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课题3 血红蛋白的提取和分离
一、基础知识：
（一）蛋白质提取和分离原理
（二）蛋白质提取和分离的方法
1、凝胶色谱法：又称分配色谱法
2、电泳法
（三）缓冲溶液
二、实验操作－－实验步骤
血液组成成分
1.洗 涤 红 细 胞
2.释放血红蛋白
3.分离血红蛋白
4.透析血红蛋白
样品处理
和粗分离
纯 化
纯度鉴定
蛋白质提取与分离的依据－－
蛋白质的物理化学性质差异：
1.分子的形状、大小
2.电荷性质和多少
3.溶解度
4.吸附性质
5.对其他分子亲和力
1.凝胶色谱法
1）原理：
2）材料：凝胶
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；
小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.
根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法
概念：
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，
促使蛋白质分子的差速流动。
混合物
上 柱
洗
脱
大分子流动快
小分子流动慢
收 集
大分子
收 集
小分子
2．凝胶电泳法：
1）原理：
不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
思考：蛋白质为什么带有电荷？
在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷
影响蛋白质分子运动速度的因素
决定
运动方向 电场
作用力 形成
阻力 决定
运动速率
电荷性质
电荷量
分子形状
分子大小
√
√
√
√
√
√
√
3）常用电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。
如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等
缓冲溶液－－洗脱剂
1） 作用：
2）配制：
调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定,从而维持蛋白质空间结构。
思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？
血液组成成分
阅读思考：
血液由______和________两部分组成。
血细胞中_______细胞数量最多，细胞的含量最高的有机化合物是_____________。
该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。
血浆
血细胞
红细胞
血红蛋白
2条α-肽链
2条β-肽链
亚铁血红素
1.洗 涤 红 细 胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？
血液
100mL
3g柠檬酸钠
低速离心
2 min
红细胞
血 浆
吸出血浆
红细胞
5倍体积生理盐水
搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
其他血细胞
2.释放血红蛋白
阅读思考：
释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？
为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析：
蒸馏水的作用是______________________________。
加入甲苯的作用是____________________________。
充分搅拌的目的是____________________________。
使红细胞大量吸水胀裂
溶解红细胞的细胞膜
加速红细胞的破裂
为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？
滤纸
过滤
脂类物质
3.分离血红蛋白
分离过程
红细胞
混合液
高速离心
10min
离心管
烧杯
有机溶剂
血红蛋白
20mmol/L磷酸缓冲液
4.透析血红蛋白
透析的目的是什么？
1mL
1mL
1mL
去除血红蛋白中的小分子杂质
纯化方法－－本实验采用凝胶色谱法
1.凝胶色谱柱的制作：
2.凝胶色谱柱的装填：
教材图5－19
3.样品的加入和洗脱
步骤 操作要求
①
②
③
④
⑤
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
洗涤平衡
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
装填悬浮液
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
根据色谱柱体积计算凝胶用量
色谱柱垂直固定在支架上
配制悬浮液
计算称量凝胶
固定色谱柱
材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液
“G”表示什么？75代表什么？
2.凝胶色谱柱的装填
3.样品的加入和洗脱
1.调液面
2.加样
3.再调液面
4.洗脱
5.收集
缓冲液
凝胶
注意事项
注意事项
1. 红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
2.色谱柱的装填：
装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
3. 凝胶的预处理：
沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
否则容易使白细胞、血小板、淋巴细胞等其他血细胞同红细胞一块儿沉淀，而无法将红细胞分离！
纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断纯化的蛋白质是否达到要求，需进行蛋白质纯度鉴定，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
知识总结
血红蛋白的提取和分离
蛋白质分子的差异性
凝胶色谱法
原 理
分离过程
凝胶电泳法
缓冲溶液
组 成
作 用
蛋白质的
提取分离
样品处理
粗 分 离
纯 化
纯度鉴定
