高考生物五年真题汇编25——微生物的利用（2）
一、单选题
1．（2020·新高考I）野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是（ ）
A．操作过程中出现杂菌污染
B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A.操作过程当中出现杂菌污染，基本培养基上生长的为杂菌，A合理；
B.若M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸形成的菌落，需要MN混合在一起才能生存，而该菌落来自于单个细菌形成的菌落，单个细菌不可能混合培养的细菌。B项不合理。
C.M、N菌株混合培养后在基本培养基上可以生存。推测可能是混合培养过程当中，菌株间发生了基因交流，获得了对方的遗传物质，C合理；
D.基因突变是不定向的，在混合培养过程中，菌株当中已突变的基因也可能再次发生突变得到可在基本培养基上生存的野生型大肠杆菌，D合理。
故答案为：B。
【分析】甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N由于各自不能够合成甲硫氨酸和苏氨酸导致无法在基本培养基上生长，而两者要单独在基本培养基中存活需要各自添加甲硫氨酸、苏氨酸。
2．（2020·江苏）为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、倒平板后无需晃动，A错误；
B、Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；
C、出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；
D、刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解
后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。
故答案为：B。
【分析】分析平板结果可知，采用的接种方法为平板划线法，且划线顺序是Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区，可以看到Ⅲ区中出现了单菌落。
3．（2020·浙江选考）细菌内某种物质在酶的作用下转变为另一种物质的过程如图所示，其中甲～戊代表生长必需的不同物质，①～⑤代表不同的酶。野生型细菌只要在培养基中添加甲就能生长，而突变型细菌必须在培养基中添加甲、乙、丁才能生长。下列叙述正确的是（ ）
A．突变型细菌缺乏酶①、②、③
B．酶④与乙结合后不会改变酶④的形状
C．酶②能催化乙转变为丙，也能催化丙转变为丁
D．若丙→戊的反应受阻，突变型细菌也能生长
【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、突变型细菌必须在培养基中添加甲、乙、丁才能生长，说明缺乏合成乙、丁所必需的的酶，即酶①、③，A错误；
B、酶与底物结合后会改变酶的形状，反应完成后，酶分子又恢复原状，B错误；
C、酶具有专一性，酶②能催化乙转变为丙，酶③能催化丙转变为丁，C错误；
D、若丙→戊的反应受阻，乙可以合成戊，所以突变型细菌也能生长，D正确。
故答案为：D。
【分析】分析题意可知，野生型细菌体内含有①～⑤这五种酶，所以只要在培养基中添加甲就能合成生长需要的乙、丙、丁、戊这四种物质；而突变型细菌必须在培养基中添加甲、乙、丁才能生长，说明缺乏合成相应物质所必需的的酶。
4．（2019·江苏）下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是（ ）
A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养
B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌
C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力
D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值
【答案】A
【知识点】纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】A.应该用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌，只有纤维素分解菌能够存活，A符合题意；
B.木材、秸秆中富含纤维素，故可以从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌，B不符合题意；
C.用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌后，为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，C不符合题意；
D.用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，可以把纤维素分解成葡萄糖，提高饲用价值，D不符合题意
故答案为：A
【分析】（1）纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖．
（2）常用的接种工具是接种环，操作时采用灼烧的方法灭菌．
（3）刚果红与纤维素反应呈红色，纤维素分解菌产生的纤维素酶会将纤维素分解而不能与刚果红染液呈红色，在菌落周围会出现透明圈．为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验．纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定．
5．（2019·江苏）下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（ ）
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
【答案】A
【知识点】微生物的分离和培养；培养基概述及其分类；灭菌技术
【解析】【解答】A接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A符合题意；
B为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B不符合题意；
C接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C不符合题意；
D分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D不符合题意
故答案为：A
【分析】一、无菌操作要求
1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间， 工作前经紫外线消毒后使用。
3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取 出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆 的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、细菌培养方法
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。
6．（2019·北京） 筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。（ ）
有关本实验的叙述，错误的是
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C 值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；培养基概述及其分类
【解析】【解答】A、培养基的化学成分都应该含有水、无机盐、碳源、氮源，有些含有生长因子，所以题中培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质，A不符合题意；
B、筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布，B不符合题意；
C、以上两种细菌周围经稀碘液处理均有透明圈说明两种细菌都能将淀粉酶分泌到细胞外分解淀粉，C符合题意；
D、H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异，H/C值越大分解淀粉能力越强，D不符合题意。
故答案为：C
【分析】1.平板划线法和稀释涂布平板法作用不完全相同：平板划线法和稀释涂布平板法都能纯化细菌，但平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。
2. 培养基的化学成分都应该含有水、无机盐、碳源、氮源，有些含有生长因子。
3.碘液遇淀粉变蓝，淀粉酶可以催化淀粉水解。
7．（2018·全国Ⅰ卷）某大肠杆菌能在基本培养基上生长，其突变体M和N均不能在基本培养基上生长，但M可在添加了氨基酸甲的基本培养基上生长，N可在添加了氨基酸乙的基本培养基上生长，将M和N在同时添加氨基酸甲和乙的基本培养基中混合培养一段时间后；再将菌体接种在基本培养基平板上，发现长出了大肠杆菌（X）的菌落。据此判断，下列说法不合理的是（ ）
A．突变体M催化合成氨基酸甲所需酶的活性丧失
B．突变体M和N都是由于基因发生突变而得来的
C．突变体M的RNA与突变体N混合培养能得到X
D．突变体M和N在混合培养期间发生了DNA转移
【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、依题意，突变体M和N分别在添加了氨基酸甲和氨基酸乙的基本培养基上生长，说明催化合成相应氨基酸的酶的活性丧失，A不符合题意；
B、原核生物的细胞内可遗传的变异只有基因突变，不可能发生基因重组和染色体变异，B不符合题意；
C、突变体M和N在同时添加氨基酸甲和乙的基本培养基中混合培养，产生了大肠杆菌X，这可能是两种大肠杆菌之间发生了重组，但不能确定突变体M的RNA与突变体N混合培养能否得到X，C符合题意；
D、当突变体M和N放到同一个培养基时发生了细胞间的DNA转移，从而产生大肠杆菌X，D不符合题意。
故答案为：C。
