高考生物五年真题汇编28——基因工程
一、单选题
1．（2021·湖北）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
【答案】D
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】PCR过程中，非特异性产物增加的原因是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确，A、B、C错误。
故答案为：D。
【分析】PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
2．（2021·湖北）限制性内切酶EcoRI识别并切割 双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6 B．250 C．4000 D．24000
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】由题意可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，DNA分子由A、T、G、C种脱氧核苷酸排列形成，则出现该固定序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，即得到DNA片段的平均长度理论约为4000。C正确，A、B、D错误。
故答案为：C。
【分析】限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3．（2021·江苏）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ ）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、农杆菌转化法的核心是农杆菌的T-DNA能插入受体细胞的染色体上，故两个质粒都必须带有T-DNA序列 ，A正确；
B和C、农杆菌转化法的转化频率是很高的，共转化后， 标记基因和目的基因必须转到不同染色体上才能遵循基因自由组合定律，得到无筛选标记转基因植株，B、C正确；
D、T-DNA是比较短小的基因小片段，T-DNA插入受体细胞的染色体上属于基因重组的范畴，D错误；
故答案为：D
【分析】（1） 农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2） 农杆菌转化法步骤：目的基因插入Ti质粒的T DNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
（3）染色体结构变异的类型： 缺失、重复、易位、倒位
。
4．（2021·辽宁）下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A．灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B．用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C．基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D．经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
【答案】C
【知识点】细胞融合的方法；单克隆抗体的制备过程；基因工程的基本工具（详细）；免疫学的应用
【解析】【解答】A、诱导动物细胞融合可以利用灭火的病毒，A正确；
B、制备单克隆抗体需先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，B正确；
C、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，C错误；
D、经灭活或者减毒的病毒可以作为疫苗用于免疫预防，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、诱导动物细胞融合的方法有物理法（电激等）、化学法（聚乙二醇PEG）、生物法（灭活的病毒）等。
2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
3、将目的基因导入受体细胞∶（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
4、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗有三种类型：（1）灭活的微生物；（2）分离的微生物成分或其他产物；（3）减毒微生物。使机体产生相应的抗体和记忆细胞（主要是得到记忆细胞），使人在不发病的情况下产生抗体，获得免疫力。
5．（2021·辽宁）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（ ）
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
【答案】D
【知识点】酶的相关综合；蛋白质工程
【解析】【解答】A、蛋白质的结构决定功能，N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一，A正确；
B、加入连接肽是通过蛋白质工程，蛋白质工程的实质是改造基因，B正确；
C、蛋白质的合成需要转录和翻译过程，C正确；
D、检测N1的活性应先置于高温环境在将N1与底物混合，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、酶
（1）酶是由活细胞产生的具有催化活性的有机物，其中大部分是蛋白质、少量是RNA。
（2）酶催化作用的实质：降低化学反应的活化能，在反应前后本身性质不会发生改变。
（3）酶的特性：①高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107-1013倍。②专一性：每一种酶只能催化一种或者一类化学反应。③酶的作用条件较温和：在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高；温度和pH偏高或偏低，酶的活性都会明显降低。
（4）酶的变性：过酸、过碱或温度过高，会使酶的空间结构遭到破坏，使酶永久失活；低温使酶活性明显下降，但在适宜温度下其活性可以恢复。
2、蛋白质工程的实质是：改造基因。蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列；进行基因修饰或基因合成；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成问题。因此，蛋白质工程生产合成的蛋白质是自然界中不存在的新型蛋白质分子。
6．（2021·山东）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A．“引子”的彻底水解产物有两种
B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
【答案】C
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】A、引子是DNA序列，彻底水解产物为磷酸、脱氧核糖和四种碱基共6种产物，A错误；
B、真核生物DNA主要存在细胞核中，线粒体和叶绿体中也有，B错误；
C、引子是根据现代人DNA序列设计并合成，C正确；
D、双链DNA分子解旋为单链才能与引子结合，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
2、分析题意可知，“引子“是一段单链DNA序列，根据碱基互补配对的原则去探测古人类DNA中与该序列配对的碱基序列。
（2021·天津）阅读下列材料，完成下面小题。
为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：
①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基同时转入棉花。
②田间策略：主要是为棉铃虫提供底护所。例如我国新疆棉区，在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供专门的庇护所：长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。
③国家宏观调控政策：如实施分区种植管理等。
7．关于上述基因策略，下列叙述错误的是（ ）
A．提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度
B．转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律
C．若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因
D．转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
8．关于上述田间策略，下列叙述错误的是（ ）
A．转基因棉田周围种植非抗虫棉，可降低棉铃虫抗性基因的突变率
B．混作提高抗虫棉的抗虫持久性，体现了物种多样性的重要价值
C．为棉铃虫提供底护所，可使敏感棉铃虫在种群中维持一定比例
D．为棉铃虫提供庇护所，可使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
【答案】7．C
8．A
【知识点】基因频率的概念与变化；基因工程的应用；变异是自然选择的原材料；生物多样性的价值
【解析】【分析】1、种群密度：种群在单位面积或单位体积中的个体数就是种群密度，种群密度是种群最基本的数量特征。
2、基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合，由于自由组合定律同时也遵循分离定律，因此可以将自由组合问题转化成分离定律问题进行解决。
3、基因突变的类型：自发突变和人工诱变。基因突变的特点：①基因突变具有普遍性：生物界中普遍存在；②低频性：自然情况下突变频率很低（10-5-10-8）；③随机性：个体发育的任何时期和部位；④不定向性：突变是不定向的；⑤多害少利性：多数对生物有害。
4、生物多样性的价值：（1）直接价值：对人类有食用、药用和工业原料等使用意义，以及有旅游观赏、科学研究和文学艺术创作等非实用意义的。（2）间接价值：对生态系统起重要调节作用的价值（生态功能）。（3）潜在价值：目前人类不清楚的价值。
5、自然选择决定生物进化的方向（1）变异是不定向的，自然选择是定向的； （2）自然选择的直接对象是生物的表现型，间接对象是相关的基因型，根本对象是与变异性状相对的基因；（3）自然选择的实质：种群的基因频率发生定向改变；（4）自然选择的方向：适应自然环境；（5）变异是普遍存在的，环境仅是一个选择因素，变异在先、选择在后。
7．A、提高Bt基因表达量，抗虫蛋白含量增加，棉铃虫数量下降，种群密度降低，A正确；
B、若两种Bt基因转入同一条染色体上，则遗传不遵循自由组合定律，B正确；
C、同源染色体上相同位置控制同一性状不同形态的基因，称为等位基因，C错误；
D、棉铃虫基因突变频率低且不定向，转入多种Bt基因可以可以提高抗虫棉的抗虫持久性，D正确。
故答案为：C。
8．A、基因突变可自发发生，突变频率与环境没有直接关系，A错误；
B、混作可以提高抗性小的抗虫棉的存活，且减少棉铃虫的生存资源，提高了抗虫棉的抗虫持久性，也具有经济价值，体现了物种多样性的直接和间接价值，B正确。
C、抗虫棉田中敏感棉铃虫在种群中维持一定比例，使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存可以为棉铃虫提供底护所，C正确；
D、抗虫棉田中敏感棉铃虫在种群中维持一定比例，使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存，且由于种内斗争，使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓，D正确。
故答案为：A。
9．（2021·北京）社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是（ ）
A．长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B．转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C．消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒
D．如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的
【答案】A
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；基因工程的应用；灭菌技术
【解析】【解答】A、高温加热破坏会维生素，造成维生素的流失和分解，A正确；
B、转基因抗虫棉产生的毒蛋白只针对棉虫，对人无毒，B错误；
C、消毒液杀死的是体表的细菌和病毒，不能清除进入人体的病毒，C错误；
D、血型遗传受基因控制，A型血和B型血的父母可能生出O型血的孩子，故血型不同也可能是亲生的，D错误。
故答案为：A
【分析】1、烹饪饮食的方法不当蔬菜、水果等食物是人体摄入维生素C的主要来源。研究发现，人们若采取以下烹饪方法，就会导致饮食中所含的维生素C大量流失：①将蔬菜先切后洗。②将蔬菜切得很碎。③用铁制的刀具切蔬菜。铁会促使蔬菜中所含的维生素C更快地发生氧化。因此，人们应尽量少用刀切菜，而应养成用手撕菜的习惯。④炖煮蔬菜的时间过长。⑤长时间地存放水果和蔬菜。维生素C易被空气中的氧气氧化，因此蔬菜、水果被存放的时间越长，其中所含的维生素C就流失得越多。
2、转基因抗虫棉产生的毒蛋白会使棉虫致死，而不对人体产生毒性，是由于人体细胞没有毒蛋白的特异性受体，并且人误食了该毒蛋白质之后经过消化系统蛋白质已经变性甚至降解，没了毒性。
3、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
4、血型分为四种，即A，B，AB，O。血型是指红细胞上所含的抗原不同而言，红细胞上只含A抗原的称A型，含有B抗原的称B型，既有A抗原又有B抗原的称为AB型，既没有A抗原也没有B抗原的称为0型。ABO血型受ABO三种基因控制，A基因控制A抗原产生，B基因控制B抗原产生，O基因控制不产生A和B两种抗原，而基因都是成对存在，控制ABO血型的基因可有六种不同组合，即AA，AO，BB，BO，AB，OO，而每个人只有其中一对。
