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备考2023年高考生物学二轮复习16 微生物的培养及发酵工程技术
一、单选题
1．（2023高三上·清远期末）下图是研究人员从落叶地的土壤中筛选高效分解纤维素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是（ ）
A．在配制步骤②③的培养基时，高压蒸汽灭菌后将pH调至中性或弱碱性
B．步骤③筛选、纯化的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C．步骤③采用稀释涂布平板法进行接种，并需要加入纤维素作为唯一的碳源
D．步骤④加入的是刚果红染液，可根据菌落与透明圈的直径比来挑选优质菌落
【答案】A
【知识点】微生物的分离和培养；纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】A、配制培养基时，调节培养基的pH应在灭菌之前进行，A错误；
B、步骤③筛选、纯化的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，可以获得单细胞菌落，B正确；
C、加入纤维素作为唯一的碳源，能分解纤维素的细菌能利用纤维素存活，不能分解纤维素的细菌由于缺少碳源则会死亡，所以步骤③采用稀释涂布平板法进行接种，并需要加入纤维素作为唯一的碳源，C正确；
D、步骤④加入的是刚果红染液，可根据菌落与透明圈的直径比来挑选优质菌落，透明圈的直径越大，说明分解纤维素的能力越强，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、微生物实验室分离中配制培养基的操作步骤：计算→称量→溶解→调pH→灭菌→倒平板。
3、刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维分解菌。
2．（2022高三上·安徽开学考）下列有关微生物的培养、筛选、分离的叙述，错误的是（ ）
A．一定浓度的酒精与水的混合物可作为醋酸菌的发酵底物
B．判断某微生物的类型时，可以不用显微镜观察菌落的形态
C．若培养基上的菌落分布均匀，则是用平板划线法获得的单菌落
D．分离尿素分解菌时，应该从具有红色环带的菌落中挑取菌株
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；尿素分解菌的分离与计数
【解析】【解答】A、果醋的制作过程中，醋酸菌可以利用一定浓度的酒精与水的混合物进行继续发酵，A正确；
B、由于不同菌种形成的菌落形态特征不同，且菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌落的形态特征，B正确；
C、培养基上菌落分布均匀是用稀释涂布平板法获得的单菌落，C错误；
D、分解尿素的细菌在分解尿素时产生氨，氨能使酚红指示剂显红色，从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、当氧气和糖源都充足时，醋酸菌能将糖分解成醋酸；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
2、微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 3、
3、分离分解尿素的细菌：
（1）选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源。
（2）鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高，指示剂变红，说明细菌能分解尿素。
3．（2022高三下·天津月考）某种物质X（一种含有C、H、O、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解X。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解X的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和X，乙的组分为无机盐、水、X和Y。下列相关叙述中错误的是（ ）
A．甲、乙培养基均属于选择培养基，乙培养基组分中的Y物质是琼脂
B．若要筛选高效降解X的细菌菌株，甲、乙培养基中X是唯一的碳源
C．步骤⑤的筛选过程中，各培养瓶中的X溶液要有一定的浓度梯度
D．步骤⑤的筛选过程中，若培养基中的X浓度过高，某菌株对X的降解量可能下降
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；组织培养基的成分及作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】A、甲、乙培养基均只含有机物X，属于选择培养基，乙培养基组分中除了X外，还加入了Y物质琼脂，从而获得固体培养基，A正确；
B、若要筛选高效降解X的细菌菌株，需要甲、乙培养基中的X是唯一提供碳源的有机物，B正确；
C、步骤⑤中自变量是挑取的不同的菌落，各培养瓶中的X溶液的浓度应该是一致的，C错误；
D、步骤⑤的筛选过程中，若培养基中的X浓度过高，则会导致菌体失水影响菌体的正常生长，因此某菌株对X的降解量可能下降，D正确。
故答案为：C。
【分析】分析题图，通过过程①获得菌悬液，过程②通过选择培养可以使分解X的细菌大量繁殖，过程③通过稀释涂布获得分解X物质的单菌落，过程④再次对各种单萄落进行筛选，经过过程，⑤多次筛选后获得高效降解X的菌体。
4．（2022高三上·广东月考）纸片扩散法药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有不同种类抗生素的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。某次实验结果如图，下列有关叙述错误的是（ ）
A．培养基中营养物质除氮源外还有碳源、水和无机盐
B．在图示固体培养基上接种的方法是稀释涂布平板法
C．形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
D．不同抗生素在平板上的扩散速率会影响抑菌圈的大小
【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、培养基为微生物提供营养，包括碳源（提供碳元素）、氮源、水、无机盐等等，A正确；
B、结合图示抑菌圈可知，在图示固体培养基上接种的方法是稀释涂布平板法，B正确；
C、形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物不太敏感，导致不能抑制微生物生长，C错误；
D、抗生素抑制细菌的生长，不同抗生素在平板上的扩散速率会影响抑菌圈的大小，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