【分析】本题考查了细菌的可遗传变异类型，当基因发生突变以后，会改变酶的活性，使代谢途径发生了变化，进而引起性状的改变。当不同种类的细菌混合培养时，会发生基因的重新组合，产生新的变异类型。
二、多选题
8．（2018·江苏）下列中学实验均使用光学显微镜进行观察，有关实验操作或现象描述错误的是（ ）
编号 实验名称 实验材料 实验操作或现象
① 观察植物细胞的质壁分离
紫色洋葱外表皮、蔗糖溶液等 原生质层呈紫色，各组成部分结构清晰
② 检测生物组织中的脂肪 花生子叶、苏丹Ⅲ染液等 在高倍镜下可见细胞中被染成橘黄色的脂肪液滴
③ 观察细胞有丝分裂
洋葱根尖、龙胆紫溶液等 在高倍镜的同一个视野中，可见分裂前期、中期、后期、末期各时期细胞呈正方形，排列紧密
④ 探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化 酵母菌、血细胞计数板等 在10×目镜、40×物镜下的一个视野中完成对整个计数室中酵母菌的计数
A．实验① B．实验② C．实验③ D．实验④
【答案】A,C,D
【知识点】质壁分离和复原；观察细胞的有丝分裂；测定某种微生物的数量；检测脂肪的实验
【解析】【解答】A、①在观察植物细胞的质壁分离实验中，利用洋葱外表皮细胞、蔗糖溶液作为实验材料，原生质层呈现紫色，可以清晰的可见细胞壁、细胞膜等，但是不能看清楚各个组成部分的结构，A符合题意；
B、②在检测生物组织中的脂肪的实验中，苏丹Ⅲ染液可以将脂肪染成橘黄色，B不符合题意；
C、③有丝分裂各个时期的细胞不一定是正方形的，如正在分裂的末期细胞不是正方形的，C符合题意；
D、④在利用血细胞计数板对酵母菌进行计数时，应该多次计数，求其平均值，D符合题意。
故答案为：ACD
【分析】（1）观察植物细胞的质壁分离的实验原理：①质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。②质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。（2）在观察细胞有丝分裂实验中，不能观察一个细胞的连续分裂过程，因为解离时细胞已死亡，可以寻找处于不同时期的细胞，连起来体会出细胞分裂的连续过程。（3）对酵母菌的计数中，一个视野只计几个小方格的数，而不是计整个计数室的数。
三、综合题
9．（2019·江苏）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V酶切位点为 ，EcoR V酶切出来的线性载体P1为 末端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
菌落类型平板类型 A B C
无抗生素 ﹢ ﹢ ﹢
氨苄青霉素 ﹢ ﹢ ﹣
四环素 ﹢ ﹣ ﹣
氨苄青霉素+四环素 ﹢ ﹣ ﹣
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。
【答案】（1）平
（2）胸腺嘧啶（T）；DNA连接
（3）B；A类菌落含有P0；C类菌落未转入质粒
（4）乙丙；目的基因反向连接
【知识点】培养基对微生物的选择作用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
故答案为 (1)平；(2)胸腺嘧啶（T） DNA连接 ；(3) B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 ；(4)乙丙 目的基因反向连接
【分析】（1）基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。
（2）基因工程的步骤
1、获取目的基因
获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒 抗细菌）基因，
2、目的基因与运载体结合
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。
3、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。
4、目的基因的检测和表达
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。
质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
10．（2019·全国Ⅱ卷） 物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是 。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择 菌落进一步纯化，选择的依据是 。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即 。
（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加 ，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明 ；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明 。
【答案】（1）W
（2）乙；乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
（3）将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
（4）缓冲液；缓冲液不能降解W；酶E与天然酶降解W的能力相近
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）能降解W的细菌可以以W为氮源，不能降解W的细菌不能以W为氮源，要想分离出能降解W的细菌，所用的选择培养基只能以W为氮源。（2）以W为氮源的选择性培养基表现为不透明，而乙菌落周围出现了透明圈，说明乙菌能降解W，甲菌落周围没有透明圈，说明甲菌不能降解W。要得到目标菌应选择乙菌落进一步纯化。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。要想确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需要在将其在无氮培养基上培养，能利用空气中氮气为氮源的细菌可生长，不能利用空气中氮气为氮源的细菌不能生长。实验思路：将甲乙菌分别接种在无氮培养基上。预期结果和结论：若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
（4）①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，A、B处均加入了酶为实验组，还需一个对照组，不加任何酶，还要遵循单一变量原则，所以C处滴加缓冲液，且三处滴加量相同。
②C处只滴加了缓冲液，若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
故答案为：（1）W （2）乙 乙菌落周围出现了透明圈，说明乙菌能降解W（3）将甲乙菌分别接种在无氮培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。（4）①缓冲液 缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近。
【分析】选择培养基：通过加入某化学物质或除去某营养物质，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
11．（2018·全国Ⅲ卷）回答下列与酵母菌有关的问题：
（1）分离培养酵母菌通常使用 （填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，该培养基应采用 灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是 。
（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进 （填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）；若进行厌氧培养，可促进 （填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）。
（3）制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是 。
【答案】（1）麦芽汁琼脂；高压蒸汽；由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
（2）菌体快速增殖；乙醇产生
（3）酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）培养酵母菌的培养基为麦芽汁琼脂培养基，培养基的灭菌方式为高压蒸汽灭菌。菌落是指在培养基上由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。（2）酵母菌可以进行有氧呼吸和无氧呼吸，当有氧气时进行有氧呼吸，可促进菌体快速增殖。进行无氧呼吸时，可进行酒精发酵，产生乙醇。（3）制作面包时，酵母菌会分解葡萄糖产生CO2，产生的气体使面包松软。
【分析】本题考查了酵母菌不同呼吸方式引起的结果不同，及生活中的应用。
（ 1 ）培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。液体培养基不加凝固剂，用于大量繁殖；半固体培养基加凝固剂，用于观察微生物的运动、分类鉴定；固体培养基加凝固剂，用于微生物分离、鉴定、活菌记数、保藏菌种。
（ 2 ）常用的灭菌方法：
灭菌方法 适用对象
灼烧灭菌 接种的工具、试管口、瓶口
干热灭菌 耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）
高压蒸汽灭菌 培养基、培养皿、实验器材
（ 3 ）酵母菌的代谢类型：异养兼性厌氧型——既能进行有氧呼吸，又能进行无氧呼吸。
反应式：
在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O
在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2
12．（2018·全国Ⅰ卷）将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