10．（2020·北京）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④
【答案】B
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。
故答案为：B。
【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。
二、综合题
11．（2022·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
Ⅰ.为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（2）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
Ⅳ.在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
Ⅴ.为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
Ⅵ.植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
【答案】（1）无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合
（2）农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；植物体细胞杂交的过程及应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）Ⅰ.枯草杆菌分泌淀粉酶的最适温度为50-75℃，为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用无菌水制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，来杀死不耐热的微生物。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种筛选程与菌种的产酶性能测定一起进行：利用淀粉遇碘液变蓝的原理，用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，并且在培养基中添加KI-12，枯草杆菌合成的淀粉酶能利用淀粉，由于淀粉被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过诱变育种、基因工程育种或者细胞工程的方法进行菌种选育。
故答案为：无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合。
（2）Ⅳ.基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入到受体细胞中，植物组织培养时通常使用抗生素，抗生素可以抑制其他杂菌的生长，并且农杆菌Ti质粒上含有抗生素的抗性基因，可以对受体细胞进行筛选。但是农杆菌使用过程中需要注意当培养基中抗生素浓度过低时，没有抗性的细胞也可能存活下来，而出现假阳性，所以在进行转化之前要对抗生素的敏感性检测。
Ⅴ.转基因植物需要经过组织培养之后形成植株，组织培养过程需要经过脱分化和再分化过程，所以受体细胞需要具有较强的再生能力和和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
Ⅵ.基因工程中受体细胞的全能性越高，越易成功。植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和培养时间长短等有关。全能性越高，越易成功，在植物细胞中受精卵的全能性最高。
故答案为：农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
3、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
4、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌一导入植物细胞一目的基因整合到植物细胞染色体上一目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
12．（2022·广东）“绿水透迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ，终止子的作用是 。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】（1）引物
（2）作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止转录，使转录在需要的地方停下来
（3）二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
（4）废物的资源化；不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】（1）目的基因的获得通常利用PCR扩增技术，PCR扩增技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
故答案为：引物。
（2）基因表达载体的结构一般为标记基因、启动子、终止子、目的基因和复制原点，其中标记基因一般为抗性基因，也可以是荧光蛋白基因，用来筛选含有目的基因的受体细胞，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，调解转录起始，终止子的作用是终止转录，使转录在需要的地方停下来。
故答案为：作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止转录，使转录在需要的地方停下来。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，由图可知，在重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，推测其原因可能是二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
故答案为：二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长。
（4）由题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，是以工业废气为原料进行生产，实现了废物资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
故答案为：废物的资源化；不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳。
【分析】1、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
2、“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
3、生态工程以生态系统的自组织、自我调节功能为基础，遵循整体、协调、循环、自生等生态学基本原理。建立该人工生态系统的目的是实现对能量的多级利用，提高能量的利用率，减少环境污染。
13．（2022·全国乙卷）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
（1）新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
【答案】（1）逆转录酶或反转录酶
（2）特异性核苷酸序列；退火或复性
（3）曾感染新冠病毒，已康复；已感染新冠病毒，是患者
（4）获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）以病毒RNA为模板合成cDNA的过程是逆转录过程，需要逆转录酶的参与。
故答案为：逆转录酶或反转录酶。
（2）引物需要有一段已知目的基因的核苷酸序列来合成，核苷酸的特异性越高，引物的准确性越高。PCR过程中需要高温变性（DNA解旋过程）；低温复性（也可称为退火，引物结合到互补链DNA上），中温延伸（合成子链）。
故答案为：特异性核苷酸序列；退火或复性。
（3）新冠病毒的检测包括核酸检测和抗体检测，核酸检测为阳性则说明体内含有新冠病毒，阴性说明体内不含有新冠病毒，抗体检测阴性说明体内不含新冠病毒抗体，阳性说明体内含有新冠病毒抗体；若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明曾感染新冠病毒，已康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明已感染新冠病毒，是患者。
故答案为：曾感染新冠病毒，已康复；已感染新冠病毒，是患者。
（4）通过基因工程技术获得蛋白S，基因工程的基本操作流程为目的基因的获取（获取S蛋白基因）→基因表达载体的构建（构建S蛋白基因与运载体的表达载体）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定（检测受体能否产生S蛋白）。
故答案为： 获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。
【分析】1、核酸检测的原理：新冠病毒需要在宿主细胞中进行增殖，所需要的原料和能量来自于人体（宿主）细胞；该病毒的基因组是指病毒体内以核苷酸序列形式存储的遗传信息。以新型冠状病毒的RNA分子为模板，经逆（反）转录过程形成DNA；用核酸检测试剂盒检测灵敏度较高的原因是逆转录过程遵循碱基互补配对的原则，具有很强的专一性。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
3、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
14．（2021·辽宁）早期地球大气中的O2浓度很低，到了大约3.5亿年前，大气中O2浓度显著增加，CO2浓度明显下降。现在大气中的CO2浓度约390μmol·mol-1，是限制植物光合作用速率的重要因素。核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一种催化CO2固定的酶，在低浓度CO2条件下，催化效率低。有些植物在进化过程中形成了CO2浓缩机制，极大地提高了Rubisco所在局部空间位置的CO2浓度，促进了CO2的固定。回答下列问题：
（1）真核细胞叶绿体中，在Rubisco的催化下，CO2被固定形成 ，进而被还原生成糖类，此过程发生在 中。
（2）海水中的无机碳主要以CO2和HCO3-两种形式存在，水体中CO2浓度低、扩散速度慢，有些藻类具有图1所示的无机碳浓缩过程，图中HCO3-浓度最高的场所是 （填“细胞外”或“细胞质基质”或“叶绿体”），可为图示过程提供ATP的生理过程有 。
（3）某些植物还有另一种CO2浓缩机制，部分过程见图2。在叶肉细胞中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）可将HCO3-转化为有机物，该有机物经过一系列的变化，最终进入相邻的维管束鞘细胞释放CO2，提高了Rubisco附近的CO2浓度。
①由这种CO2浓缩机制可以推测，PEPC与无机碳的亲和力 （填“高于”或“低于”或“等于”）Rubisco。
②图2所示的物质中，可由光合作用光反应提供的是 。图中由Pyr转变为PEP的过程属于 （填“吸能反应”或“放能反应”）。
③若要通过实验验证某植物在上述CO2浓缩机制中碳的转变过程及相应场所，可以使用 技术。
（4）通过转基因技术或蛋白质工程技术，可能进一步提高植物光合作用的效率，以下研究思路合理的有__________。
A．改造植物的HCO3-转运蛋白基因，增强HCO3-的运输能力
B．改造植物的PEPC基因，抑制OAA的合成
C．改造植物的Rubisco基因，增强CO2固定能力
D．将CO2浓缩机制相关基因转入不具备此机制的植物
【答案】（1）三碳化合物；叶绿体基质
（2）叶绿体；呼吸作用和光合作用
（3）高于；NADPH和ATP；吸能；同位素示踪
（4）A；C
【知识点】光合作用的过程和意义；基因工程的应用
【解析】【解答】（1）真核细胞叶绿体中，在Rubisco的催化下，CO2被固定形成三碳化合物，进而被还原生成糖类，此过程发生在叶绿体基质中。
故答案为： 三碳化合物； 叶绿体基质 。
（2）由图可知， HCO3- 的运输需要消耗ATP， HCO3- 的运输是主动运输方式，逆浓度运输，则HCO3- 浓度最高的场所是叶绿体。细胞质中的ATP由呼吸作用提供，叶绿体中的ATP由光合作用提供。
故答案为： 叶绿体 ； 呼吸作用和光合作用 。
（3）①由题意可知，PEPC参与催化 HCO3- +PEP过程，即PEPC与无机碳的亲和力高于Rubisco。
②由图可知，光合作用光反应提供ATP和NADPH，由Pyr转变为PEP的过程消耗ATP，是吸能反应。
③验证某植物在上述CO2浓缩机制中碳的转变过程及相应场所，可以使用同位素示踪技术。
故答案为： 高于 ；NADPH和ATP；吸能 ； 同位素示踪 。
（4）A、由题意可知，HCO3-的运输能力增强，可以提高植物光合作用的效率，A正确；
B、由题意可知，抑制OAA的合成，会导致进入卡尔文循环的CO2减少，降低植物光合作用的效率，B错误；
C、 Rubisco是一种催化CO2固定的酶，改造植物的Rubisco基因，CO2固定能力增强，可以提高植物光合作用的效率，C正确；
D、不具备此机制的植转入物CO2浓缩机制相关基因，不一定提高植物光合作用的效率，D错误。
故答案为：AC。
【分析】光合作用的反应阶段：
①光反应阶段：场所是类囊体薄膜
a．水的光解：2H2O 4[H]+O2
b．ATP的生成：ADP+Pi ATP
②暗反应阶段：场所是叶绿体基质
a．CO2的固定：CO2+C5 2C3
b．C3的还原：2C3 （CH2O）+C5+H2O
光反应与暗反应的联系：光反应为暗反应提供[H]和ATP，暗反应为光反应提供ADP、Pi和NADP+。
15．（2021·辽宁）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的pHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】（1）逆转录
