提取分离出的紫杉醇是一种有效的抗癌药物，自然状态下红豆杉生长慢，紫杉醇含量低，通过植物细胞悬浮培养技术可获得大量紫杉醇。植物细胞悬浮培养是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中，用摇床或转床进行大规模培养的方法。通过不断的继代培养筛选出疏松性均匀一致、分散性良好、大小大致相同的细胞和细胞团，建立悬浮培养细胞系。据图叙述正确的是（ ）
A．离体的红豆杉组织细胞通过果胶酶分散处理后直接进行悬浮培养
B．悬浮培养液中大多数细胞在形态上呈等径形，核-质比率大，胞质浓厚，液泡化程度高
C．植物细胞悬浮培养培养液中一般细胞分裂素与生长素含量比值小于1
D．植物细胞悬浮培养中植物细胞生长没有接触抑制，因此只要空间足够大，就可以扩大培养。
【答案】B,C
【知识点】植物细胞工程的应用
【解析】【解答】A、离体的红豆杉组织细胞通过纤维素酶和果胶酶分散处理后直接进行悬浮培养，A错误；
B、悬浮培养液中细胞脱分化形成愈伤组织，大多数细胞在形态上大小相差不大，细胞的核-质比率大，胞质浓厚，液泡化程度高，B正确；
C、脱分化过程一般细胞分裂素与生长素含量比值小于1，C正确；
D、植物细胞悬浮培养中植物细胞生长没有接触抑制，但是不可能无限扩大培养，D错误。
故答案为：BC。
【分析】 1、去除高等植物细胞壁，需要用果胶酶和纤维素酶。
2、愈伤组织细胞高度泡状化，大多数细胞在形态上大小相差不大，已经脱去分化。
3、脱分化过程中，一般细胞分裂素与生长素含量比值小于1；再分化过程中，一般细胞分裂素与生长素含量比值大于1。
18．（2022高二下·南京期中）下列有关“基因污染”叙述中，正确的是（ ）
A．转基因生物有可能成为“外来物种”，影响生态系统的稳定性
B．转基因生物的外源基因本身来源于自然界，故不存在“基因污染”的问题
C．抗除草剂基因有可能通过花粉传播进入杂草，从而产生“超级杂草”
D．“基因污染”有可能会从一种生物扩散到其它多种生物物种
【答案】A,C,D
【知识点】转基因生物的安全性问题
【解析】【解答】A. 转基因植物竞争能力强，可能成为“入侵的外来物种”，影响生态系统的稳定性，A正确；
B. 基因污染”会通过花粉等扩散到其他物种，所以转基因植物存在“基因污染”问题，B错误；
C. 转基因作物的抗除草剂基因可通过花粉散落到杂草上，从而污染生物基因库，产生“超级杂草”，C正确；
D. “基因污染”会通过花粉等扩散到其他物种，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】转基因生物的安全性问题有：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）等；其中生物安全主要体现在：①转基因植物扩散到种植区外变成野生种或杂草，②转基因植物竞争能力强，可能成为“入侵的外来物种”，③转基因植物的外源基因与细菌或病毒杂交，重组出有害的病原体，④可能使杂草成为有抗除草剂基因“超级杂草”。
19．（2021·南京模拟）下图为单克隆抗体制备过程示意图。下列有关叙述正确的是（ ）
A．X细胞是从脾脏中提取的已免疫的B淋巴细胞
B．Y细胞是杂交瘤细胞，通常取用培养10代以内的细胞
C．图中筛选过程至少两次且方法不同，最终保留抗体检测呈阳性的细胞
D．图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象
【答案】A,C,D
【知识点】单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、单克隆抗体的制备是用经过免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞，所以X细胞是从脾脏中提取的已免疫的B淋巴细胞，A正确；
B、Y细胞是骨髓瘤细胞，B错误；
C、图中筛选过程至少两次且方法不同，第一次筛选是选择杂交瘤细胞，需要抑制同种细胞的融合体、以及未融合的细胞的增殖，第二次筛选是用抗体检测的方法选择能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，最终保留抗体检测呈阳性的细胞，C正确；
D、由于杂交瘤细胞即保留了骨髓瘤细胞无限增殖的特点，又有浆细胞产生特异性抗体的作用，所以图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象，D正确。
故答案为：ACD。
【分析】分析图示可知，给小鼠注射抗原后，从小鼠体内收集经过免疫的细胞（X细胞），与体外培养的Y（骨髓瘤细胞）细胞融合，经过培养后筛选能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
三、综合题
20．（2022高二下·南京期中）花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病。野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。据图回答下列问题：
（1）过程①所需的酶是 。
（2）过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的 存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是 。原生质体经过 再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
（4）脱分化形成的愈伤组织在 、 两种植物激素的作用下，经 过程形成再生植株。