（1）M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制 的生长，加入了链霉素的培养基属于 培养基。
（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有 (答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有 (答出两点即可)。
（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是 该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是 。
（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的偏落数分别是110，140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是 。
【答案】（1）细菌；选择
（2）碳源、无机盐（答出两点即可）；蛋白质、核酸（答出两点即可）
（3）碘液；淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被分解，形成透明圈
（4）乙同学的结果中1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）M培养基若用于真菌的筛选，应该抑制细菌的生长，链霉素是抗生素，可抑制细菌的生长。该培养基从功能的角度属于选择培养基。 （2）微生物生长需要多种营养物质 除氮源外，还需要碳源、无机盐、生长因子等。氮元素是蛋白质、核酸等生物大分子的组成元素。（3）筛选产淀粉酶的微生物， 依据淀粉遇碘液变蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被分解，形成透明圈。（4）在同一稀释倍数涂布的平板，所得微生物的菌落数应差距不大。而乙同学的结果中1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果不准确。
【分析】本题考查了如何筛选某种微生物以及筛选的原理，培养基的营养成分，涂布平板中遇到的问题。
（1）培养基的营养物质
培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
四、实验探究题
13．（2020·江苏）产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
（1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是 （填编号）。
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
（2）称取1.0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌 个。
（3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径 的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
（4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株 进行后续相关研究，理由是 。
【答案】（1）④
（2）梯度稀释；4.6×105（或460000）
（3）诱变；脂肪（或油脂）；较大
（4）B；该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）培养基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培养皿一般通过干热灭菌，涂布器应该用酒精引燃灭菌；故①②③正确，错误的是④。（2）稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。根据题意，1.0g土壤样品转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，则稀释的倍数为1000倍，其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10000倍，故每克土壤中含酵母菌数为46×10000=4.6×105个。（3）根据题意，欲提高酵母菌产酶能力，可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐射，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培养基，将辐射处理的酵母菌涂布在该固体培养基上，形成单菌落；产脂肪酶能力越强的酵母菌，分解利用脂肪的能力越强，菌落生长越好，一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。（4）据题图分析可知，相同时间内，菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关研究可选择菌株B，原因是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的能力强，净化效果更好。
【分析】灭菌指用强烈的物理或化学方法杀灭所有微生物，包括致病的和非致病的，以及细菌的芽胞.常用灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌适用于对一般培养基和玻璃器皿的灭菌，干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，微生物接种时的金属接种工具和试管口可以用灼烧灭菌。稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
14．（2020·全国Ⅰ）[生物——选修1：生物技术实践]
某种物质S（一种含有C、H、N 有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于 培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 （答出1点即可）。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤 。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌；琼脂；选择
（2）104
（3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
（4）取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数
（5）水、碳源、氮源和无机盐
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类；灭菌技术
【解析】【解答】（1）常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。
（2）若要在每个平板上涂布100μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1000×100÷200=1×104倍。
（3）当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。
（4）要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。
（5）甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。
【分析】分析题图：①为淤泥取样进行稀释；②为接种到液体培养基上；③为稀释涂布平板法接种到以S为唯一碳源和氮源的选择培养基上，其中Y为琼脂；④为挑取单菌落接种到⑤已S为唯一碳源和氮源的选择及上进一步筛选。
每克样品中的菌落数 =（C/V）× M ；其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
该题目中：每克样品中的菌落数 ：2×107 个/mL、C：200、V：100μL，求M的值。
15．（2019·全国Ⅲ卷）回答下列与细菌培养相关的问题。
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是 （填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是 。硝化细菌在没有碳源的培养基上 （填“能够”或“不能”）生长，原因是 。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板 （填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是 。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过 处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】（1）蛋白胨；不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同；能够；硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
（2）倒置
（3）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
（4）灭菌
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）能同时提供碳源、氮源的物质必需含有碳元素和氮元素，蛋白胨符合要求，葡萄糖没有氮元素，NaNO3没有碳元素。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH不同，当pH值超过最适范围时，细菌的生长达到顶点。硝化细菌能进行化能合成作用，它们能以空气中的二氧化碳为主要碳源，以无机含氮化合物为氮源，合成细胞物质，并通过氧化外界无机物获得生长所需要的能量。
（2）平板倒置可以防止水分蒸发；防止皿盖上冷凝水滴到正在生长的菌落上而将其冲散；防止杂菌污染等
（3）不同种微生物菌落特征也各不相同，因此可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散.