（2）EcoRI；PvitⅡ；T4DNA连接酶
（3）感受态
（4）3
（5）G2/M
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由RNA获得CDNA的过程是逆转录过程。
故答案为： 逆转录
（2）目的基因应导入启动子和终止子之间，由图可知，两者之间由三种限制酶切点，由于KpnI在质粒上有两个酶切位点，所以选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；由于PvitⅡ切出的是平末端，所以应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
故答案为： EcoRI ； PvitⅡ ； T4DNA连接酶 。
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
故答案为： 感受态 。
（4）重组质粒被酶切割之后，应该产生两个片段，一个是目的基因片段 大小为0.9kb（1kb=1000碱基对） ，另一个是质粒片段，对应电泳图应是菌落3。
故答案为：3.
（5）由图可知，处理之后G1期和S期细胞数量减少，G2/M期细胞数量增多，即细胞可以进入G2期，G2期的细胞不能完成分裂进入下一个G1期，即PHB2蛋白作用于G2/M期。
故答案为： G2/M 。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。
③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
16．（2021·山东）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
【答案】（1）SalI；EcoRI；6
（2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
（3）引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上；根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由提意可知，为扩增后的产物定向插入载体蛋白基因表达，在F1~F7末端需要添加序列，增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunI识别序列端结合，扩增后的产物才能定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。定向插入时引物末端两端添加限制酶的识别序列，被限制酶识别并切割后，产生的黏性末端不能相同，分析图中各种酶切酶识别序列，可知在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶EcoRI和限制酶是SalI；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRI的识别位点，为保证荧光蛋白基因的完整，不能使用限制酶EcoRI，而使用限制酶MunI和XhoI切割。扩增完基因，切割完载体之后，在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；需要使用Taq酶催化扩增产物来合成更多的产物，即从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Tag酶、限制酶EcoRI、限制酶Sall、限制酶MunI、限制酶XhoI、DNA连接酶；
故答案为：SalI ； EcoRI ； 6 。
（2）受体细胞载入的载体中已经除去BCL11A基因，不会抑制荧光蛋白基因的表达；RNA聚合酶与启动子结合完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
故答案为：F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，诱导BCL11A基因表达产生BCL11A蛋白，该蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，荧光蛋白基因被抑制；含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，表明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，表明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，由此推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
故答案为：引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 ； 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 。
【分析】 基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
17．（2021·天津）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑 和 。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】（1）细胞质基质
（2）包含BamHI的识别序列；将GTG改为ATG；原核生物复制原点；不能；缺失尿嘧啶
（3）B
【知识点】无氧呼吸的过程和意义；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）酵母细胞无氧呼吸的场所为细胞质基质。
故答案为：细胞质基质。
（2）①为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应包含BamHl的识别序列。
②PCR产物和质粒连接获得重组质粒，重组质粒上需要有原核生物复制原点，才能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③利于不含尿腔啶的选择培养基筛选含重组质粒的转基因酿酒酵母。
故答案为：包含BamHI的识别序列；将GTG改为ATG；原核生物复制原点；不能；缺失尿嘧啶。
（3）A、优化发酵条件，是条件更适合乳酸菌的生存和繁殖，提高其乳酸产量，A正确；
B、启动子存在物种特异性，酵母细胞中不表达乳酸菌LDH基因自身的启动子，B错误；
C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，酵母菌则不能进行酒精发酵，只进行乳酸发酵，C正确；
D、基因突变具有不定向性，对转基因酸酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、无氧呼吸全过程：第一阶段：在细胞质的基质中，与有氧呼吸的第一阶段完全相同。即一分子的葡萄糖在酶的作用下分解成两分子的丙酮酸，过程中释放少量的[H]和少量能量。第二阶段：在细胞质的基质中，丙酮酸在不同酶的催化下，分解为酒精和二氧化碳，或者转化为乳酸。无氧呼吸第二阶段不产生能量。
2、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
18．（2021·海南）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9蛋白可切割 序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程： 。
【答案】（1）DNA连接酶
（2）感受态细胞法
（3）碱基互补配对原则；目标DNA特定的核苷酸序列
（4）DNA分子杂交技术；出现杂交带
（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）将目的基因连接到质粒上需要利用DNA连接酶进行连接。
故答案为：DNA连接酶。
（2）由图可知，过程②为将目的基因导入受体细胞的过程，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是感受态细胞法。
故答案为： 感受态细胞法。
（3）复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对原则。二者结合后，Cas9蛋白可切割目标DNA特定的核苷酸序列序列。
故答案为：碱基互补配对原则；目标DNA特定的核苷酸序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是DNA分子杂交技术，成功的依据是出现杂交带。
故答案为：DNA分子杂交技术；出现杂交带。
（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
故答案为： CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
19．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与甘蔗醋制作有关的问题：
①为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，震荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
②优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下震荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。
③制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。
（2）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
①由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
②为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
③为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
【答案】（1）冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法
（2）富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞
【知识点】微生物发酵及其应用；果酒果醋的制作；基因工程的应用；动物体细胞克隆；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】 (1)①培养基需经高压蒸汽灭菌及冷却后使用；涂布菌种可采用玻璃刮刀；菌种产生的透明圈大，说明其可产生高效分解甘蔗的酶从而产生大量的醋酸，同CaCO3反应形成透明圈；临时保持菌种需再固体斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存。
②醋酸菌可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，所以当乙醇含量最低时，发酵结束。随着发酵的进行菌种生活的环境会变为乙醇高、酸度高的环境，所以优良产酸菌种还需具有耐酒精度高、耐酸高的特点。
③发酵过程的关键是防止杂菌污染，所以需要对固定介质进行灭菌，甘蔗渣具有较强的吸附性，可才有吸附法进行固定。
故答案为：冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法。
（2）①人类产生的污水中含有大量的无机盐，直接排入河流、湖泊会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华。
②转基因技术的关键是构建基因表达载体，即用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成重组DNA分子，质粒应具有一个或多个限制性核酸内切酶的识别位点、标记基因如抗生素抗性基因等、具有复制原点等特点；将目的基因导入动物细胞，常采用显微注射法。
③分散细胞，可以使用胰蛋白酶处理，破坏细胞之间的连接蛋白，并对分散的细胞进行原代培养以扩大细胞数目；培养瓶中添加成纤维细胞作为饲养层细胞，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
故答案为：富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞。
【分析】（1）微生物发酵过程：
①选育菌种：可采用自然界选种、诱变育种、基因工程育种等。
②配制培养基：根据微生物的营养需要提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
③灭菌：培养基和发酵设备均需严格灭菌。利用单一菌种发酵。
④扩大培养和接种：大规模生产中需要使菌种达到一定数量；将菌种接种到培养基上，接种时防止杂菌污染。
⑤发酵罐内发酵：要随时检测发酵进程，要及时满足营养需要，还要严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件。
⑥分离、提纯产物：如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法；如果产品是代谢产物，可采用提取、分离和纯化措施来获得产品。
（2）醋酸菌为异养好养型细菌，在氧气充足的情况下，可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
（3）动物细胞培养需要将细胞分散成单个细胞，故需要添加胰蛋白酶或胶原蛋白酶，进行原代培养（1-20代）。
（4）将目的基因导入受体细胞的常用方法：
生物
种类 植物 动物 微生物
常用
方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
主要
受体
细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化
过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
（5）动物细胞培养时注意的几个问题：
