课件31张PPT。课题1 DNA的粗提取与鉴定DNA和蛋白质技术 DNA的提取是现代生物技术进行
中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有
效提取要求材料中的DNA尽可能少的
降解。但用于生药真实性鉴别的药材
在干燥、加工、贮藏等过程中均造成
了DNA不同程度的降解，一般DNA的
含量也比较低。药材中次生代谢产物含量较高，会干扰提取。另外也可能有微生物引起的外源DNA的污染。DNA的质量将直接关系到实验的成败。不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。本课题将为你提供从生物体内直接提取DNA的机会。知识清单DNA的粗提取和鉴定1．DNA的粗提取
(1)基本思路：利用DNA与______、________和______等在物理和化学性质方面的______，提取DNA，去除其他成分。
(2)方法和原理
①DNA和________等其他成分在不同浓度的______溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的________就能使DNA充分溶解，而使______沉淀，或者相反，以达到分离目的。1．(1)RNA 蛋白质 脂质 差异
(2)①蛋白质 NaCl 盐浓度 杂质②DNA不溶于______，但是某些______则可溶于其中。
③______能水解蛋白质，但是对______没有影响。
④大多数蛋白质不能忍受________的高温而发生变性，而DNA在________以上才会变性。
⑤________能瓦解细胞膜，但对DNA无影响。
2．DNA的鉴定
在沸水浴的条件下，DNA遇________会被染成蓝色。②酒精 蛋白质 ③蛋白酶 DNA ④60～80 ℃ 80℃ ⑤洗涤剂
2．二苯胺尝试应用1．DNA在下列浓度的NaCl溶液中，溶解度最低的是( )
A．2 mol·L－1 B．0.015 mol·L－1
C．0.14 mol·L－1 D．5 mol·L－1 解析：DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度最高，在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，并且DNA在冷却的酒精溶液中会析出白色丝状物。
答案：C
?D2．鉴定DNA的试剂及出现的颜色反应是( )
A．斐林试剂、砖红色 B．苏丹Ⅲ染液、橘黄色 C．双缩脲试剂、紫色 D．二苯胺试剂、蓝色知识清单实验设计1．选取实验材料：选用________的生物组织，成功的可能性更大。
2．破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的________，同时____________，过滤后收集滤液即可。如果是植物细胞，需要先用________溶解________。
3．去除滤液中杂质
(1)方案一：通过控制________的浓度去除______。1．DNA含量较高
2．蒸馏水 用玻璃棒搅拌 洗涤剂 细胞膜
3．(1)NaCl溶液 杂质 (2)方案二：直接向滤液中加入____________，反应10～15 min，________中的________能够分解蛋白质。
(3)方案三：将滤液放在________的恒温水浴箱中保温10～15 min，注意严格控制温度范围，使________沉淀析出而________分子还未变性，可以将DNA与蛋白质分离。
4．DNA的进一步提纯
利用DNA不溶于冷却的________这一原理，可从______中析出较纯净的DNA，此时DNA的状态为__________。(2)嫩肉粉 嫩肉粉 木瓜蛋白酶
(3)60～75 ℃ 蛋白质 DNA
4．95%酒精 滤液 白色丝状物5．DNA的析出与鉴定
(1)DNA的析出：DNA的析出用的是与滤液体积相等的、______的______溶液。
(2)DNA鉴定：鉴定DNA时在试管中先加入物质的量浓度为________的NaCl溶液5 mL。两支试管中其中一支加入DNA丝状物，各加入二苯胺________。
在沸水浴的条件下，DNA遇__________会被染成蓝色，因此__________可以作为鉴定DNA的试剂。5．(1)冷却 酒精 (2)2 mol/L 4 mL 二苯胺 二苯胺5．DNA的析出与鉴定
(1)DNA的析出：DNA的析出用的是与滤液体积相等的、______的______溶液。
(2)DNA鉴定：鉴定DNA时在试管中先加入物质的量浓度为________的NaCl溶液5 mL。两支试管中其中一支加入DNA丝状物，各加入二苯胺________。
在沸水浴的条件下，DNA遇__________会被染成蓝色，因此__________可以作为鉴定DNA的试剂。5．(1)冷却 酒精 (2)2 mol/L 4 mL 二苯胺 二苯胺尝试应用1．提取DNA最好不要选用的材料是( )
A．鸡血 B．花椰莱
C．鱼卵 D．羊血 解析：哺乳动物成熟的红细胞中已经没有了细胞器和细胞核，所以不能选用成熟的哺乳动物红细胞作为提取DNA的原料。
答案：D2．在DNA的粗提取实验过程中，有两次DNA沉淀析出，其依据的原理是( )
①DNA在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低 ②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出
A．两次都是①
B．两次都是②
C．第一次是①，第二次是②
D．第一次是②，第二次是①C 一、提取DNA选用鸡血，不用哺乳动物血的原因
哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，不能用作提取DNA的材料；而鸡血细胞的细胞核中DNA含量丰富，材料易得，是提取DNA的好材料。
二、析出DNA用冷却95%酒精的原因
DNA溶于一定浓度的NaCl溶液，但不溶于酒精，而冷却的酒精可以降低分子运动，有利于DNA的聚合、析出，同时低温有利于增加DNA分子的柔韧性以减少断裂，便于用玻璃棒卷起，此外冷却的酒精还可以降低并抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解，从而提取到较多的DNA物质。
可以通过设置对照实验，向含有DNA物质的滤液中分别加入等体积的体积分数为95%的冷却酒精和常温态酒精，比较最终获得的白色丝状物数量。三、实验成功的关键及注意事项
1．破碎细胞，释放DNA过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5 min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10 min。
2．用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精，必须经过充分预冷后才能使用。
3．在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。
4．由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基也带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少DNA的损失。四、实验现象不明显的原因分析
1．材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
2．加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
3．二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果。
4．析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果。
5．实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果。 DNA在NaCl溶液中的溶解度有两重性，随NaCl溶液浓度的变化而变化，则下图所示能反映DNA的溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是( )DNA粗提取的原理、方法解析：DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低。
答案：C
名师点睛：在0.14 mol/L NaCl溶液中，DNA溶解度最低，而蛋白质的溶解度较高；在高浓度的NaCl溶液中，DNA溶解度较高，而蛋白质的溶解度较低。利用这一原理，可以使DNA和蛋白质分离。变式训练1．蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来，下列药品可达到上述同一目的的是( )