故答案为：（1）蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源；（2）倒置 ；（3）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征；（4）灭菌
【分析】主要考查微生物的培养。培养基，是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物（碳源）、含氮物质（氮源）、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。硝化细菌属于自养型细菌，利用NH3和HNO2氧化所释放的能量以空气中的二氧化碳为碳源合成有机物。平板倒置可以防止水分蒸发，倒置培养使琼脂里水分不易蒸发，充分保持琼脂的弹性与细菌容易繁殖和生存的环境；防止皿盖上冷凝水滴到正在生长的菌落上而将其冲散，否则会影响微生物生长，且不易辨别菌落特征、不便计数；防止杂菌污染；由于重力的作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需的营养物质，利于微生物生长。菌落，是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。各种微生物在一定条件下形成的菌落特征，如大小、形状、边缘、表面、质地、颜色等，具有一定的稳定性，是衡量菌种纯度、辨认和鉴定菌种的重要依据。使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃， 这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，以防止培养物的扩散。
16．（2019·全国Ⅰ卷）已知一种有机物X（仅含有C、H两种元素）不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌（目标菌）。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X（5 g/L）。
Ⅱ号培养基：氯化钠（5 g/L），硝酸铵（3 g/L），其他无机盐（适量），X（15 g/L）。
Ⅲ号培养基：氯化钠（5 g/L），硝酸铵（3 g/L），其他无机盐（适量）。X（45 g/L）。
回答下列问题。
（1）在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是 。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是 。
（2）若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会 ，其原因是 。
（3）Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是 。
（4）假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供 和 。
【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨；X
（2）下降；不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
（3）稀释涂布平板法
（4）能量；合成其他物质的原料
【知识点】有氧呼吸的过程和意义；测定某种微生物的数量；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）Ⅰ号培养基中含有N元素的物质只有牛肉膏蛋白胨，Ⅱ、Ⅲ号培养基中氯化钠，硝酸铵和其他无机盐都不含碳元素，所以惟一碳源只能是有机物X。
（2）Ⅱ号液体培养基中惟一碳源为有机物X，所以不能分解有机物X的细菌无法获得碳元素，故其无法合成细胞所需的有机物，细胞将会死亡。
（3）该问的关键点在于计数，但是由于平板划线法不能计数，而稀释涂布平板法能计数，所以该空填稀释涂布平板法。
（4）丙酮酸为呼吸作用的原料，且元素组成为C，H，O，所以能为细菌生长提供能量和碳源。
故答案为：（1）牛肉膏蛋白胨 有机物X （2）下降 不能降解有机物X的细菌无法繁殖
（3）稀释涂布平板法 （4）能量和碳源
【分析】1．培养基的概念、种类及营养构成
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(3)营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
3、接种方法：平板划线法和稀释涂布法。
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。
17．（2018·江苏）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的 ，及时对培养基进行分装，并进行 灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约 （在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有 。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
（4）步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和 供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上 色细胞的个数应不少于 ，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
【答案】（1）pH；高压蒸汽（湿热）
（2）50 ℃
（3）a、b、d
（4）氧气；无；30
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】（1）配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。（2）在步骤③中，待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板。（3）在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a合理；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b合理；该实验的目的是获得利用工业废甲醇作为碳源的酵母菌，不需要测定酵母菌中的甲醇含量，c不合理；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d合理。（4）酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本（菌体）总数=80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于（3×109）÷（1000×2×104×400÷80）=30个。
【分析】无菌技术：
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 火焰灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、
金属用具等
高压蒸汽
灭菌法 培养基及容
器的灭菌
倒平板：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近进行倒平板。
划线分离操作：在操作的第一步及第一次划线之后每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。
18．（2018·全国Ⅱ卷）在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。
回答下列问题：
（1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具 (填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬间消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是 。
（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能 。在照射前，适量喷洒 ，可强化消毒效果。
（4）水厂供应的自来水通常是经过 （填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。
（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是 。
【答案】（1）可以
（2）可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏
（3）破坏DNA结构；石炭酸或煤酚皂溶液
（4）氯气
（5）加热灭菌锅时没有排尽锅内的冷空气
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）玻璃和金属材质的实验器具能耐高温且需要保持干燥可以用干热灭菌法灭菌（2）巴氏消毒法可以用于一些不耐高温的液体的消毒，如牛奶，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。（3）照射前适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。（4）氯气具有强氧化性可以用于水源消毒。（5）高压蒸汽灭菌主要是靠温度，如果不排除冷空气，冷空气热膨胀后对压力锅的工作压力是有贡献的，当压力达到要求了，但工作温度低于显示温度。所以应排尽冷空气。
【分析】实验室常用的灭菌方法：
煮沸法：煮沸（100℃）5~6分钟，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
巴氏消毒法：70~75℃煮30分钟或80℃煮15分钟，可以用于一些不耐高温的液体的消毒，如牛奶，可以可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏
化学药剂法：氯气消毒水源
灼烧灭菌法：可以用于接种工具（接种环、接种针或其他金属）和试管口瓶口等的消毒。
干热灭菌：能用于能耐高温需要保持干燥的物品的消毒，如：玻璃器皿和金属用具。
高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌主要是靠温度，如果不排除冷空气，冷空气热膨胀后对压力锅的工作压力是有贡献的，此时压力和温度就不能一一对应了，显示的温度比工作温度要高。
紫外线照射：可用于接种室、接种箱和超净工作台的消毒，照射前适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
1 / 1高考生物五年真题汇编25——微生物的利用（2）
一、单选题
1．（2020·新高考I）野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是（ ）
A．操作过程中出现杂菌污染
B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
2．（2020·江苏）为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