①进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。分散细胞时不能用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.8。胰蛋白酶作用的适宜pH为7.2-7.8，而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4。
②原代培养与传代培养的区别
a.原代培养：细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养。
b.传代培养：原代培养的细胞生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致接触抑制，影响细胞的生长，因此需要重新用胰蛋白酶等处理，进行分瓶扩大培养，即传代培养。
（6）饲养层细胞一般是胚胎成纤维细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。
20．（2021·湖南）[选修3：现代生物科技专题]
M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是 ，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是 。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是 。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为 （答出两点即可），功能上具有 。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路 。
【答案】（1）限制性核酸内切酶（限制酶）；磷酸二酯键
（2）清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
（3）动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难；细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答）；发育的全能性
（4）B；用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活
【知识点】动物细胞培养技术；动物细胞核移植技术；基因工程的基本工具简介
【解析】【解答】（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），所以切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，细胞全能性高，动物体细胞分化程度高，细胞全能性低，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活。
故答案为：（1） 限制性核酸内切酶（限制酶） ； 磷酸二酯键 （2） 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害 （3） 动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 ； 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答） ； 发育的全能性 （4） B ； 用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活
【分析】1.限制性核酸内切酶存在于原核生物中，识别特定的核苷酸序列，并在特定位点将磷酸二酯键断开。
2.动物细胞培养条件：（1）无菌、无毒环境，培养液和培养用具进行无菌处理，培养过程加抗生素，定期更换培养液，清除代谢产物。（2）营养，除糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素之外还需加入血清、血浆等天然成分。（3）适宜的温度（4）气体环境。
3.核移植技术的原理是动物细胞核具有全能性。核移植分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。
4.细胞分化程度从高到低依次为：体细胞>生殖细胞>受精卵。一般来说，细胞分化程度越高，全能性越难以表达，细胞分化程度越低，全能性就越高。
21．（2021·河北）[选修3：现代生物科技专题]
采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为 。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是 。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的 （填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 （写出两点即可）。
【答案】（1）基因组文库
（2）限制酶和DNA连接酶；便于目的基因的检测和鉴定
（3）农杆菌转化法；避免目的基因在自然界中的扩散
（4）耐性；茎叶
（5）YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水；杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【知识点】基因工程的应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
故答案为：基因组文库。
（2）构建基因表达载体，需要用限制酶切割目的基因DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
故答案为：限制酶和DNA连接酶；便于目的基因的检测和鉴定。
（3）印度芥菜是双子叶植物，农杆菌容易侵染双子叶植物，将其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，所以将目的基因导入双子叶植物印度芥菜采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
故答案为：农杆菌转化法；避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）据图1可知，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均比野生型高，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2可知，转基因植株的根、茎、叶中Cd含量高于野生型，但转基因植物叶和茎的Cd含量增加的更加明显，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
故答案为：耐性；茎、叶。
（5）由于YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，推测转基因植物可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水。相较于草本植物，乔木具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用。
故答案为：YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水；
杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用。
【分析】 （1）基因文库是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。基因组文库含有一种生物全部基因的基因文库。部分基因分库(cDNA文库)含有一种生物部分基因的基因文库。
（2）基因表达载体的构建：用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（常用的标记基因是抗生素基因。可以用四环素、氨芐青霉素等抗性基因，也可以用荧光蛋白基因或产物能显色的基因。）
（3）将目的基因导入植物细胞可用农杆菌转化法、花粉管通道法和基因枪法。农杆菌一般可以感染双子叶植物和裸子植物的受伤部位，将T-DNA整合到植物的染色体上，随着植物细胞的细胞染色体复制，T-DNA也随着复制，从而实现外源基因稳定性的表达。
22．（2021·广东）[选修3：现代生物科技专题]
非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有 。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是 。在分子水平上，可以通过改变 ，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】（1）基因文库中获取、人工合成法
（2）盐析法、酶解法或高温变性
（3）感受态；抗原-抗体杂交技术
（4）有的酶失活而使反应中断；基因的碱基序列
【知识点】基因工程的应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由题意可得，研究人员采用了PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因，此外获得酶基因（目的基因）的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）DNA通常会和蛋白质结合在一起。高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同，从而去除蛋白质，方法较多样，例如盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）将目的基因导入到细菌体内通常采用感受态细胞法。研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用Ga2+处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。因为抗原和抗体结合具有特异性，所以在基因工程中，酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的特性之一是作用条件较温和，若这些酶条件不同，条件不适宜，则可能导致有的酶活性降低甚至失活而使反应中断。在分子水平上，通过蛋白质工程进行对酶加以改造和修饰。蛋白质工程设计思路是可以通过改变合成蛋白质的基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【分析】（1）目的基因的获取：
（2）将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
（3）目的基因的检测与鉴定
①利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。
②利用分子杂交技术检测目的基因的转录。
③利用抗原—抗体杂交检测目的基因的翻译。
④利用个体生物学水平的检测鉴定重组性状的表达。
23．（2021·全国甲）[生物——选修3：现代生物科技专题]
PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是 ，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】（1）④②③①
（2）Taq酶（热稳定DNA聚合酶）；延伸；Taq酶从引物起始进行互补链的合成
（3）两条单链DNA
（4）一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】 （1）进行PCR条件：模板，引物（进行PCR操作的前提），热稳定DNA聚合酶。PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，需要先获取需要复制的DNA片段，进行引物设计。所以正确的操作顺序应该是④②③① 。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，由于仿照细胞内DNA的复制环境，需要酶的催化。但是体外合成DNA需要较高温度，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶）。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
（3）引物可以从某个起点开始体外合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接。引物可以DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条解开的单链DNA特异性结合，称为DNA子链合成的起点。
（4）PCR技术的中文名称是多聚酶链式反应技术，是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【分析】PCR扩增技术中文名称为聚合酶链式反应，关于PCR技术扩增目的基因简介：
1、原理：DNA双链可以进行半保留复制；
2、过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成；
3、条件：模板，引物，热稳定高考生物五年真题汇编28——基因工程
一、单选题
1．（2021·湖北）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
2．（2021·湖北）限制性内切酶EcoRI识别并切割 双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6 B．250 C．4000 D．24000
3．（2021·江苏）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ ）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
4．（2021·辽宁）下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A．灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B．用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C．基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D．经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
