专题2 微生物的培养与应用
【高考新动向】
1、微生物的分离和培养
2、培养基对微生物的选择作用
3、某种微生物数量的测定
4、利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用
【考纲全景透析】
一、微生物的分离和培养
1、微生物的营养：碳源、氮源、水、无机盐和生长因子。
1、培养基
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质
（2）成分：一般都含有水、碳源、氮源无机盐，还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的 要求。
（3）分类：固体培养基：含凝固剂，如琼脂
液体培养基：不含凝固剂
2、无菌技术
（1）含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法
（2）关键：防止外来杂菌的入侵
（3）方法：消毒：煮沸消毒法，化学药剂消毒法，紫外线消毒法
灭菌：灼烧灭菌，干热灭菌，高压蒸汽灭菌
区别消毒和灭菌
3、纯化大肠杆菌以及菌种的保藏
（1）制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
（2）纯化大肠杆菌
①原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个细胞繁殖而来的子细胞群体。
②方法：平板划线法、稀释涂布平板法。
（3）菌种的保藏
①短期保存：将菌种接种到试管的固体斜面培养基上4℃保存，菌种易被污染或产生变异。
②长期保存：－20℃甘油管在冷冻箱中保藏。
二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、分离的原理
（1）土壤中的细菌之所以能够分解尿素，是因为它们体内能合成脲酶。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。
（2）实验室中微生物的筛选应用的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。[ ]
2、统计菌落数目的方法：
稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
3、细菌分离与计数的实验流程
土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数
三、分解纤维素的微生物的分离
1、纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。作用：
2、纤维素分解菌的筛选方法及原理
（1）方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
（2）原理：
①刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
②纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3、土壤中纤维素分解菌的筛选
【热点难点全析】
一、培养基的种类
划分标准 培养及种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物分离、鉴定等
用途 选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物（如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；用尿素为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌）
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落成黑色）
二、细菌的分离与计数
1.筛选菌株
(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)菌株筛选原理的比较
2.统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：用计数板计数。
③缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
3.设置对照
(1)目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
(2)方法：①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。
②证明选择培养基的选择作用，用基础培养基接种等量同种菌液作对照。专题3 植物的组织培养技术
【高考新动向】
植物的组织培养
【考纲全景透析】
一、植物组织培养的原理与基本过程
1、原理：植物细胞全能性。
2、
3、基本过程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织胚状体新植物体
二、菊花的组织培养
1、影响植物组织培养的因素
（1）材料的选取：一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。
（2）营养供应：常用的培养基是MS培养基，一般需要添加生长素和细胞分裂素两种植物激素。
2、实验操作过程
（1）制备MS固体培养基：配制各种母液，配制培养基，灭菌
（2）外植体消毒：先用70%的酒精消毒，然后无菌水清洗，再用0.1%的氯化汞溶液消毒，再用无菌水清洗
（3）接种：始终在酒精灯火焰旁进行，对接种工具要用火焰灼烧灭菌。将菊花茎段插入培养基中时不要倒插。
（4）培养与移栽：在18℃~22℃的无菌箱中培养，得到试管苗后进行移栽。
三、月季的花药培养
（1）被子植物花粉的发育过程：花粉母细胞（小孢子母细胞）→四分体时期→单核期→双核期→花粉粒。
（2）产生花粉植株的两种途径
