高考生物五年真题汇编25——微生物的利用（1）
一、单选题
1．（2021·山东）含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（ ）
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
2．（2021·天津）下列操作能达到灭菌目的的是（ ）
A．用免洗酒精凝胶擦手 B．制作泡菜前用开水烫洗容器
C．在火焰上灼烧接种环 D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
3．（2021·北京）社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是（ ）
A．长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B．转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C．消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒
D．如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的
4．（2021·北京）人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是（ ）
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
5．（2021·浙江）下列关于原生质体和细胞计数的叙述，错误的是（ ）
A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板
B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数
C．涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数
D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度
6．（2020·浙江选考）下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是（ ）
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
7．（2020·天津）阅读下列材料，回答下列小题。
甜瓣子是豆瓣酱的重要成分，风味受蚕豆蛋白分解产生的氨基酸影响，也受发酵过程中不同微生物的多种代谢产物影响。其生产工艺如下图所示。
某研究团队对加盐水后的发酵阶段的传统工艺（盐度15%，温度37 ℃，发酵30天）进行了改良，改良后甜瓣子风味得以提升。新工艺参数如下表所示。
时期 时段（天） 盐度（%） 温度（℃）
前期 0~12 6 12
中期 12~16 6 37
后期 16~30 15 37
两种工艺的结果比较见下图。
（1）下列关于本研究的实验方法与原理的描述，错误的是（ ）
A．发酵开始阶段的微生物主要来源于制曲过程的积累
B．蚕豆瓣可提供微生物生长繁殖所需的碳源和氮源
C．温度与盐度都影响微生物的生长繁殖
D．定期取样，使用平板划线法统计活细菌总数
（2）下列对实验结果的分析，错误的是（ ）
A．新工艺中期活霉菌总数下降由温度升高导致
B．新工艺后期活细菌总数下降由温度、盐度均升高导致
C．新工艺中期氨基酸产生速率较前期末加快，是因为温度升高提高了蛋白酶活性
D．新工艺中甜瓣子风味提升，与前、中期活微生物总数高和氨基酸终产量高均有关
二、多选题
8．（2021·江苏）为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是（ ）
A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B．涂布用的菌浓度应控制在30~300个/mL
C．需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D．挑取培养基上长出的较大单菌落，给纯化后进行降解效率分析
三、综合题
9．（2022·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
Ⅰ.为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（2）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
Ⅳ.在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
Ⅴ.为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
Ⅵ.植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
10．（2022·广东）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对南中国海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用 法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用 法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难度解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系绘组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌物各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 。
11．（2022·浙江选考）回答下列(1)、(2)小题：
（1）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：
Ⅰ.取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔。制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为了进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。
Ⅱ.红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、20nm和505nm波长处均有较大吸收峰，用光电比色法测定红曲色素提取中的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。
Ⅲ.生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和
处理。
（2）我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩，但全球疫情形势仍然非常严峻，尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
Ⅰ.新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
Ⅱ.接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。
Ⅲ.单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。
12．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与甘蔗醋制作有关的问题：
①为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，震荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
②优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下震荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。
③制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。
（2）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
①由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
②为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
③为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
13．（2021·广东）[选修1：生物技术实践]
中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产pHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有 等。（答出两种方法即可）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是 。（答出两点即可）
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和pHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产pHA，说明其能分泌 。
14．（2021·全国乙卷）[生物-选修：生物技术实践]
工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品的过程，利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。
回答下列问题：
（1）米曲霉发酵过程中，加入大豆、小麦和麦麸可以为米曲霉的生长提供营养物质，大豆中的 可为米曲霉的生长提供氮源，小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供 。
（2）米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖、大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的 、 能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和 。米曲发酵过程需要提供营养物质、通入空气并搅拌，由此可以判断米曲霉属于 (填“自养厌氧”*异养厌氧”或“异养好氧")微生物。
（3）在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于 (填“真核生物“或“原核生物”)；添加的酵母菌在无氧条件下分解葡萄糖的产物是 。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，据图分析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是 (答出1点即可)。
15．（2020·浙江选考）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：
Ⅰ.柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的 。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的 ，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值 的处理效果好。③对不同处理进行 ，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。
Ⅱ.加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成 ，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已 的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径 的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的 下降。
（2）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
Ⅰ.天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的 。
Ⅱ.结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、 及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用 的转基因方法。
Ⅲ.利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间 ，且不经历 过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
Ⅳ.与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加 ，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成 ，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如 （A.提高蔗糖浓度B.降低培养基浓度C.提高大量元素浓度D.不添加琼脂）。
四、实验探究题
16．（2022·全国乙卷）化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重（g/L） S产量（g/L）
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
（1）通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有 （答出2点即可）。
（2）由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是 ；用菌株C生产S的最适碳源是 。菌株C的生长除需要碳源外，还需要 （答出2点即可）等营养物质。
（3）由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是 。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路： 。
（5）利用制糖废液生产S可以实验废物利用，其意义是 （答出1点即可）。
17．（2022·全国甲卷）某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
（1）实验所用培养基中作为碳源的成分是 。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成 （答出2种即可）等生物大分子。
（2）步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是 。
（3）为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是 。
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A +++ ++
B ++ -
（4）现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是 ，理由是 。
18．（2021·湖南）[选修1：生物技术实践]
大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以 为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于 培养基。
（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是 。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是 。
（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路 。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株 ，理由是 。
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重（%） 纤维素降解率（%）
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
19．（2021·河北）[选修1：生物技术实践]
葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。
回答下列问题：
（1）皮渣中含有较多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前将原料干燥、粉碎的目的分别是 ，萃取效率主要取决于萃取剂的 。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷 。研究发现，萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理可提高花色苷的提取率，原因是 。
（2）为了解皮渣中微生物的数量，取10g皮渣加入90mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为 个。
（3）皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至 性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是 。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为 。
（4）皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。（简要写出实验步骤和预期结果）
20．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。
Ⅰ.从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或 法，两种方法均能在固体培养基上形成 。对分离的菌株进行诱变、 和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。
Ⅱ.固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除 ；③检验固定化菌株的 。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是 。
Ⅲ.对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是 。
（2）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。
Ⅰ.为保护三叶青的 多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用 技术，实现了三叶青的林下种植。
Ⅱ.依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成 和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成 ，再分化形成毛状根。
Ⅲ.剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次 培养，培养基中添加抗生素的主要目的是 。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的 和温度，调节培养基成分中的 ，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
答案解析部分
1．【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】 A、由图可知，乙菌穿刺能力比甲强，A正确；
B、为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；
C、由实验可判断产生硫化氢的能力大小，不能测定产生硫化氢的量，C正确；
D、微生物培养的关键是无菌操作，接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的运动时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
2、由题意可知，黑色沉淀越多，产生硫化氢能力越强，穿刺能力越强。
3、液体、半固体、固体培养基的特点与用途：
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 大量繁殖
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基（最常用） 微生物分离、鉴定、活菌记数、保藏菌种
2．【答案】C
【知识点】灭菌技术
【解析】【解答】 A、免洗酒精凝胶擦手是化学药剂消毒法属于消毒，A错误；
B、开水烫洗容器是煮沸消毒法，B错误；
C、在火焰上灼烧接种环属于灼烧灭菌，C正确；
D、防疫期间用石炭酸喷洒教室属于化学药剂消毒法，D错误。
故答案为：C。
【分析】消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
3．【答案】A
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；基因工程的应用；灭菌技术
【解析】【解答】A、高温加热破坏会维生素，造成维生素的流失和分解，A正确；
B、转基因抗虫棉产生的毒蛋白只针对棉虫，对人无毒，B错误；
C、消毒液杀死的是体表的细菌和病毒，不能清除进入人体的病毒，C错误；
D、血型遗传受基因控制，A型血和B型血的父母可能生出O型血的孩子，故血型不同也可能是亲生的，D错误。
故答案为：A
【分析】1、烹饪饮食的方法不当蔬菜、水果等食物是人体摄入维生素C的主要来源。研究发现，人们若采取以下烹饪方法，就会导致饮食中所含的维生素C大量流失：①将蔬菜先切后洗。②将蔬菜切得很碎。③用铁制的刀具切蔬菜。铁会促使蔬菜中所含的维生素C更快地发生氧化。因此，人们应尽量少用刀切菜，而应养成用手撕菜的习惯。④炖煮蔬菜的时间过长。⑤长时间地存放水果和蔬菜。维生素C易被空气中的氧气氧化，因此蔬菜、水果被存放的时间越长，其中所含的维生素C就流失得越多。
2、转基因抗虫棉产生的毒蛋白会使棉虫致死，而不对人体产生毒性，是由于人体细胞没有毒蛋白的特异性受体，并且人误食了该毒蛋白质之后经过消化系统蛋白质已经变性甚至降解，没了毒性。
3、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
4、血型分为四种，即A，B，AB，O。血型是指红细胞上所含的抗原不同而言，红细胞上只含A抗原的称A型，含有B抗原的称B型，既有A抗原又有B抗原的称为AB型，既没有A抗原也没有B抗原的称为0型。ABO血型受ABO三种基因控制，A基因控制A抗原产生，B基因控制B抗原产生，O基因控制不产生A和B两种抗原，而基因都是成对存在，控制ABO血型的基因可有六种不同组合，即AA，AO，BB，BO，AB，OO，而每个人只有其中一对。
4．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；灭菌技术
【解析】【解答】A、培养基及容器一般利用高压蒸汽灭菌，A正确；
B、为了减少杂菌污染，应使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；
C、取样后需先在液体培养基中扩大培养，再涂布到固体培养基上选择培养，C错误；
D、不同的微生物的菌落形态和颜色不同，可根据这些特征进行初步判断，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、 实验室常用的消毒和灭菌方法的比较：
（1）消毒：煮沸消毒法（一般物品）、巴氏消毒法（一些不耐高温的液体，如牛奶）、化学药剂消毒法（如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等）、紫外线消毒法（接种室、操作台）；
（2）灭菌：灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。
5．【答案】C
【知识点】测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A.血细胞计数板适用于较大的细胞或颗粒的计数，实验中需先将原生质体制成悬浊液再进行计数，A说法正确；
B.红墨水的成分细胞不需要，因此不能进入活细胞，活细胞不会被染红，而死细胞的膜失去了选择透过性，会被染红，由此可用于检测细胞的存活状态并计数，B说法正确；
C. 涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，但只有涂布分离法可用于细胞计数，C说法错误；
D. 随着酵母菌数目的增加，酵母菌培养液的浑浊度会上升，所以可以用比浊计测定其密度，D说法正确。
故答案为：C。
【分析】 血细胞计数板计数法，是常用的一种计数血细胞数量的计数方法，经常应用于白细胞、红细胞等血细胞的计数。 除了计数血细胞以外，还可用于酵母菌、细菌等病原微生物的技术，血细胞计数板是通过显微镜下，把计数板分成了很多网格状的结构，然后进行适当的稀释血液进行计数，最终计算出各种血细胞的数量。
6．【答案】A
【知识点】微生物的分离和培养；果酒果醋的制作
【解析】【解答】A、利用尿素固体培养基，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非杀死，A错误；
B、不同的微生物所需的pH不同，所以配置培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；
C、酵母菌不能直接利用淀粉，应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C正确；
D、醋化醋杆菌在有氧条件下利用酒精产生醋酸，D正确。
故答案为：A。
【分析】培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能选择分解尿素的微生物。
7．【答案】（1）D
（2）B
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用
【解析】【解答】（1）A、制曲过程中会有微生物的积累，是发酵开始阶段微生物的主要来源，A正确；
B、蚕豆瓣中有很多有机物，可以提供微生物生长繁殖所需的碳源和氮源，B正确；
C、观察新工艺各个时期的活霉菌总数和活细菌总数的变化，从前期到中期，盐度不变温度升高，活霉菌总数下降，说明温度影响微生物的生长繁殖；从中期到后期，盐度升高温度不变，活细菌总数下降，说明盐度影响微生物的生长繁殖，C正确；
D、平板划线法不能用来计数，统计活细菌总数要用稀释涂布平板法，D错误。
故答案为：D。（2）A、分析新工艺的参数和结果，从前期到中期，盐度不变，温度升高，活霉菌总数下降，说明中期活霉菌总数下降是由温度升高导致，A正确；
B、新工艺从中期到后期，盐度升高，温度不变，活细菌总数下降，说明活细菌总数下降是由盐度升高导致的，B错误；
C、新工艺从前期到中期，盐度不变，温度升高，因此，中期氨基酸产生速率较前期末加快是由于温度升高提高了蛋白酶的活性，C正确；
D、比较两种工艺的结果，新工艺前、中期活微生物总数和氨基酸终产量都比传统工艺高，因此，新工艺中甜瓣子风味有所提升，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、新工艺前期至中期，盐度不变，温度升高，中期至后期，温度保持不变，盐度增加；传统工艺中盐度和温度一直不变。分析两种工艺的结果，新工艺在前期和中期，活霉菌总数和活细菌总数均高于传统工艺，且最终的氨基酸态氮含量高于传统工艺。
8．【答案】A,B
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；灭菌技术
【解析】【解答】A、先将培养皿灭菌后，再分装培养基到培养皿中，A错误；
B、题干中已告知是固体培养基，涂布用的菌应该是一般选取菌落数在 30~300 之间的平板进行计数，而不是浓度，B错误；
C、诱变时间也是诱变处理的关键因素，C正确；
D、培养基长出的较大的菌落，经过纯化得到目的菌株进行石油的降解效率的分析，D正确；
故答案为：AB
【分析】（1）制作培养基时首先需要对培养皿进行灭菌处理（灭菌就是指用激烈的手段杀死全部微生物，包括芽孢和孢子）。
（2）培养基上得到的微生物，需要经过纯化 ，微生物的纯化培养技术有：平板划线法和稀释涂布平板法， 这两种方法都使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落 ，以便纯化菌种。
9．【答案】（1）无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合
（2）农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；植物体细胞杂交的过程及应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）Ⅰ.枯草杆菌分泌淀粉酶的最适温度为50-75℃，为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用无菌水制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，来杀死不耐热的微生物。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种筛选程与菌种的产酶性能测定一起进行：利用淀粉遇碘液变蓝的原理，用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，并且在培养基中添加KI-12，枯草杆菌合成的淀粉酶能利用淀粉，由于淀粉被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过诱变育种、基因工程育种或者细胞工程的方法进行菌种选育。
故答案为：无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合。
（2）Ⅳ.基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入到受体细胞中，植物组织培养时通常使用抗生素，抗生素可以抑制其他杂菌的生长，并且农杆菌Ti质粒上含有抗生素的抗性基因，可以对受体细胞进行筛选。但是农杆菌使用过程中需要注意当培养基中抗生素浓度过低时，没有抗性的细胞也可能存活下来，而出现假阳性，所以在进行转化之前要对抗生素的敏感性检测。
Ⅴ.转基因植物需要经过组织培养之后形成植株，组织培养过程需要经过脱分化和再分化过程，所以受体细胞需要具有较强的再生能力和和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
Ⅵ.基因工程中受体细胞的全能性越高，越易成功。植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和培养时间长短等有关。全能性越高，越易成功，在植物细胞中受精卵的全能性最高。
故答案为：农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
3、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
4、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌一导入植物细胞一目的基因整合到植物细胞染色体上一目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
10．【答案】（1）高压蒸汽灭菌；平板划线；纤维素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
（3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
（4）耐低温
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；生态系统的物质循环；灭菌技术
【解析】【解答】（1）制备培养基时，培养基的灭菌用高压蒸汽灭菌法，灭菌之后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，微生物的纯培养，除了稀释涂布平板法，还可以采用平板划线法。由图可知，新的微生物菌株在以纤维素作为碳源的培养基上相同时间的细胞数目最多，即生长状况最好。
故答案为：高压蒸汽灭菌；平板划线；纤维素。
（2）由题意可知，在海洋沉淀物中有很多微生物在各种培养基中都不能被分离筛选出来，可能是因为这些生物只有在深海冷泉的环境中才能生存，这些微生物的生存离不开深海冷泉中的特有物质。
故答案为：某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）。
（3）藻类细胞解体后的难溶解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系绘组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
故答案为：拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
