第44讲 酶的应用
[考纲要求] 1.酶的存在与简单制作方法。2.酶活力测定的一般原理和方法。3.酶在食品制造和洗涤等方面的应用。4.制备和应用固相化酶。
考点一 影响果汁产量的物质、因素及探究方法
1． 果胶酶的组成和作用
(1)组成：多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。
(2)作用：分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层。
2． 酶的活性及其影响因素
(1)酶的活性：酶催化一定化学反应的能力。酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示。
(2)影响酶活性的因素：温度、pH、酶的抑制剂等。
3． 探究温度和pH对酶活性的影响
(1)实验原理
①果胶酶活性受温度和pH的影响，处于最适温度或pH时，活性最高。
②果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶活性大小呈正相关。
(2)实验结果：温度和pH在很大程度上对酶的空间结构会产生影响，过高或过低都会影响酶活性。
4． 探究果胶酶的最适用量
37_℃恒温水浴加热→将果胶酶溶液与苹果泥混合→37_℃恒温水浴中反应20 min左右→过滤果汁，测量果汁量并记录
易错警示 (1)酶活性不等同于酶促反应速度
同等条件下的酶促反应速度的快慢可以表示酶活性的高低，但酶活性与酶促反应速度仍然是两个完全不同的概念，其影响因素也不完全相同，如酶的浓度、反应物的浓度可以影响反应速度，但不能影响酶的活性。
(2)在苹果泥和果胶酶混合之前，一定要保证底物和酶达到所要求的温度或pH条件，以避免混合后条件的变化，确保实验结果的可靠性。
(3)探究×××酶的最适条件(温度、pH)及最适用量时都需设置一系列浓度梯度，且不同的温度梯度之间或不同的pH梯度之间构成了相互对照，通过相互对照可确定果胶酶的最适温度或最适pH。
1． 下列有关果胶酶及与果胶酶实验探究的叙述正确的是 ( )
A．探究果胶酶的用量时，pH、温度不影响实验结果
B．果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和葡萄糖异构酶等
C．探究温度对果胶酶活性的影响时，温度、苹果泥、果胶酶用量及反应时间等都是
变量
D．可以用相同时间内过滤得到的果汁体积来确定果胶酶的用量
答案 D
解析 探究果胶酶的用量时，pH、温度会影响实验结果；葡萄糖异构酶不属于果胶酶的成分；探究温度对果胶酶活性的影响实验中，温度为单一变量，其他因素保持不变。
1． 果胶酶与纤维素酶的比较
种类 组成 作用
果胶酶 多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等 催化水解果胶成为可溶性半乳糖醛酸
纤维素酶 C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶 纤维素纤维二糖葡萄糖
2． 探究影响果汁产量的因素
(1)探究温度对酶活性的影响时，可以选用10 ℃作为温度梯度，设置的具体温度为10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃等，也可以根据酶的特点，尝试以5 ℃作为温度梯度。
(2)探究pH对酶活性的影响时，只需将温度梯度改成pH梯度，并在该酶的最适温度下进行。反应液中的pH可以用质量分数为0.1%的氢氧化钠溶液或盐酸进行调节。
(3)探究酶的用量是建立在探究最适温度和pH对酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是酶的用量，其他因素都应保持相同。实验时可以配制不同浓度的酶溶液，也可以只配制一种浓度的酶溶液，然后使用不同的体积。需要注意的是，反应液的pH和温度必须相同，否则将影响实验结果的准确性。
3． 确定果胶酶最适用量的方法
如果随酶浓度的增加，过滤到的果汁的体积也增加，说明酶的用量不足；当酶的浓度增加到某个值后，再增加酶的用量，过滤到的果汁的体积不再改变，说明酶的用量已经足够，这个值就是酶的最适用量。
考点二 探究不同种类加酶洗衣粉的洗涤效果
1． 梳理加酶洗衣粉的去污机理
种类 洗涤原理 洗涤的物质种类
蛋白酶 蛋白质小分子的肽＋氨基酸 血渍、奶渍及各种食品类的蛋白质污垢
脂肪酶 脂肪甘油＋脂肪酸 食品的油渍、人体皮脂、口红
淀粉酶 淀粉麦芽糖＋葡萄糖 来自面条、巧克力等的污垢
纤维素酶 使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，达到更好的去污效果 棉纺织品的表面浮毛
2． 探究不同类型加酶洗衣粉的洗涤效果
(1)实验原理：酶的催化作用具有专一性，复合酶洗衣粉加入的酶制剂种类较多，与单一加酶洗衣粉相比，对各种污渍都有较好的洗涤效果。
(2)实验变量
①自变量：加酶洗衣粉。
②无关变量：其他条件相同且适宜(如温度、pH等)。
(3)实验步骤
步骤 烧杯编号
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
注入自来水 500 mL 500 mL 500_mL
加入物质(等量) 奶渍布 奶渍布 奶渍布
控制水温 37 ℃ 37 ℃ 37_℃
加入洗衣粉(等量) 蛋白酶洗衣粉 复合酶洗衣粉 脂肪酶洗衣粉
用玻棒搅拌 5 min 5 min 5 min
观察实验现象 颜色浅 已消失 颜色浅
易错警示 (1)与普通洗衣粉相比，加酶洗衣粉洗涤效果更好，又由于不含磷元素，酶制剂进入无机环境中后可以被微生物分解，因此不会对环境造成污染。
(2)一般来说，丝绸类的衣物不可以使用加酶洗衣粉洗涤，是因为蛋白酶会水解蛋白质类的丝绸。
(3)酶的催化作用需要适宜的温度，用温水浸泡衣物可以缩短衣物的浸泡时间，加快洗涤。
(4)人体皮肤细胞有蛋白质，如不彻底清洗双手，就会使手的皮肤受到腐蚀，而使人患过敏性皮炎、湿疹等。因此，应避免与这类洗衣粉长时间地接触。
(5)加酶洗衣粉的酶制剂不含肽酶，因为肽本身易溶于水。
2． 加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。请回答下列问题：
(1)由下图推知，该实验的目的是_________________________________。50 ℃时加酶洗衣粉中碱性蛋白酶的最适含量约是________%。
(2)下表是添加脂肪酶的加酶洗衣粉和普通洗衣粉洗涤效果的实验记录，请据表回答问题。
脸盆编号 洗涤物(等量) 洗涤温度 洗衣粉(等量) 水量 洗净所需时间
1 油污布 45 ℃ 加酶 2 L 4 min
2 油污布 45 ℃ 普通 2 L 7 min
3 油污布 5 ℃ 加酶 2 L 9 min
4 油污布 5 ℃ 普通 2 L 8 min
①该实验设计体现了______________________原则。
②若1号实验组洗净油污布所需时间接近7min，最可能的原因是____________________
____________________________________________________。
(3)下列衣料不适宜用添加蛋白酶的加酶洗衣粉洗涤的有____________。
①棉织品 ②毛织品 ③腈纶织品 ④蚕丝织品
(4)根据以上实验结果，请写出两项提高加酶洗衣粉洗涤效果的措施：________________
________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)探究温度、碱性蛋白酶含量对去污力的影响 0.6
(2)对照、单一变量 酶失活 (3)②④
(4)用温水浸泡；延长浸泡时间；增加洗衣粉的用量等(写出两项合理答案即可)
解析 (1)由题图可知，实验中存在两个变量：温度与碱性蛋白酶含量，即实验探究的是温度、碱性蛋白酶含量对去污力的影响。在50 ℃时，洗衣粉的去污力在碱性蛋白酶含量为0.6%时达到最大。
(2)由表中数据可知，1、3号为实验组，2、4号为对照组，1、2号与3、4号中只有是否加酶一个变量，因此该实验设计体现了对照原则和单一变量原则。若1号实验组洗净油污布所需时间接近7 min，最可能的原因是酶已经失活。
(3)蛋白酶可分解蛋白质，故毛织品、蚕丝织品等以蛋白质为主要成分的衣料不能用含蛋白酶的加酶洗衣粉洗涤。
(4)用温水浸泡(提高酶的活性)，延长浸泡时间(增加酶的催化时间)，增加酶的用量等都可以提高加酶洗衣粉的洗涤效果。
1． 变量的分析和控制
影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量和种类，衣物的材料、大小及浸泡时间和洗涤时间等。
在探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件实验中，水温是要研究的对象，实验自变量是水温；在探究加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤效果的实验中，实验自变量为洗衣粉的种类；在探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤效果的实验中，实验自变量为加酶洗衣粉的种类。在设计实验时，应遵循单一变量原则和对照原则等。
2． 洗涤方式和材料的选择
(1)采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，使其机械搅拌作用相同。
(2)洗涤材料的选择也有一些讲究。选用布料作为实验材料比较可行。在设置对照实验时，可以控制布料的大小、颜色及污物的量，使其相同；同时，也便于洗涤效果的比较。
3． 水量、水质和洗衣粉用量的问题
(1)水量和布料的大小是成正比的。做实验用的布料不宜过大，水量不宜过多，但应该让布料充分浸泡在水中。
(2)其他相关问题简述如下：实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻棒搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同。
考点三 酵母细胞的固定化
1． 固定化细胞技术的概念
固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2． 固定化细胞技术常用的方法
包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。
3． 酵母细胞的固定化及发酵程序
酵母细胞的活化→配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。
易错警示 固定化实验中的易错总结
(1)海藻酸钠溶液的浓度对包埋酵母细胞数量的影响
①海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠。
②浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量少。
(2)海藻酸钠溶液配制注意事项
①海藻酸钠溶化时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。
②将溶化后的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母细胞混合，避免高温杀死酵母细胞。
③固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。
3． 在20世纪50年代，酶已经大规模地应用于各个生产领域，到了70年代又发明了固定化酶与固定化细胞的技术。
(1)在实际生产中，固定化酶技术的优点是_____________________________________
________________________________________________________________________。
与固定化酶技术相比，固定化细胞固定的是____________。
(2)制备固定化酵母细胞，常用的包埋材料是________，使用了下图中方法[ ]________(填出号码与名称)。
(3)制作固定化酵母细胞时，充分混合均匀的酵母细胞溶液可在饱和________溶液中形成凝胶珠。部分同学实验制得的凝胶珠不是圆形或椭圆形，其主要原因是____________。
答案 (1)酶既容易与反应物接触，又容易与产物分离，固定在载体上的酶能反复利用 多酶系统(或一系列酶、多种酶)
(2)海藻酸钠 ③ 包埋法 (3)CaCl2 海藻酸钠溶液浓度过高(或针筒口离液面过近，高度不够)
解析 将酶固定化后，可使酶在催化反应之后不随产物流走，可以反复利用；将细胞固定化后，可以将一种细胞内的多种酶同时进行固定。海藻酸钠一般不能参与化学反应，同时，在高温下容易溶化，温度降低时又形成多孔性固体颗粒，是包埋酵母菌的好材料。图①为化学结合法，图②为物理吸附法，图③为包埋法。凝胶珠是高温下溶化的海藻酸钠与酵母菌混合后在CaCl2溶液中形成的，若海藻酸钠浓度过高或制凝胶珠时离液面太近，可能形成片状或长条形，而不是圆形的凝胶珠。
1． 直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
制作方法 化学结合法固定化、物理吸附法固定化 包埋法固定化
是否需要营养物质 否 否 是
催化反应 单一或多种 单一 一系列(或多种)
反应底物 各种物质(大分子、小分子) 各种物质(大分子、小分子) 小分子物质
缺点 ①对环境条件非常敏感，易失活；②难回收，成本高，影响产品质量 不利于催化一系列酶促反应 反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降
优点 催化效率高、耗能低、低污染 ①既能与反应物接触，又能与产物分离；②可以重复利用 成本低、操作容易
2． 酵母细胞的固定化方法
1． (2012·江苏卷，16)下列关于“探究加酶洗衣粉和普通洗衣粉的洗涤效果”的叙述，合理的是 ( )
A．先用热水溶解洗衣粉，再将水温调节到最适温度
B．实验的观察指标可以是相同洗涤时间内污渍的残留程度
C．相同pH时加酶洗衣粉洗涤效果好于普通洗衣粉
D．衣物质地和洗衣粉用量不会影响实验结果
答案 B
解析 由于温度会影响酶的活性，高温会导致加酶洗衣粉中的酶变性失活，A项错误；本实验的目的是探究两种洗衣粉的洗涤效果，所以观察指标可以是相同洗涤时间内污渍的残留程度或达到同样洗涤效果所需时间的长短，B项正确；在适宜的pH下，加酶洗衣粉的洗涤效果高于普通洗衣粉，但pH过高或过低时酶都会变性失活，则两者洗涤效果相似，C项错误；酶具有专一性，加有蛋白酶的洗衣粉不能用于洗涤真丝、羊毛等衣料，适当增加洗衣粉的用量会使洗涤效果增强，D项错误。
2． (2012·江苏卷，17)下列关于酶和固定化酵母细胞的研究与应用的叙述，错误的是
( )
A．从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小
B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药
C．尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用
D．将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌
答案 C
解析 酶的固定方式有包埋法、化学结合法和物理吸附法，物理吸附的过程是利用吸附剂本身的表面张力，从而对附近的分子产生吸附，吸附剂不会与被吸附物质发生化学反应而使其发生性质改变，所以吸附法对酶活性影响很小，A项正确；消化酶在人体消化道内发挥作用，蛋白酶制剂一般在最外面加上糖衣后通过口服方式给药，B项正确；尿糖试纸是一种酶试纸，是将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色化合物固定在纸条上，制成测试尿糖含量的酶试纸，这种酶试纸与尿液相遇时，很快会因为尿液中葡萄糖含量的多少而呈现一定的颜色，再次使用时颜色会有掩盖作用，所以不能反复使用，C项错误；制备固定化酵母细胞时，将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗的目的是洗去CaCl2和杂菌，防止凝胶珠硬度过大和杂菌的污染，D项正确。
3． (2012·广东理综，29)食品种类多，酸碱度范围广。生物兴趣小组拟探究在食品生产中应用范围较广的蛋白酶，查阅相关文献，得知：