（3）影响花药培养的因素：主要因素是材料的选择和培养基的组成。一般月季的花药培养选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。
（4）培养过程及成功的关键
材料的选取：挑选完全未开放的花蕾，确定花粉发育时期最常用发放是醋酸洋红法
接种：灭菌后的花蕾，在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。剥离花药时尽量不要损伤花药。
培养：温度控制在25℃左右，幼小植株形成后才需要光照。如果花药开裂释放出胚状体，就要在花药开裂后尽快将幼小植株分开
【热点难点全析】
一、植物组织培养技术
1、植物组织培养过程比较
[
2、菊花茎与月季花药组织培养的比较选修1
专题1 传统发酵技术的应用
【高考新动向】
1、运用发酵技术加工食品的基本方法
2、测定食品加工中可能产生的有害物质
【考纲全景透析】
一、与传统发酵有关的几类微生物的比较
酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
生活方式 异养兼性厌氧 异养需氧 异养需氧 异养厌氧
适宜温度 20℃左右 30℃~35℃ 15℃~18℃[ ] 室温
主要用途 酿酒、发酵 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
二、果酒和果醋的制作
1、果酒和果醋的制作原理及发酵技术比较
果酒制作 果醋制作
制作原理 利用酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵 利用醋酸菌在氧气、糖源充足时，将糖分解成醋酸；当缺少糖源时，将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸
反应式 [21世纪教育网]
最适发酵温度 18℃~25℃ 30℃~35℃
对氧的需求 前期需氧，后期不需氧 需充足氧
Ph 酸性环境（3.3-3. 5） 酸性环境（5.4-6.3）
发酵时间 10d-12d 7d-8d
2、果酒和果醋的制作流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵
↓ ↓
果酒 果醋
三、腐乳的制作
1、原理
（1）菌种：在多种微生物的协同作用下进行，期中起主要作用的是毛霉，它是一种丝状真菌，新陈代谢类型是异养需要型
（2）菌种作用特点[ ]
2、流程
让豆腐上长出毛菌→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
3、影响腐乳品质的条件
（1）卤汤配制：卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。加酒既抑制微生物的生长，又能使腐乳具有独特的香味。香辛料不但能调制腐乳的风味，还具有防腐杀菌作用
（2）材料用量
控制盐的用量，盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。
酒的含量一般控制在12%左右
四、制作泡菜并检测亚硝酸盐的含量
1、泡菜制作
（1）所需菌种
乳酸菌：异养厌氧型，
反应原理：
（2）操作关键
泡菜坛的选择：火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好
腌制的条件：控制腌制的时间、温度和食盐的用量。防止杂菌污染，严格密封
2、测定亚硝酸盐的含量
（1）亚硝酸盐危害：当摄入总量较多时，可引起中毒或死亡，在特定条件（适宜温度、pH和微生物作用）下，亚硝酸盐可以转变成致癌物——亚硝胺
【热点难点全析】
一、泡菜的制作及亚硝酸盐含量的测定
1.泡菜制作过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化情况分析
发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
发酵初期 少（有氧气，乳酸菌活动受到抑制） 少 增加
发酵中期 最多（乳酸抑制其他菌活动） 积累增多，pH下降 下降
发酵后期 减少 继续增多，pH继续下降 下降至相对稳定
2.制作泡菜并检测亚硝酸盐含量的流程
二、制作过程中的注意事项
(1)果酒、果醋制作的注意事项
①材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先冲洗后除去枝梗，以避免去除枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
②防止发酵液被污染需要从发酵制作的过程进行全面的考虑，因为操作的每一步都可能混入杂菌。为避免杂菌污染，榨汁机要洗净并晾干；发酵装置要洗净并用70%的酒精消毒；封闭充气口；若用简易的发酵装置，每隔一定时间排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
③控制好发酵时间与温度、果醋制作时适时充气。
(2)腐乳制作注意事项
①影响腐乳品质的条件：水、盐、酒、温度、发酵时间等。
a．水的控制：含水量约70%，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。
b．盐的控制：盐浓度过高，会影响腐乳的口味，浓度过低，豆腐易腐败变质。
c．酒的控制：酒精含量一般控制在12%左右。酒精含量过高，使腐乳成熟期延长。酒精含量过低，杂菌繁殖快，豆腐易腐败。
d．温度的控制：温度15～18 ℃适合毛霉生长。发酵时间易控制在6个月左右。
②防止杂菌污染
a．用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。
b．装瓶时，操作要迅速小心。加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
【例】(2012·南通高三第一次模拟)下列有关果酒发酵和果醋发酵的叙述中，正确的是(多选)( )
A．参与发酵的微生物都含有线粒体
B．都需要持续通入无菌空气
C．发酵过程中培养液pH都会下降
D．果酒制成后可将装置转移至温度较高的环境中制果醋