3．（2020·浙江选考）细菌内某种物质在酶的作用下转变为另一种物质的过程如图所示，其中甲～戊代表生长必需的不同物质，①～⑤代表不同的酶。野生型细菌只要在培养基中添加甲就能生长，而突变型细菌必须在培养基中添加甲、乙、丁才能生长。下列叙述正确的是（ ）
A．突变型细菌缺乏酶①、②、③
B．酶④与乙结合后不会改变酶④的形状
C．酶②能催化乙转变为丙，也能催化丙转变为丁
D．若丙→戊的反应受阻，突变型细菌也能生长
4．（2019·江苏）下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是（ ）
A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养
B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌
C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力
D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值
5．（2019·江苏）下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（ ）
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
6．（2019·北京） 筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。（ ）
有关本实验的叙述，错误的是
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C 值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
7．（2018·全国Ⅰ卷）某大肠杆菌能在基本培养基上生长，其突变体M和N均不能在基本培养基上生长，但M可在添加了氨基酸甲的基本培养基上生长，N可在添加了氨基酸乙的基本培养基上生长，将M和N在同时添加氨基酸甲和乙的基本培养基中混合培养一段时间后；再将菌体接种在基本培养基平板上，发现长出了大肠杆菌（X）的菌落。据此判断，下列说法不合理的是（ ）
A．突变体M催化合成氨基酸甲所需酶的活性丧失
B．突变体M和N都是由于基因发生突变而得来的
C．突变体M的RNA与突变体N混合培养能得到X
D．突变体M和N在混合培养期间发生了DNA转移
二、多选题
8．（2018·江苏）下列中学实验均使用光学显微镜进行观察，有关实验操作或现象描述错误的是（ ）
编号 实验名称 实验材料 实验操作或现象
① 观察植物细胞的质壁分离
紫色洋葱外表皮、蔗糖溶液等 原生质层呈紫色，各组成部分结构清晰
② 检测生物组织中的脂肪 花生子叶、苏丹Ⅲ染液等 在高倍镜下可见细胞中被染成橘黄色的脂肪液滴
③ 观察细胞有丝分裂
洋葱根尖、龙胆紫溶液等 在高倍镜的同一个视野中，可见分裂前期、中期、后期、末期各时期细胞呈正方形，排列紧密
④ 探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化 酵母菌、血细胞计数板等 在10×目镜、40×物镜下的一个视野中完成对整个计数室中酵母菌的计数
A．实验① B．实验② C．实验③ D．实验④
三、综合题
9．（2019·江苏）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V酶切位点为 ，EcoR V酶切出来的线性载体P1为 末端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
菌落类型平板类型 A B C
无抗生素 ﹢ ﹢ ﹢
氨苄青霉素 ﹢ ﹢ ﹣
四环素 ﹢ ﹣ ﹣
氨苄青霉素+四环素 ﹢ ﹣ ﹣
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。
10．（2019·全国Ⅱ卷） 物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是 。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择 菌落进一步纯化，选择的依据是 。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即 。
（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加 ，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明 ；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明 。
11．（2018·全国Ⅲ卷）回答下列与酵母菌有关的问题：
（1）分离培养酵母菌通常使用 （填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，该培养基应采用 灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是 。
（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进 （填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）；若进行厌氧培养，可促进 （填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）。
（3）制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是 。
12．（2018·全国Ⅰ卷）将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
（1）M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制 的生长，加入了链霉素的培养基属于 培养基。
（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有 (答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有 (答出两点即可)。
（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是 该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是 。
（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的偏落数分别是110，140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是 。
四、实验探究题
13．（2020·江苏）产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
（1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是 （填编号）。
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
（2）称取1.0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌 个。
（3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径 的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
（4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株 进行后续相关研究，理由是 。
14．（2020·全国Ⅰ）[生物——选修1：生物技术实践]
某种物质S（一种含有C、H、N 有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于 培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 （答出1点即可）。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤 。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。
15．（2019·全国Ⅲ卷）回答下列与细菌培养相关的问题。
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是 （填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是 。硝化细菌在没有碳源的培养基上 （填“能够”或“不能”）生长，原因是 。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板 （填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是 。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过 处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
16．（2019·全国Ⅰ卷）已知一种有机物X（仅含有C、H两种元素）不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌（目标菌）。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X（5 g/L）。
Ⅱ号培养基：氯化钠（5 g/L），硝酸铵（3 g/L），其他无机盐（适量），X（15 g/L）。
Ⅲ号培养基：氯化钠（5 g/L），硝酸铵（3 g/L），其他无机盐（适量）。X（45 g/L）。
回答下列问题。
（1）在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是 。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是 。
（2）若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会 ，其原因是 。
（3）Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是 。
（4）假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供 和 。
17．（2018·江苏）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的 ，及时对培养基进行分装，并进行 灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约 （在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有 。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
（4）步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和 供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上 色细胞的个数应不少于 ，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