5．（2021·辽宁）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（ ）
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
6．（2021·山东）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A．“引子”的彻底水解产物有两种
B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
（2021·天津）阅读下列材料，完成下面小题。
为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：
①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基同时转入棉花。
②田间策略：主要是为棉铃虫提供底护所。例如我国新疆棉区，在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供专门的庇护所：长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。
③国家宏观调控政策：如实施分区种植管理等。
7．关于上述基因策略，下列叙述错误的是（ ）
A．提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度
B．转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律
C．若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因
D．转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
8．关于上述田间策略，下列叙述错误的是（ ）
A．转基因棉田周围种植非抗虫棉，可降低棉铃虫抗性基因的突变率
B．混作提高抗虫棉的抗虫持久性，体现了物种多样性的重要价值
C．为棉铃虫提供底护所，可使敏感棉铃虫在种群中维持一定比例
D．为棉铃虫提供庇护所，可使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
9．（2021·北京）社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是（ ）
A．长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B．转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C．消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒
D．如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的
10．（2020·北京）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④
二、综合题
11．（2022·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
Ⅰ.为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（2）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
Ⅳ.在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
Ⅴ.为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
Ⅵ.植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
12．（2022·广东）“绿水透迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ，终止子的作用是 。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
13．（2022·全国乙卷）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
（1）新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
14．（2021·辽宁）早期地球大气中的O2浓度很低，到了大约3.5亿年前，大气中O2浓度显著增加，CO2浓度明显下降。现在大气中的CO2浓度约390μmol·mol-1，是限制植物光合作用速率的重要因素。核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一种催化CO2固定的酶，在低浓度CO2条件下，催化效率低。有些植物在进化过程中形成了CO2浓缩机制，极大地提高了Rubisco所在局部空间位置的CO2浓度，促进了CO2的固定。回答下列问题：
（1）真核细胞叶绿体中，在Rubisco的催化下，CO2被固定形成 ，进而被还原生成糖类，此过程发生在 中。
（2）海水中的无机碳主要以CO2和HCO3-两种形式存在，水体中CO2浓度低、扩散速度慢，有些藻类具有图1所示的无机碳浓缩过程，图中HCO3-浓度最高的场所是 （填“细胞外”或“细胞质基质”或“叶绿体”），可为图示过程提供ATP的生理过程有 。
（3）某些植物还有另一种CO2浓缩机制，部分过程见图2。在叶肉细胞中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）可将HCO3-转化为有机物，该有机物经过一系列的变化，最终进入相邻的维管束鞘细胞释放CO2，提高了Rubisco附近的CO2浓度。
①由这种CO2浓缩机制可以推测，PEPC与无机碳的亲和力 （填“高于”或“低于”或“等于”）Rubisco。
②图2所示的物质中，可由光合作用光反应提供的是 。图中由Pyr转变为PEP的过程属于 （填“吸能反应”或“放能反应”）。
③若要通过实验验证某植物在上述CO2浓缩机制中碳的转变过程及相应场所，可以使用 技术。
（4）通过转基因技术或蛋白质工程技术，可能进一步提高植物光合作用的效率，以下研究思路合理的有__________。
A．改造植物的HCO3-转运蛋白基因，增强HCO3-的运输能力
B．改造植物的PEPC基因，抑制OAA的合成
C．改造植物的Rubisco基因，增强CO2固定能力
D．将CO2浓缩机制相关基因转入不具备此机制的植物
15．（2021·辽宁）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的pHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
16．（2021·山东）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
17．（2021·天津）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑 和 。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
18．（2021·海南）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9蛋白可切割 序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程： 。
19．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）回答与甘蔗醋制作有关的问题：
①为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，震荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
②优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下震荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。
③制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。
（2）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
①由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
②为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
③为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
20．（2021·湖南）[选修3：现代生物科技专题]
M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是 ，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是 。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是 。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为 （答出两点即可），功能上具有 。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路 。
21．（2021·河北）[选修3：现代生物科技专题]
采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为 。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是 。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的 （填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 （写出两点即可）。
22．（2021·广东）[选修3：现代生物科技专题]
非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有 。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是 。在分子水平上，可以通过改变 ，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
23．（2021·全国甲）[生物——选修3：现代生物科技专题]
PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是 ，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
24．（2021·全国乙卷）[生物选修3：现代生物科技专题]
用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示，
回答下列问题
（1）常用的 DNA连接酶有E.coli DNA连接和T4 DNA连接酶，上图中 酶切割后的 DNA片段可以用E .coli DNA连接酶连接，上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒 DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
25．（2020·海南）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。
回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是 。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计 ，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为 ；出现阴性反应者，胚胎为 。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是 ，检测的基本思路是 。
三、实验探究题
26．（2021·福建）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
（1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用 酶将载体P切开，再用 （填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
（3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是 。
27．（2021·江苏）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
（1）目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
（2）重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在 。
（3）融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
28．（2021·北京）近年来发现海藻糖-6-磷酸（T6P）是一种信号分子，在植物生长发育过程中起重要调节作用。研究者以豌豆为材料研究了T6P在种子发育过程中的作用。
（1）豌豆叶肉细胞通过光合作用在 中合成三碳糖，在细胞质基质中转化为蔗糖后运输到发育的种子中转化为淀粉贮存。
（2）细胞内T6P的合成与转化途径如下：
底物 T6P 海藻糖
将P酶基因与启动子U（启动与之连接的基因仅在种子中表达）连接，获得U-P基因，导入野生型豌豆中获得U-P纯合转基因植株，预期U-P植株种子中T6P含量比野生型植株 ，检测结果证实了预期，同时发现U-P植株种子中淀粉含量降低，表现为皱粒。用同样方法获得U-S纯合转基因植株，检测发现植株种子中淀粉含量增加。
（3）本实验使用的启动子U可以排除由于目的基因 对种子发育产生的间接影响。