（4）深海冷泉的环境中，微生物体内的降解酶除了具有酶的一般共性外，由于深海冷泉温度较低，长期存在于低温环境这些酶还会存在耐低温的特性。
故答案为：耐低温。
【分析】1、实验室常用的消毒和灭菌方法的比较：
（1）消毒：煮沸消毒法（一般物品）、巴氏消毒法（一些不耐高温的液体，如牛奶）、化学药剂消毒法（如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等）、紫外线消毒法（接种室、操作台）；
（2）灭菌：灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
4、生态系统碳循环：（1）碳在无机环境中的存在形式主要是碳酸盐和二氧化碳；（2）碳在生物群落中的存在形式主要是含碳有机物；（3）碳在生物群落和无机环境之间主要以二氧化碳的形式循环；（4）碳在生物群落内部是以含碳有机物的形式流动；（5）碳循环过程为：无机环境中碳进出生物群落的途径是光合作用、化能合成作用，而生物群落中的碳进入无机环境的途径有呼吸作用。微生物的分解作用、燃烧作用。
11．【答案】（1）无菌水；活化；离心；破碎；其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小；70%乙醇溶液；灭菌；资源化
（2）逆转录；核酸探针；抗原；载体；使腺病毒失去复制能力；脾；动物血清
【知识点】微生物的分离和培养；动物细胞培养技术；单克隆抗体的制备过程；灭菌技术；免疫学的应用
【解析】【解答】（1）Ⅰ.红曲色素的提取时，取红曲霉菌种斜面，加适量的无菌水清洗菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化的菌种。收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得上清液即为红曲色素提取液。为了进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎。
Ⅱ.红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、20nm和505nm波长处均有较大吸收峰，用光电比色法测定红曲色素提取中的红色素含量时，由于其它色素对该波长光的吸收相对较少，所以为了减少干扰，通常选用505nm波长测定，测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。
Ⅲ.生产上提取红曲色素后的残渣，经过灭菌处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。
故答案为：无菌水；活化；离心；破碎；其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小；70%乙醇溶液；灭菌；资源化。
（2）Ⅰ.新冠病毒需要在宿主细胞中进行增殖，所需要的原料和能量来自于人体（宿主）细胞；该病毒的基因组是指病毒体内以核苷酸序列形式存储的遗传信息。以新型冠状病毒的RNA分子为模板，经逆（反）转录过程形成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针进行检测。
Ⅱ.疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
Ⅲ.单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。
故答案为：逆转录；核酸探针；抗原；载体；使腺病毒失去复制能力；脾；动物血清。
【分析】1、实验室常用的消毒和灭菌方法的比较：
（1）消毒：煮沸消毒法（一般物品）、巴氏消毒法（一些不耐高温的液体，如牛奶）、化学药剂消毒法（如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等）、紫外线消毒法（接种室、操作台）；
（2）灭菌：灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、绿叶中色素的提取和分离实验，提取色素时需要加入无水乙醇（溶解色素)、石英砂（使研磨更充分）和碳酸钙（防止色素被破坏）﹔分离色素时采用纸层析法，原理是色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，最后的结果是观察到四条色素带，从上到下依次是胡萝卜素（橙黄色、最窄）、叶黄素(黄色）)、叶绿素a(蓝绿色、最宽)、叶绿素b（黄绿色)。绿叶中的色素包括叶绿素a和叶绿素b，类胡萝卜素和叶黄素，其中叶绿素a能够吸收传递光能之外还能转化光能，叶绿素a主要吸收红光和蓝紫光。
4、核酸检测的原理：新冠病毒需要在宿主细胞中进行增殖，所需要的原料和能量来自于人体（宿主）细胞；该病毒的基因组是指病毒体内以核苷酸序列形式存储的遗传信息。以新型冠状病毒的RNA分子为模板，经逆（反）转录过程形成DNA；用核酸检测试剂盒检测灵敏度较高的原因是逆转录过程遵循碱基互补配对的原则，具有很强的专一性。
5、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。
6、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
7、动物细胞培养条件：①无菌、无毒的环境：a、消毒、灭菌；b、添加一定量的抗生素；c、定期更换培养液，以清除代谢废物。②营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。③温度和pH。④气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。注意事项：①动物细胞连续培养50代左右，会出现大量细胞死亡而只有少量细胞生存的现象，这少数细胞的遗传物质发生变化，往往具有癌变的特点。②动物细胞培养基液体，植物细胞培养基固体，培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官。③动物组织处理使细胞分散后的初次培养称为原代培养， 一般传至10代左右便会出现生长停滞 。
12．【答案】（1）冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法
（2）富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞
【知识点】微生物发酵及其应用；果酒果醋的制作；基因工程的应用；动物体细胞克隆；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】 (1)①培养基需经高压蒸汽灭菌及冷却后使用；涂布菌种可采用玻璃刮刀；菌种产生的透明圈大，说明其可产生高效分解甘蔗的酶从而产生大量的醋酸，同CaCO3反应形成透明圈；临时保持菌种需再固体斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存。
②醋酸菌可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，所以当乙醇含量最低时，发酵结束。随着发酵的进行菌种生活的环境会变为乙醇高、酸度高的环境，所以优良产酸菌种还需具有耐酒精度高、耐酸高的特点。
③发酵过程的关键是防止杂菌污染，所以需要对固定介质进行灭菌，甘蔗渣具有较强的吸附性，可才有吸附法进行固定。
故答案为：冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法。
（2）①人类产生的污水中含有大量的无机盐，直接排入河流、湖泊会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华。
②转基因技术的关键是构建基因表达载体，即用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成重组DNA分子，质粒应具有一个或多个限制性核酸内切酶的识别位点、标记基因如抗生素抗性基因等、具有复制原点等特点；将目的基因导入动物细胞，常采用显微注射法。
③分散细胞，可以使用胰蛋白酶处理，破坏细胞之间的连接蛋白，并对分散的细胞进行原代培养以扩大细胞数目；培养瓶中添加成纤维细胞作为饲养层细胞，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
故答案为：富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞。
【分析】（1）微生物发酵过程：
①选育菌种：可采用自然界选种、诱变育种、基因工程育种等。
②配制培养基：根据微生物的营养需要提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
③灭菌：培养基和发酵设备均需严格灭菌。利用单一菌种发酵。
④扩大培养和接种：大规模生产中需要使菌种达到一定数量；将菌种接种到培养基上，接种时防止杂菌污染。
⑤发酵罐内发酵：要随时检测发酵进程，要及时满足营养需要，还要严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件。
⑥分离、提纯产物：如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法；如果产品是代谢产物，可采用提取、分离和纯化措施来获得产品。
（2）醋酸菌为异养好养型细菌，在氧气充足的情况下，可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
（3）动物细胞培养需要将细胞分散成单个细胞，故需要添加胰蛋白酶或胶原蛋白酶，进行原代培养（1-20代）。
（4）将目的基因导入受体细胞的常用方法：
生物
种类 植物 动物 微生物
常用
方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
主要
受体
细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化
过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
（5）动物细胞培养时注意的几个问题：
①进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。分散细胞时不能用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.8。胰蛋白酶作用的适宜pH为7.2-7.8，而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4。
②原代培养与传代培养的区别
a.原代培养：细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养。
b.传代培养：原代培养的细胞生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致接触抑制，影响细胞的生长，因此需要重新用胰蛋白酶等处理，进行分瓶扩大培养，即传代培养。
（6）饲养层细胞一般是胚胎成纤维细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。
13．【答案】（1）唯一碳源；血细胞计数板计数；诱变育种、基因工程育种
（2）盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
（3）氧气（O2或溶解氧）
（4）蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】（1）由题意可得，为了提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢对碳的需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源 。并不断提高其浓度，经多次传代培养以获得目标菌株。 嗜盐单胞菌H 是一种单细胞生物，所以培养过程中定期取样并用血细胞计数板计数的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。 此外，可以根据基因突变原理产生新的基因，基因重组产生新的基因型，所以选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。
（2）基于菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60d以上，而盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因外界渗透压过高因而失水过多而死亡；pH为10的条件下，强碱环境，其他杂菌的酶变性失活，生物体内多数新陈代谢为酶促反应，其他细菌生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。
（3）分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件下适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和pHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，乙醇是无氧呼吸的产物，说明发酵条件中氧气缺乏，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气（O2或溶解氧）是限制高密度培养的重要因素。
（4）因为酶的专一性可知，一种酶催化分解或者合成一种物质或者一类物质；菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产pHA，说明其能分泌相应的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
【分析】1、（1）微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。
（2）原理：不同微生物的代谢途径不同，生产的代谢产物也不同。例如：谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精；黄色短杆菌发酵生产赖氨酸。
（3）发酵过程：
①选育菌种：可采用自然界选种、诱变育种、基因工程育种等。
②配制培养基：根据微生物的营养需要提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
③灭菌：培养基和发酵设备均需严格灭菌。利用单一菌种发酵。
④扩大培养和接种：大规模生产中需要使菌种达到一定数量；将菌种接种到培养基上，接种时防止杂菌污染。
⑤发酵罐内发酵：要随时检测发酵进程，要及时满足营养需要，还要严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件。
⑥分离、提纯产物：如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法；如果产品是代谢产物，可采用提取、分离和纯化措施来获得产品。
（4）发酵工程的应用
①生产日常食品：如馒头、面包、腐乳、泡菜、葡萄酒等。
②生产食品添加剂：味精、醋、酱油等。
2、选育菌种：根据微生物遗传变异的特点，人们在生产实践中已经试验出一套行之有效的微生物育种方法。主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。
3、微生物两种计数方法的比较：
项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
14．【答案】（1）蛋白质；碳源
（2）蛋白酶；脂肪酶；氨基酸；异养好氧
（3）原核生物；二氧化碳和酒精；乳酸 (酒精、食盐)
【知识点】无氧呼吸的过程和意义；微生物发酵及其应用；果酒果醋的制作
【解析】【解答】(1)大豆中富含蛋白质可为发酵提供氮源，小麦中的淀粉可为发酵提供碳源。
(2)蛋白酶能将蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，脂肪酶能将脂肪分解为甘油和脂肪酸。米曲霉发酵需要提供营养物质并通入空气，说明米曲霉属于异养好氧微生物。
(3)乳酸菌是原核生物；酵母菌进行无氧呼吸的产物是二氧化碳和酒精。在发酵池发酵阶段存在乳酸菌和酵母菌，它们产生的乳酸和酒精均可以抑制其它微生物的生长，加入的食盐也可抑制微生物生长。
【分析】 1、大豆富含蛋白质（组成元素C、H、O、N等），得知大豆中的哪种成分提供氮源。淀粉可以作为发酵底物，作为碳源。
2、结合酶具有专一性，例如蛋白酶将促进蛋白质水解，进行答题。
3、米曲霉发酵过程需要提供营养物质（说明米曲霉是异养型生物）、通入空气（目的之一提供氧气）并搅拌，由此可以判断米曲霉属于哪种新陈代谢类型。
4、结合题意进行答题：
① 乳酸菌全名是“乳酸杆菌”，带“杆菌”的一般都是原核生物。
②CHO→2CO2+2CH3CH2OH。
③细菌生存易受到环境的影响，酸、碱、重金属、高渗透压或者地渗透压等因素都会影响细菌的生存。
15．【答案】（1）澄清度；95%乙醇；较小；抽滤；细菌悬液；灭菌；较小；粘性