（5）采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果。据下图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有 。
（6）对杂种植株进行 接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
【答案】（1）纤维素酶和果胶酶
（2）叶绿体
（3）保持原生质体完整性；细胞壁
（4）生长素；细胞分裂素；再分化
（5）1、2、4
（6）黑腐病菌
【知识点】植物组织培养的过程；植物体细胞杂交的过程及应用
【解析】【解答】 (1)图中①表示采用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁的过程。
(2)用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，因此可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。
(3)原生质体没有细胞壁的保护，需要加入适宜浓度的甘露醇以保证渗透压的稳定，以避免原生质体吸水或失水破坏原生质体的完整性；原生质体通过再生细胞壁形成杂种细胞，进而形成愈伤组织。
(4)愈伤组织在含合适浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上再分化形成再生植株。
(5)根据图谱，花椰菜含有碱基对为300和600的DNA片段，黑芥还有碱基对为1000、1300和1500的片段，再生植株3，只含有长度为300和600的片段，与花椰菜一致，1、2、4 既含有花椰菜DNA 片段，又含有黑芥DNA片段，为杂种植株。
(6)对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。
【分析】1、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
2、植物组织培养
（1）原理是植物细胞的全能性。嫩枝或分化程度较低的部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，故外植体一般选用嫩枝或分化程度较低的部位成功率更高。
（2）植物组织培养过程是：离体的植物器言、组织或细胞（外植体）脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养的流程为：制备MS培养基→外植体消毒→接种→培养→移裁→栽培。
（3）植物组织培养的注意事项：①接种时应注意的事项：a、接种室要消毒；b、无菌操作；接种时要防止交叉污染；c、接种完立刻盖好瓶口。②外植体接种前，需要将接种室、接种箱灭菌和对外植体消毒的操作：a、接种前一天，将接种室的四个角落用甲醛溶液和高锰酸钾重蒸。b、接种前1小时，在接种室内用喷雾器喷洒来苏水；桌椅也用来苏水擦拭；接种箱内用甲醛溶液和高锰酸钾重蒸。c、将灭菌室和接种箱内用紫外灯灭菌。d、接种前，操作者用肥皂清洗双手，擦干，再用酒精棉球擦拭双手。e、用次氯酸钠溶液将外植体消毒。
（4）在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
（5）影响植物组织培养的因素：①培养基配制；②外植体选取；③激素的运用；④消毒；⑤温度、pH、光照。
（6）植物组织培养中植物激素使用：物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。
初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，初线代谢物有糖类、脂质、蛋白质、核酸等。次生代谢物指植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本生命活动所必需的产物，一类小分子有机化合物（如酚类、菇类和含氨化合物等）。
21．（2022高二下·南京期中）某研究小组分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌时，选取了从自然界中采集到的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中进行培养。回答下列问题：
（1）配制酵母菌培养液时，需控制培养液的浓度，浓度过高则会导致另需加入一定剂量的青霉素等抗生素，其目的是 ，对培养液进行灭菌时，切断高压蒸汽灭菌锅热源后，须待观察到 时，才能打开放气阀以释放锅内余气，最后开启锅盖取出培养液。
（2）该研究小组成功分离出某品种的酵母菌后，用等量菌液分别接种于3个盛有等量液体培养基的锥形瓶中，并分别置于转速为150r/min、200r/min、250r/min的摇床上培养，检测结果如图1所示，摇床转速为250r/min的酵母菌种群密度最大的原因是 。
（3）图2是采用血细胞计数板直接计数和稀释涂布平板法计数两种方法计数培养液中酵母菌数量时得到的结果，其中采用稀释涂布平板法计数得到的是曲线 ，下列判断依据中正确的有 。
①稀释涂布平板法只计数活的酵母细胞，死细胞无法形成菌落
②采用血细胞计数板直接计数时，可能会将死细胞与活细胞一起计数
③采用稀释涂布平板法计数时，两个或多个细胞连在一起长成一个菌落
④采用稀释涂布平板法计数时，因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