【析】选CD。果醋发酵中的醋酸菌是原核生物，其细胞中无线粒体；果酒发酵时不能通入空气。果酒发酵产生二氧化碳、果醋发酵产生醋酸，故发酵过程中培养液pH都会下降。果酒发酵的适宜温度是18～25 ℃，而果醋发酵的适宜温度是30～35 ℃。专题5 DNA和蛋白质技术
【高考新动向】
1、蛋白质的提取和分离
2、PCR技术的基本操作和应用
【考纲全景透析】
一、DNA的粗提取与鉴定
1、实验原理：(1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低。
(2)DNA不溶于酒精溶液。
(3)DNA不被蛋白酶所水解。
(4)DNA在沸水浴条件下可被二苯胺染成蓝色。
2．DNA与蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度不同
3.DNA的析出与鉴定
(1)析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液等体积的冷却酒精溶液(体积分数为95%)静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。
(2)鉴定
二、多聚酶链式反应扩增DNA片段
1、PCR：多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
原理：DNA的热变性
2、PCR反应过程
（1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
（2）复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
（3）延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸（A,T,C,G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
3、PCR结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
三、血红蛋白的提取和分离实验
1、方法及原理
方法 原理
凝胶色谱法 根据相对分子质量的大小分离蛋白质
电泳法 各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同来分离蛋白质
2、操作程序：[ ]
（1）样品处理：
红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液
（2）粗分离——透析：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
（3）纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。
（4）纯度鉴定：一般用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。
3、细胞内DNA复制与PCR技术的比较
细胞内DNA复制 PCR
不同点 解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制 80℃~100℃高温解旋，双链分开
酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶
引物 RNA DNA或RNA
温度 体内温和条件 高温
相同点 （1）需提供DNA复制的模板（2）四中脱氧核苷酸作原料（3）子链延伸的方向都是从5ˊ端到3ˊ端（4）都需要酶的催化
【热点难点全析】
一、DNA和蛋白质的技术
1、比较细胞内DNA复制与DNA扩增（PCR）
2.血红蛋白的提取和分离方法
(1)凝胶色谱法
①含义：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。
②原理
a.相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。
b.相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
(2)电泳法
①含义：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
②原理：利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异和分子本身大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
(3)缓冲溶液
①组成：1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。
②作用：在一定范围内抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，确保实验室条件下能准确模拟生物体内的代谢过程。专题6 植物有效成分的提取
【高考新动向】
从生物材料中提取某些特定的成分
【考纲全景透析】
一、植物芳香油的提取
1、植物芳香油的主要化学成分：萜类化合物及其衍生物，具有很强的挥发性。提取方法有：蒸馏、压榨和萃取等。
2、玫瑰精油的提取实验
方法：水蒸气蒸馏法
流程：
鲜玫瑰花+清水（1:4）→水蒸气蒸馏→油水混合物分离油层除水玫瑰油
2、橘皮精油的提取实验
方法：一般用压榨法
流程：
石灰水浸泡橘皮→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮油。
3、胡萝卜素的提取
胡萝卜素的性质：不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂
方法：萃取法，石油醚最适宜作萃取剂
流程：
胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素。
鉴定方法：纸层析法。
二、五中物质的提取方法及原理的比较
提取物质 提取方法 提取原理
