微生物的实验室培养课件

(共59张PPT)
第一节
第一课时
微生物
包括哪五类：
病毒
细菌
放线菌
真菌
原生动物
特点：结构都相当简单,多数个体十分微小(原核
原生生物界
真菌界
病毒界
真核
病毒
SARS病毒 禽流感病毒
朊病毒（蛋白质病毒）
真菌
如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构
酵母菌和霉菌
青霉
了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。
一、课题目标：
掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。
无菌技术的操作。
二、课题重点和难点：
三、技能目标：
（2）按培养基的物理形态分：
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
一 基础知识:
（3）按培养基的功能分：
基础培养基
选择培养基
鉴别培养基
（1）按培养基的化学成分分：
·天然培养基
·合成培养基
·半合成培养基
阅读课本分别说出它们的优点、缺点。
培养基的种类
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
据物理性质分
天然培养基
合成培养基
据化学成分分
选择培养基
鉴别培养基
据用途分
常用于工业生产
常用于观察微生物的运动、鉴定菌种
用于微生物的分离、计数
常用于工业生产
常用于分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。
选择培养基
加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞
加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:
分离杂交瘤细胞
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
合成培养基:
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
天然培养基：
固体培养基：菌落
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
半固体培养基：
无动力 有动力(弥散)
(是否运动)
培养基的配制原则：
①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
细菌pH为：6.5-7.5；
放线菌pH为：7.5-8.5；
真菌pH为：5.0-6.0
微生物的五种营养要素
碳源
氮源（nitrogen source）
生长因子 微生物生长不可缺少的微量有机物质叫生长因子。维生素 氨基酸 碱 基
无机盐（mineral salts）
水（wahtor）
Cncnc-micro
凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质都称为碳源 。
凡是能为微生物提供所需氮元素的营养物质都称为氮源。
无机C源：CO2、碳酸盐，只能被自养微生物利用
有机C源：各种糖类，其次是有机酸、醇类、 脂类和烃类化合物
碳源种类
Cncnc-micro
分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源
无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用
有机态氮：蛋白质及其降解产物
a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源
b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等
氮源种类
Cncnc-micro
构成微生物细胞的组成成分
调解微生物细胞的渗透压， PH值和氧化还原电 位
有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源
构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。Mg、Ca、K是多种酶的激活剂
无机盐（mineral salts）
无机盐功能
Cncnc-micro
构成微生物细胞以C、H、O、N、P、S六种元素为主，约占细胞干重的95％以上；
Ca、K 、Mg、Fe为大量元素，以无机盐阳离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。
Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培养中有0.1PPM就可以了，自来水原料中已够用，不需另加。
无机盐种类
Cncnc-micro
碳源、氮源、生长因子的比较
来 源 常用原料 功 能
碳源 CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等 糖类 构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养做生物的主要能源物质
氮源 N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等 铵盐、硝酸盐等 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
生长因子 维生素、氨基酸、碱基 酶、核酸等的组成成分
各种培养基的具体配方不同，但一般都包括哪些成分？
答：不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质。
注： 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。
二 无菌技术：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线消毒
……
(1)常用消毒的方法：
1、灼烧灭菌:
2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.
(2)常用灭菌的方法：
分类 定义 方法
灭菌法
杀灭一切微生物 物理法：热力、辐射、微波、等离子体
化学法：醛类、烷化剂
高效消毒法 杀灭一切致病微生物 紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等
中效消毒法 杀灭除芽孢外的致病微生物 超声波、碘类、醇类、酚类
低效消毒法 杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒 单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子
无菌技术：
常
识
1． 无菌技术包括：
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。
2． 消毒方法：
（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法；
（2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（作简要介绍）；
（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。
（4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒；
（5）饮水水源用 氯气 进行消毒。
3．灭菌方法：
（1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法；
（2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ；
（3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 。
（4）表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
3.微生物实验室培养的基本操作程序
1、器具的灭菌
2、培养基的配制
3、培养基的灭菌
4、倒平板
5、微生物接种
6、恒温箱中培养
7、菌种的保存
三、实验操作
1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
1)．配制：计算、称量、熔化
2)．调节pH：　用3%的HCI/NaOH调节
pH 7．0--- 7．2
3)．分装：分装过程中注意不要使培养基沾 在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
4)．包扎：
操作步骤:
5)．灭菌:
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。
将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
6)．倒平板:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.
7)．无菌检查：
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
倒平板:
菌种的保存
1)、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2)、长期保存：甘油冷冻管藏法
1).培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
注意:
3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
2、纯化大肠杆菌:
接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的接种技术
菌落：
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
菌落
细菌的菌落特征因种而异
霉菌的菌落特征
因种而异
菌落
划线后 培养一段时间后
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
四、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（二）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（三）是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。
本课题知识小结:
【典例解析】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是:
A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。
答案：D
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是:
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌
D.灭菌必须在接种前
答案：B
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
如不想浪费此培养基，可再加入 .
用于培养 金黄色葡萄球菌.
自养型微生物
含碳有机物
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
固氮微生物
3
调整pH
依微生物的生长需要确定
琼脂（或凝固剂）
解析： 对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分②，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂——琼脂。