（2）抗性基因；全能性表达充分；显微注射；短；脱分化；生长素；根的分生组织；B
【知识点】微生物的分离和培养；果胶酶的活性测定；组织培养基的成分及作用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）Ⅰ.由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。Ⅱ.为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。（2）Ⅰ.设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。Ⅱ.转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。Ⅲ.利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故答案为：B。
【分析】（1）果胶酶：果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等。
①分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层；提高水果的出汁率
②使果胶水解为半乳糖醛酸，并使果汁变得澄清。
（2）发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
（3）生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
16．【答案】（1）高压蒸汽灭菌、干热灭菌
（2）葡萄糖；制糖废液；氮源、无机盐、水
（3）缺少淀粉酶
（4）分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度
（5）减少污染、节省原料、降低生产成本
【知识点】培养基对微生物的选择作用；灭菌技术
【解析】【解答】（1）实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。适合对玻璃器皿进行灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
故答案为： 干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
（2）由表可知，在葡萄糖为碳源的培养基中培养时，菌株C的细胞干重最大，在制糖废液作为碳源的培养基中培养时，菌株C的S产量最高，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖，用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液，培养基 为微生物提供的营养物质除了碳源，还有氨源、无机盐和水。
故答案为：葡萄糖；制糖废液；氮源、无机盐、水。
（3）由表可知，菌株C在淀粉为碳源的培养基中不能生长也不能产生化合物S，菌株C不能利用淀粉作为碳源，不能分解淀粉，菌株C可能缺少分解淀粉所需的酶，即淀粉酶。
故答案为：缺少淀粉酶。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，则配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，且实验应遵循单一变量原则和等量原则，各实验组之间除培养基中制糖废液的浓度不同，其他的无关变量相同且适宜，培养一段时间后检测不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度。
故答案为：分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度。
（5）以制糖废液作为碳源培养菌株C，生产化合物S，可以实现制糖废液的重复利用，减少废物排放，减少了污染，并且废物循环利用减低成本、节省原料，同时提高了产量。
故答案为：减少污染、节省原料、降低生产成本。
【分析】1、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
2、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
3、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
17．【答案】（1）石油；DNA、RNA、蛋白质
（2）N0 2n
（3）在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
（4）A；A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】（1）由题意可知，实验是从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，培养基中的石油作为唯一的碳源。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成DNA、RNA和蛋白质等含氮生物大分子。
故答案为：石油；DNA、RNA、蛋白质。
（2）在食物充足，无限空间，无天敌的理想条件下种群数量呈“J”型曲线增长，Nt=N0λt，即若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是N0 2n。
故答案为： N0 2n。
（3）由表可知，A菌株在平板Ⅰ和Ⅱ上都有降解石油的能力，且在平板Ⅰ上降解石油的能力高于B菌株；而B菌株在平板Ⅱ上不能降解石油，该步实验的目的是在分离得到A和B两株可以降解石油的细菌的基础上，采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。生物实验的单一变量和对照原则，本实验的自变量为A、B两种不同菌落及不同培养基，因变量为两种菌落在不同培养基上的生长情况（透明圈大小、多少），则该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板I的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
故答案为：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
（4）由题意和表可知，A菌株分解石油的能力大于B菌株，且在平板Ⅱ上也可以生长，平板Ⅱ中不含碳源，即A菌落不仅分解石油能力强，并且在不含碳元素的培养基中也可以生长，所以若要治理贫瘠且被石油污染的土壤，应选择菌株A。
故答案为：A；A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、化合物的元素组成：（1）蛋白质的组成元素有C、H、O、N元素构成，有些还含有S；（2）核酸的组成元素为C、H、O、N、P；（3）脂质的组成元素有C、H、O，磷脂还含有N、P；（4）糖类的组成元素为C、H、O。
3、种群数量增长的两种曲线：“J”型曲线：指数增长函数，描述在食物充足，无限空间，无天敌的理想条件下生物无限增长的情况，Nt=N0λt。“S“型曲线：是受限制的指数增长函数，描述食物、空间都有限，有天敌捕食的真实生物数量增长情况，存在环境容纳的最大值K。
4、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
18．【答案】（1）C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；纤维素；选择
（2）为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）；不接种培养（或空白培养 ）
（3）将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测 大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数
（4）C；接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
【知识点】纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；该培养基通过加入特殊的营养物质纤维素，使纤维素分解菌可以生存，其他微生物不能生存，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。
（2）配制培养基的常用高压蒸汽灭菌，目的是为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。为检测灭菌效果可将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
（3）测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，常采用稀释涂布平板法，即将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。
（4）测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
故答案为：（1） C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 ； 纤维素；选择 （2） 为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子） ； 不接种培养（或空白培养 ） （3） 将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测 大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数 （4） C ； 接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
【分析】1.纤维素酶：纤维素分解菌可产生纤维素酶，纤维素酶是复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。C1酶、Cx酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。
2.微生物培养计数方法：
（1）直接计数法：显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板计数，不能区分细菌的死活。
（2）间接计数法：稀释涂布平板法。
3.培养基的制作是否符合：将未接种的培养基在恒温箱中保温1~2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。
4.纤维素分解菌的分离流程：取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。透明圈越大说明纤维素酶的活力越高。
19．【答案】（1）利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触；性质和使用量；分解；纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率
（2）8.8×106
（3）中性或偏碱；使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈；碳源
（4）实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小 。
预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；芳香油的提取；胡萝卜素的提取
【解析】【解答】（1）萃取前将原料干燥去除水分，有利于萃取剂（有机溶剂）溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料与萃取剂充分接触；萃取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷分解。萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理，可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。
故答案为：利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触；性质和使用量；分解；纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。
（2）104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则三个平板中平均菌落数为（78+91+95）÷3=88，每克皮渣中微生物数量为88÷0.1×104=8.8×106个。
故答案为： 8.8×106 。
（3）醋酸菌属于细菌，培养细菌时，需要将培养基的pH调至中性或弱碱性；加入碳酸钙可使培养基不透明，醋酸菌产生的醋酸可分解碳酸钙，产生透明圈，根据这一特点可筛选出醋酸菌；在缺少糖源的液体培养基中醋酸菌以乙醇为碳源，先把乙醇氧化为乙醛，再把乙醛氧化为乙酸。
故答案为：中性或偏碱；使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈；碳源。
（4）醋酸菌为好氧菌，乳酸菌为与兼性厌氧型，若要区别两者，可将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小。若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
故答案为： 实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小 预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
【分析】 （1）萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、草取的温度和时间等条件的影响。一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。
（2）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
①统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30-300的平板进行计数。
②每克样品中的菌株数=(C÷V)×M
C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M：稀释倍数
注意：①统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
②一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数
③为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC3.本法仅限于形成菌落的微生物。
（3）培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。
20．【答案】（1）涂布分离；单菌落；筛选；未固定的细菌；降解富营养化污水污染物的能力；包埋法和吸附法；特定介质能为菌株繁殖提供X
（2）遗传；间种；DNA聚合酶；愈伤组织；继代；杀灭发根农杆菌；转速；营养元素以及生长调节剂的种类和浓度
【知识点】微生物的分离和培养；基因工程的应用；固定化酶及其应用；固定化细胞及其应用；生物多样性的保护措施
【解析】【解答】（1）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。Ⅰ.分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。Ⅱ.固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。Ⅲ.由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。（2）Ⅰ.生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。Ⅱ.分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。Ⅲ.剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【分析】1、分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。2、固定化酶( insoluble enzyme)就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。3、植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。4、在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。