（4）在进一步探讨T6P对种子发育的调控机制时，发现U-P植株种子中一种生长素合成酶基因R的转录降低，U-S植株种子中R基因转录升高。已知R基因功能缺失突变体r的种子皱缩，淀粉含量下降。据此提出假说：T6P通过促进R基因的表达促进种子中淀粉的积累。请从①~⑤选择合适的基因与豌豆植株，进行转基因实验，为上述假说提供两个新的证据。写出相应组合并预期实验结果。
①U-R基因 ②U-S基因 ③野生型植株④U-P植株 ⑤突变体r植株
29．（2021·北京）玉米是我国重要的农作物，研究种子发育的机理对培育高产优质的玉米新品种具有重要作用。
（1）玉米果穗上的每一个籽粒都是受精后发育而来。我国科学家发现了甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4。籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的 定律。上述果穗上的正常籽粒均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株所占比例约为 。
（2）为阐明籽粒干瘪性状的遗传基础，研究者克隆出候选基因A/a。将A基因导入到甲品系中，获得了转入单个A基因的转基因玉米。假定转入的A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，请从下表中选择一种实验方案及对应的预期结果以证实“A基因突变是导致籽粒干瘪的原因” 。
实验方案 预期结果
I.转基因玉米×野生型玉米 II.转基因玉米×甲品系 III.转基因玉米自交 IV.野生型玉米×甲品系 ①正常籽粒：干瘪籽粒≈1：1 ②正常籽粒：干瘪籽粒≈3：1 ③正常籽粒：干瘪籽粒≈7：1 ④正常籽粒：干瘪籽粒≈15：1
（3）现已确认A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA（见图1），使A基因功能丧失。甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株的基因型为 。
（4）为确定A基因在玉米染色体上的位置，借助位置已知的M/m基因进行分析。用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P与基因型为MM的甲品系杂交得F1，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒（F2）胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，如图2所示。
统计干瘪籽粒（F2）的数量，发现类型1最多、类型2较少、类型3极少。请解释类型3数量极少的原因。
30．（2021·全国甲）用一段由放射性同位素标记的DNA片段可以确定基因在染色体上的位置。某研究人员使用放射性同位素32P标记的脱氧腺苷三磷酸(dATP，dA-Pα~Pβ~Pγ，)等材料制备了DNA片段甲（单链），对W基因在染色体上的位置进行了研究，实验流程的示意图如下。
回答下列问题：
（1）该研究人员在制备32p标记的DNA片段甲时，所用dATP的α位磷酸基团中的磷必须是32p，原因是 。
（2）该研究人员以细胞为材料制备了染色体样品，在混合操作之前去除了样品中的RNA分子，去除RNA分子的目的是 。
（3）为了使片段甲能够通过碱基互补配对与染色体样品中的W基因结合，需要通过某种处理使样品中的染色体DNA 。
（4）该研究人员在完成上述实验的基础上，又对动物细胞内某基因的mRNA进行了检测，在实验过程中用某种酶去除了样品中的DNA，这种酶是 。
31．（2021·浙江）回答下列（1）、（2）小题：
（1）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。
Ⅰ.从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或 法，两种方法均能在固体培养基上形成 。对分离的菌株进行诱变、 和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。
Ⅱ.固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除 ；③检验固定化菌株的 。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是 。
Ⅲ.对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是 。
（2）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。
Ⅰ.为保护三叶青的 多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用 技术，实现了三叶青的林下种植。
Ⅱ.依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成 和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成 ，再分化形成毛状根。
Ⅲ.剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次 培养，培养基中添加抗生素的主要目的是 。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的 和温度，调节培养基成分中的 ，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
答案解析部分
1．【答案】D
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】PCR过程中，非特异性产物增加的原因是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确，A、B、C错误。
故答案为：D。
【分析】PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
2．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】由题意可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，DNA分子由A、T、G、C种脱氧核苷酸排列形成，则出现该固定序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，即得到DNA片段的平均长度理论约为4000。C正确，A、B、D错误。
故答案为：C。
【分析】限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3．【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、农杆菌转化法的核心是农杆菌的T-DNA能插入受体细胞的染色体上，故两个质粒都必须带有T-DNA序列 ，A正确；
B和C、农杆菌转化法的转化频率是很高的，共转化后， 标记基因和目的基因必须转到不同染色体上才能遵循基因自由组合定律，得到无筛选标记转基因植株，B、C正确；
D、T-DNA是比较短小的基因小片段，T-DNA插入受体细胞的染色体上属于基因重组的范畴，D错误；
故答案为：D
【分析】（1） 农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2） 农杆菌转化法步骤：目的基因插入Ti质粒的T DNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
（3）染色体结构变异的类型： 缺失、重复、易位、倒位
。
4．【答案】C
【知识点】细胞融合的方法；单克隆抗体的制备过程；基因工程的基本工具（详细）；免疫学的应用
【解析】【解答】A、诱导动物细胞融合可以利用灭火的病毒，A正确；
B、制备单克隆抗体需先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，B正确；
C、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，C错误；
D、经灭活或者减毒的病毒可以作为疫苗用于免疫预防，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、诱导动物细胞融合的方法有物理法（电激等）、化学法（聚乙二醇PEG）、生物法（灭活的病毒）等。
2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
3、将目的基因导入受体细胞∶（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
4、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗有三种类型：（1）灭活的微生物；（2）分离的微生物成分或其他产物；（3）减毒微生物。使机体产生相应的抗体和记忆细胞（主要是得到记忆细胞），使人在不发病的情况下产生抗体，获得免疫力。
5．【答案】D
【知识点】酶的相关综合；蛋白质工程
【解析】【解答】A、蛋白质的结构决定功能，N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一，A正确；
B、加入连接肽是通过蛋白质工程，蛋白质工程的实质是改造基因，B正确；
C、蛋白质的合成需要转录和翻译过程，C正确；
D、检测N1的活性应先置于高温环境在将N1与底物混合，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、酶
（1）酶是由活细胞产生的具有催化活性的有机物，其中大部分是蛋白质、少量是RNA。
（2）酶催化作用的实质：降低化学反应的活化能，在反应前后本身性质不会发生改变。
（3）酶的特性：①高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107-1013倍。②专一性：每一种酶只能催化一种或者一类化学反应。③酶的作用条件较温和：在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高；温度和pH偏高或偏低，酶的活性都会明显降低。
（4）酶的变性：过酸、过碱或温度过高，会使酶的空间结构遭到破坏，使酶永久失活；低温使酶活性明显下降，但在适宜温度下其活性可以恢复。
2、蛋白质工程的实质是：改造基因。蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列；进行基因修饰或基因合成；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成问题。因此，蛋白质工程生产合成的蛋白质是自然界中不存在的新型蛋白质分子。
6．【答案】C
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】A、引子是DNA序列，彻底水解产物为磷酸、脱氧核糖和四种碱基共6种产物，A错误；
B、真核生物DNA主要存在细胞核中，线粒体和叶绿体中也有，B错误；
C、引子是根据现代人DNA序列设计并合成，C正确；
D、双链DNA分子解旋为单链才能与引子结合，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
2、分析题意可知，“引子“是一段单链DNA序列，根据碱基互补配对的原则去探测古人类DNA中与该序列配对的碱基序列。
【答案】7．C
8．A
【知识点】基因频率的概念与变化；基因工程的应用；变异是自然选择的原材料；生物多样性的价值
【解析】【分析】1、种群密度：种群在单位面积或单位体积中的个体数就是种群密度，种群密度是种群最基本的数量特征。
2、基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合，由于自由组合定律同时也遵循分离定律，因此可以将自由组合问题转化成分离定律问题进行解决。
3、基因突变的类型：自发突变和人工诱变。基因突变的特点：①基因突变具有普遍性：生物界中普遍存在；②低频性：自然情况下突变频率很低（10-5-10-8）；③随机性：个体发育的任何时期和部位；④不定向性：突变是不定向的；⑤多害少利性：多数对生物有害。
4、生物多样性的价值：（1）直接价值：对人类有食用、药用和工业原料等使用意义，以及有旅游观赏、科学研究和文学艺术创作等非实用意义的。（2）间接价值：对生态系统起重要调节作用的价值（生态功能）。（3）潜在价值：目前人类不清楚的价值。
5、自然选择决定生物进化的方向（1）变异是不定向的，自然选择是定向的； （2）自然选择的直接对象是生物的表现型，间接对象是相关的基因型，根本对象是与变异性状相对的基因；（3）自然选择的实质：种群的基因频率发生定向改变；（4）自然选择的方向：适应自然环境；（5）变异是普遍存在的，环境仅是一个选择因素，变异在先、选择在后。
7．A、提高Bt基因表达量，抗虫蛋白含量增加，棉铃虫数量下降，种群密度降低，A正确；
B、若两种Bt基因转入同一条染色体上，则遗传不遵循自由组合定律，B正确；
C、同源染色体上相同位置控制同一性状不同形态的基因，称为等位基因，C错误；
D、棉铃虫基因突变频率低且不定向，转入多种Bt基因可以可以提高抗虫棉的抗虫持久性，D正确。
故答案为：C。
8．A、基因突变可自发发生，突变频率与环境没有直接关系，A错误；
B、混作可以提高抗性小的抗虫棉的存活，且减少棉铃虫的生存资源，提高了抗虫棉的抗虫持久性，也具有经济价值，体现了物种多样性的直接和间接价值，B正确。
C、抗虫棉田中敏感棉铃虫在种群中维持一定比例，使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存可以为棉铃虫提供底护所，C正确；
D、抗虫棉田中敏感棉铃虫在种群中维持一定比例，使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存，且由于种内斗争，使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓，D正确。
故答案为：A。
9．【答案】A
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；基因工程的应用；灭菌技术
【解析】【解答】A、高温加热破坏会维生素，造成维生素的流失和分解，A正确；