（4）通过如图3所示的方法进行纯化培养时，用移液枪取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基表面，然后将沾有少量酒精的涂布器 后再进行涂布。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的4个平板上菌落数分别为69个、52个、44个、26个，则可以推测原酵母菌液中每毫升含菌数为 个。
【答案】（1）抑制细菌的生长；压力表指针降至“0”点
（2）摇床转速越高，提供的氧气越充足，酵母菌代谢旺盛，增殖快
（3）乙；①和②
（4）灼烧冷却；5.5×107
【知识点】微生物的分离和培养；灭菌技术
【解析】【解答】（1）分离野生酵母菌时需要加入青霉素等抗生素的原因是酵母菌对青霉素不敏感，而细菌、放线菌对抗生素敏感，所以培养基中加入青霉素可以抑制细菌的生长。切断高压蒸汽灭菌锅热源后，须待观察到压力表指针降至“0”点，才能打开放气阀以释放锅内余气。
（2）根据题意可知，摇床转速越高，提供的氧气越充足，从图中可看出摇床转速越高，酵母菌代谢旺盛，增殖快，因此繁殖的速度和总量越高，种群密度最大。
（3）根据图2可知，由于稀释涂布平板法只计数活的酵母菌，血细胞计数板直接计数会将死细胞一起计数，稀释涂布平板法获得的菌落数目比血细胞计数法计数时微生物数目少，因此采用稀释涂布平板法计数的是曲线乙。
因此判断依据有①和②。
（4）在培养基上进行涂布时，要将涂布器灼烧冷却后才能进行操作；根据图解可知菌液被稀释了105倍（M），同时选择菌落数目在30-300的进行计数，所以每毫升含菌数为个。
【分析】1、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
22．（2022高二下·南京期中）下图1表示利用生物技术制备抗X的单克隆抗体的过程；图2表示培育优质奶牛的过程。请据图回答下列问题：
（1）图1所示过程所用的生物技术有 ，将特定的抗原注入小鼠，需在一定时间内间隔注射3次以上，其目的是 。
（2）将经免疫处理后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得能分泌抗X的单克隆抗体的杂交瘤细胞的过程中，至少要进行两次筛选，一次是通过 培养基，筛选出杂交瘤细胞，另一次是通过 检测，筛选出能分泌抗X的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
（3）通过上述方法得到的单克隆抗体可快速准确地识别抗原X，其原因是该抗体具有 的特点。
（4）培养杂交瘤细胞的培养基中需加入动物血清，原因是 ，提供气体条件CO2的作用 ，杂交瘤细胞体外培养过程中，为避免细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，常采取的措施是 。
（5）图2中的早期胚胎发育到 阶段才可以移植，在移植之前，需要进行质量检查，用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，发现活胚胎细胞不能被染色，其原因是 。为了获得多个基因型相同的优质奶牛，可采用的技术手段是 。
【答案】（1）动物细胞融合技术和动物细胞培养技术；加强免疫，刺激小鼠机体产生更多的淋巴细胞
（2）选择；抗体（抗体阳性）
（3）特异性强、灵敏高度
（4）补充细胞生长所需的未知营养物质；维持培养液的pH；定期更换培养液
（5）桑葚胚或囊胚；活细胞的细胞膜具有选择透过性；胚胎分割
【知识点】动物细胞核移植技术；单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】（1）图1所示过程中，需要用动物细胞培养技术培养已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，需要运用动物细胞融合技术诱导已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，再通过动物细胞培养技术培养杂交瘤细胞获得单克隆抗体。相同抗原再次入侵机体时，初次免疫产生的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量新的效应B细胞（浆细胞）和新的记忆细胞，效应B细胞进而产生抗体消灭抗原，因此二次免疫反应较初次免疫强而快 可见，将特定的抗原注入小鼠，需在一定时间内间隔注射3次以上，其目的是加强免疫，刺激小鼠机体产生更多的淋巴细胞。
（2）在抗X的单克隆抗体制备过程中，至少需要进行两次筛选，第一次是通过选择培养基，将所有的杂交瘤细胞筛选出来；第二次是对第一次筛选出来的杂交瘤细胞进行克隆化培养与抗体检测，筛选出能分泌抗X的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
（3）单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏高度，因此可快速准确地识别抗原。
（4）培养杂交瘤细胞需采用动物细胞培养技术，由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此培养杂交瘤细胞的培养基中需加入动物血清，以补充细胞生长所需的未知营养物质。提供气体条件CO2的作用是维持培养液的pH。杂交瘤细胞体外培养过程中，为避免细胞代谢产物积累对细胞自身造成的危害，需要定期更换培养液。
（5）在进行胚胎移植时，一般选择发育到桑葚胚或囊胚阶段的早期胚胎进行移植。用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，染料分子不能通过细胞膜，因此活胚胎细胞不能被染色。为了获得多个基因型相同的优质奶牛，可采用胚胎分割技术。
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、体细胞核移植技术
