动物细胞工程
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课件66张PPT。动物细胞工程专题2 细胞工程◆动物细胞培养◆动物细胞融合◆单克隆抗体制备◆动物体细胞核移植技术和克隆动物思考与回忆：
1、动物细胞全能性特点？
随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。
2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？
不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。
3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？
细胞增殖
动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术其它动物细胞工程的基础 一：动物细胞培养
二：核移植技术本节内容：一、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.
2、原理：细胞增殖1、概念： 烧伤病人图片异体皮肤移植图片定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3：过程图示原代培养强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制 定义：
当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。3、总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶单个细胞加培养液制成细胞悬浮液10代
细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能
最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.动物细胞培养过程：增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养去掉组织间
蛋白问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，有利于细胞吸收营养及排除细胞代谢废物。动动脑？问题1、动物细胞培养的原理：细胞增殖。问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？长时间处理会消化细胞膜蛋白，当然会损伤细胞，所以必须控制好时间！问题3：为什么用胰蛋白酶处理？动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：
1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？
2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？
讨 论葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子和动物血清等。适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境见教材46页4.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒 的环境： 适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。
适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产
如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
2.应用于基因工程
主要用于作为受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性
4.细胞的生理、药理、病理研究
如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较： 见金版新学案P24页表二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理： 动物细胞核具有全能性4、体细胞核移植过程---示动物克隆---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：另一头绵羊的子宫◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：
一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.
二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕
受体 ◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：
◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内 妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养） 1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？核移植流程:1、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。讨论1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？
3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。体细胞核移植技术的应用前景1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病1、成功率比较低 2、大多存在健康问题 3、克隆动物食品安全问题体细胞核移植技术存在的问题5.体细胞核移植技术存在的问题教材P49-50页思考与探究1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因。细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。肿瘤组织或细胞 ＞ 正常组织或细胞 拓展---动物组织或细胞培养的难易程度幼体组织或细胞 ＞ 老龄组织或细胞分化程度低的组织或细胞 ＞ 分化程度高的组织或细胞因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。思考与探究2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。
可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？
从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。
应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。本节内容小结1、动物细胞培养过程涉及的概念
细胞贴壁、细胞的接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系3、植物细胞和动物细胞培养的比较4、动物细胞培养技术的应用2、动物细胞培养条件1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示： b表示: 2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。3、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为 核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都来自白面绵羊aa动物细胞融合与
单克隆抗体1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。
细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合 受精作用动物细胞融合仙台病毒
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒2、诱导融合的因素
生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)
化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.
物理法：电激融合病毒颗粒黏 附细胞表面细胞膜连接细胞膜被 病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞物理法化学法生物法：灭活的病毒仙台病毒丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）3、动物细胞融合技术的应用细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂
质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭
活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。人们获得抗体的传统方法是?
将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体
这种方法的缺点是什么?
效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。
运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？
能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？
B淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备思考单克隆抗体的制备—极富创造性的方案
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。
米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。动物特异性免疫
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）
细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）
第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。
选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：3）、为何要进行两次筛选？4）、如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：1）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.
2、用于治疗疾病和运载药物：
主要用于癌症治疗。
生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。3、单克隆抗体的应用主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用 途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原 理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物、动物细胞融合的比较总结一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞一个优势构建知识网络细胞融合核移植 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 --------------------（ ）
A．细胞系 B．细胞株
C．原代细胞 D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是 ------（ ）
A.动物细胞融合 B.单克隆抗体
C.胚胎移植 D.动物细胞培养 AD课堂反馈练习3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （ ） A.容易产生各种变异
B具有更强的全能性 C.取材十分方便
D分裂增殖的能力强D4、下列属于动物细胞工程中的工具是（ ）
A．限制性内切酶 B．DNA连接酶
C．胰蛋白酶 D．果胶酶C具有一定的流动性C有丝不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点 [例题2]
（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，
将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ）
A．T淋巴细胞 B．效应B淋巴细胞
C．抗体 D．记忆细胞
（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，
正确的是 (多选) （ ）
A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台
病毒或聚乙二醇诱导
B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克
隆抗体
C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不
能无限增殖
D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，
优越性明显 BCD ACD已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。
（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出
杂种细胞，并说原理。
方法： 。
原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50例3：1.动物细胞工程技术的基础是：（ ）
A．动物细胞融合
B．胚胎移植
C．动物细胞培养
D．核移植Ｃ课堂练习;２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）
A．结果是相同的
B．杂种细胞的形成过程基本相同
C．操作过程中酶的作用相同
D．诱导融合的手段相同
Ｂ３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ）
①淋巴细胞
②小鼠骨髓瘤细胞
③B淋巴细胞自身融合细胞
④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞
⑤杂交瘤细胞
A． ②④ B．①③⑤
C． ①②③④ D．②③ C
1、动物细胞全能性特点？
随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。
2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？
不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。
3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？
细胞增殖
动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术其它动物细胞工程的基础 一：动物细胞培养
二：核移植技术本节内容：一、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.