1 / 1高考生物五年真题汇编25——微生物的利用（1）
一、单选题
1．（2021·山东）含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（ ）
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】 A、由图可知，乙菌穿刺能力比甲强，A正确；
B、为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；
C、由实验可判断产生硫化氢的能力大小，不能测定产生硫化氢的量，C正确；
D、微生物培养的关键是无菌操作，接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的运动时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
2、由题意可知，黑色沉淀越多，产生硫化氢能力越强，穿刺能力越强。
3、液体、半固体、固体培养基的特点与用途：
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 大量繁殖
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基（最常用） 微生物分离、鉴定、活菌记数、保藏菌种
2．（2021·天津）下列操作能达到灭菌目的的是（ ）
A．用免洗酒精凝胶擦手 B．制作泡菜前用开水烫洗容器
C．在火焰上灼烧接种环 D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
【答案】C
【知识点】灭菌技术
【解析】【解答】 A、免洗酒精凝胶擦手是化学药剂消毒法属于消毒，A错误；
B、开水烫洗容器是煮沸消毒法，B错误；
C、在火焰上灼烧接种环属于灼烧灭菌，C正确；
D、防疫期间用石炭酸喷洒教室属于化学药剂消毒法，D错误。
故答案为：C。
【分析】消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
3．（2021·北京）社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是（ ）
A．长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B．转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C．消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒
D．如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的
【答案】A
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；基因工程的应用；灭菌技术
【解析】【解答】A、高温加热破坏会维生素，造成维生素的流失和分解，A正确；
B、转基因抗虫棉产生的毒蛋白只针对棉虫，对人无毒，B错误；
C、消毒液杀死的是体表的细菌和病毒，不能清除进入人体的病毒，C错误；
D、血型遗传受基因控制，A型血和B型血的父母可能生出O型血的孩子，故血型不同也可能是亲生的，D错误。
故答案为：A
【分析】1、烹饪饮食的方法不当蔬菜、水果等食物是人体摄入维生素C的主要来源。研究发现，人们若采取以下烹饪方法，就会导致饮食中所含的维生素C大量流失：①将蔬菜先切后洗。②将蔬菜切得很碎。③用铁制的刀具切蔬菜。铁会促使蔬菜中所含的维生素C更快地发生氧化。因此，人们应尽量少用刀切菜，而应养成用手撕菜的习惯。④炖煮蔬菜的时间过长。⑤长时间地存放水果和蔬菜。维生素C易被空气中的氧气氧化，因此蔬菜、水果被存放的时间越长，其中所含的维生素C就流失得越多。
2、转基因抗虫棉产生的毒蛋白会使棉虫致死，而不对人体产生毒性，是由于人体细胞没有毒蛋白的特异性受体，并且人误食了该毒蛋白质之后经过消化系统蛋白质已经变性甚至降解，没了毒性。
3、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
4、血型分为四种，即A，B，AB，O。血型是指红细胞上所含的抗原不同而言，红细胞上只含A抗原的称A型，含有B抗原的称B型，既有A抗原又有B抗原的称为AB型，既没有A抗原也没有B抗原的称为0型。ABO血型受ABO三种基因控制，A基因控制A抗原产生，B基因控制B抗原产生，O基因控制不产生A和B两种抗原，而基因都是成对存在，控制ABO血型的基因可有六种不同组合，即AA，AO，BB，BO，AB，OO，而每个人只有其中一对。
4．（2021·北京）人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是（ ）
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；灭菌技术
【解析】【解答】A、培养基及容器一般利用高压蒸汽灭菌，A正确；
B、为了减少杂菌污染，应使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；
C、取样后需先在液体培养基中扩大培养，再涂布到固体培养基上选择培养，C错误；
D、不同的微生物的菌落形态和颜色不同，可根据这些特征进行初步判断，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、 实验室常用的消毒和灭菌方法的比较：
（1）消毒：煮沸消毒法（一般物品）、巴氏消毒法（一些不耐高温的液体，如牛奶）、化学药剂消毒法（如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等）、紫外线消毒法（接种室、操作台）；
（2）灭菌：灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。
5．（2021·浙江）下列关于原生质体和细胞计数的叙述，错误的是（ ）
A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板
B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数
C．涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数
D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度
【答案】C
【知识点】测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A.血细胞计数板适用于较大的细胞或颗粒的计数，实验中需先将原生质体制成悬浊液再进行计数，A说法正确；
B.红墨水的成分细胞不需要，因此不能进入活细胞，活细胞不会被染红，而死细胞的膜失去了选择透过性，会被染红，由此可用于检测细胞的存活状态并计数，B说法正确；
C. 涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，但只有涂布分离法可用于细胞计数，C说法错误；
D. 随着酵母菌数目的增加，酵母菌培养液的浑浊度会上升，所以可以用比浊计测定其密度，D说法正确。
故答案为：C。
【分析】 血细胞计数板计数法，是常用的一种计数血细胞数量的计数方法，经常应用于白细胞、红细胞等血细胞的计数。 除了计数血细胞以外，还可用于酵母菌、细菌等病原微生物的技术，血细胞计数板是通过显微镜下，把计数板分成了很多网格状的结构，然后进行适当的稀释血液进行计数，最终计算出各种血细胞的数量。
6．（2020·浙江选考）下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是（ ）
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
【答案】A
【知识点】微生物的分离和培养；果酒果醋的制作
【解析】【解答】A、利用尿素固体培养基，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非杀死，A错误；
B、不同的微生物所需的pH不同，所以配置培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；
C、酵母菌不能直接利用淀粉，应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C正确；
D、醋化醋杆菌在有氧条件下利用酒精产生醋酸，D正确。
故答案为：A。
【分析】培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能选择分解尿素的微生物。
7．（2020·天津）阅读下列材料，回答下列小题。
甜瓣子是豆瓣酱的重要成分，风味受蚕豆蛋白分解产生的氨基酸影响，也受发酵过程中不同微生物的多种代谢产物影响。其生产工艺如下图所示。
某研究团队对加盐水后的发酵阶段的传统工艺（盐度15%，温度37 ℃，发酵30天）进行了改良，改良后甜瓣子风味得以提升。新工艺参数如下表所示。
时期 时段（天） 盐度（%） 温度（℃）
前期 0~12 6 12
中期 12~16 6 37
后期 16~30 15 37
两种工艺的结果比较见下图。
（1）下列关于本研究的实验方法与原理的描述，错误的是（ ）
A．发酵开始阶段的微生物主要来源于制曲过程的积累
B．蚕豆瓣可提供微生物生长繁殖所需的碳源和氮源
C．温度与盐度都影响微生物的生长繁殖
D．定期取样，使用平板划线法统计活细菌总数
（2）下列对实验结果的分析，错误的是（ ）
A．新工艺中期活霉菌总数下降由温度升高导致
B．新工艺后期活细菌总数下降由温度、盐度均升高导致
C．新工艺中期氨基酸产生速率较前期末加快，是因为温度升高提高了蛋白酶活性
D．新工艺中甜瓣子风味提升，与前、中期活微生物总数高和氨基酸终产量高均有关
【答案】（1）D
（2）B
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用
【解析】【解答】（1）A、制曲过程中会有微生物的积累，是发酵开始阶段微生物的主要来源，A正确；
B、蚕豆瓣中有很多有机物，可以提供微生物生长繁殖所需的碳源和氮源，B正确；
C、观察新工艺各个时期的活霉菌总数和活细菌总数的变化，从前期到中期，盐度不变温度升高，活霉菌总数下降，说明温度影响微生物的生长繁殖；从中期到后期，盐度升高温度不变，活细菌总数下降，说明盐度影响微生物的生长繁殖，C正确；
D、平板划线法不能用来计数，统计活细菌总数要用稀释涂布平板法，D错误。
故答案为：D。（2）A、分析新工艺的参数和结果，从前期到中期，盐度不变，温度升高，活霉菌总数下降，说明中期活霉菌总数下降是由温度升高导致，A正确；
B、新工艺从中期到后期，盐度升高，温度不变，活细菌总数下降，说明活细菌总数下降是由盐度升高导致的，B错误；
C、新工艺从前期到中期，盐度不变，温度升高，因此，中期氨基酸产生速率较前期末加快是由于温度升高提高了蛋白酶的活性，C正确；
D、比较两种工艺的结果，新工艺前、中期活微生物总数和氨基酸终产量都比传统工艺高，因此，新工艺中甜瓣子风味有所提升，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、新工艺前期至中期，盐度不变，温度升高，中期至后期，温度保持不变，盐度增加；传统工艺中盐度和温度一直不变。分析两种工艺的结果，新工艺在前期和中期，活霉菌总数和活细菌总数均高于传统工艺，且最终的氨基酸态氮含量高于传统工艺。
二、多选题
8．（2021·江苏）为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是（ ）
A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B．涂布用的菌浓度应控制在30~300个/mL
C．需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D．挑取培养基上长出的较大单菌落，给纯化后进行降解效率分析
【答案】A,B
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；灭菌技术
【解析】【解答】A、先将培养皿灭菌后，再分装培养基到培养皿中，A错误；
B、题干中已告知是固体培养基，涂布用的菌应该是一般选取菌落数在 30~300 之间的平板进行计数，而不是浓度，B错误；
C、诱变时间也是诱变处理的关键因素，C正确；
D、培养基长出的较大的菌落，经过纯化得到目的菌株进行石油的降解效率的分析，D正确；
故答案为：AB
【分析】（1）制作培养基时首先需要对培养皿进行灭菌处理（灭菌就是指用激烈的手段杀死全部微生物，包括芽孢和孢子）。
（2）培养基上得到的微生物，需要经过纯化 ，微生物的纯化培养技术有：平板划线法和稀释涂布平板法， 这两种方法都使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落 ，以便纯化菌种。
三、综合题
9．（2022·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
Ⅰ.为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（2）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
Ⅳ.在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
Ⅴ.为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
Ⅵ.植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
【答案】（1）无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合
（2）农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；植物体细胞杂交的过程及应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）Ⅰ.枯草杆菌分泌淀粉酶的最适温度为50-75℃，为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用无菌水制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，来杀死不耐热的微生物。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种筛选程与菌种的产酶性能测定一起进行：利用淀粉遇碘液变蓝的原理，用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，并且在培养基中添加KI-12，枯草杆菌合成的淀粉酶能利用淀粉，由于淀粉被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过诱变育种、基因工程育种或者细胞工程的方法进行菌种选育。
故答案为：无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合。
（2）Ⅳ.基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入到受体细胞中，植物组织培养时通常使用抗生素，抗生素可以抑制其他杂菌的生长，并且农杆菌Ti质粒上含有抗生素的抗性基因，可以对受体细胞进行筛选。但是农杆菌使用过程中需要注意当培养基中抗生素浓度过低时，没有抗性的细胞也可能存活下来，而出现假阳性，所以在进行转化之前要对抗生素的敏感性检测。
Ⅴ.转基因植物需要经过组织培养之后形成植株，组织培养过程需要经过脱分化和再分化过程，所以受体细胞需要具有较强的再生能力和和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
Ⅵ.基因工程中受体细胞的全能性越高，越易成功。植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和培养时间长短等有关。全能性越高，越易成功，在植物细胞中受精卵的全能性最高。
故答案为：农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
3、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
4、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌一导入植物细胞一目的基因整合到植物细胞染色体上一目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