A．蒸馏水 B．NaCl溶液
C．NaOH溶液 D．盐酸
解析：本题为DNA提纯原理的应用。DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，蛋白质可溶，从而把DNA和蛋白质分开。
答案：BDNA的精提取与鉴定的实验操作 (多选)下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是( )解析：在DNA粗提取与鉴定实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(水浴加热)产生蓝色反应。
答案：AC
名师点睛：在DNA析出的步骤中，用玻璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程中DNA的损失。变式训练2．下列关于DNA的粗提取和鉴定的有关说法，正确的是( )
A．DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的增大而增大
B．溶有DNA的NaCl溶液中加入4 mL二苯胺试剂即变蓝色
C．DNA粗提取和鉴定时，选材最好用鸡血而不用猪血
D．提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，食盐有利于DNA从细胞中释放出来解析：本题考查DNA的粗提取和鉴定中相关步骤的模糊点。需要对每一个选项认真分析，用排除法选择。从DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线可知，NaCl溶液在低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐下降，0.14 mol/L时溶解度最低，当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度逐渐增加。A选项只注重一段范围内的变化，不够全面。二苯胺试剂使用时需要水浴加热才能出现实验现象。猪的成熟红细胞没有细胞核，无DNA，故不能用于本实验。而提取洋葱的DNA时，食盐的作用是溶解释放出的DNA，洗涤剂的作用才是使DNA从细胞中释放出来。
答案：C水平测试
1．下列各项不适宜选作DNA提取材料的是( )
A．洋葱表皮细胞 B．鲜豌豆种子
C．人的成熟红细胞 D．猪肝
解析：人的成熟红细胞不含DNA，不适宜用来提取DNA。
答案：C 素能提高
7．DNA粗提取的实验材料中有三次过滤：(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液；(2)过滤含粘稠物的0.14mol/L NaCl溶液；(3)过滤溶解有DNA的2mol/L NaCl溶液。以上三次过滤分别为了获得( )
A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液
C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNA
D．含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液解析：用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。
答案：A祝您学业有成课件33张PPT。课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA和蛋白质技术 2003年9月28日，沈阳市沈河区发生了一起凶杀案，在案发现场发现的烟灰缸中有一个可疑的烟头。
法医从这个烟头中提取了微量的
DNA，但由于DNA含量太低，无法确
定嫌疑犯的DNA特征。他们利用DNA
体外扩增技术，将样品DNA大量扩增
，准确分析出嫌疑犯的DNA特征，并
以此为依据迅速找到了凶手。这项技
术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。在本课题中，我们将了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。知识清单PCR技术1．概念：是一种体外迅速扩增______片段的技术，它能以极少量的______为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
2．原理：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供：______模板，分别与两条模板链相结合的______，四种__________，耐热的__________，同时通过控制______使DNA复制在体外反复进行。
(1)DNA的方向：______为羟基(—OH)末端，________末端为5′端。1．DNA DNA
2．DNA 两种引物 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 温度
(1)3′端 磷酸基(2)DNA合成的方向：从子链的______向______延伸。
(3)变性：在________的温度范围内，DNA的_______结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度________后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成_____。
3．反应过程：PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为______、______和______三步。
(1)______：当温度上升到______以上时，双链DNA______为单链。
(2)______：温度下降到______左右，______引物通过____________与两条单链DNA结合。
(3)______：温度上升到______左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。答案：(2) 5′端 3′端
(3)80～100 ℃ 双螺旋 缓慢降低 双链
3．变性 复性 延伸 (1)变性 90 ℃ 解聚
(2)复性 50 ℃ 两种 碱基互补配对
(3)延伸 72 ℃尝试应用1．PCR技术利用了DNA的什么原理来控制DNA的解聚与结合？( )
A．特异性 B．稳定性
C．热变性 D．多样性
解析：DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。
答案：C2. 有关PCR反应的叙述中，正确的是( )
A．PCR反应所需要的引物只有RNA
B．PCR反应所需要的原料是核糖核苷酸
C．PCR反应所需要的酶在60 ℃会变性
D．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行 D 知识清单实验操作实验操作用具主要有__________、__________和__________等。微量移液器 微量离心管 PCR仪尝试应用1．DNA在什么紫外线波段有一强烈吸收峰？( )
A．220 nm B．240 nm
C．260 nm D．280 nmC 2．PCR实验室中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是( )
A．反复洗涤 B．用酒精擦洗
C．高压灭菌 D．在－20 ℃储存
解析：为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验室中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。
答案：C一、生物体内DNA复制与PCR反应的比较二、PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成：
1．模板DNA的变性：模板DNA经加热至95 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA的双链解开，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。2．模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3．引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min,2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、PCR的实验操作