18．（2018·全国Ⅱ卷）在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。
回答下列问题：
（1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具 (填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬间消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是 。
（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能 。在照射前，适量喷洒 ，可强化消毒效果。
（4）水厂供应的自来水通常是经过 （填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。
（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是 。
答案解析部分
1．【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A.操作过程当中出现杂菌污染，基本培养基上生长的为杂菌，A合理；
B.若M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸形成的菌落，需要MN混合在一起才能生存，而该菌落来自于单个细菌形成的菌落，单个细菌不可能混合培养的细菌。B项不合理。
C.M、N菌株混合培养后在基本培养基上可以生存。推测可能是混合培养过程当中，菌株间发生了基因交流，获得了对方的遗传物质，C合理；
D.基因突变是不定向的，在混合培养过程中，菌株当中已突变的基因也可能再次发生突变得到可在基本培养基上生存的野生型大肠杆菌，D合理。
故答案为：B。
【分析】甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N由于各自不能够合成甲硫氨酸和苏氨酸导致无法在基本培养基上生长，而两者要单独在基本培养基中存活需要各自添加甲硫氨酸、苏氨酸。
2．【答案】B
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、倒平板后无需晃动，A错误；
B、Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；
C、出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；
D、刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解
后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。
故答案为：B。
【分析】分析平板结果可知，采用的接种方法为平板划线法，且划线顺序是Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区，可以看到Ⅲ区中出现了单菌落。
3．【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、突变型细菌必须在培养基中添加甲、乙、丁才能生长，说明缺乏合成乙、丁所必需的的酶，即酶①、③，A错误；
B、酶与底物结合后会改变酶的形状，反应完成后，酶分子又恢复原状，B错误；
C、酶具有专一性，酶②能催化乙转变为丙，酶③能催化丙转变为丁，C错误；
D、若丙→戊的反应受阻，乙可以合成戊，所以突变型细菌也能生长，D正确。
故答案为：D。
【分析】分析题意可知，野生型细菌体内含有①～⑤这五种酶，所以只要在培养基中添加甲就能合成生长需要的乙、丙、丁、戊这四种物质；而突变型细菌必须在培养基中添加甲、乙、丁才能生长，说明缺乏合成相应物质所必需的的酶。
4．【答案】A
【知识点】纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】A.应该用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌，只有纤维素分解菌能够存活，A符合题意；
B.木材、秸秆中富含纤维素，故可以从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌，B不符合题意；
C.用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌后，为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，C不符合题意；
D.用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，可以把纤维素分解成葡萄糖，提高饲用价值，D不符合题意
故答案为：A
【分析】（1）纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖．
（2）常用的接种工具是接种环，操作时采用灼烧的方法灭菌．
（3）刚果红与纤维素反应呈红色，纤维素分解菌产生的纤维素酶会将纤维素分解而不能与刚果红染液呈红色，在菌落周围会出现透明圈．为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验．纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定．
5．【答案】A
【知识点】微生物的分离和培养；培养基概述及其分类；灭菌技术
【解析】【解答】A接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A符合题意；
B为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B不符合题意；
C接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C不符合题意；
D分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D不符合题意
故答案为：A
【分析】一、无菌操作要求
1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间， 工作前经紫外线消毒后使用。
3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取 出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆 的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、细菌培养方法
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。
6．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；培养基概述及其分类
【解析】【解答】A、培养基的化学成分都应该含有水、无机盐、碳源、氮源，有些含有生长因子，所以题中培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质，A不符合题意；
B、筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布，B不符合题意；
C、以上两种细菌周围经稀碘液处理均有透明圈说明两种细菌都能将淀粉酶分泌到细胞外分解淀粉，C符合题意；
D、H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异，H/C值越大分解淀粉能力越强，D不符合题意。
故答案为：C
【分析】1.平板划线法和稀释涂布平板法作用不完全相同：平板划线法和稀释涂布平板法都能纯化细菌，但平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。
2. 培养基的化学成分都应该含有水、无机盐、碳源、氮源，有些含有生长因子。
3.碘液遇淀粉变蓝，淀粉酶可以催化淀粉水解。
7．【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、依题意，突变体M和N分别在添加了氨基酸甲和氨基酸乙的基本培养基上生长，说明催化合成相应氨基酸的酶的活性丧失，A不符合题意；
B、原核生物的细胞内可遗传的变异只有基因突变，不可能发生基因重组和染色体变异，B不符合题意；
C、突变体M和N在同时添加氨基酸甲和乙的基本培养基中混合培养，产生了大肠杆菌X，这可能是两种大肠杆菌之间发生了重组，但不能确定突变体M的RNA与突变体N混合培养能否得到X，C符合题意；
D、当突变体M和N放到同一个培养基时发生了细胞间的DNA转移，从而产生大肠杆菌X，D不符合题意。
故答案为：C。
【分析】本题考查了细菌的可遗传变异类型，当基因发生突变以后，会改变酶的活性，使代谢途径发生了变化，进而引起性状的改变。当不同种类的细菌混合培养时，会发生基因的重新组合，产生新的变异类型。
8．【答案】A,C,D
【知识点】质壁分离和复原；观察细胞的有丝分裂；测定某种微生物的数量；检测脂肪的实验
【解析】【解答】A、①在观察植物细胞的质壁分离实验中，利用洋葱外表皮细胞、蔗糖溶液作为实验材料，原生质层呈现紫色，可以清晰的可见细胞壁、细胞膜等，但是不能看清楚各个组成部分的结构，A符合题意；
B、②在检测生物组织中的脂肪的实验中，苏丹Ⅲ染液可以将脂肪染成橘黄色，B不符合题意；
C、③有丝分裂各个时期的细胞不一定是正方形的，如正在分裂的末期细胞不是正方形的，C符合题意；
D、④在利用血细胞计数板对酵母菌进行计数时，应该多次计数，求其平均值，D符合题意。
故答案为：ACD
【分析】（1）观察植物细胞的质壁分离的实验原理：①质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。②质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。（2）在观察细胞有丝分裂实验中，不能观察一个细胞的连续分裂过程，因为解离时细胞已死亡，可以寻找处于不同时期的细胞，连起来体会出细胞分裂的连续过程。（3）对酵母菌的计数中，一个视野只计几个小方格的数，而不是计整个计数室的数。
9．【答案】（1）平
（2）胸腺嘧啶（T）；DNA连接
（3）B；A类菌落含有P0；C类菌落未转入质粒
（4）乙丙；目的基因反向连接
【知识点】培养基对微生物的选择作用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
故答案为 (1)平；(2)胸腺嘧啶（T） DNA连接 ；(3) B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 ；(4)乙丙 目的基因反向连接
【分析】（1）基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。
（2）基因工程的步骤
1、获取目的基因
获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒 抗细菌）基因，
2、目的基因与运载体结合
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。
3、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。