(1)pH对不同蛋白酶的活力影响有差异。据图可知，________________________更适宜作为食品添加剂，理由是___________________________________________________
________________________________________________________________________。
蛋白酶的活力可用______________________的量来表示。
(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
兴趣小组分别对酶保护剂浓度、提取液pH进行了探究实验。结果显示，酶保护剂浓度在0.02～0.06 mol/L范围内，酶活力较高；提取液pH在6.0～8.0范围内，酶活力较高。他们认为，要进一步提高粗酶制剂的酶活力，以达到最佳提取效果，还需对酶保护剂浓度和提取液pH进行优化，并确定以此为探究课题。请拟定该课题名称，设计实验结果记录表。
答案 (1)木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶的活力不随pH的变化而变化 单位时间内、单位体积中底物减少(或产物增加) (2)课题名称：探究酶保护剂的浓度和提取液的pH的最佳组合
提取液的pH底物的减少量(或产物的产生量)酶保护剂浓度 mol/L 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
解析 (1)题目中已经提供了信息“食品种类多，酸碱度范围广”，所以选择的食品添加剂应该有较广的酸碱度适应范围，由图可知，木瓜蛋白酶的活力不随pH的变化而变化，所以可以选作食品添加剂。酶的活力可用单位时间内、单位体积中底物的减少量(或产物的增加量)来表示。(2)由题中信息可知酶保护剂的适宜浓度范围和提取液pH的适宜范围，故实验的自变量是酶保护剂的浓度和提取液的pH，需在适宜范围内确定较小的梯度进行实验。实验结果记录表要包含自变量酶保护剂的浓度和提取液的pH以及因变量底物的减少量(或产物的产生量)。
4． (2008·江苏卷，34A)为探究洗衣粉加酶后的洗涤效果，将一种无酶洗衣粉分成3等份，进行3组实验。甲、乙组在洗衣粉中加入1种或2种酶，丙组不加酶，在不同温度下清洗同种化纤布上的2种污渍，其他实验条件均相同，下表为实验记录。请回答下列问题。
水温/℃ 10 20 30 40 50
组别 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙
清除血渍时间/min 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67
清除油渍时间/min 93 78 95 87 63 91 82 46 85 75 27 77 69 8 68
(1)提高洗衣粉去污能力的方法有__________________，甲组在洗衣粉中加入了____________，乙组在洗衣粉中加入了______________________。
(2)甲、乙两组洗涤效果的差异，说明酶的作用具有________。
(3)如果甲、乙和丙3组均在水温为80 ℃时洗涤同一种污渍，请比较这3组洗涤效果之间的差异并说明理由：
________________________________________________________________________。
(4)加酶洗衣粉中的酶是用特殊的化学物质包裹的，遇水后包裹层很快溶解，释放出来的酶迅速发挥催化作用。请说明这是否运用了酶的固定化技术及其理由：______________。
答案 (1)加酶和适当提高温度 蛋白酶 蛋白酶和脂肪酶
(2)专一性 (3)没有差异，因为高温使酶失活 (4)未运用酶的固定化技术，因为酶未固定在不溶于水的载体上，也不能重复利用
解析 加酶洗衣粉中添加了多种酶制剂，如碱性蛋白酶制剂和碱性脂肪酶制剂等。这些酶制剂不仅可以有效地清除衣物上的污渍，而且对人体没有毒害作用，并且这些酶制剂及其分解产物能够被微生物分解，不会污染环境。既然是酶制剂，就具备酶的特性，需要适宜的温度和pH，具有专一性；温度过高时，酶变性失活，三者几乎没有差别。固定化后的酶在保持原有催化活性的同时，又可以同一般催化剂一样能回收和反复使用，可在生产工艺上实现连续化和自动化，更适应工业化生产的需要。第43讲 微生物的培养与应用
[考纲要求] 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。
考点一 微生物的实验室培养
1． 培养基的分析
(1)据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型 ( × )
(2)培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分 ( √ )
(3)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求
( √ )
2． 无菌技术(连一连)
3． 纯化大肠杆菌
(1)制备固体培养基的流程
→→→→
(2)纯化大肠杆菌的方法
常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
①平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
易错警示 (1)自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同：①自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。②含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。(2)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项：①倒平板的适宜温度是50 ℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(3)平板划线操作的注意事项：①第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。②灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。③划线时最后一区不要与第一区相连。④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
1． 下列无菌操作中，错误的是 ( )
A．无菌操作的目的是防止杂菌污染
B．用酒精擦拭双手的方法对操作者进行消毒
C．实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行
D．玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭
答案 D
解析 对操作者应用较温和的方法进行消毒。实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行，防止瓶口的微生物污染培养基。对无菌操作用到的玻璃器皿要用干热灭菌的方法彻底消灭其中的微生物，用酒精擦拭不能达到目的。
2． 下列是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答：
试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL
(1)培养基的类型有很多，但培养基中一般都含有水、碳源、____________和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是__________________________。培养基配制完成以后，一般还要调节pH，并对培养基进行__________处理。该培养基从物理性质上分类属于____________。
(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是____________和____________________。
(3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项)
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 固体培养基 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌即接着划第二次；培养过程中灭菌不严格，受到了其他微生物的污染(任选两个)
解析 培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。配制培养基时加入了琼脂，因此该培养基属于固体培养基。培养基配制完成后要调pH和灭菌。牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。分离纯化微生物一般用平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法中每次划线前都要将接种环灼烧灭菌，以杀死上次划线时接种环上残留的菌种；采用稀释涂布平板法时稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。
1． 微生物和动植物营养要素的比较
项目 碳源 氮源 能源 无机盐、水
动物 糖类、脂肪等 蛋白质或其降解物 同碳源 都需要，种类及功能基本相同
微生物 异养型 糖类、脂肪、醇、有机酸等 蛋白质或其降解物、铵盐、硝酸盐、N2等 同碳源
自养型 CO2、碳酸盐等 NH3、铵盐、硝酸盐等 氧化无机物或利用光能
绿色植物 铵盐、硝酸盐 光能
2． 消毒和灭菌比较
比较项目 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭
消毒 较为温和 部分生活状态的微生物 不能
灭菌 强烈 全部微生物 能
3.两种纯化细菌的方法的比较
项目 优点 缺点
平板划线法 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 不能计数
稀释涂布平板法 可以计数，可以观察菌落特征 吸收量较小，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
4． 培养基的营养构成
(1)各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
(2)不同培养基要满足不同微生物对pH、特殊营养物质及氧气的需求。
考点二 分解尿素的细菌的分离与计数
1． 完善土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
2． 判断正误
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 ( √ )
(2)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源 ( √ )
(3)统计样品中的活菌一般用平板划线法 ( × )
(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌 ( × )
易错警示 (1)在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。
(2)统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
3． 自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
实验步骤：
(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
(2)为了得到更加准确的结果，你选用____________法接种样品。
(3)适宜温度下培养。
结果分析：
(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是________________，其理由是______________________________________
________________________________________________________________________。
A．一个平板，统计的菌落数是230
B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C．三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260
D．四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250
(2)一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是__________(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)。
(3)用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测得的数量____________，因为________________________________________________________________________
______________________。
答案 实验步骤：(2)稀释涂布平板
结果分析：(1)D 在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否合理
(2)2.34×108 (3)多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析 实验步骤：为了得到更加准确的结果，应用稀释涂布平板法接种样品。
结果分析：(1)选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。
(2)234÷0.1×105＝2.34×108。
(3)因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
1． 筛选菌株的原理
微生物的选择培养：在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
2． 统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
②方法：用计数板计算。
③缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作：a.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
3． 鉴定分解尿素的细菌
(1)原理：CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。
(2)方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。
4． 对照原则的运用
(1)判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。
(2)判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
考点三 分解纤维素的微生物的分离
1． 纤维素酶
(1)组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用：纤维素纤维二糖葡萄糖
2． 筛选方法
(1)方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
(2)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
3． 筛选流程
土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
易错警示 对选择培养基的选择方法区分不清