B、转基因抗虫棉产生的毒蛋白只针对棉虫，对人无毒，B错误；
C、消毒液杀死的是体表的细菌和病毒，不能清除进入人体的病毒，C错误；
D、血型遗传受基因控制，A型血和B型血的父母可能生出O型血的孩子，故血型不同也可能是亲生的，D错误。
故答案为：A
【分析】1、烹饪饮食的方法不当蔬菜、水果等食物是人体摄入维生素C的主要来源。研究发现，人们若采取以下烹饪方法，就会导致饮食中所含的维生素C大量流失：①将蔬菜先切后洗。②将蔬菜切得很碎。③用铁制的刀具切蔬菜。铁会促使蔬菜中所含的维生素C更快地发生氧化。因此，人们应尽量少用刀切菜，而应养成用手撕菜的习惯。④炖煮蔬菜的时间过长。⑤长时间地存放水果和蔬菜。维生素C易被空气中的氧气氧化，因此蔬菜、水果被存放的时间越长，其中所含的维生素C就流失得越多。
2、转基因抗虫棉产生的毒蛋白会使棉虫致死，而不对人体产生毒性，是由于人体细胞没有毒蛋白的特异性受体，并且人误食了该毒蛋白质之后经过消化系统蛋白质已经变性甚至降解，没了毒性。
3、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
4、血型分为四种，即A，B，AB，O。血型是指红细胞上所含的抗原不同而言，红细胞上只含A抗原的称A型，含有B抗原的称B型，既有A抗原又有B抗原的称为AB型，既没有A抗原也没有B抗原的称为0型。ABO血型受ABO三种基因控制，A基因控制A抗原产生，B基因控制B抗原产生，O基因控制不产生A和B两种抗原，而基因都是成对存在，控制ABO血型的基因可有六种不同组合，即AA，AO，BB，BO，AB，OO，而每个人只有其中一对。
10．【答案】B
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。
故答案为：B。
【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。
11．【答案】（1）无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合
（2）农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；植物体细胞杂交的过程及应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）Ⅰ.枯草杆菌分泌淀粉酶的最适温度为50-75℃，为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用无菌水制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，来杀死不耐热的微生物。
Ⅱ.为提高筛选效率，可将菌种筛选程与菌种的产酶性能测定一起进行：利用淀粉遇碘液变蓝的原理，用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，并且在培养基中添加KI-12，枯草杆菌合成的淀粉酶能利用淀粉，由于淀粉被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
Ⅲ.为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过诱变育种、基因工程育种或者细胞工程的方法进行菌种选育。
故答案为：无菌水；水浴；杀死不耐热微生物；分离；KI-I2；人工诱变；原生质体融合。
（2）Ⅳ.基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入到受体细胞中，植物组织培养时通常使用抗生素，抗生素可以抑制其他杂菌的生长，并且农杆菌Ti质粒上含有抗生素的抗性基因，可以对受体细胞进行筛选。但是农杆菌使用过程中需要注意当培养基中抗生素浓度过低时，没有抗性的细胞也可能存活下来，而出现假阳性，所以在进行转化之前要对抗生素的敏感性检测。
Ⅴ.转基因植物需要经过组织培养之后形成植株，组织培养过程需要经过脱分化和再分化过程，所以受体细胞需要具有较强的再生能力和和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
Ⅵ.基因工程中受体细胞的全能性越高，越易成功。植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和培养时间长短等有关。全能性越高，越易成功，在植物细胞中受精卵的全能性最高。
故答案为：农杆菌；过低；敏感性；再生；细胞核；形态特征和数量；培养时间；受精卵。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、选择培养原理：（1）利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养：不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物，无氮培养基分离自生固氮微生物；（2）利用微生物(目的菌）对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者：石油作为唯一碳源的培养基分离出能消除石油污染的微生物，尿素为唯一氮源的培养基分离分解尿素的微生物；（3）在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长：加入青霉素等抗生素分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长，加入高浓度的食盐分离耐高温的微生物；（4）利用培养条件进行的选择培养：在高温环境中培养分离耐高温的微生物，将培养基pH调至较低水平分离耐酸的微生物，在无氧环境中培养分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物。
3、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
4、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌一导入植物细胞一目的基因整合到植物细胞染色体上一目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
12．【答案】（1）引物
（2）作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止转录，使转录在需要的地方停下来
（3）二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
（4）废物的资源化；不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】（1）目的基因的获得通常利用PCR扩增技术，PCR扩增技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
故答案为：引物。
（2）基因表达载体的结构一般为标记基因、启动子、终止子、目的基因和复制原点，其中标记基因一般为抗性基因，也可以是荧光蛋白基因，用来筛选含有目的基因的受体细胞，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，调解转录起始，终止子的作用是终止转录，使转录在需要的地方停下来。
故答案为：作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止转录，使转录在需要的地方停下来。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，由图可知，在重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，推测其原因可能是二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
故答案为：二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长。
（4）由题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，是以工业废气为原料进行生产，实现了废物资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
故答案为：废物的资源化；不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳。
【分析】1、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
2、“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
3、生态工程以生态系统的自组织、自我调节功能为基础，遵循整体、协调、循环、自生等生态学基本原理。建立该人工生态系统的目的是实现对能量的多级利用，提高能量的利用率，减少环境污染。
13．【答案】（1）逆转录酶或反转录酶
（2）特异性核苷酸序列；退火或复性
（3）曾感染新冠病毒，已康复；已感染新冠病毒，是患者
（4）获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）以病毒RNA为模板合成cDNA的过程是逆转录过程，需要逆转录酶的参与。
故答案为：逆转录酶或反转录酶。
（2）引物需要有一段已知目的基因的核苷酸序列来合成，核苷酸的特异性越高，引物的准确性越高。PCR过程中需要高温变性（DNA解旋过程）；低温复性（也可称为退火，引物结合到互补链DNA上），中温延伸（合成子链）。
故答案为：特异性核苷酸序列；退火或复性。
（3）新冠病毒的检测包括核酸检测和抗体检测，核酸检测为阳性则说明体内含有新冠病毒，阴性说明体内不含有新冠病毒，抗体检测阴性说明体内不含新冠病毒抗体，阳性说明体内含有新冠病毒抗体；若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明曾感染新冠病毒，已康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明已感染新冠病毒，是患者。
故答案为：曾感染新冠病毒，已康复；已感染新冠病毒，是患者。
（4）通过基因工程技术获得蛋白S，基因工程的基本操作流程为目的基因的获取（获取S蛋白基因）→基因表达载体的构建（构建S蛋白基因与运载体的表达载体）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定（检测受体能否产生S蛋白）。
故答案为： 获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。
【分析】1、核酸检测的原理：新冠病毒需要在宿主细胞中进行增殖，所需要的原料和能量来自于人体（宿主）细胞；该病毒的基因组是指病毒体内以核苷酸序列形式存储的遗传信息。以新型冠状病毒的RNA分子为模板，经逆（反）转录过程形成DNA；用核酸检测试剂盒检测灵敏度较高的原因是逆转录过程遵循碱基互补配对的原则，具有很强的专一性。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
3、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
14．【答案】（1）三碳化合物；叶绿体基质
（2）叶绿体；呼吸作用和光合作用
（3）高于；NADPH和ATP；吸能；同位素示踪
（4）A；C
【知识点】光合作用的过程和意义；基因工程的应用
【解析】【解答】（1）真核细胞叶绿体中，在Rubisco的催化下，CO2被固定形成三碳化合物，进而被还原生成糖类，此过程发生在叶绿体基质中。
故答案为： 三碳化合物； 叶绿体基质 。
（2）由图可知， HCO3- 的运输需要消耗ATP， HCO3- 的运输是主动运输方式，逆浓度运输，则HCO3- 浓度最高的场所是叶绿体。细胞质中的ATP由呼吸作用提供，叶绿体中的ATP由光合作用提供。
故答案为： 叶绿体 ； 呼吸作用和光合作用 。
（3）①由题意可知，PEPC参与催化 HCO3- +PEP过程，即PEPC与无机碳的亲和力高于Rubisco。
②由图可知，光合作用光反应提供ATP和NADPH，由Pyr转变为PEP的过程消耗ATP，是吸能反应。
③验证某植物在上述CO2浓缩机制中碳的转变过程及相应场所，可以使用同位素示踪技术。
故答案为： 高于 ；NADPH和ATP；吸能 ； 同位素示踪 。
（4）A、由题意可知，HCO3-的运输能力增强，可以提高植物光合作用的效率，A正确；
B、由题意可知，抑制OAA的合成，会导致进入卡尔文循环的CO2减少，降低植物光合作用的效率，B错误；
C、 Rubisco是一种催化CO2固定的酶，改造植物的Rubisco基因，CO2固定能力增强，可以提高植物光合作用的效率，C正确；
D、不具备此机制的植转入物CO2浓缩机制相关基因，不一定提高植物光合作用的效率，D错误。
故答案为：AC。
【分析】光合作用的反应阶段：
①光反应阶段：场所是类囊体薄膜
a．水的光解：2H2O 4[H]+O2
b．ATP的生成：ADP+Pi ATP
②暗反应阶段：场所是叶绿体基质
a．CO2的固定：CO2+C5 2C3
b．C3的还原：2C3 （CH2O）+C5+H2O
光反应与暗反应的联系：光反应为暗反应提供[H]和ATP，暗反应为光反应提供ADP、Pi和NADP+。
15．【答案】（1）逆转录
（2）EcoRI；PvitⅡ；T4DNA连接酶
（3）感受态
（4）3
（5）G2/M
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由RNA获得CDNA的过程是逆转录过程。
故答案为： 逆转录
（2）目的基因应导入启动子和终止子之间，由图可知，两者之间由三种限制酶切点，由于KpnI在质粒上有两个酶切位点，所以选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；由于PvitⅡ切出的是平末端，所以应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
故答案为： EcoRI ； PvitⅡ ； T4DNA连接酶 。
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
故答案为： 感受态 。
（4）重组质粒被酶切割之后，应该产生两个片段，一个是目的基因片段 大小为0.9kb（1kb=1000碱基对） ，另一个是质粒片段，对应电泳图应是菌落3。
故答案为：3.