DNA 盐析法 ①在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同②不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
血红蛋白 凝胶色谱法、电泳法 ①根据相对分子质量的大小 ②各种分子带电性质差异以及分子本身大小、形状的不同
玫瑰精油 水蒸气蒸馏法 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来
橘皮精油 压榨法 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油
胡萝卜素 萃取法 使提取物溶解在有机溶剂中，蒸发后得到提取物
【热点难点全析】
一、植物芳香油的提取方法
提取方法 方法步骤 原理 优点 不足 适用范围
水蒸气蒸馏法 ①水蒸气蒸馏②分离油层③除水、过滤 利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来 简单易行，便于分离 会导致原料焦糊和有效成分水解 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
压 榨 法 ①石灰水浸泡、漂洗②压榨、过滤、静置③再次过滤[ ] 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 成本低，保持原料原有结构和功能，常温下不发生化学反应，质量提高 分离较为困难，出油率相对较低 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取
萃取法 ①粉碎、干燥②萃取、过滤③浓缩 使芳香油溶解在有机溶剂中，通过蒸发溶剂后就可获得 出油率高，易于分离 使用有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量[ ] 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中
归纳：不同物质的提取是根据其理化性质的不同来进行的，因此在提取物质时，应先确定该物质的理化性质，然后再选择适宜的提取方法进行提取。专题4 酶的研究与应用
【高考新动向】
1、酶的存在与简单制作方法
2、酶活力测定的一般原理和方法
3、酶在食品制作和洗涤等方面的应用
4、制备和应用固定化酶
【考纲全景透析】
一、酶的存在、制作及活力测定的原理
1、果胶酶的组成与作用
（1）种类：多聚半乳糖醛酸酶，果胶分解酶，果胶酯酶
（2）作用：瓦解植物细胞壁和胞间层。
2、酶的活性及其影响因素
（1）酶的活性是指酶催化 一定化学反应的能力。酶反应速度用单位时间内，单位体积中反应物的减少量或产物的增加量表示。
（2）影响酶活性的因素常提的是温度、pH值和酶的抑制剂等。
3、研究温度对果胶酶活性影响的实验
（1）实验方案：确定温度梯度，探讨控制温度的方法和措施
（2）实验程序：制备水果泥→水果泥与果胶酶分别水浴保温→将水果泥和果胶酶混合保温→过滤出果汁→记录果汁量→改变不同温度后，重复上面的实验。
（3）记录实验数据，并填入表格
（4）得出结论：获得的果汁越多，或果汁越澄清，表明果胶酶的活性越高。
二、加酶洗衣粉的去污机理
种类 洗涤原理 洗涤实例
蛋白酶 血渍、奶渍及各种食品类的蛋白质污垢
脂肪酶 油渍、人体皮脂、口红
淀粉酶 来自面条、巧克力等的污垢
纤维素酶 使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，达到更好的去污效果
3、探究不同种类的加酶洗衣粉的洗涤效果
（1）实验原理：酶的催化作用具有专一性，复合酶洗衣粉加入的酶制剂种类较多，与单一加酶洗衣粉相比，对各种污渍都有较好的洗涤效果。
（2）实验变量：
自变量：不同种类的加酶洗衣粉
无关变量：其他条件相同且适宜（如温度、PH等）
实验步骤：
①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。
②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。
⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果
三、制备和应用固定化酶
1、固定化酶的应用实例：如果葡萄糖异构酶，将葡萄糖转化为果糖。固定化酶技术在反应柱上的孔应该满足酶颗粒无法通过，反应溶液可以自由出入。
2、固定化细胞技术
（1）概念：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
（2）方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。
（3）实验操作：
【热点难点全析】
一、探究影响果胶酶活性因素实验的分析
1.实验原则：遵循单一变量原则、对照性原则，严格控制变量，尽量减少无关变量的影响。
2.实验原理：果胶酶活性受温度、pH或酶抑制剂的影响，在最适温度或pH时，活性最高，果肉的出汁率、果汁的澄清度都与果胶酶的活性大小成正比。
3.设计实验
(1)探究最适温度时，pH为不变量，最好是最适pH；探究最适pH时，温度为不变量，最好是最适温度。
(2)探究果胶酶的最适用量时，最适用量是在温度、pH等适宜条件下测出来的，如果无关变量改变，最适用量也会发生变化。
二、直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
酶的种数 一种或几种 一种 一系列酶
制作方法 化学结合固定化，物理吸附固定化 包埋法固定化
是否需要营养物质 否 否 是
催化反应 单一或多种 单一 一系列
反应底物 各种物质（大分子、小分子） 各种物质（大分子、小分子） 小分子物质
缺点 对环境条件非常敏感，容易失活；难回收，成本高，影响产品质量 不利于催化一系列的酶促反应 反应物不易与酶接触，尤其是大分子物质，反应效率下降
优点 催化效率高、耗能低、低污染 既能与反应物接触，又能与产物分离；可以反复利用 成本低、操作容易