(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。
(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。
(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。
4． 纤维素分解菌能够产生纤维素酶分解纤维素。回答下列问题：
(1)在筛选纤维素分解菌的过程中，通常用____________染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对纤维素分解菌进行筛选。甲同学在实验时得到了如图所示的结果，则纤维素分解菌位于 ( )
A．③ B．①② C．②③ D．①②③
(2)乙同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，进行培养时除了营养不同外，最主要的实验条件差别是________________________。
该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目________。
(3)丙同学在提取和分离纤维素酶的过程中，为了抵制外界酸和碱对酶活性的影响，采取的措施是向提取液和分离液中添加____________。若探究纤维素酶活性的最适温度，如何设置对照？__________________________________________________________。
答案 (1)刚果红 A (2)保证无氧环境 小(低)
(3)缓冲溶液 不同的温度梯度之间相互对照
解析 (1)刚果红与纤维素形成的红色复合物在纤维素被分解后将不再形成，则在培养基上出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。(2)牛胃是一个厌氧的环境，所以其中的纤维素分解菌与需氧的醋酸菌培养条件有所不同。因是活菌计数法，所以部分死亡菌无法计数。另外当两个或多个细菌连在一起时平板上只观察到一个菌落，所以偏小。(3)探究最适温度可设置一系列的温度梯度相互对照，其他无关变量要适宜。
1． 两种菌株筛选原理的比较
土壤中分解尿素的细菌 分解纤维素的微生物
①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素 ①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2． 选择培养基与鉴别培养基的比较
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质 依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计 鉴别不同种类的微生物 伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
3． 分离纤维素分解菌的几个关键步骤
(1)分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；因培养基中无凝固剂，为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。
(2)鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，因为要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是此培养基。
1． (2012·北京卷，5)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是 ( )
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
答案 C
解析 在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外植体的生长，甚至杀死外植体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果影响也不会太大。
2． (2009·安徽卷，6)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是
( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
答案 D
解析 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
3． (2011·新课标全国卷，39)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于________培养基。
(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即____________和____________。
(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________________________________________________。
(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和____________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
答案 (1)原油 选择 (2)平板划线法 稀释涂布平板法(3)强 (4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰
解析 (1)可以将所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，能降解原油的细菌才能在只含原油这一碳源的培养基上生存。(2)分离纯化菌种时，接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。(3)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌(如接种环)、干热灭菌(如培养皿)和高压蒸汽灭菌(如培养基)等。无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。
4． (2009·宁夏卷，40)(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑________、____________和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、____________、________________等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。
(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和____________；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能___________________________________
_____________________________________________________________________________________________________________。
(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的______________。
(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________________。
(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_____________________________________________________________。
(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过____________处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
答案 (1)温度 酸碱度 易培养 生活周期短 (2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构 (3)比例合适 (4)鉴别(或分类) (5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 (6)灭菌
解析 (1)影响微生物培养的因素除了营养条件外，外界条件主要包括温度、酸碱度和渗透压等。由于大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，所以常作为遗传学研究的实验材料。(2)对培养基和培养器皿要进行灭菌，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒，静止空气中的细菌在用紫外线照射后能够使蛋白质变性，并损伤DNA结构，使细菌死亡。(3)样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落的数目，实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得的菌落数在30～300之间。(4)菌落的特征是判断微生物种类的重要依据，对获得的纯菌种可以依据菌落的特征对细菌进行初步的鉴别。(5)要判断固体培养基是否被污染，可将未接种的培养基在适宜的温度下培养一段时间，若发现有菌落说明培养基已被污染。(6)进行微生物培养时，使用过的培养基及培养物必须经灭菌后才能丢弃，防止培养的微生物扩散到环境中，造成危害。
1． 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的下列操作中，不正确的是 ( )
A．操作流程是计算、称量、溶化、灭菌和倒平板
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同倒入烧杯中再加水、去纸
C．灭菌后向牛肉膏蛋白胨溶液中加2%琼脂，并使其溶解
D．将培养基冷却到约50 ℃时，在酒精灯火焰附近倒平板
答案 C
解析 琼脂加入到牛肉膏蛋白胨溶液中，溶化后再灭菌。
2． 平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是
( )
A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作
C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D．都会在培养基表面形成单个菌落
答案 D
解析 平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法需要将不同稀释度的菌液滴加到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落。
3． 某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是 ( )
A．利用平板划线法对细菌进行计数
B．用以石油为唯一碳源的培养基筛选
C．采用稀释涂布平板法分离菌种
D．称取和稀释土壤样品时应在火焰旁
答案 A
解析 分离细菌常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，但平板划线法不能对细菌进行计数；筛选能分解石油的细菌，要以石油作为培养基中唯一的碳源；筛选细菌的整个操作过程都需要在无菌条件下进行，所以应在火焰旁进行。
4． 在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用以尿素为唯一氮源的培养基，乙组实验的培养基中的氮源除尿素外还含硝酸盐，其他成分都相同，在相同条件下操作，培养观察，则乙组实验属于 ( )
A．空白对照 B．标准对照
C．相互对照 D．条件对照
答案 D
解析 乙组和甲组实验的培养条件不同，形成了条件对照。
5． 某同学学习完微生物的实验室培养后，要利用所学知识研究水中微生物的情况。该同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题：
(1)该同学所用培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了____________和____________。
(2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是____________。
(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于____________________中培养、培养的温度设定在37 ℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种____________作为对照进行实验。
答案 (1)氮源 碳源 (2)高压蒸汽灭菌 (3)恒温培养箱 无菌水
解析 蛋白胨是源于动物的原料，含有维生素、糖和有机氮等营养物质，在培养基中主要作为氮源。实验室的灭菌方法一般有：灼烧灭菌(适用于接种工具的灭菌)、干热灭菌(适用于耐高温的、需要保持干燥的物品的灭菌)、高压蒸汽灭菌(适用于培养基等物品的灭菌)。要想使微生物快速地繁殖，就要置于适宜的条件下，特别是适宜的温度下，所以要置于恒温培养箱中。对照实验就是要设置一个用无菌水接种的平板进行观察比较。
6． 大肠杆菌是“明星菌”，在生物技术上常用作“工程菌”。某生物小组的同学利用实验室提供的某品系大肠杆菌及其他必需材料，对该品系大肠杆菌进行了培养、计数。
(1)大肠杆菌在生长过程中对各种营养成分所需的量不同，故制备培养基时各营养成分要有合适的________。
(2)在制备固体培养基进行倒平板操作时，平板冷凝后，甲同学将平板倒置，其原因是________________________________________________________________________。
(3)乙同学采用平板划线法接种，获得单菌落后继续筛选，在每次划线之前都要灼烧接种环，其目的是__________________________________。
(4)丙、丁同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：丙同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；丁同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，然后取其平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：
①丙同学的结果________，原因是____________________。
②丁同学的结果________，原因是____________________。
(5)戊同学在测定大肠杆菌的密度时发现培养基上还有其他杂菌的菌落，由此他判断该品系大肠杆菌被污染了。他的判断是否确切？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)比例 (2)培养皿盖上会凝结有水珠，平板倒置可防止水珠落入培养皿中而造成污染，还可使培养皿表面的水分更好地挥发 (3)杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种 (4)①不合理 没有设置重复组，结果不具有说服力 ②不合理 一个平板上的计数结果与另外两个相差太远(或在操作过程中可能出现了错误，或只简单地计算了平均值)(5)不确切。因为不能确定杂菌是来自培养基还是来自培养过程