1．操作步骤
(1)按PCR反应体系的配方配制所需试剂。
(2)用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分。
(3)盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。
(4)将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。
(5)将离心管放在PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。
以上过程可以概括为：准备、移液、混合、离心、反应五大步。2．实验结果与分析
(1)实验中DNA含量的测定
①稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品稀释了50倍。
②对照调零：以蒸馏水作空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调至零。
③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。
④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。(2)理论上DNA扩增数目的计算
DNA扩增与DNA复制一样，呈指数扩增。若只有一个DNA为模板，则复制n次后有2n个；若一开始有a个模板，则复制n次有a×2n个DNA。
(3)DNA扩增是否成功
检测DNA片段扩增情况可以采用上述方法，也可以采用电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。PCR原理过程 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( )
A．92 ℃、50 ℃、72 ℃ B．72 ℃、50 ℃、92 ℃
C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、50 ℃、72 ℃解析：当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
答案：A
名师点睛：PCR利用DNA的热变性原理，通过控制温度控制DNA双链的解聚与结合。其与体内DNA复制的主要区别有：体外进行，不需要解旋酶、DNA聚合酶耐高温等。 变式训练1．DNA的复制需要引物，其主要原因是( )
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助DNA聚合酶的延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链解析：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(－OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
答案：DPCR实验操作 下列操作过程的叙述中错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换解析：从冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。
答案：C
名师点睛：为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性吸液枪头。在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。变式训练2．在PCR实验操作中，下列说法不正确的是( )
A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果
解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。
答案：A水平测试
1．PCR技术最突出的优点是( )
A．原理简单
B．原料易找
C．Taq DNA聚合酶有耐热性
D．快速、高效、灵活、易于操作 解析：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。但最突出的优点则是快速、高效、灵活、易于操作等特点。
答案：D素能提高
7．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60 ℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括( )
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．加入引物的量足够多而模板链数量少
D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合解析：DNA分子在80～100 ℃的温度范围内双螺旋结构解体，双链打开，在DNA分子复制时提供模板，这个过程称为变性。当温度缓慢降低到50 ℃左右时，两条解聚的单链重新结合成双链，称为复性，故D阐述错误。
答案：D祝您学业有成课件36张PPT。课题3 血红蛋白的提取和分离DNA和蛋白质技术蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。
血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。蛋白质电泳示意图知识清单凝胶色谱法1．概念：凝胶色谱法也称作__________，是根据______________分离蛋白质的有效方法。
2．原理：大多数凝胶是由__________构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，______________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度______；而______________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在________移动，路程______，移动速度______，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离开。1．分配色谱法 相对分子质量的大小
2．多糖类化合物 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快尝试应用1．下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是( )
A．层析柱高 B．层析柱的直径
C．缓冲溶液 D．样品的分布
解析：分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶液的pH影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。
答案：B2．凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是( )
A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径
B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C．将酶或细胞固定在凝胶中
D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
解析：凝胶的种类较多，但每一种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
答案：A知识清单缓冲溶液和电泳1．作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制________对溶液______的影响，维持pH基本不变。生物体内进行的各种生物化学反应都是在__________进行的，为了能够在________下准确模拟______的过程，就必须保持体外的______与体内的基本一致。
2．配制：通常由______种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的________就可以制得____________的缓冲液。1．外界的酸碱 pH 一定的pH下 实验室条件 生物体内 pH
2．1～2 使用比例 在不同pH范围内使用尝试应用人体血液中的缓冲物质都是由一种弱酸和相应的强碱盐组成，下列正确的一项是( )
A．Na2CO3/NaHCO3 B．Na2HPO4/Na3PO4