（1）将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理是动物细胞核的全能性。
（2）体细胞核移植过程：
（3）体细胞核移植的应用：a、加速家畜的遗传改良进程，促进优良种群繁育；b、转基因克隆动物做生物反应器，生产珍贵的医用蛋白；c、克隆动物的组织、器官做移植的供体；d、研究克隆动物和克隆细胞可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。
（4）体细胞核移植技术存在的问题：①胚胎成活率低；②动物健康存在问题；③克隆动物食品的安全性问题。
23．（2022高二下·南京期中）为培育转固氮基因的小麦新品种，科研人员利用土壤农杆菌的Ti质粒和普通质粒按下图构建了双元载体系统（Ti辅助质粒和T-DNA给体质粒），图中vir基因编码产物能激活T-DNA转移，ori为复制原点，tmr和tms为致瘤基因，LB和RB为T-DNA两端的重复序列，kan为卡那霉素抗性基因，ter 为四环素抗性基因。下表是几种限制酶识别序列及切割位点。请回答下列问题：
限制酶 EcoR I BamH I Sau3A I BclI SmaI Xmal
识别序列及切糖粒点 - G↓AATTC- - G↓GATOC- -↓GATC- -T↓GATCA- - CCC↓GGG- -C↓CCGGG-
（1）研究发现T-DNA的RB序列相当保守，是由于该序列的突变类型在 过程中被淘汰。
（2）双子叶植物受到损伤时，伤口处的细胞分泌大量酚类化合物会吸引农杆菌移向这些细胞。农杆菌一般难以感染小麦等单子叶植物，若想提高农杆菌转化小麦的成功率，可采取的方法是 。·T-DNA转移至植物细胞可使植物患“肿瘤”，研究发现“肿瘤”的发生与植物激素有关，据此推测T-DNA中致瘤基因tmr、tms 可能与 等植物激素的合成有关。
（3）为防止植物形成“肿瘤”，研究人员按上图构建了双元载体系统。图中过程①需先用 制酶处理Ti质粒以去除致瘤基因，再用 酶将经过处理的固氮基因接入Ti质粒，以构建重组质粒；过程②用 限制酶处理重组质粒，获得含vir基因的DNA片段和含固氮基因的T-DNA，再经过程③、④分别构建Ti辅助质粒和T-DNA给体质粒。
（4）科研人员用限制酶EcoRI和SauBAI处理T-DNA给体质粒，完全酶切后可以得到含 条带的凝胶电泳图谱。
（5）将构建的Ti辅助质粒和T-DNA给体质粒通过 方法同时导入土壤农杆菌内，选择在含有 的培养基上能形成菌落的土壤农杆菌去感染小麦细胞。该过程中T-DNA给体质粒并不含有vir基因，但仍能将转化成功的原因是 。
（6）种植转基因固氮小麦，在环境保护上的重要意义有 。
【答案】（1）自然选择
（2）在小麦伤口处加入酚类化合物；细胞分裂素和生长素
（3）SmaI 和 BamHI；T4DNA 连接酶；EcoRI
（4）3
（5）感受态细胞法（或 Ca2+处理）；卡那霉素；Ti 辅助质粒含有 vir 基因，其编码的产物能促进T-DNA 给体质粒中的 T-DNA 转化成功
（6）减少氮肥的使用，减轻环境污染
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核苷酸序列（如 RNA 或 DNA 序列），蛋白质中氨基酸序列，蛋白质结构或糖类中的序列。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。很多科学家认为， 保守序列的基因区域发生突变会导致生命体无法存活或被自然选择所淘汰。
（2）将目的基因导入单子叶植物常用的方法是农杆菌转化法，转化前可将小麦伤口处加入酚类化合物；T-DNA 转移至植物细胞可使植物患“肿瘤”，植物的“肿瘤”实际上是植物创伤组织的生长与分裂造成。题干暗示了“肿瘤”的发生与植物激素有关，促进植物组织生长与分裂 有关的激素包括生长素与细胞分裂素等。据此可以推测 T-DNA 中致瘤基因 tmr、tms 可能与生长素、细胞分裂素等植物激素的合成有关。
（3）图中过程①需先用 Sma I 和 BamH I 限制酶处理 Ti 质粒以去除致瘤基因。具体分析如下：BamH I 限制酶识别序列中包含了 Sau3AI 限制酶识别序列。因此选用 BamH I 限制酶就可以选用 Sau3AI 限制酶。因为要去除致瘤基因（tmr 和 tms），应该选择 Xma I 和 BamHI 两种限制酶，同时需要 酶切后将目的基因固氮基因插入其中。观察固氮基因的两端，一端为平末端，一端为黏性末端（-CTAG），BamHI 酶切后的黏性末端可以与固氮基因的黏性末端相配对，但 Xma I 酶 切后为黏性末端，无法与固氮基因的平末端相连。而所提供的 Sma I 限制酶的识别序列与Xma I 限制酶的识别序列相同，但切出的为平末端。因此选择 Sma I 和 BamH I 限制酶处理 Ti 质粒以去除致瘤基因。在此过程中不能选择 Sau3AI 限制酶，因为不仅 BamH I 限制酶识别序列中包含 Sau3AI 限制酶识别序列，BclI 限制酶中也包含包含 Sau3AI 限制酶识别序列。如果选择 Sau3AI 限制酶，有可能不能剔除tms基因。因为 T4DNA 连接酶既可以连接平末端，也可以连接黏性末端，故酶切后再用 T4DNA 连接酶将经过处理的固氮基因接入 Ti 质粒，以构建重组质粒。要从重组质粒中获得含 vir 基因的 DNA 片段和含固氮基因的 T-DNA，必须再进行酶切。观察重组质粒，其中 LB 和 RB 两侧分别含有 EcoRI 的酶切位点，因此用 EcoR I 限制酶处理重组质粒，获得含 vir 基因的 DNA 片段和含固氮基因的 T-DNA。