（5）由图可知，处理之后G1期和S期细胞数量减少，G2/M期细胞数量增多，即细胞可以进入G2期，G2期的细胞不能完成分裂进入下一个G1期，即PHB2蛋白作用于G2/M期。
故答案为： G2/M 。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。
③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
16．【答案】（1）SalI；EcoRI；6
（2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
（3）引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上；根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由提意可知，为扩增后的产物定向插入载体蛋白基因表达，在F1~F7末端需要添加序列，增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunI识别序列端结合，扩增后的产物才能定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。定向插入时引物末端两端添加限制酶的识别序列，被限制酶识别并切割后，产生的黏性末端不能相同，分析图中各种酶切酶识别序列，可知在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶EcoRI和限制酶是SalI；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRI的识别位点，为保证荧光蛋白基因的完整，不能使用限制酶EcoRI，而使用限制酶MunI和XhoI切割。扩增完基因，切割完载体之后，在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；需要使用Taq酶催化扩增产物来合成更多的产物，即从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Tag酶、限制酶EcoRI、限制酶Sall、限制酶MunI、限制酶XhoI、DNA连接酶；
故答案为：SalI ； EcoRI ； 6 。
（2）受体细胞载入的载体中已经除去BCL11A基因，不会抑制荧光蛋白基因的表达；RNA聚合酶与启动子结合完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
故答案为：F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，诱导BCL11A基因表达产生BCL11A蛋白，该蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，荧光蛋白基因被抑制；含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，表明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，表明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，由此推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
故答案为：引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 ； 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 。
【分析】 基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
17．【答案】（1）细胞质基质
（2）包含BamHI的识别序列；将GTG改为ATG；原核生物复制原点；不能；缺失尿嘧啶
（3）B
【知识点】无氧呼吸的过程和意义；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）酵母细胞无氧呼吸的场所为细胞质基质。
故答案为：细胞质基质。
（2）①为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应包含BamHl的识别序列。
②PCR产物和质粒连接获得重组质粒，重组质粒上需要有原核生物复制原点，才能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③利于不含尿腔啶的选择培养基筛选含重组质粒的转基因酿酒酵母。
故答案为：包含BamHI的识别序列；将GTG改为ATG；原核生物复制原点；不能；缺失尿嘧啶。
（3）A、优化发酵条件，是条件更适合乳酸菌的生存和繁殖，提高其乳酸产量，A正确；
B、启动子存在物种特异性，酵母细胞中不表达乳酸菌LDH基因自身的启动子，B错误；
C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，酵母菌则不能进行酒精发酵，只进行乳酸发酵，C正确；
D、基因突变具有不定向性，对转基因酸酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、无氧呼吸全过程：第一阶段：在细胞质的基质中，与有氧呼吸的第一阶段完全相同。即一分子的葡萄糖在酶的作用下分解成两分子的丙酮酸，过程中释放少量的[H]和少量能量。第二阶段：在细胞质的基质中，丙酮酸在不同酶的催化下，分解为酒精和二氧化碳，或者转化为乳酸。无氧呼吸第二阶段不产生能量。
2、基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
18．【答案】（1）DNA连接酶
（2）感受态细胞法
（3）碱基互补配对原则；目标DNA特定的核苷酸序列
（4）DNA分子杂交技术；出现杂交带
（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）将目的基因连接到质粒上需要利用DNA连接酶进行连接。
故答案为：DNA连接酶。
（2）由图可知，过程②为将目的基因导入受体细胞的过程，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是感受态细胞法。
故答案为： 感受态细胞法。
（3）复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对原则。二者结合后，Cas9蛋白可切割目标DNA特定的核苷酸序列序列。
故答案为：碱基互补配对原则；目标DNA特定的核苷酸序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是DNA分子杂交技术，成功的依据是出现杂交带。
故答案为：DNA分子杂交技术；出现杂交带。
（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
故答案为： CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
19．【答案】（1）冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法
（2）富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞
【知识点】微生物发酵及其应用；果酒果醋的制作；基因工程的应用；动物体细胞克隆；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】 (1)①培养基需经高压蒸汽灭菌及冷却后使用；涂布菌种可采用玻璃刮刀；菌种产生的透明圈大，说明其可产生高效分解甘蔗的酶从而产生大量的醋酸，同CaCO3反应形成透明圈；临时保持菌种需再固体斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存。
②醋酸菌可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，所以当乙醇含量最低时，发酵结束。随着发酵的进行菌种生活的环境会变为乙醇高、酸度高的环境，所以优良产酸菌种还需具有耐酒精度高、耐酸高的特点。
③发酵过程的关键是防止杂菌污染，所以需要对固定介质进行灭菌，甘蔗渣具有较强的吸附性，可才有吸附法进行固定。
故答案为：冷却；玻璃刮刀；较大透明圈；斜面；乙醇；耐酒精度高、耐酸高；灭菌；吸附法。
（2）①人类产生的污水中含有大量的无机盐，直接排入河流、湖泊会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华。
②转基因技术的关键是构建基因表达载体，即用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成重组DNA分子，质粒应具有一个或多个限制性核酸内切酶的识别位点、标记基因如抗生素抗性基因等、具有复制原点等特点；将目的基因导入动物细胞，常采用显微注射法。
③分散细胞，可以使用胰蛋白酶处理，破坏细胞之间的连接蛋白，并对分散的细胞进行原代培养以扩大细胞数目；培养瓶中添加成纤维细胞作为饲养层细胞，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
故答案为：富营养化；重组DNA分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射；胰蛋白酶；原代；饲养层细胞。
【分析】（1）微生物发酵过程：
①选育菌种：可采用自然界选种、诱变育种、基因工程育种等。
②配制培养基：根据微生物的营养需要提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
③灭菌：培养基和发酵设备均需严格灭菌。利用单一菌种发酵。
④扩大培养和接种：大规模生产中需要使菌种达到一定数量；将菌种接种到培养基上，接种时防止杂菌污染。
⑤发酵罐内发酵：要随时检测发酵进程，要及时满足营养需要，还要严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件。
⑥分离、提纯产物：如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法；如果产品是代谢产物，可采用提取、分离和纯化措施来获得产品。
（2）醋酸菌为异养好养型细菌，在氧气充足的情况下，可以将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
（3）动物细胞培养需要将细胞分散成单个细胞，故需要添加胰蛋白酶或胶原蛋白酶，进行原代培养（1-20代）。
（4）将目的基因导入受体细胞的常用方法：
生物
种类 植物 动物 微生物
常用
方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
主要
受体
细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化
过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
（5）动物细胞培养时注意的几个问题：
①进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。分散细胞时不能用胃蛋白酶