C．NaH2PO4/Na3PO4 D．H2CO3/NaHCO3D知识清单电泳1．概念：带电粒子在______的作用下发生______的过程。
2．原理：许多重要的生物大分子，如______、______等都具有________的基团，在一定pH下，这些基团会带上______或______。在电场的作用下，这些带电子分子会向着_________移动。电泳利用了待分离样品中各种分子________以及分子本身的______、______的不同，使带电分子产生不同的_____从而实现样品中各种分子的分离。1．电场 迁移
2．多肽 核酸 可解离 正电 负电 与其所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速率尝试应用1．电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？( )
A．纤维状、大分子 B．纤维状、小分子
C．球状、大分子 D．球状、小分子
解析：电泳就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说，球形分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。
答案：D知识清单实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、________、______和________。样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定尝试应用1．洗涤红细胞时，离心所采用的方法是( )
A．低速长时间离心 B．低速短时间离心
C．高速长时间离心 D．高速短时间离心
解析：高速或长时间离心，会导致白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，进而影响后面血红蛋白的提取纯度。
答案：B2．下列试剂可用于血红蛋白释放的是( )
①0.9%的生理盐水 ②甲苯 ③磷酸缓冲液 ④蒸馏水 ⑤柠檬酸钠
A．②④ B．①④ C．④⑤ D．①③
解析：在蒸馏水的作用下，红细胞吸水会破裂，甲苯能溶解脂质物质也有利于红细胞的涨破和血红蛋白的释放。
答案：A一、凝胶色谱法的原理二、缓冲液及其作用原理
在一定范围内，能对抗少量外来强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用。具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。三、电泳及其作用原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。四、血红蛋白的提取和分离的实验操作
1．样品处理
(1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。
(2)血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况：第3层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液。
(4)透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。2．凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的装填
①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。
②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。
③装填完后，立即用300 mL 20 mmol/L磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。
(2)样品的加入和洗脱
①加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②按正确方法加样，不能破坏凝胶面。
③进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。 关于电泳的说法不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少
D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小物质分离的方法原理解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案：C
名师点睛：电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。变式训练1．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )
A．具有相同的相对分子质量
B．相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子
C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D．具有相对分子质量不同的蛋白质解析：若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现出分子筛效应。
答案：D血红蛋白的提取和分离实验操作 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是( )
A．增大蛋白质的相对分子质量
B．改变蛋白质分子的形状
C．掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别
D．减少蛋白质分子的相对分子质量解析：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案：C名师点睛：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低，因此可从已知相对分子质量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的相对分子质量。变式训练2．下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是( )
A．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于分子的大小
B．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小
C．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离
D．凝胶中加入SDS可以消除净电荷对迁移率的影响解析：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，而SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低。
答案：A 水平测试
1．用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是( )
A．相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质
B．相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质
C．相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质
D．二者根本无法比较 解析：在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的分子无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
答案：A 素能提高
7．（2011年广东理综）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( )
A．洗涤血红细胞时，使用生理盐水可以防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢 解析：在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的分子无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。所以血红蛋白分子比相对分子质量较小的杂分子移动速度要快。
答案：D祝您学业有成