解析 (1)从培养基制备的重要原则入手分析，制备培养基时要注意控制各种营养物质的比例。(2)平板冷凝后培养皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止培养皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(3)灼烧接种环的目的是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，以免对实验结果造成影响。(4)实验时，至少要涂布3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性，丁同学虽然涂布了3个平板，但其中一个平板上的菌落数与另外两个平板上的菌落数相差甚远，故不能取这3个平板上的菌落的平均值作为统计结果。(5)判断杂菌的来源时，只有排除其他可能的情况才能得出确切的结论。
7． 从自然菌样中筛选较理想的生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适宜的环境中采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。筛选噬盐菌的菌样应从____________环境中采集。
(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择__________________的培养基，并在____________条件下培养。
(3)如图甲、乙是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。
获得图甲效果的接种方法是____________________，获得图乙效果的接种方法是________________。
(4)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行____________，接种前要进行________________。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在____________条件下进行。
答案 (1)海滩等高盐 (2)以淀粉为唯一碳源 高温 (3)稀释涂布平板法 平板划线法 (4)pH调整 高压蒸汽灭菌 无菌
解析 采集菌样时必须考虑所分离的微生物的生理特性和相应的土壤特点。培养微生物时则要考虑它对营养的需要和对氧气、pH的不同要求。分析图甲和图乙不难得出相应的接种方法。配制培养基的步骤包括计算、称量、溶化、调节pH、分装、包扎、灭菌、倒平板等。
8． 尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如下图所示。请分析回答问题：
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10 g 1 g 15 g
将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL
(1)此培养基能否用于植物组织培养？
_____________________________________________________，
理由是_____________________________________________。
(2)培养基中加入尿素的目的是__________________，这种培养基属于____________培养基。
(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的________和__________________，实验需要振荡培养，原因是________________________________________________________________________。
(4)转为固体培养时，常采用__________________________(方法)接种，获得单菌落后继续筛选。
(5)下列材料或用具中：①培养细菌用的培养基与培养皿；②玻棒、试管、锥形瓶和吸管；③实验操作者的双手。
需要灭菌的是______；需要消毒的是______。(填序号)
(6)在进行分离分解尿素的细菌实验时，A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有__________(填序号)。
①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照
(7)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________，细菌合成的________将尿素分解为氨，pH增高，使指示剂变红色。
答案 (1)不能 缺少植物激素(或缺少植物需要的各种营养) (2)筛选目的菌 选择 (3)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (4)稀释涂布平板法(平板划线法) (5)①② ③ (6)①②③ (7)酚红指示剂 脲酶
解析 (1)微生物与植物生长所需的营养不完全相同，培养微生物的培养基不能用于组织培养。(2)培养基中加入尿素作唯一氮源，分解尿素的微生物可生长，这种培养基属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自尿素和葡萄糖。实验需要振荡培养增加溶氧量。(4)在固体培养基上接种用稀释涂布平板法或平板划线法。(5)灭菌要彻底消灭微生物及其芽孢，如①或②。实验操作者的双手要消毒。(6)A同学从培养基上筛选出的菌落数与其他组相比，原因可能是土样不同，培养基污染，操作失误等。与是否设置对照无关。(7)由于细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH增高，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂将变红。第45讲 生物技术在其他方面的应用
[考纲要求] 1.植物的组织培养。2.PCR技术的基本操作和应用。3.蛋白质的提取和分离。4.从生物材料中提取某些特定的成分。5.实验：DNA的粗提取与鉴定。
考点一 植物组织培养
1． 植物组织培养的过程
外植体愈伤组织幼苗―→移栽
植物组织培养常用的培养基是MS培养基，一般需要添加生长素和细胞分裂素两种植物激素。
2． 植物组织培养的实验操作
(1)菊花的组织培养过程
制备MS培养基(配制母液、配制培养基、灭菌)→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培。
(2)月季的花药培养过程
①过程：材料的选取→材料的消毒→接种和培养→鉴定和筛选。
②影响花药培养的因素主要有材料的选择和培养基的组成。
③要挑选完全未开放的花蕾，确定花粉发育时期最常用的方法是醋酸洋红法。
3． 影响植物组织培养的因素
(1)菊花的组织培养，一般选择开花植株的茎上部新萌生的侧枝 ( × )
(2)植物激素的浓度可影响细胞分化，但使用的先后顺序及比例不影响组织培养的过程
( × )
(3)pH、温度和光照等也影响植物组织培养 ( √ )
易错警示 实验操作中易错的几个问题
(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季的花药培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。
(2)外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。
(3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季的花药培养不需光照；而在后期均需光照。
1． 植物的花药培养在育种上有特殊的意义。植物组织培养可用于无病毒植株及细胞产物的工厂化生产等方面。请回答相关问题：
(1)利用月季的花药离体培养产生单倍体时，选材非常重要。一般来说，在____________期花药培养的成功率最高。为了选择该期的花药，通常选择____________的花蕾。确定花粉发育时期最常用的方法有____________法，但是对于花粉细胞核不易着色的植物，需采用____________法，该法能将花粉细胞核染成____________色。
(2)若要进行兰花无病毒植株的培育，首先选择兰花的____________作为外植体。从外植体到无病毒植株试管苗，要人为控制细胞的____________和____________过程。
(3)进行组织培养需配制MS培养基，在该培养基中常需要添加____________、____________等植物激素。欲有利于根的分化，植物激素的用量比例应为________________________________________________________________________。
(4)不同植物的组织培养除需营养和激素外，____________________________等外界条件也很重要。
(5)无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，下列各项中使用化学药剂进行消毒的是____________，采用灼烧方法进行灭菌的是____________。(填序号)
①培养皿 ②培养基 ③实验操作的双手 ④三角锥形瓶⑤接种环 ⑥花蕾
答案 (1)单核靠边 完全未开放 醋酸洋红 焙花青—铬矾 蓝黑 (2)茎尖分生组织 脱分化(或去分化) 再分化(3)生长素 细胞分裂素(两空顺序可以颠倒) 生长素多于细胞分裂素 (4)pH、温度和光照 (5)③⑥ ⑤
解析 (1)早期的花药比后期的更容易培养成功。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。该时期的花药通常存在于完全未开放的花蕾中。(2)根尖、茎尖约0～0.1 mm区域中几乎不含病毒。病毒通过维管系统移动，而分生组织中不存在维管系统，且茎尖分生组织中，代谢活力高，竞争中病毒复制处于劣势。(3)生长素与细胞分裂素等植物激素可调节脱分化和再分化。当生长素含量多于细胞分裂素含量时，利于生根。(4)植物培养时，除需要营养、激素外，还需要适宜的温度、pH和光照等。(5)对实验器具进行灭菌处理，对实验过程中的具有生物活性的材料或用具进行消毒处理。
1． 植物组织培养技术和花药离体培养技术的异同
项目内容 菊花的组织培养 月季的花药培养
理论依据 植物细胞的全能性
基本过程 脱分化→再分化
外植体的细胞类型 体细胞 生殖细胞
操作流程 制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培 选材→消毒→接种和培养→筛选和诱导→移栽→栽培选育
影响因素 选材、营养、植物激素、pH、温度、阳光等
培养结果 正常植株 单倍体植株
生殖方式 无性生殖 有性生殖
可育性 可育 高度不育，秋水仙素处理后可育
2． 植物激素与组织培养
(1)生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点：
①在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。
②使用顺序不同，结果不同，具体如下：
使用顺序 实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但细胞不分化
先使用细胞分裂素，后使用生长素 细胞既分裂也分化
同时使用 分化频率提高
③用量比例不同，结果也不同
3． 影响植物组织培养的因素
(1)材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。
(2)营养：常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。
(3)环境条件：pH、温度、光照等条件。如菊花的组织培养所需pH为5.8左右，温度为18～22 ℃，光照条件为每日用日光灯照射12 h。
考点二 DNA的粗提取与鉴定
1． 基本原理
2． 操作过程
材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织
去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的
不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质
DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水
中加热5 min，溶液变成蓝色
易错警示 (1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。(2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。
2． 下图表示以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答下列问题：
(1)步骤一中，向鸡血细胞液中加入____________并搅拌，可使鸡血细胞破裂。
(2)步骤二中，过滤后收集含有DNA的____________。
(3)步骤三、四的操作原理是________________________________________________
________________________________________________________________________；
步骤四中，通过向溶液中加入____________调节NaCl溶液的物质的量浓度至____________mol/L时，DNA将会析出，过滤去除溶液中的杂质。
(4)步骤七：向步骤六过滤后的____________中加入等体积的冷却的____________，静置2～3 min，溶液中会出现________色丝状物，这就是粗提取的DNA。
(5)步骤七：DNA遇____________试剂，沸水浴5 min，冷却后，溶液呈______色。
答案 (1)蒸馏水 (2)滤液 (3)DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质 蒸馏水 0.14 (4)滤液 酒精 白 (5)二苯胺 蓝
解析 破碎红细胞应用蒸馏水，使之吸水涨破。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，在0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA析出。可通过加入蒸馏水将2 mol/L的NaCl溶液稀释为0.14 mol/L的NaCl溶液。DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加热呈蓝色。
1． DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较
2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 溶解规律
DNA 溶解 析出
蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解 NaCl溶液从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大
2． DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较
试剂 浓度 用途 原理(“△”为实验的主要原理)
NaCl溶液 2 mol/L 溶解DNA DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2 mol/L时最大、在0.14 mol/L时最小 △
0.14 mol/L 析出DNA
2 mol/L 鉴定时的溶剂
酒精 95%(体积分数) 除去杂质以提纯DNA DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可以溶于酒精 △
二苯胺 鉴定剂 DNA遇二苯胺(沸水浴)会变蓝色 △
柠檬酸钠 0.03 g/mL 抗凝剂 除去血液中的钙离子，防止血液凝固
3． DNA粗提取实验材料和方法的选择
(1)不同生物的组织中DNA含量不同
在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
(2)材料不同所采用的提取方法不同