4、目的基因的检测和表达
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。
质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
10．【答案】（1）W
（2）乙；乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
（3）将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
（4）缓冲液；缓冲液不能降解W；酶E与天然酶降解W的能力相近
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）能降解W的细菌可以以W为氮源，不能降解W的细菌不能以W为氮源，要想分离出能降解W的细菌，所用的选择培养基只能以W为氮源。（2）以W为氮源的选择性培养基表现为不透明，而乙菌落周围出现了透明圈，说明乙菌能降解W，甲菌落周围没有透明圈，说明甲菌不能降解W。要得到目标菌应选择乙菌落进一步纯化。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。要想确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需要在将其在无氮培养基上培养，能利用空气中氮气为氮源的细菌可生长，不能利用空气中氮气为氮源的细菌不能生长。实验思路：将甲乙菌分别接种在无氮培养基上。预期结果和结论：若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
（4）①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，A、B处均加入了酶为实验组，还需一个对照组，不加任何酶，还要遵循单一变量原则，所以C处滴加缓冲液，且三处滴加量相同。
②C处只滴加了缓冲液，若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
故答案为：（1）W （2）乙 乙菌落周围出现了透明圈，说明乙菌能降解W（3）将甲乙菌分别接种在无氮培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。（4）①缓冲液 缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近。
【分析】选择培养基：通过加入某化学物质或除去某营养物质，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
11．【答案】（1）麦芽汁琼脂；高压蒸汽；由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
（2）菌体快速增殖；乙醇产生
（3）酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）培养酵母菌的培养基为麦芽汁琼脂培养基，培养基的灭菌方式为高压蒸汽灭菌。菌落是指在培养基上由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。（2）酵母菌可以进行有氧呼吸和无氧呼吸，当有氧气时进行有氧呼吸，可促进菌体快速增殖。进行无氧呼吸时，可进行酒精发酵，产生乙醇。（3）制作面包时，酵母菌会分解葡萄糖产生CO2，产生的气体使面包松软。
【分析】本题考查了酵母菌不同呼吸方式引起的结果不同，及生活中的应用。
（ 1 ）培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。液体培养基不加凝固剂，用于大量繁殖；半固体培养基加凝固剂，用于观察微生物的运动、分类鉴定；固体培养基加凝固剂，用于微生物分离、鉴定、活菌记数、保藏菌种。
（ 2 ）常用的灭菌方法：
灭菌方法 适用对象
灼烧灭菌 接种的工具、试管口、瓶口
干热灭菌 耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）
高压蒸汽灭菌 培养基、培养皿、实验器材
（ 3 ）酵母菌的代谢类型：异养兼性厌氧型——既能进行有氧呼吸，又能进行无氧呼吸。
反应式：
在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O
在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2
12．【答案】（1）细菌；选择
（2）碳源、无机盐（答出两点即可）；蛋白质、核酸（答出两点即可）
（3）碘液；淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被分解，形成透明圈
（4）乙同学的结果中1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）M培养基若用于真菌的筛选，应该抑制细菌的生长，链霉素是抗生素，可抑制细菌的生长。该培养基从功能的角度属于选择培养基。 （2）微生物生长需要多种营养物质 除氮源外，还需要碳源、无机盐、生长因子等。氮元素是蛋白质、核酸等生物大分子的组成元素。（3）筛选产淀粉酶的微生物， 依据淀粉遇碘液变蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被分解，形成透明圈。（4）在同一稀释倍数涂布的平板，所得微生物的菌落数应差距不大。而乙同学的结果中1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果不准确。
【分析】本题考查了如何筛选某种微生物以及筛选的原理，培养基的营养成分，涂布平板中遇到的问题。
（1）培养基的营养物质
培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
13．【答案】（1）④
（2）梯度稀释；4.6×105（或460000）
（3）诱变；脂肪（或油脂）；较大
（4）B；该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）培养基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培养皿一般通过干热灭菌，涂布器应该用酒精引燃灭菌；故①②③正确，错误的是④。（2）稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。根据题意，1.0g土壤样品转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，则稀释的倍数为1000倍，其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10000倍，故每克土壤中含酵母菌数为46×10000=4.6×105个。（3）根据题意，欲提高酵母菌产酶能力，可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐射，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培养基，将辐射处理的酵母菌涂布在该固体培养基上，形成单菌落；产脂肪酶能力越强的酵母菌，分解利用脂肪的能力越强，菌落生长越好，一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。（4）据题图分析可知，相同时间内，菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关研究可选择菌株B，原因是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的能力强，净化效果更好。
【分析】灭菌指用强烈的物理或化学方法杀灭所有微生物，包括致病的和非致病的，以及细菌的芽胞.常用灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌适用于对一般培养基和玻璃器皿的灭菌，干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，微生物接种时的金属接种工具和试管口可以用灼烧灭菌。稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
14．【答案】（1）高压蒸汽灭菌；琼脂；选择
（2）104
（3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
（4）取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数
（5）水、碳源、氮源和无机盐
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类；灭菌技术
【解析】【解答】（1）常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。
（2）若要在每个平板上涂布100μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1000×100÷200=1×104倍。
（3）当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。
（4）要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。
（5）甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。
【分析】分析题图：①为淤泥取样进行稀释；②为接种到液体培养基上；③为稀释涂布平板法接种到以S为唯一碳源和氮源的选择培养基上，其中Y为琼脂；④为挑取单菌落接种到⑤已S为唯一碳源和氮源的选择及上进一步筛选。
每克样品中的菌落数 =（C/V）× M ；其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
该题目中：每克样品中的菌落数 ：2×107 个/mL、C：200、V：100μL，求M的值。
15．【答案】（1）蛋白胨；不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同；能够；硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
（2）倒置
（3）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
（4）灭菌
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）能同时提供碳源、氮源的物质必需含有碳元素和氮元素，蛋白胨符合要求，葡萄糖没有氮元素，NaNO3没有碳元素。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH不同，当pH值超过最适范围时，细菌的生长达到顶点。硝化细菌能进行化能合成作用，它们能以空气中的二氧化碳为主要碳源，以无机含氮化合物为氮源，合成细胞物质，并通过氧化外界无机物获得生长所需要的能量。
（2）平板倒置可以防止水分蒸发；防止皿盖上冷凝水滴到正在生长的菌落上而将其冲散；防止杂菌污染等
（3）不同种微生物菌落特征也各不相同，因此可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散.