2、原理：细胞增殖1、概念： 烧伤病人图片异体皮肤移植图片定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3：过程图示原代培养强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制 定义：
当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。3、总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶单个细胞加培养液制成细胞悬浮液10代
细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能
最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.动物细胞培养过程：增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养去掉组织间
蛋白问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，有利于细胞吸收营养及排除细胞代谢废物。动动脑？问题1、动物细胞培养的原理：细胞增殖。问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？长时间处理会消化细胞膜蛋白，当然会损伤细胞，所以必须控制好时间！问题3：为什么用胰蛋白酶处理？动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：
1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？
2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？
讨 论葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子和动物血清等。适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境见教材46页4.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒 的环境： 适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。
适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产
如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
2.应用于基因工程
主要用于作为受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性
4.细胞的生理、药理、病理研究
如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较： 见金版新学案P24页表二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理： 动物细胞核具有全能性4、体细胞核移植过程---示动物克隆---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：另一头绵羊的子宫◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：
一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.
二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕
受体 ◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：
◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内 妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养） 1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？核移植流程:1、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。讨论1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？
3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。体细胞核移植技术的应用前景1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病1、成功率比较低 2、大多存在健康问题 3、克隆动物食品安全问题体细胞核移植技术存在的问题5.体细胞核移植技术存在的问题教材P49-50页思考与探究1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因。细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。肿瘤组织或细胞 ＞ 正常组织或细胞 拓展---动物组织或细胞培养的难易程度幼体组织或细胞 ＞ 老龄组织或细胞分化程度低的组织或细胞 ＞ 分化程度高的组织或细胞因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。思考与探究2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。
可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？
从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。
应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。本节内容小结1、动物细胞培养过程涉及的概念
细胞贴壁、细胞的接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系3、植物细胞和动物细胞培养的比较4、动物细胞培养技术的应用2、动物细胞培养条件1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示： b表示: 2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。3、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为 核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都来自白面绵羊aa动物细胞融合与
单克隆抗体1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。
细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合 受精作用动物细胞融合仙台病毒
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒2、诱导融合的因素
生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)
化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.
物理法：电激融合病毒颗粒黏 附细胞表面细胞膜连接细胞膜被 病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞物理法化学法生物法：灭活的病毒仙台病毒丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）3、动物细胞融合技术的应用细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂
质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭
活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。人们获得抗体的传统方法是?
将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体
这种方法的缺点是什么?
效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。
运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？
能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？
B淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备思考单克隆抗体的制备—极富创造性的方案
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。
米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。动物特异性免疫
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）
细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）
第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。
选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：3）、为何要进行两次筛选？4）、如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：1）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.
2、用于治疗疾病和运载药物：
主要用于癌症治疗。
生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。3、单克隆抗体的应用主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用 途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原 理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物、动物细胞融合的比较总结一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞一个优势构建知识网络细胞融合核移植 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 --------------------（ ）
A．细胞系 B．细胞株
C．原代细胞 D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是 ------（ ）
A.动物细胞融合 B.单克隆抗体
C.胚胎移植 D.动物细胞培养 AD课堂反馈练习3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （ ） A.容易产生各种变异
B具有更强的全能性 C.取材十分方便
D分裂增殖的能力强D4、下列属于动物细胞工程中的工具是（ ）
A．限制性内切酶 B．DNA连接酶
C．胰蛋白酶 D．果胶酶C具有一定的流动性C有丝不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点 [例题2]
（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，
将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ）
A．T淋巴细胞 B．效应B淋巴细胞
C．抗体 D．记忆细胞
（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，
正确的是 (多选) （ ）
A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台
病毒或聚乙二醇诱导
B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克
隆抗体
C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不
能无限增殖
D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，
优越性明显 BCD ACD已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。
（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出
杂种细胞，并说原理。
方法： 。
原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50例3：1.动物细胞工程技术的基础是：（ ）
A．动物细胞融合
B．胚胎移植
C．动物细胞培养
D．核移植Ｃ课堂练习;２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）
A．结果是相同的
B．杂种细胞的形成过程基本相同
C．操作过程中酶的作用相同
D．诱导融合的手段相同
Ｂ３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ）
①淋巴细胞
②小鼠骨髓瘤细胞
③B淋巴细胞自身融合细胞
④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞
⑤杂交瘤细胞
A． ②④ B．①③⑤
C． ①②③④ D．②③ C