①植物组织：取材→研磨→过滤→沉淀。
②鸡血：制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。
考点三 PCR技术的基本操作和应用
1． PCR原理
DNA热变性原理，即：
2． PCR反应过程
(1)变性：当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解聚为单链。
(2)复性：温度下降到55_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(3)延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
易错警示 (1)DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100 ℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50 ℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。
反应场所：PCR仪。
(2)PCR技术中的引物：①含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。②作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。③种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。
④数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。⑤与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。
3． 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将________________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的____________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到__________________________________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫______________。
(3)PCR的每次循环可以分为______________________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。
(4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。
(5)简述PCR技术的主要应用。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)磷酸基团 3′端 (2)耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32
(4)如图所示
(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定(要求3项以上)
解析 (1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3′ 羟基上，与DNA母链结合的引物就提供这个羟基。
(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。
(3)DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。
(4)新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。
(5)PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。
1． 细胞内DNA复制与PCR技术的比较
细胞内DNA复制 PCR
不同点 解旋 在DNA解旋酶作用下，边解旋边复制 80～100 ℃高温解旋，双链完全分开
酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶
引物 RNA DNA或RNA
温度 体内温和条件 高温
相同点 ①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端
2． PCR的反应过程
(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：
(2)复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
(3)延伸：温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
考点四 血红蛋白的提取和分离
1． 血红蛋白的提取和分离原理及方法
(1)原理：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
(2)分离方法
①凝胶色谱法：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②电泳法：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。常用的电泳法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2． 血红蛋白的提取和分离过程
样品处理：红细胞的洗涤―→血红蛋白的释放―→分离血红蛋白溶液
纯化：用凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质
3． 判断正误
(1)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗脱出来 ( × )
(2)在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关 ( × )
(3)在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移率完全取决于分子的大小 ( √ )
易错警示 “血红蛋白的提取和分离实验”中的注意事项
(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；要低速、短时离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。(2)凝胶的预处理：用沸水浴法不但节约时间，而且除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。(3)色谱柱的装填：装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。(4)色谱柱成功的标志：红色区带均匀一致地移动。
4． 红细胞中含有大量的血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是 ( )
A．血红蛋白提取和分离一般按照样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定的顺序进行
B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液
C．粗分离中透析的目的是去除相对分子质量较小的杂质
D．可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定
答案 B
解析 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。提取和分离血红蛋白时，首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品处理；再通过透析法除去相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去，即样品纯化，纯化过程中凝胶应用蒸馏水充分溶胀后，配制成凝胶悬浮液，而不是用生理盐水；最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
1． 常用的蛋白质分离方法
(1)凝胶色谱法
蛋白质项目 相对分子质量大 相对分子质量小
凝胶内部 不能进入 能进入
运动方式 垂直向下 垂直向下和无规则扩散运动
经过路程 较短 较长
洗脱次序 先流出 后流出
(2)电泳法原理
①在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的作用下，带 电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
②由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带 电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
2． 分离DNA、PCR技术、分离蛋白质的比较
分离DNA PCR技术 分离蛋白质
实验原理 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精 利用DNA热变性原理体外扩增DNA 依据相对分子质量的大小不同来分离蛋白质
实验过程 选取材料→破碎细胞释放DNA→除杂→DNA析出与鉴定 变性→复性→延伸 样品处理→凝胶色谱操作
实验结果 获得较纯净的DNA 获得大量DNA 相对分子质量不同的蛋白质得以分离
实验意义 为DNA研究打下基础 解决了DNA研究中材料不足的问题 为蛋白质的研究和利用提供了原材料
3． 比较琼脂糖凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
考点五 植物有效成分的提取
1． 植物芳香油的提取
(1)提取玫瑰精油实验
①方法：水蒸气蒸馏法。
②实验流程
(2)提取橘皮精油的实验
①方法：一般用压榨法。
②实验流程
2． 胡萝卜素的提取
(1)胡萝卜素性质：不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。
(2)实验设计
①方法：萃取法，石油醚最适宜作萃取剂。
②实验流程
(3)鉴定方法：纸层析法。
易错警示 胡萝卜素粗品鉴定过程中的5个易错点
(1)层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显：为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。
(2)点样时点样圆点太大(直径大于2 mm)，导致最终在滤纸上形成一条线，无法辨认被提取的色素：点样圆点的直径应为2 mm。
(3)将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时不能将滤纸两边相互接触：以避免由于毛细管现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。
(4)层析液没及样品原点，色素溶解于层析液中，造成实验失败：层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。(5)没设置标准样品作对照：层析液中是否提取到胡萝卜素，可通过与标准样品中的β－胡萝卜素作对比予以确认。
5． 请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：
(1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、________和________。
(2)芳香油溶解性的特点是难溶于________________，易溶于______________，因此可用________________作为提取剂来提取芳香油。
(3)橘子果实含有芳香油，通常可用________作为材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是____________________________________________________
________________________。
(4)对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物获得乳状液可采用的方法是________。
(5)得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的________层，原因是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。加入氯化钠的作用是_________________________________________________________
______________________________。
(6)从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，其作用是___________________
_____________________________________________________。
答案 (1)蒸馏法 萃取法 (2)水 有机溶剂 有机溶剂(3)橘子皮 芳香油含量较高 (4)过滤 (5)上 油层的密度比水层小 增加水层密度，使油和水分层 (6)吸收芳香油中残留的水分
解析 植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、蒸馏法和萃取法。一般采用新鲜的橘子皮来提取芳香油，因为新鲜的橘子皮芳香油含量较高。除去液体中的固体常用的方法是过滤。芳香油密度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。无水硫酸钠可以吸收芳香油中残留的水分。
植物芳香油提取方法的比较
提取方法 水蒸气蒸馏法 压榨法 有机溶剂萃取法
实验原理 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂获得芳香油
方法步骤 ①水蒸气蒸馏②分离油层③除水过滤 ①石灰水浸泡、漂洗；②压榨、过滤、静置；③再次过滤 ①粉碎、干燥②萃取、过滤③浓缩
适用范围 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中
优点 简单易行，便于分离 生产成本低，易保持原料原有的结构和功能 出油率高，易分离
局限性 水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题 分离较为困难，出油率相对较低 使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量
1． (2012·江苏卷，18)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是 ( )
A．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B．将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C．常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取
D．用玻璃棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少
答案 C
解析 洗涤剂可瓦解细胞膜，有利于释放DNA，但不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度，A项错误；含DNA的丝状物应先溶解在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，再用二苯胺试剂在沸水浴条件下检测，冷却后变成蓝色，B项错误；常温下菜花匀浆中某些酶如DNA水解酶，其活性较高，会影响DNA的提取，C项正确；用玻璃棒缓慢搅拌滤液可防止DNA分子断裂，但不影响DNA的提取量，D项错误。