故答案为：（1）蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源；（2）倒置 ；（3）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征；（4）灭菌
【分析】主要考查微生物的培养。培养基，是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物（碳源）、含氮物质（氮源）、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。硝化细菌属于自养型细菌，利用NH3和HNO2氧化所释放的能量以空气中的二氧化碳为碳源合成有机物。平板倒置可以防止水分蒸发，倒置培养使琼脂里水分不易蒸发，充分保持琼脂的弹性与细菌容易繁殖和生存的环境；防止皿盖上冷凝水滴到正在生长的菌落上而将其冲散，否则会影响微生物生长，且不易辨别菌落特征、不便计数；防止杂菌污染；由于重力的作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需的营养物质，利于微生物生长。菌落，是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。各种微生物在一定条件下形成的菌落特征，如大小、形状、边缘、表面、质地、颜色等，具有一定的稳定性，是衡量菌种纯度、辨认和鉴定菌种的重要依据。使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃， 这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，以防止培养物的扩散。
16．【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨；X
（2）下降；不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
（3）稀释涂布平板法
（4）能量；合成其他物质的原料
【知识点】有氧呼吸的过程和意义；测定某种微生物的数量；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）Ⅰ号培养基中含有N元素的物质只有牛肉膏蛋白胨，Ⅱ、Ⅲ号培养基中氯化钠，硝酸铵和其他无机盐都不含碳元素，所以惟一碳源只能是有机物X。
（2）Ⅱ号液体培养基中惟一碳源为有机物X，所以不能分解有机物X的细菌无法获得碳元素，故其无法合成细胞所需的有机物，细胞将会死亡。
（3）该问的关键点在于计数，但是由于平板划线法不能计数，而稀释涂布平板法能计数，所以该空填稀释涂布平板法。
（4）丙酮酸为呼吸作用的原料，且元素组成为C，H，O，所以能为细菌生长提供能量和碳源。
故答案为：（1）牛肉膏蛋白胨 有机物X （2）下降 不能降解有机物X的细菌无法繁殖
（3）稀释涂布平板法 （4）能量和碳源
【分析】1．培养基的概念、种类及营养构成
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(3)营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
3、接种方法：平板划线法和稀释涂布法。
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。
17．【答案】（1）pH；高压蒸汽（湿热）
（2）50 ℃
（3）a、b、d
（4）氧气；无；30
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】（1）配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。（2）在步骤③中，待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板。（3）在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a合理；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b合理；该实验的目的是获得利用工业废甲醇作为碳源的酵母菌，不需要测定酵母菌中的甲醇含量，c不合理；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d合理。（4）酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本（菌体）总数=80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于（3×109）÷（1000×2×104×400÷80）=30个。
【分析】无菌技术：
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 火焰灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、
金属用具等
高压蒸汽
灭菌法 培养基及容
器的灭菌
倒平板：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近进行倒平板。
划线分离操作：在操作的第一步及第一次划线之后每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。
18．【答案】（1）可以
（2）可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏
（3）破坏DNA结构；石炭酸或煤酚皂溶液
（4）氯气
（5）加热灭菌锅时没有排尽锅内的冷空气
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）玻璃和金属材质的实验器具能耐高温且需要保持干燥可以用干热灭菌法灭菌（2）巴氏消毒法可以用于一些不耐高温的液体的消毒，如牛奶，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。（3）照射前适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。（4）氯气具有强氧化性可以用于水源消毒。（5）高压蒸汽灭菌主要是靠温度，如果不排除冷空气，冷空气热膨胀后对压力锅的工作压力是有贡献的，当压力达到要求了，但工作温度低于显示温度。所以应排尽冷空气。
【分析】实验室常用的灭菌方法：
煮沸法：煮沸（100℃）5~6分钟，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
巴氏消毒法：70~75℃煮30分钟或80℃煮15分钟，可以用于一些不耐高温的液体的消毒，如牛奶，可以可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏
化学药剂法：氯气消毒水源
灼烧灭菌法：可以用于接种工具（接种环、接种针或其他金属）和试管口瓶口等的消毒。
干热灭菌：能用于能耐高温需要保持干燥的物品的消毒，如：玻璃器皿和金属用具。
高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌主要是靠温度，如果不排除冷空气，冷空气热膨胀后对压力锅的工作压力是有贡献的，此时压力和温度就不能一一对应了，显示的温度比工作温度要高。
紫外线照射：可用于接种室、接种箱和超净工作台的消毒，照射前适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
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