（4）经过③获得的给体质粒上含有这几种酶的酶切位点：两个 EcoR I 限制酶酶切位点（因为是用 EcoR I 来酶切 T-DNA 与普通质粒后拼接而得给体质粒）、一个 Sma I 和一个 BamH I 限制酶酶切位点（因为是用这两种酶构建重组质粒的）。其中 BamH I 限制酶的识别序列中包含 GATC 也能为 Sau3A I 限制酶识别。因此用限制酶 EcoR I 和 Sau3A I 处理 T-DNA 给体 质粒，完全酶切后可以得到含 3 个条带的凝胶电泳图谱。
（5）将目的基因导入微生物体内，常采用的方法是用一定浓度 CaCl2溶液处理微生物，提高细胞摄取外源治理 DNA 的能力，该方法为感受态细胞法；基因表达载体上含有卡那霉素标记基因，故可用卡那霉素进行培养选择，农杆菌体内给体质粒上的 T-DNA 片段具有可转移性，即能够从农杆菌中转移至植物细胞内，并整合到植物细胞的染色体 DNA 上，但这种转移需要 vir基因编码产物的激活。
（6）因为氮元素是生物体蛋白质组成的必需元素，也是生物生长必须的大量元素 之一，同时还参与多种生命活动。因此植物的生长需要大量的氮肥。为满足农作物的生长 需求，对于无法进行固氮的植物而言，就必须大量使用化肥。而种植转基因固氮小麦，在环境保护上的重要意义有减少氮肥使用，减轻环境污染 。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
24．（2022高二下·南京期中）科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如下图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题。
限制酶 识别序列
ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
HindⅢ 5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′
KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′
SacⅠ 5′GAGCT↓C3′
（1）以RNA为模板，通过RT-PCR技术可获取P基因。进行RT–PCR时一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）而不是脱氧核苷酸，其原因是 ，同时需加入的酶有 。为了特异性扩增P基因序列，需根据 设计特异性引物。
（2）在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T-DNA的 特性，最终使P基因 。
（3）将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
（4）对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有 。
【答案】（1）dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量)；逆转录酶和 Tag酶；P基因两端的碱基序列
（2）BamHI；Sac I；可转移；整合到玉米细胞染色体上
（3）潮霉素
（4）基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)多聚酶链式反应简称PCR技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术，需要能量和原料等，dNTP（dATP， dTTP， dGTP， dCTP） 能为子链延伸过程提供能量和原料，因此进行RT–PCR时一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）。以RNA为模板获取P基因属于逆转录过程，需要逆转录酶，PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，即Tag酶。引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，为了特异性扩增P基因序列，需根据P基因两端的碱基序列设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamHI切割，另一种酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在质粒中，KpnⅠ识别序列在BamHI识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用KpnⅠ切割，目的基因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamHI和Sac I。T-DNA是Ti质粒上的一个片段。利用农杆菌等微生物可将人工合成的目的基因（P基因）片段通过T-DNA载体转移到受体植物（玉米细胞）的基因组中，是基因工程的重要技术手段。
(3)据图可知，利用Ti质粒的T-DNA可将目的基因（P基因）转移到玉米细胞，T-DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，标记基因的作用检测受体细胞中是否含有目的基因，因此培养基中需加入潮霉素，能在此环境中生存的玉米即为转基因玉米。
(4)基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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