2． (2011·广东卷，5)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是 ( )
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
答案 D
解析 生理盐水为猪体细胞的等渗溶液，所以在洗涤红细胞时，使用生理盐水可维持细胞的正常形态，A项正确；由于哺乳动物的成熟红细胞缺少细胞核和各种细胞器，所以提纯时杂蛋白相对较少，B项正确；如果凝胶色谱柱装填得很成功，分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出，所以血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测，C项正确；当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后洗脱出来，D项错误。
3． (2012·山东卷，34)辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如下图：
(1)图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的________和__________过程。
(2)图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是________。培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值____(填“高”或“低”)时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是________________。
(3)图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是________。用酶解法将愈伤组织分离成单细胞时，常用的酶是__________和纤维素酶。
(4)提取辣椒素过程中，萃取加热时需安装冷凝回流装置，其目的是__________________
______________________________________________________。
答案 (1)脱分化(或去分化) 再分化 (2)琼脂 低 高压蒸汽灭菌 (3)70% 果胶酶 (4)防止有机溶剂的挥发
解析 (1)由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程称为脱分化，对脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可重新分化出根或芽等器官，这个过程叫做再分化。(2)培养基中常用的凝固剂是琼脂。同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比值大小影响植物细胞的发育方向，生长素和细胞分裂素用量的比值低时，有利于芽的分化；反之，有利于根的分化。培养基应用高压蒸汽灭菌法灭菌。(3)外植体消毒所用酒精的体积分数是70%。酶解法将愈伤组织分离成单细胞所用的酶是果胶酶和纤维素酶。(4)用萃取法提取植物有效成分时，应在瓶口安装冷凝回流装置，目的是防止加热时有机溶剂的挥发。
4． (2010·课标全国卷，37)下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：
(1)玫瑰精油适合用水蒸气蒸馏法提取，其理由是玫瑰精油具有_____________________
___________________________________________________
的性质。蒸馏时收集的蒸馏液________(是、不是)纯的玫瑰精油，____________________
____________________________________________________。
(2)当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和________。当原料量等其他条件一定时，提取量随蒸馏时间的变化趋势是______________________________________________________________________。
(3)如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会________，原因是__________________
______________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度________的地方，目的是____________________。
(5)某植物花中精油的相对含量随花的不同生长发育时期的变化趋势如图所示。提取精油时采摘花的最合适时间为________天左右。
(6)从薄荷叶中提取薄荷油时____(能、不能)采用从玫瑰花中 提取玫瑰精油的方法，理由是___________________________
_____________________________________________。
答案 (1)易挥发、难溶于水、化学性质稳定 不是 玫瑰精油与水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物 (2)蒸馏温度 在一定的时间内提取量随蒸馏时间的延长而增加，一定时间后提取量不再增加 (3)下降 部分精油会随水蒸气挥发而流失 (4)较低 减少挥发 (5)a (6)能 薄荷油与玫瑰精油的化学性质相似
解析 由于玫瑰精油易挥发，难溶于水，化学性质稳定，因此可以用水蒸气蒸馏法提取，冷却后必然含有水；蒸馏的提取效果与蒸馏的温度与蒸馏的时间有关，随着蒸馏时间的延长，原料中含有的精油减少，提取的量也会减少直至再也提不出精油。蒸馏过程中，如果不冷却，提取后的混合液温度较高，由于精油易挥发，其中的含量会降低；保存时，环境温度应较低为好，防止精油挥发；第(5)小题为信息题，主要考查学生的读图、识图及图文转化能力，根据图像可知，玫瑰精油在蓓蕾期、开放期之间花的含量较高，应在此时采收；由于薄荷精油与玫瑰精油的化学性质相似，可以采用相同的提取方法。
1． 在用果胶酶处理果泥时，为了使果胶酶能够充分地催化反应，应采取的措施是( )
A．加大果泥用量 B．加大果胶酶用量
C．进一步提高温度 D．用玻璃棒不时地搅拌反应混合物
答案 D
解析 用果胶酶处理果泥时，用玻璃棒不时地搅拌反应混合物，能使果胶酶与果胶充分接触，使果胶酶能够充分地催化反应。
2． 在“探究不同温度条件下加酶洗衣粉的洗涤效果”的实验中，变量控制方法正确的是
( )
A．实验材料的污染程度属于本研究的无关变量，实验过程中不必考虑
B．若采用手洗法进行去污操作，需尽可能保证各组的洗涤用力程度、时间等基本相同
C．水温属于本研究的变量，实验过程中必须保证各组实验温度相同且恒定
D．水的用量和布料的大小是成正比的，实验用的布料越大、水量越多实验效果越好
答案 B
解析 根据实验设计的对照原则和单一变量原则，水温是本研究的自变量，要有温度梯度，各组实验温度不能相同，其他的无关变量要保持适宜且相同。该实验用的布料大小、水量要适中，不是布料越大、水量越多实验效果越好。
3． 如图为胡萝卜的离体组织在一定条件下培育形成试管苗的过程示意图。下列有关叙述正确的是 ( )
A．①和②过程中都会发生细胞的增殖和分化
B．在利用单倍体育种法培育优质小麦的过程中，不经过愈伤组织阶段
C．此过程依据的生物学原理是细胞膜具有流动性
D．利用此过程获得的试管苗可能为杂合子
答案 D
解析 ①表示脱分化，②表示再分化。①过程中发生细胞的有丝分裂，不发生分化；利用单倍体育种法培育优质小麦的过程中，需采用花药离体培养技术，要经过愈伤组织阶段；植物组织培养过程依据的生物学原理是植物细胞的全能性；此过程是无性生殖，获得的试管苗的遗传物质取决于取材个体，因此可能为杂合子。
4． 下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述中，错误的是 ( )
A．可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质
B．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质
C．透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜
D．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法
答案 A
解析 猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。
5． 假设你已经探究了果胶酶的最适温度(为45 ℃)和最适pH(为 4.8)，若还想进一步研究果胶酶的最适用量，此时，实验的自变量是______________________。合理设置果胶酶用量的梯度后，可通过苹果泥出汁的多少来判断酶的用量是否合适。请根据所给的材料和用具完成以下探究实验。
(1)材料用具：制备好的苹果泥、恒温水浴装置、试管、漏斗、滤纸、量筒、试管夹、质量分数为2%的果胶酶溶液、质量分数为0.1%的NaOH溶液和盐酸。
(2)实验步骤：
①取6支试管，编号为1～6，分别加入________________________，调节pH至4.8。
②向1～6号试管中分别加入________________________，然后放入45 ℃恒温水浴装置中____________。
③________________________________________________________________________。
(3)以上实验步骤的设计是否有不妥之处？如果有，试分析原因。____________________
____________________________________________________。
答案 果胶酶的用量 (2)①等量的苹果泥 ②不同体积的pH为4.8的果胶酶溶液 保温相同时间 ③过滤苹果泥并记录果汁体积 (3)有。为了保证苹果泥与果胶酶混合前后的温度相同，应先将盛苹果泥和果胶酶的试管放在同一温度的水浴装置中恒温，再将两者混合
解析 在探究影响果汁产量的酶的用量时，除酶的用量是变量外，其他条件都应相同且适宜。为了避免因混合导致温度变化而影响实验结果，应先将盛苹果泥的试管和盛不同量酶的试管放到相同温度下恒温，然后将两者混合。
6． 下面是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答：
活化酵母细胞→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。
(1)在________状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复________状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时______________。
(2)如果海藻酸钠溶液浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞数目____________，影响实验效果。
(3)观察形成凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明___________________________；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明__________________________________。
(4)固定化细胞技术一般采用包埋法，原因是____________。
答案 (1)缺水 正常的生活 体积会增大 (2)少 (3)海藻酸钠溶液浓度偏低 海藻酸钠溶液浓度偏高，制作失败 (4)细胞个大，不易从包埋材料中漏出
解析 (1)酵母菌在干燥时，处于休眠状态，需加水活化，否则制成的固定化酵母细胞在发酵时酶活性较低且酵母菌增殖缓慢。(2)如果海藻酸钠溶液的浓度过低，则形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。(3)如果制作的凝胶珠颜色过浅或呈白色，说明海藻酸钠溶液的浓度偏低；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明海藻酸钠溶液的浓度偏高，制作失败，需要再尝试。(4)由于细胞个大，不易从包埋材料中漏出，故细胞的固定化一般采用包埋法。
7． 下图是月季的花药离体培养产生花粉植株的两种途径，请据图回答有关问题：
(1)选用的材料合适与否是能否成功诱导出花粉植株的关键。一般来说，选用________期的花粉可提高成功率。选择花药时，一般要通过____________来确定其中的花粉是否处于合适的发育期，这时需要对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是____________。
(2)上图中花粉经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中______________
__________________________________________。
(3)胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织的细胞排列疏松、无规则，是一种高度________的薄壁细胞，胚状体与____________发育形成的胚有类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。
(4)试管苗移栽到土壤前，通常要进行壮苗处理，应如何壮苗？
________________________________________________________________________。
答案 (1)单核 镜检(显微镜观察) 醋酸洋红 (2)激素的种类及其浓度配比 (3)液泡化 正常受精卵(或受精卵)(4)将试管苗移栽到经过消毒的培养基中生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到土壤中
解析 (1)单核期花粉对离体刺激较敏感，选用该期花粉可提高培养的成功率；选择花粉时可用显微镜观察进行筛选；对花粉细胞核进行染色应选择碱性染料，常用醋酸洋红。(2)花药离体培养成植株的两条途径之间没有明显的界限，主要取决于植物激素的种类及比例。(3)愈伤组织细胞的特点为细胞排列疏松、无规则、高度液泡化；胚状体具有与胚相似的胚根、胚轴和胚芽等结构。(4)壮苗是使试管苗进一步适应外界环境的做法。
8． PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物，请据图回答相关问题：
(1)PCR的全称是______________________。PCR与体内DNA复制的不同之外主要表现在温度环境的不同，在PCR技术中先用95 ℃高温处理的目的是____________，而这一过程在细胞内是通过____________实现的。
(2)在PCR技术中所需要的引物实质上是一种__________________________。请在图中绘出引物结合的位置。
(3)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入____________个引物。
(4)DNA子链复制的方向是____________，这是由于_______________________________
_________________________________________________________________________。
答案 (1)多聚酶链式反应 使DNA变性(使DNA的两条链解开) 解旋酶的催化 (2)单链DNA或RNA分子 如图所示
(3)211－2 (4)从5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接单个脱氧核苷酸分子