10．（2022·广东）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对南中国海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用 法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用 法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难度解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系绘组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌物各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌；平板划线；纤维素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
（3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
（4）耐低温
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；生态系统的物质循环；灭菌技术
【解析】【解答】（1）制备培养基时，培养基的灭菌用高压蒸汽灭菌法，灭菌之后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，微生物的纯培养，除了稀释涂布平板法，还可以采用平板划线法。由图可知，新的微生物菌株在以纤维素作为碳源的培养基上相同时间的细胞数目最多，即生长状况最好。
故答案为：高压蒸汽灭菌；平板划线；纤维素。
（2）由题意可知，在海洋沉淀物中有很多微生物在各种培养基中都不能被分离筛选出来，可能是因为这些生物只有在深海冷泉的环境中才能生存，这些微生物的生存离不开深海冷泉中的特有物质。
故答案为：某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）。
（3）藻类细胞解体后的难溶解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系绘组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
故答案为：拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
（4）深海冷泉的环境中，微生物体内的降解酶除了具有酶的一般共性外，由于深海冷泉温度较低，长期存在于低温环境这些酶还会存在耐低温的特性。
故答案为：耐低温。
【分析】1、实验室常用的消毒和灭菌方法的比较：
（1）消毒：煮沸消毒法（一般物品）、巴氏消毒法（一些不耐高温的液体，如牛奶）、化学药剂消毒法（如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等）、紫外线消毒法（接种室、操作台）；
（2）灭菌：灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
4、生态系统碳循环：（1）碳在无机环境中的存在形式主要是碳酸盐和二氧化碳；（2）碳在生物群落中的存在形式主要是含碳有机物；（3）碳在生物群落和无机环境之间主要以二氧化碳的形式循环；（4）碳在生物群落内部是以含碳有机物的形式流动；（5）碳循环过程为：无机环境中碳进出生物群落的途径是光合作用、化能合成作用，而生物群落中的碳进入无机环境的途径有呼吸作用。微生物的分解作用、燃烧作用。
11．（2022·浙江选考）回答下列(1)、(2)小题：
（1）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：
Ⅰ.取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔。制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为了进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。
Ⅱ.红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、20nm和505nm波长处均有较大吸收峰，用光电比色法测定红曲色素提取中的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。
Ⅲ.生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和
处理。
（2）我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩，但全球疫情形势仍然非常严峻，尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
Ⅰ.新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
Ⅱ.接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。
Ⅲ.单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。
【答案】（1）无菌水；活化；离心；破碎；其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小；70%乙醇溶液；灭菌；资源化
（2）逆转录；核酸探针；抗原；载体；使腺病毒失去复制能力；脾；动物血清
【知识点】微生物的分离和培养；动物细胞培养技术；单克隆抗体的制备过程；灭菌技术；免疫学的应用
【解析】【解答】（1）Ⅰ.红曲色素的提取时，取红曲霉菌种斜面，加适量的无菌水清洗菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化的菌种。收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得上清液即为红曲色素提取液。为了进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎。
Ⅱ.红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、20nm和505nm波长处均有较大吸收峰，用光电比色法测定红曲色素提取中的红色素含量时，由于其它色素对该波长光的吸收相对较少，所以为了减少干扰，通常选用505nm波长测定，测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。
Ⅲ.生产上提取红曲色素后的残渣，经过灭菌处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。
故答案为：无菌水；活化；离心；破碎；其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小；70%乙醇溶液；灭菌；资源化。
（2）Ⅰ.新冠病毒需要在宿主细胞中进行增殖，所需要的原料和能量来自于人体（宿主）细胞；该病毒的基因组是指病毒体内以核苷酸序列形式存储的遗传信息。以新型冠状病毒的RNA分子为模板，经逆（反）转录过程形成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针进行检测。
Ⅱ.疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
Ⅲ.单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。
故答案为：逆转录；核酸探针；抗原；载体；使腺病毒失去复制能力；脾；动物血清。
【分析】1、实验室常用的消毒和灭菌方法的比较：
（1）消毒：煮沸消毒法（一般物品）、巴氏消毒法（一些不耐高温的液体，如牛奶）、化学药剂消毒法（如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等）、紫外线消毒法（接种室、操作台）；
（2）灭菌：灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、绿叶中色素的提取和分离实验，提取色素时需要加入无水乙醇（溶解色素)、石英砂（使研磨更充分）和碳酸钙（防止色素被破坏）﹔分离色素时采用纸层析法，原理是色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，最后的结果是观察到四条色素带，从上到下依次是胡萝卜素（橙黄色、最窄）、叶黄素(黄色）)、叶绿素a(蓝绿色、最宽)、叶绿素b（黄绿色)。绿叶中的色素包括叶绿素a和叶绿素b，类胡萝卜素和叶黄素，其中叶绿素a能够吸收传递光能之外还能转化光能，叶绿素a主要吸收红光和蓝紫光。
4、核酸检测的原理：新冠病毒需要在宿主细胞中进行增殖，所需要的原料和能量来自于人体（宿主）细胞；该病毒的基因组是指病毒体内以核苷酸序列形式存储的遗传信息。以新型冠状病毒的RNA分子为模板，经逆（反）转录过程形成DNA；用核酸检测试剂盒检测灵敏度较高的原因是逆转录过程遵循碱基互补配对的原则，具有很强的专一性。
5、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。
6、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
7、动物细胞培养条件：①无菌、无毒的环境：a、消毒、灭菌；b、添加一定量的抗生素；c、定期更换培养液，以清除代谢废物。②营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。③温度和pH。④气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。注意事项：①动物细胞连续培养50代左右，会出现大量细胞死亡而只有少量细胞生存的现象，这少数细胞的遗传物质发生变化，往往具有癌变的特点。②动物细胞培养基液体，植物细胞培养基固体，培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官。③动物组织处理使细胞分散后的初次培养称为原代培养， 一般传至10代左右便会出现生长停滞 。
12．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与甘蔗醋制作有关的问题：
①为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，震荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
②优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下震荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。
③制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。
（2）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
①由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
②为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
③为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
【答案】（1）冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法
（2）富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞
【知识点】微生物发酵及其应用；果酒果醋的制作；基因工程的应用；动物体细胞克隆；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】 (1)①培养基需经高压蒸汽灭菌及冷却后使用；涂布菌种可采用玻璃刮刀；菌种产生的透明圈大，说明其可产生高效分解甘蔗的酶从而产生大量的醋酸，同CaCO3反应形成透明圈；临时保持菌种需再固体斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存。
②醋酸菌可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，所以当乙醇含量最低时，发酵结束。随着发酵的进行菌种生活的环境会变为乙醇高、酸度高的环境，所以优良产酸菌种还需具有耐酒精度高、耐酸高的特点。
③发酵过程的关键是防止杂菌污染，所以需要对固定介质进行灭菌，甘蔗渣具有较强的吸附性，可才有吸附法进行固定。
故答案为：冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法。
（2）①人类产生的污水中含有大量的无机盐，直接排入河流、湖泊会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华。
②转基因技术的关键是构建基因表达载体，即用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成重组DNA分子，质粒应具有一个或多个限制性核酸内切酶的识别位点、标记基因如抗生素抗性基因等、具有复制原点等特点；将目的基因导入动物细胞，常采用显微注射法。
③分散细胞，可以使用胰蛋白酶处理，破坏细胞之间的连接蛋白，并对分散的细胞进行原代培养以扩大细胞数目；培养瓶中添加成纤维细胞作为饲养层细胞，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
故答案为：富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞。
【分析】（1）微生物发酵过程：
①选育菌种：可采用自然界选种、诱变育种、基因工程育种等。
②配制培养基：根据微生物的营养需要提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
③灭菌：培养基和发酵设备均需严格灭菌。利用单一菌种发酵。
④扩大培养和接种：大规模生产中需要使菌种达到一定数量；将菌种接种到培养基上，接种时防止杂菌污染。
⑤发酵罐内发酵：要随时检测发酵进程，要及时满足营养需要，还要严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件。
⑥分离、提纯产物：如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法；如果产品是代谢产物，可采用提取、分离和纯化措施来获得产品。
（2）醋酸菌为异养好养型细菌，在氧气充足的情况下，可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
（3）动物细胞培养需要将细胞分散成单个细胞，故需要添加胰蛋白酶或胶原蛋白酶，进行原代培养（1-20代）。
（4）将目的基因导入受体细胞的常用方法：
生物
种类 植物 动物 微生物
常用
方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
主要
受体
细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化
过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
（5）动物细胞培养时注意的几个问题：
①进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。分散细胞时不能用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.8。胰蛋白酶作用的适宜pH为7.2-7.8，而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4。
②原代培养与传代培养的区别
a.原代培养：细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养。
b.传代培养：原代培养的细胞生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致接触抑制，影响细胞的生长，因此需要重新用胰蛋白酶等处理，进行分瓶扩大培养，即传代培养。
（6）饲养层细胞一般是胚胎成纤维细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。
13．（2021·广东）[选修1：生物技术实践]
中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产pHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有 等。（答出两种方法即可）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是 。（答出两点即可）
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和pHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产pHA，说明其能分泌 。