5．（2022高二下·扬州期末）利用传统的纯粮固态发酵工艺生产高品质白酒过程中有多种微生物参与：将谷物中的大分子物质分解为小分子糖类等物质的a类菌种、将糖类发酵产生酒精的b类菌种、将酒精转化为醋酸的c类菌种、将酒精和酸性物质等转化为有香味酯的d类菌种。下列说法正确的是（ ）
A．可以使用以纤维素为唯一碳源的培养基来筛选a类菌种
B．产酒过程中需经常搅拌原料以增加b类菌种发酵所需氧气
C．控制温度在18~25℃有利于抑制c类菌种的生长而增加产酒量
D．不同白酒的品质差异只取决于d类菌种
【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用；果酒果醋的制作
【解析】【解答】A、分析题意可知，a类菌种可将谷物中的大分子物质分解为小分子糖，并以此作为碳源，故可以使用以谷物为唯一碳源的培养基来筛选a类菌种，A错误；
B、b类菌种可将糖类发酵为酒精，该过程应营造无氧环境，搅拌会增加发酵液中的溶氧量，B错误；
C、结合分析可知，c类菌种主要是醋酸菌，醋酸菌发酵适宜的温度是30～35℃，而b类菌种酒精发酵所需的适宜温度是18~25℃，故控制温度在18~25℃有利于抑制c类菌种的生长而增加产酒量，C正确；
D、据题意可知，白酒最终产生需要四类菌种的参与，故不同白酒的品种取决于4类菌种，D错误。
故答案为：C。
【分析】 1、选择培养基指在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。
2、分析题意可知，a类菌种能产生酒精，主要是酵母菌；c类菌种可将酒精转化为醋酸，故为醋酸菌。
3、酵母菌是单细胞真菌，是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，酒酿酵母最适生长温度约为28℃。
4、醋酸菌是好氧菌，当氧气和糖源都充足时能将糖分解成醋酸；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
6．（2022高三上·辽宁开学考）很多生活实例中蕴含着微生物发酵的原理。下列相关叙述错误的是（ ）
A．自制葡萄酒在发酵过程中，葡萄汁应装满发酵瓶并加盖以确保无氧
B．夏天开瓶后的红酒容易变酸，是由于空气中的醋酸菌将乙醇变成乙醛而后变为乙酸
C．用巴氏消毒法能对牛奶消毒杀死其中的绝大多数微生物，且不破坏牛奶的营养成分
D．用白萝卜制作泡菜时为缩短腌制时间，可向新坛中添加老坛内已经腌制过的泡菜汁
【答案】A
【知识点】果酒果醋的制作；泡菜的制作；灭菌技术
【解析】【解答】A、为了防止发酵过程中发酵液溢出，葡萄汁装入发酵瓶时不能装满，要留约1/3的空间，A错误；
B、夏天开瓶后的红酒，在有氧的条件下，空气中的醋酸菌将乙醇变成乙醛而后变为乙酸，导致红酒变酸，B正确；
C、巴氏消毒法是一种低温消毒法，用巴氏消毒法对牛奶消毒既能杀死牛奶中的绝大多数微生物，又不破坏牛奶中的营养成分，C正确；
D、泡菜汁中含有一定量的发酵菌种，所以在腌制过程中，加入一些已经腌制过泡菜汁可缩短腌制时间，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵。温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，20℃左右，酒精发酵时，一般将温度控制在18~25℃，在葡萄酒自然发酵过程当中，其主要作用的是附着在葡萄皮上的野生酵母菌。
2、醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30~35℃。
3、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
7．（2022·湖北）灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（ ）
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
【答案】D
【知识点】DNA的粗提取和鉴定；动物细胞培养技术；灭菌技术
【解析】【解答】A、动、植物细胞DNA的提取过程不需要在无菌环境，A错误；
B、动物细胞培养基中需要无菌无毒的环境，添加一定量的抗生素，微生物的培养不能加入抗生素，抗生素抑制细菌生长，B错误；
C、培养基一般用湿热灭菌法进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；
D、湿热灭菌法和干热灭菌法都可用来对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
2、DNA粗提取和鉴定过程：
（1）DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
（2）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；
（3）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可.如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜.例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；
（4）DNA的析出与鉴定：（1）将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2~3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分；（2）取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解.然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
3、动物细胞培养：
（1）定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，原理细胞增殖。
（2）动物细胞培养过程：取动物组织块→用机械方法或胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
（3）动物培养条件：
①无菌、无毒的环境：a、消毒、灭菌；b、添加一定量的抗生素；c、定期更换培养液，以清除代谢废物。②营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。③温度和pH。④气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。