解析 PCR技术又称多聚酶链式反应。在PCR技术中，用95 ℃高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，两条链解开，即使DNA分子变性。引物是一种单链DNA或RNA分子，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供吸附位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从5′端到3′端。在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，即2×210－2＝211－2(个)。2014年高考生物大一轮复习 第十一单元 第42讲 传统发酵技术的应用教案
1． 涵盖范围
本单元包括选修1全部内容——微生物的培养与传统发酵技术及实践应用；植物的组织培养技术及DNA和蛋白质的提取与分离技术；酶的研究和实践应用；植物有效成分的提取方法、过程及注意事项。
2． 考情分析
考查力度：相对固定，如山东理综只出一个8分的简答题。
考查内容及形式：
(1)微生物的培养与应用多以简答题形式考查。
(2)酶的研究与应用，常与必修1中酶的本质、特性等知识有机结合考查。
(3)植物的组织培养技术常与植物有效成分提取相结合考查。
(4)传统发酵技术及实践应用多以简答题形式考查。
(5)酶的研究、DNA和蛋白质提取技术多以选择题形式考查。
3． 复习指导
(1)复习线索
①以转基因——微生物培养——酶生产——酶应用为线索，系统复习微生物培养技术、酶的研究和实践应用。
②以技术手段、技术流程为主线，复习发酵、组织培养、有效成分及DNA、蛋白质提取等有关知识。
(2)复习方法
①列表比较法——DNA、蛋白质的提取与分离。
②实践联系——发酵技术、植物有效成分提取技术。
③实验联系——植物组织培养、微生物培养实验过程。
第42讲 传统发酵技术的应用
[考纲要求] 1.运用发酵加工食品的基本方法。2.测定食品加工中可能产生的有害物质。3.利用微生物进行发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用。
考点一 果酒和果醋的制作
1． 完善制作原理和发酵条件
果酒制作 果醋制作
制作原理 菌种 酵母菌 醋酸菌
反应 有氧条件下，大量繁殖：C6H12O6＋6O2＋6H2O―→6CO2＋12H2O无氧条件下，酒精发酵：C6H12O6―→2C2H5OH＋2CO2 氧气、糖源充足时：C6H12O6＋2O2―→2CH3COOH＋2CO2＋2H2O缺少糖源、氧气充足时：C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O
发酵条件 最适发酵温度 18～25_℃ 30～35_℃
空气 前期：需氧；后期：不需氧 需要充足的氧气
时间 10～12 d 7～8 d
2． 完善制作流程
3． 判断正误
(1)在果酒自然发酵中，需人工添加酵母菌种 ( × )
(2)红葡萄酒中的红色是红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的 ( √ )
(3)变酸的酒的表面的菌膜是酵母菌大量繁殖形成的 ( × )
(4)在葡萄酒制作中，采摘的葡萄应反复冲洗，且要先除枝梗再冲洗 ( × )
易错警示 果酒和果醋制作中的几点注意事项
(1)酿酒和酿醋所利用的微生物不同：前者为酵母菌——真核生物；后者为醋酸菌——原核生物。二者本质区别是有无以核膜为界限的细胞核。
(2)制作果酒使用的葡萄应先冲洗，再除去枝梗，不能反过来，以免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。对于果酒的自然发酵，冲洗不要反复进行，以免使酵母菌数量减少，发酵周期加长，产生的果酒中酒精含量下降。
(3)酵母菌进行有氧呼吸时，产生能量多，可大量繁殖；进行无氧呼吸时，产生能量少，仅能满足自身代谢，基本不繁殖；所以利用酵母菌进行工业生产时先进行通气再密封。
(4)防止发酵液被污染
榨汁机要清洗干净并晾干，发酵瓶要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒；装入葡萄汁后要封闭充气口。
(5)发酵后酒精的检验及对照原则
①检验
→3 mol/L的H2SO4 3滴→振荡混匀→重铬酸钾溶液3滴→振荡试管→观察
→3 mol/L的H2SO43滴→振荡混匀→重铬酸钾溶液3滴→振荡试管→观察
②对照
两种对照方式都必须遵循单一变量原则：前者是标准对照，后者是自身对照。
1． 下列关于果酒和果醋制作的叙述，正确的是 ( )
A．在制作果酒和果醋实验中，一直保持厌氧环境
B．温度对酵母菌酒精发酵的影响很大，而对醋酸菌的发酵影响不大
C．当氧气、糖源充足时，醋酸菌能将果汁中的糖发酵为醋酸
D．由于酵母菌的繁殖能力很强，不需对所用装置进行消毒处理
答案 C
解析 酒精发酵用酵母菌，温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20 ℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵时一般将温度控制在18～25 ℃。同样，醋酸发酵用醋酸菌，应将温度严格控制在30～35 ℃。发酵过程应注意防止杂菌污染，需要对所用装置进行消毒处理。
2． (2010·江苏卷，7)下图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是
( )
A．过程①和②都只能发生在无氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母细胞的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
答案 C
解析 酵母菌是兼性厌氧型微生物，有氧条件下进行有氧呼吸，无氧条件下进行无氧呼吸；醋酸菌是好氧细菌，在糖源缺乏时可将乙醇氧化为醋酸。由图可见，①过程是葡萄糖在细胞质基质里分解为丙酮酸，在有氧或无氧条件下都能进行；②过程是在无氧条件下，酵母菌将丙酮酸氧化分解为乙醇和水；③过程是在有氧条件下，酵母菌线粒体里完成有氧呼吸的第二、三阶段，需要氧气和水的参与；④过程是在氧气充足、糖源缺乏的条件下，醋酸菌将乙醇氧化为醋酸。酵母菌发酵的最适温度为18～25 ℃，醋酸菌发酵的最适温度为30～35 ℃。
1． 果酒和果醋的制作步骤的比较
制果酒 制果醋
相同过程 ①选材和材料处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物后，再去枝梗②制作发酵液，防止杂菌污染③发酵：将葡萄汁注入发酵瓶，注意液体量不要超过发酵瓶总体积的2/3
不同过程 ①一般将温度控制在18～25 ℃，时间控制在10～12 d左右。发酵旺盛期的CO2产量非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂②检测指标：7～10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以嗅味和品尝、用重铬酸钾检验酒精含量，进行酵母菌的镜检、测定pH等工作 ①将温度严格控制在30～35 ℃，并注意适时通过充气口充气②检测指标：果醋的制作是否成功可以通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的pH进一步鉴定。还可以在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量作进一步鉴定
2． 装置图解读
(1)各部位的作用
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管：加水后防止空气中微生物的污染。
③出料口：是用来取样的。
(2)该装置的使用方法
使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。考点二 腐乳的制作
1． 完善制作原理
(1)菌种：需多种微生物协同作用，其中起主要作用的是毛霉。
(2)菌种作用特点
①蛋白质氨基酸＋小分子肽
②脂肪甘油＋脂肪酸
2． 完善制作流程
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
3． 完善影响腐乳品质的条件
(1)卤汤成分：酒及各种香辛料。
①酒的作用：抑制微生物的生长，又能使腐乳具有独特的香味。
②香辛料的作用：调制腐乳风味，防腐杀菌。
(2)盐的用量
①浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质。
②浓度过高，会影响腐乳的口味。
(3)酒的含量：一般控制在12%左右。
易错警示 (1)传统腐乳制作与现代腐乳生产的区别
①条件：传统腐乳制作不需要灭菌，现代腐乳生产必须在严格无菌条件下进行；
②菌种传统腐乳制作，菌种来自空气中的毛霉孢子；现代腐乳生产，菌种是经过筛选的优良毛霉菌种，并且直接接种在豆腐上。
(2)豆腐及腐乳的营养成分不同
豆腐由大豆直接磨制而成，其成分与大豆成分相同。大豆富含蛋白质，其含量高达36～40%，常食用大豆或大豆制品，可有效补充食物中的蛋白质。大豆中含脂肪约8%，同时还含有硫胺素、尼克酸、维生素A以及钙、磷、铁等矿物质，对人体具有良好的保健作用。
腐乳是豆腐在毛霉的发酵下形成的。由于毛霉能产生蛋白酶和脂肪酶，可将豆腐中的蛋白质和脂肪分别分解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸等小分子物质，所以其味道鲜美，易于消化吸收。
3． 下列关于腐乳制作的叙述，错误的是 ( )
A．毛霉可利用其体内的酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸
B．卤汤中酒的含量越高，杂菌繁殖越快，豆腐越易腐败
C．用盐腌制腐乳的过程中，要控制盐的用量，盐的浓度过高会影响口味，过低则不足以抑制杂菌的生长，导致豆腐腐败
D．其制作过程可以表示为：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
答案 B
解析 豆类中含量最多的有机物是蛋白质，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸。卤汤中酒的含量过高，腐乳成熟的时间将会延长；卤汤中酒的含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，可能导致豆腐腐败。
腐乳制作条件的控制
1． 盐：长满毛霉的豆腐块(毛坯)与盐的质量比为5∶1。
2． 酒的用量：卤汤中酒的含量应控制在12%左右为宜。酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量过高，对蛋白酶的抑制作用越大，则腐乳成熟期越长；若酒精含量过低，则蛋白酶的活性高，蛋白质水解得快，杂菌繁殖也快，豆腐易腐败，难以成块。
3． 发酵的温度：前期发酵温度应保持在15～18 ℃，并保持一定的时间，以利于毛霉的生长。
4． 香辛料：具有调味和杀菌的作用，也会影响腐乳的风味或质量。
5． 防止杂菌污染的措施
(1)用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。
(2)装瓶时操作要迅速小心，装瓶后要用胶条密封，且最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染，进而影响腐乳风味。
考点三 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
1． 完善泡菜的制作
(1)制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
(2)制作流程
(3)操作关键
①泡菜坛的选择：火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
②腌制的条件：控制腌制的时间、温度和食盐的用量。防止杂菌污染，严格密封。
2． 检测亚硝酸盐含量
(1)原理
①亚硝酸盐＋对氨基苯磺酸→反应物；
反应物＋N－1－萘基乙二胺盐酸盐→玫瑰红色染料。
②亚硝酸盐溶液的浓度越高，颜色越深；浓度越低，颜色越浅。
(2)流程
→→→
(3)用显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行对比，并估算泡菜中亚硝酸盐的含量。
3． 判断正误
(1)泡菜制作的菌种主要是醋酸菌 ( × )
(2)泡菜制作的前期通氧，后期应严格厌氧 ( × )
(3)配制盐水时，盐与水的质量比为4∶1 ( × )
易错警示 (1)由于醋酸菌和乳酸菌属于原核生物，因此在利用这两类微生物时，其环境中一定不要加入青霉素等抗生素。
(2)亚硝酸盐与人体健康的关系
①膳食中绝大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”的形式随尿排出，但当摄入总量较多时，可引起中毒或死亡。
②亚硝酸盐在一定条件下可转化为致癌、致畸和致突变的物质——亚硝胺。
(3)亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的。
(4)应该从原料、装置和实验过程三个层次进行无菌操作。
4． 某综合实践活动小组进行了“探究泡菜在腌制过程中亚硝酸盐的含量变化”的实验。下图为泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图，下表为测量结果：
亚硝酸盐含量(mg/kg) 封坛前 第4天 第8天 第12天 第16天
1号坛 0.15 0.6 0.2 0.1 0.1
2号坛 0.15 0.2 0.1 0.05 0.05
3号坛 0.15 0.7 0.6 0.2 0.2
请根据上述情况，回答下列问题：
(1)制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜，原因是_____________________________________。
(2)制备泡菜的盐水中清水与盐的质量比约为__________，为什么盐水需煮沸并冷却后才可使用？_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为确保发酵过程所需的无氧环境，应注意__________________________________
________________________________________________________________________。
(4)实验中3只坛中产生的亚硝酸盐含量存在差异，最可能的原因是___________________
_____________________________________________________。
(5)测定亚硝酸盐含量的方法是_________________________________________________
_______________________。
答案 (1)亚硝酸盐含量低
(2)4∶1 加热煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响
(3)经常补充坛盖边沿水槽中的水
(4)各坛中微生物种类和数量可能存在差异
(5)比色法
解析 (1)有些蔬菜中含有丰富的硝酸盐，这些蔬菜放置过久，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。
(2)注意从煮沸和冷却两个方面说明操作的意图。
(3)成功制作泡菜的关键是营造无氧环境，常用的方法是将坛口用水封好，防止外界空气进入。因此要经常补充坛盖边沿水槽中的水。
(4)泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖(包括一些硝酸盐还原菌)，这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。可见，亚硝酸盐的含量与坛内的微生物种类和数量有关。
(5)测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合，使溶液呈玫瑰红色。将显色反应后的待测样品与已知浓度的标准显色液对比，即可大致估算出样品中亚硝酸盐的含量。