【答案】（1）唯一碳源；血细胞计数板计数；诱变育种、基因工程育种
（2）盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
（3）氧气（O2或溶解氧）
（4）蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】（1）由题意可得，为了提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢对碳的需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源 。并不断提高其浓度，经多次传代培养以获得目标菌株。 嗜盐单胞菌H 是一种单细胞生物，所以培养过程中定期取样并用血细胞计数板计数的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。 此外，可以根据基因突变原理产生新的基因，基因重组产生新的基因型，所以选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。
（2）基于菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60d以上，而盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因外界渗透压过高因而失水过多而死亡；pH为10的条件下，强碱环境，其他杂菌的酶变性失活，生物体内多数新陈代谢为酶促反应，其他细菌生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。
（3）分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件下适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和pHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，乙醇是无氧呼吸的产物，说明发酵条件中氧气缺乏，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气（O2或溶解氧）是限制高密度培养的重要因素。
（4）因为酶的专一性可知，一种酶催化分解或者合成一种物质或者一类物质；菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产pHA，说明其能分泌相应的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
【分析】1、（1）微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。
（2）原理：不同微生物的代谢途径不同，生产的代谢产物也不同。例如：谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精；黄色短杆菌发酵生产赖氨酸。
（3）发酵过程：
①选育菌种：可采用自然界选种、诱变育种、基因工程育种等。
②配制培养基：根据微生物的营养需要提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
③灭菌：培养基和发酵设备均需严格灭菌。利用单一菌种发酵。
④扩大培养和接种：大规模生产中需要使菌种达到一定数量；将菌种接种到培养基上，接种时防止杂菌污染。
⑤发酵罐内发酵：要随时检测发酵进程，要及时满足营养需要，还要严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件。
⑥分离、提纯产物：如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法；如果产品是代谢产物，可采用提取、分离和纯化措施来获得产品。
（4）发酵工程的应用
①生产日常食品：如馒头、面包、腐乳、泡菜、葡萄酒等。
②生产食品添加剂：味精、醋、酱油等。
2、选育菌种：根据微生物遗传变异的特点，人们在生产实践中已经试验出一套行之有效的微生物育种方法。主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。
3、微生物两种计数方法的比较：
项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
14．（2021·全国乙卷）[生物-选修：生物技术实践]
工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品的过程，利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。
回答下列问题：
（1）米曲霉发酵过程中，加入大豆、小麦和麦麸可以为米曲霉的生长提供营养物质，大豆中的 可为米曲霉的生长提供氮源，小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供 。
（2）米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖、大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的 、 能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和 。米曲发酵过程需要提供营养物质、通入空气并搅拌，由此可以判断米曲霉属于 (填“自养厌氧”*异养厌氧”或“异养好氧")微生物。
（3）在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于 (填“真核生物“或“原核生物”)；添加的酵母菌在无氧条件下分解葡萄糖的产物是 。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，据图分析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是 (答出1点即可)。
【答案】（1）蛋白质；碳源
（2）蛋白酶；脂肪酶；氨基酸；异养好氧
（3）原核生物；二氧化碳和酒精；乳酸 (酒精、食盐)
【知识点】无氧呼吸的过程和意义；微生物发酵及其应用；果酒果醋的制作
【解析】【解答】(1)大豆中富含蛋白质可为发酵提供氮源，小麦中的淀粉可为发酵提供碳源。
(2)蛋白酶能将蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，脂肪酶能将脂肪分解为甘油和脂肪酸。米曲霉发酵需要提供营养物质并通入空气，说明米曲霉属于异养好氧微生物。
(3)乳酸菌是原核生物；酵母菌进行无氧呼吸的产物是二氧化碳和酒精。在发酵池发酵阶段存在乳酸菌和酵母菌，它们产生的乳酸和酒精均可以抑制其它微生物的生长，加入的食盐也可抑制微生物生长。
【分析】 1、大豆富含蛋白质（组成元素C、H、O、N等），得知大豆中的哪种成分提供氮源。淀粉可以作为发酵底物，作为碳源。
2、结合酶具有专一性，例如蛋白酶将促进蛋白质水解，进行答题。
3、米曲霉发酵过程需要提供营养物质（说明米曲霉是异养型生物）、通入空气（目的之一提供氧气）并搅拌，由此可以判断米曲霉属于哪种新陈代谢类型。
4、结合题意进行答题：
① 乳酸菌全名是“乳酸杆菌”，带“杆菌”的一般都是原核生物。
②CHO→2CO2+2CH3CH2OH。
③细菌生存易受到环境的影响，酸、碱、重金属、高渗透压或者地渗透压等因素都会影响细菌的生存。
15．（2020·浙江选考）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：
Ⅰ.柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的 。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的 ，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值 的处理效果好。③对不同处理进行 ，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。
Ⅱ.加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成 ，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已 的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径 的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的 下降。
（2）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
Ⅰ.天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的 。
Ⅱ.结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、 及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用 的转基因方法。
Ⅲ.利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间 ，且不经历 过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
Ⅳ.与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加 ，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成 ，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如 （A.提高蔗糖浓度B.降低培养基浓度C.提高大量元素浓度D.不添加琼脂）。
【答案】（1）澄清度；95%乙醇；较小；抽滤；细菌悬液；灭菌；较小；粘性
（2）抗性基因；全能性表达充分；显微注射；短；脱分化；生长素；根的分生组织；B
【知识点】微生物的分离和培养；果胶酶的活性测定；组织培养基的成分及作用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）Ⅰ.由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。Ⅱ.为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。（2）Ⅰ.设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。Ⅱ.转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。Ⅲ.利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故答案为：B。
【分析】（1）果胶酶：果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等。
①分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层；提高水果的出汁率
②使果胶水解为半乳糖醛酸，并使果汁变得澄清。
（2）发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
（3）生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
四、实验探究题
16．（2022·全国乙卷）化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重（g/L） S产量（g/L）
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
（1）通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有 （答出2点即可）。
（2）由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是 ；用菌株C生产S的最适碳源是 。菌株C的生长除需要碳源外，还需要 （答出2点即可）等营养物质。
（3）由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是 。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路： 。
（5）利用制糖废液生产S可以实验废物利用，其意义是 （答出1点即可）。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌、干热灭菌
（2）葡萄糖；制糖废液；氮源、无机盐、水
（3）缺少淀粉酶
（4）分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度
（5）减少污染、节省原料、降低生产成本
【知识点】培养基对微生物的选择作用；灭菌技术
【解析】【解答】（1）实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌（接种工具）、干热灭菌（玻璃器皿、金属用具）、高压蒸汽灭菌（培养基及容器）。适合对玻璃器皿进行灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
故答案为： 干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
（2）由表可知，在葡萄糖为碳源的培养基中培养时，菌株C的细胞干重最大，在制糖废液作为碳源的培养基中培养时，菌株C的S产量最高，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖，用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液，培养基 为微生物提供的营养物质除了碳源，还有氨源、无机盐和水。
故答案为：葡萄糖；制糖废液；氮源、无机盐、水。
（3）由表可知，菌株C在淀粉为碳源的培养基中不能生长也不能产生化合物S，菌株C不能利用淀粉作为碳源，不能分解淀粉，菌株C可能缺少分解淀粉所需的酶，即淀粉酶。
故答案为：缺少淀粉酶。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，则配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，且实验应遵循单一变量原则和等量原则，各实验组之间除培养基中制糖废液的浓度不同，其他的无关变量相同且适宜，培养一段时间后检测不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度。
故答案为：分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度。
（5）以制糖废液作为碳源培养菌株C，生产化合物S，可以实现制糖废液的重复利用，减少废物排放，减少了污染，并且废物循环利用减低成本、节省原料，同时提高了产量。
故答案为：减少污染、节省原料、降低生产成本。
【分析】1、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
2、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
3、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
17．（2022·全国甲卷）某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
（1）实验所用培养基中作为碳源的成分是 。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成 （答出2种即可）等生物大分子。
（2）步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是 。
（3）为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是 。
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A +++ ++
B ++ -
（4）现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是 ，理由是 。
【答案】（1）石油；DNA、RNA、蛋白质
（2）N0 2n
（3）在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
（4）A；A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】（1）由题意可知，实验是从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，培养基中的石油作为唯一的碳源。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成DNA、RNA和蛋白质等含氮生物大分子。
故答案为：石油；DNA、RNA、蛋白质。
（2）在食物充足，无限空间，无天敌的理想条件下种群数量呈“J”型曲线增长，Nt=N0λt，即若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是N0 2n。
故答案为： N0 2n。
（3）由表可知，A菌株在平板Ⅰ和Ⅱ上都有降解石油的能力，且在平板Ⅰ上降解石油的能力高于B菌株；而B菌株在平板Ⅱ上不能降解石油，该步实验的目的是在分离得到A和B两株可以降解石油的细菌的基础上，采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。生物实验的单一变量和对照原则，本实验的自变量为A、B两种不同菌落及不同培养基，因变量为两种菌落在不同培养基上的生长情况（透明圈大小、多少），则该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板I的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
故答案为：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
（4）由题意和表可知，A菌株分解石油的能力大于B菌株，且在平板Ⅱ上也可以生长，平板Ⅱ中不含碳源，即A菌落不仅分解石油能力强，并且在不含碳元素的培养基中也可以生长，所以若要治理贫瘠且被石油污染的土壤，应选择菌株A。
故答案为：A；A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、化合物的元素组成：（1）蛋白质的组成元素有C、H、O、N元素构成，有些还含有S；（2）核酸的组成元素为C、H、O、N、P；（3）脂质的组成元素有C、H、O，磷脂还含有N、P；（4）糖类的组成元素为C、H、O。
3、种群数量增长的两种曲线：“J”型曲线：指数增长函数，描述在食物充足，无限空间，无天敌的理想条件下生物无限增长的情况，Nt=N0λt。“S“型曲线：是受限制的指数增长函数，描述食物、空间都有限，有天敌捕食的真实生物数量增长情况，存在环境容纳的最大值K。
4、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
18．（2021·湖南）[选修1：生物技术实践]
大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以 为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于 培养基。
（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是 。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是 。
（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路 。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株 ，理由是 。
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重（%） 纤维素降解率（%）
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
【答案】（1）C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；纤维素；选择
（2）为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）；不接种培养（或空白培养 ）
（3）将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测 大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数
（4）C；接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
【知识点】纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；该培养基通过加入特殊的营养物质纤维素，使纤维素分解菌可以生存，其他微生物不能生存，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。
（2）配制培养基的常用高压蒸汽灭菌，目的是为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。为检测灭菌效果可将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
（3）测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，常采用稀释涂布平板法，即将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。
（4）测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
故答案为：（1） C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 ； 纤维素；选择 （2） 为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子） ； 不接种培养（或空白培养 ） （3） 将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测 大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数 （4） C ； 接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
【分析】1.纤维素酶：纤维素分解菌可产生纤维素酶，纤维素酶是复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。C1酶、Cx酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。
2.微生物培养计数方法：
（1）直接计数法：显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板计数，不能区分细菌的死活。
（2）间接计数法：稀释涂布平板法。
3.培养基的制作是否符合：将未接种的培养基在恒温箱中保温1~2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。
4.纤维素分解菌的分离流程：取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。透明圈越大说明纤维素酶的活力越高。
19．（2021·河北）[选修1：生物技术实践]
葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。
回答下列问题：
（1）皮渣中含有较多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前将原料干燥、粉碎的目的分别是 ，萃取效率主要取决于萃取剂的 。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷 。研究发现，萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理可提高花色苷的提取率，原因是 。
（2）为了解皮渣中微生物的数量，取10g皮渣加入90mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为 个。
（3）皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至 性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是 。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为 。
（4）皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。（简要写出实验步骤和预期结果）
【答案】（1）利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触；性质和使用量；分解；纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率
（2）8.8×106
（3）中性或偏碱；使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈；碳源
（4）实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小 。
预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；芳香油的提取；胡萝卜素的提取
【解析】【解答】（1）萃取前将原料干燥去除水分，有利于萃取剂（有机溶剂）溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料与萃取剂充分接触；萃取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷分解。萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理，可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。
故答案为：利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触；性质和使用量；分解；纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。
（2）104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则三个平板中平均菌落数为（78+91+95）÷3=88，每克皮渣中微生物数量为88÷0.1×104=8.8×106个。
故答案为： 8.8×106 。
（3）醋酸菌属于细菌，培养细菌时，需要将培养基的pH调至中性或弱碱性；加入碳酸钙可使培养基不透明，醋酸菌产生的醋酸可分解碳酸钙，产生透明圈，根据这一特点可筛选出醋酸菌；在缺少糖源的液体培养基中醋酸菌以乙醇为碳源，先把乙醇氧化为乙醛，再把乙醛氧化为乙酸。
故答案为：中性或偏碱；使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈；碳源。
（4）醋酸菌为好氧菌，乳酸菌为与兼性厌氧型，若要区别两者，可将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小。若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
故答案为： 实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小 预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
【分析】 （1）萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、草取的温度和时间等条件的影响。一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。
（2）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
①统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30-300的平板进行计数。
②每克样品中的菌株数=(C÷V)×M
C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M：稀释倍数
注意：①统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
②一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数
③为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC3.本法仅限于形成菌落的微生物。
（3）培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。
20．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。
Ⅰ.从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或 法，两种方法均能在固体培养基上形成 。对分离的菌株进行诱变、 和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。
Ⅱ.固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除 ；③检验固定化菌株的 。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是 。
Ⅲ.对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是 。
（2）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。
Ⅰ.为保护三叶青的 多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用 技术，实现了三叶青的林下种植。
Ⅱ.依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成 和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成 ，再分化形成毛状根。
Ⅲ.剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次 培养，培养基中添加抗生素的主要目的是 。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的 和温度，调节培养基成分中的 ，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【答案】（1）涂布分离；单菌落；筛选；未固定的细菌；降解富营养化污水污染物的能力；包埋法和吸附法；特定介质能为菌株繁殖提供X
（2）遗传；间种；DNA聚合酶；愈伤组织；继代；杀灭发根农杆菌；转速；营养元素以及生长调节剂的种类和浓度
【知识点】微生物的分离和培养；基因工程的应用；固定化酶及其应用；固定化细胞及其应用；生物多样性的保护措施
【解析】【解答】（1）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。Ⅰ.分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。Ⅱ.固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。Ⅲ.由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。（2）Ⅰ.生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。Ⅱ.分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。Ⅲ.剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【分析】1、分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。2、固定化酶( insoluble enzyme)就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。3、植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。4、在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。
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