1． 与传统发酵有关的几类微生物的比较
酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
生活方式 异养兼性厌氧 异养需氧 异养需氧 异养厌氧
适宜温度 20 ℃左右 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
主要生殖方式 适宜条件下出芽生殖 二分裂生殖 孢子生殖 二分裂生殖
主要用途 酿酒、发面 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
2． 泡菜制作的注意事项
(1)材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
(3)氧气需求
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛内要注满水，以保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(4)温度：发酵过程温度控制在室温即可，最好在26～36 ℃。温度过高，则易滋生杂菌；温度过低，则发酵时间延长。
3． 泡菜制作过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化情况分析
发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
发酵初期 少(有氧气，乳酸菌活动受到抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌作用)
发酵中期 最多(乳酸抑制其他菌活动) 积累增多，pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵后期 减少(乳酸积累，pH下降，抑制其活动) 继续增多，pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
4． 乳酸菌、乳酸、亚硝酸盐的数量随时间变化的曲线
1． (2012·江苏卷，21)下列关于制作果酒、果醋和腐乳的叙述，合理的是(多选) ( )
A．在果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可延长
B．条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸
C．果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小
D．将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量
答案 ABC
解析 果酒发酵后期，因营养物质的消耗、反应物减少等，酵母菌无氧呼吸产生CO2的量减少，所以可延长拧松瓶盖的间隔时间，A项正确；当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸，B项正确；果酒发酵过程中不断消耗葡萄糖等营养物质，产生的酒精使发酵液的密度逐渐减小，C项正确；制作腐乳时，对长满毛霉的豆腐加盐腌制时，需逐层加盐，并随层数加高而增加用盐量，在近瓶口处要铺得厚一些，D项错误。
2． (2010·广东卷，25)小李尝试制作果酒，他将葡萄汁放入已灭菌的发酵装置中进行实验(见右图)，恰当的做法是(多选) ( )
A．加入适量的酵母菌
B．一直打开阀b通气
C．一直关紧阀a，偶尔打开阀b几秒钟
D．把发酵装置放到4 ℃冰箱中进行实验
答案 AC
解析 酵母菌在无氧环境中可以利用葡萄糖进行发酵，产生酒精，果酒的制作即应用了此原理。4 ℃的环境不利于酵母菌进行发酵。
3． (2012·海南卷，30)回答下列关于腐乳制作的问题。
(1)腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是__________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为__________和____________；其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和__________。
(2)发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制____________生长。
(3)腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的____________。
答案 (1)毛霉 小分子的肽 氨基酸 脂肪酶 甘油 脂肪酸 (2)微生物 (3)风味
解析 (1)腐乳是以豆腐为原料，在毛霉以及多种微生物参与下发酵而制成的食品，富含易被人体吸收的多种营养物质，如多肽、氨基酸等。腐乳制作过程中，豆腐中的蛋白质在蛋白酶的作用下被水解为小分子的肽，进而在肽酶的作用下被水解为各种氨基酸；脂肪在脂肪酶的作用下被分解为甘油和脂肪酸。(2)在发酵完成后的腌制过程中，盐能抑制微生物的生长，防止豆腐块腐败变质。(3)卤汤除能防腐外，还可使腐乳具有独特的风味。
4． (2009·浙江自选，17)下面是有关食醋和泡菜制作的实验。请完成下列问题：
(1)食醋可用大米为原料经三步发酵来制作。
第一步：大米经蒸熟、冷却后加入淀粉酶，将原料中的淀粉分解成________(填中间产物)，然后进一步分解成葡萄糖，这一过程可用________(填淀粉指示剂)来检测，因为该试剂遇淀粉呈蓝色，遇上述中间产物呈红色。
第二步：用________菌将葡萄糖转化成乙醇，这一发酵过程中，玻璃发酵瓶不应完全密闭的主要原因是___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
第三步：用______________菌将乙醇转化成乙酸，这一过程____________氧气。
(2)泡菜发酵过程中，会产生多种酸，其中主要是____________________________，还有少量的亚硝酸。对亚硝酸盐的定量测定可以用__________________法，因为亚硝酸盐与对氨基苯磺酸的反应产物能与N—1—萘基乙二胺盐酸盐偶联成________色化合物。进行样品测定时，还要取等量水进行同样的测定，目的是________________。
答案 (1)糊精 碘液 酵母 发酵过程中会产生大量CO2，使瓶内压力升高而可能引起爆裂 醋酸 需要消耗 (2)乳酸(或有机酸) (光电)比色 玫瑰红 作为对照
解析 (1)大米经蒸熟、冷却后加入淀粉酶(淀粉酶必须冷却后加入，因为酶在高温时会变性失活)，大米的主要成分是淀粉，在淀粉酶催化作用下，分解成糊精(主要含麦芽糖等)，这一过程可用碘液(或KI－I2溶液)来检测。酵母菌将葡萄糖转化成乙醇的过程中产生CO2，随着反应的进行， 发酵瓶中CO2逐渐增多，瓶内压力升高，可能引起爆裂，所以不要完全密闭。醋酸菌是好氧细菌，在将乙醇转化成乙酸的过程中消耗氧气。(2)泡菜发酵过程中离不开乳酸菌，其产生的酸主要是乳酸，还有少量的亚硝酸。亚硝酸盐总量达到0.3～0.5 g时就会引起人中毒，必须对泡菜中亚硝酸盐含量进行测定，其测定可用比色法。
1． 下列关于果酒和果醋制作的叙述，不正确的是 ( )
A．制作果酒时瓶口要密闭，而制作果醋时中断通氧可能会引起醋酸菌死亡
B．在变酸的果酒表面观察到的菌膜是醋酸菌在液面大量繁殖而形成的
C．温度对酵母菌进行酒精发酵的影响很大，而对醋酸菌进行的发酵影响不大
D．制作果酒和果醋时都应用体积分数为70%的酒精对发酵瓶进行消毒，并注意无菌
操作
答案 C
解析 制作果酒利用的是酵母菌，制作果醋时利用的是醋酸菌。温度对酵母菌进行酒精发酵和醋酸菌进行的发酵都有影响。
2． 某同学在制作腐乳的过程中，发现豆腐腐败变质，下列不属于其原因的是 ( )
A．用盐腌制时，加盐太少
B．用来腌制腐乳的玻璃瓶，没有用沸水消毒
C．制作卤汤时，加的料酒过多
D．装瓶后，没有将瓶口密封
答案 C
解析 豆腐腐败变质是杂菌繁殖造成的。用来腌制腐乳的玻璃瓶，没有用沸水消毒；装瓶后，没有将瓶口密封；用盐腌制时，加盐太少或制作卤汤时加料酒太少都会导致杂菌大量繁殖。相反，如果料酒加入过多，则不会导致杂菌大量繁殖。
3． 在果酒、果醋和腐乳制作过程中，都要防止微生物污染，下列有关叙述正确的是
( )
A．果醋发酵阶段应封闭充气口，防止杂菌进入
B．腌制腐乳的卤汤中应含有12%左右的酒以抑制细菌的增殖
C．利用自然菌种发酵果酒时，将封有葡萄汁的发酵瓶进行高压灭菌
D．将长满毛霉的豆腐放在瓶中，并逐层加盐，接近瓶口部分的盐要铺薄一些
答案 B
解析 醋酸菌是好氧细菌，发酵时需要通入无菌空气；利用自然菌种发酵时利用的就是葡萄汁中的酵母菌，高压灭菌会杀死酵母菌；腐乳制作过程中，装瓶时靠近瓶口部分的盐要铺厚一些。
4． 下列与传统发酵有关的微生物的比较中 ，不正确的是 ( )
A B C D
微生物 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
生活方式 异养兼性厌氧 异养需氧 异养需氧 异养厌氧
适宜温度 18～25 ℃ 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
主要用途 酿酒、发面 酿醋、酸奶 制作腐乳 制作泡菜
答案 B
5． 葡萄发酵可产生葡萄酒，请利用相关的知识回答问题。
(1)利用葡萄制作葡萄酒的过程中，发挥作用的微生物是________。
(2)该微生物通过无氧呼吸可分解________，产生的终产物是________和________。
(3)甲、乙、丙三位同学将葡萄榨成汁后分别装入相应的发酵瓶中，在温度等适宜的条件下进行发酵，如上图所示。发酵过程中，每隔一段时间均需排气一次。据图分析，甲和丙同学的操作有误，其中甲同学的错误是_____________________________________，
导致发酵中出现的主要异常现象是__________________________。丙同学的错误是____________________________，导致发酵中出现的主要异常现象是______________________________。上述发酵过程结束后，甲、乙、丙同学实际得到的发酵产品依次是________、________、________。
(4)在上述制作葡萄酒的过程中，假设乙同学的某一步骤操作错误导致发酵瓶瓶塞被冲开，该错误操作是________________________________________________________。
答案 (1)酵母菌 (2)葡萄糖 乙醇 CO2
(3)未夹住发酵瓶的充气管 发酵液从充气管流出，发酵液变酸 瓶中发酵液过多，淹没了排气管在瓶内的管口 排气时发酵液从排气管流出 葡萄醋(或果醋) 葡萄酒(或果酒) 葡萄酒(或果酒)
(4)未及时排气
解析 酵母菌无氧呼吸可以产生酒精和CO2，是葡萄酒制作过程中发挥作用的微生物。酵母菌只有在无氧条件下，才能进行无氧呼吸产生酒精；甲装置的充气口始终开放，不能创造瓶内无氧环境，故不能用来生产葡萄酒；在有氧条件下，醋酸菌能利用葡萄糖产生醋酸。酵母菌在发酵过程中产生的CO2导致乙装置中气压升高，故要定期打开排气管进行放气。丙装置发酵瓶中发酵液过多，淹没了排气管在瓶内的管口，不利于放气；同时导致瓶内氧气过少，不利于发酵前期酵母菌的大量繁殖。
6． 腐乳，又称乳腐或豆腐乳，是我国著名的民族特色发酵食品之一。其滋味鲜美，酱香宜人，制作历史悠久，品种多样，主要有红方腐乳、酱腐乳和白腐乳等，而红曲酱腐乳既具有红方腐乳适宜的天然红曲色泽，又具有酱腐乳特有的浓郁的酱醋香味，深受人们的喜爱，具有广阔的市场前景。某兴趣小组按照以下工艺流程制作红曲酱腐乳，请据图回答：
(1)现代科学研究表明，许多种微生物参与了豆腐的发酵，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种______状真菌。
(2)在腐乳制作的过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成____________和____________，____________将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
(3)传统的制作过程中，豆腐块上生长的毛霉来自__________________。而现代的腐乳生产是在严格的无菌条件下，将优良的毛霉菌种接种在豆腐上，这样可以________________
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(4)搓毛是将长满菌丝的白坯用手扶抹，让菌丝裹住坯体，其目的是___________________
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(5)在逐层加盐腌坯的过程中，随层数的加高而__________盐量，接近瓶口要____________铺一些。
(6)红曲酱卤是由红曲、面酱、黄酒按一定的比例配制而成的，加入黄酒的作用是________________________________________________________________________
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答案 (1)丝 (2)小分子的肽 氨基酸 脂肪酶
(3)空气中的毛霉孢子 避免其他菌种的污染，保证产品的质量
(4)防止腐乳烂块 (5)增加 多
(6)抑制微生物的生长，使腐乳具有独特的香味
解析 (1)豆腐发酵有多种微生物参与，其中毛霉起主要作用，毛霉是一种丝状真菌。(2)毛霉等微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。在多种微生物的协同作用下，豆腐转变成腐乳。(3)传统制作中，豆腐上的毛霉来自空气中的毛霉孢子，现代腐乳生产是在无菌条件下，将优良的毛霉菌种接种在豆腐上，避免其他菌种的污染，保证产品的质量。(4)搓毛促进毛霉覆盖整块腐乳，以防止其他微生物的污染导致腐乳烂块。(5)加盐的作用是析出豆腐中的水分，使豆腐变硬，在后期制作中不会过早酥烂。同时盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。(6)加酒可以抑制微生物的生长，同时使腐乳具有独特的香味，以防腐乳烂块。
7． 我国利用酵母菌酿酒的历史悠久，其中安徽就盛产诸多名酒。除了酿酒，利用乳酸菌发酵生产泡菜、利用毛霉等生产腐乳和利用醋酸菌发酵生产食醋等更是家喻户晓。据此回答以下问题：
(1)安徽怀远盛产石榴，石榴酒也是当地的特产。利用石榴发酵制作石榴酒的过程中，发酵装置内加入石榴汁后要留约1/3的空间，目的是_________________________________
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(2)下面是利用石榴生产果酒和果醋的流程，④过程是在酒精发酵液中接种醋酸菌，如果酒精发酵液中糖分消耗殆尽，则此时醋酸发酵的反应简式为_________________________
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(3)相传，腐乳是一位进京赶考的安徽举人王致和无意间发明的。利用毛霉制作腐乳是因为毛霉能够产生两种酶，即____________________。
答案 (1)有利于酵母菌进行有氧呼吸从而快速繁殖；防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出
(2)C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O
(3)蛋白酶和脂肪酶
解析 (1)果酒发酵装置留约1/3的空间，目的是有利于酵母菌进行有氧呼吸从而快速繁殖及防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。(2)醋酸菌在有氧状态下，可把葡萄糖分解成醋酸，如果发酵液中缺乏糖类，其可把乙醇转化成乙醛进而转化成醋酸。(3)腐乳制作过程中利用毛霉产生的蛋白酶把蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶把脂肪分解成甘油和脂肪酸，这样豆腐变成了风味独特的腐乳。