（4）注意事项：①动物细胞连续培养50代左右，会出现大量细胞死亡而只有少量细胞生存的现象，这少数细胞的遗传物质发生变化，往往具有癌变的特点。②动物细胞培养基液体，植物细胞培养基固体，培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官。③动物组织处理使细胞分散后的初次培养称为原代培养， 一般传至10代左右便会出现生长停滞。
8．（2022高二下·扬州期末）丙草胺（C17H26ClNO2）是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组为获得能修复污染土壤的微生物资源，从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株并对其计数，如下图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A．涂布前要了解培养基是否被污染可接种蒸馏水来培养检测
B．利用该方法计数结果往往比显微镜直接计数法偏小
C．以丙草胺为唯一氮源的培养基进行培养可提高降解菌的浓度
D．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数约为1.7×109个
【答案】A
【知识点】测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、涂布前要了解培养基是否被污染可将未接种的培养基在相同条件下培养，观察是否有菌落出现，A错误；
B、该计数方法为稀释涂布平板法，由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故计数结果比显微镜直接计数法偏小，B正确；
C、若以丙草胺作为唯一氮源，则只有具有降解能力的降解菌能够存活，故可以提高降解菌的浓度，C正确；
D、根据5号试管的数据可知，每克土壤中菌株数为（168+175+167）÷3÷0.1×106=1.7×109个，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、稀释涂布平板法：
（1）稀释：将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL悬液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（2）涂布：取0.1mL的菌液，滴加到培养基表面。涂布器先浸在有酒精的烧杯中，再放在火焰上灼烧，待酒精烧尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂布时转动培养皿，使涂布均匀。
（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱（30~37℃）中培养1~2天 ，在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。
（4）计数：一般选择菌落数在30-300的平板进行计数，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，以减少偶然误差。
2、稀释涂布平板法计算公式：每克样品中的菌株数=C/VxM，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液体积（mL），M代表稀释倍数。
9．（2022·台州模拟）涂布分离法可用于微生物的技术，下列叙述正确的是（ ）
A．选取具有最少菌落数的稀释倍数进行计数
B．严格厌氧微生物的计数宜采用涂布分离法
C．涂布培养基上的菌落数代表样品中的全部菌数
D．样品中待测菌数量多而稀释倍数太小时计数结果会偏小
【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、一般选取平板上菌落数30-300内的平板进行计数，需要合适的稀释度，A错误；
B、稀释涂布平板法会接触到空气，不适宜用于严格厌氧微生物的计数，B错误；
C、涂布培养基上的菌落数代表样品中的全部活菌数，不包括死的菌 ，C错误；
D、样品中待测菌数量多而稀释倍数太小时会有细菌重叠在一起形成一个菌落，计数结果会偏小，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
10．（2022高二下·博罗期中）微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是（ ）
A．在每一区域内画线时接种环上的菌种直接来源于菌液
B．划线操作时应在酒精灯火焰旁边打开皿盖划线接种，接种完后在皿盖上做上相应标记
C．每次划线只能从上一次划线的末端开始，才能确保菌种逐步稀释以得到单菌落
D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、 划线 1时的菌种直接来自于菌液， 2、3、4、5 划线的菌种直接来自上次划线的尾端，A错误；
B、 划线操作时应在酒精灯火焰旁边打开一道缝进行划线接种 ，避免空气中的杂菌污染，B错误；
C、每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。为了得到单菌落，第1区和第5区的划线是不能连接起来的，C正确，D错误；
故答案为：C
【分析】（1）平板划线法接种菌种时在，整个过程中需要防止杂菌污染：
①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
②划线操作在酒精灯火焰旁进行。
③接种环蘸取菌液时，要将试管口通过火焰。
④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
（2）在作第二次划线以及其后的操作时，要从上一次划线的末端开始划线的原因是划线末端含有的细菌数目较少， 每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。
11．（2022·浙江模拟）下列关于“分离以尿素为氮源的微生物”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌
B．液体培养基振荡培养的目的是使微生物均匀分布以便涂布
C．对含有尿素的培养基进行灭菌时，需降低高压蒸汽灭菌的压力与温度
D．称取土壤、稀释土壤溶液、涂布平板这些操作都需要在酒精灯火焰旁进行
【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；尿素分解菌的分离与计数；灭菌技术
【解析】【解答】解：A、在尿素固体培养基上生长的细菌，不一定都是以尿素为氮源的，可能利用空气中的氮气，A不符合题意；
B、振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，所以振荡培养条件下细菌生长速度加快，B不符合题意；
C、对含有尿素的培养基进行灭菌时，不能降低高压蒸汽灭菌的压力与温度，否则达不到灭菌的效果，C不符合题意；
D、为防止杂菌污染，称取土壤、稀释土壤溶液、涂布平板都要在火焰旁进行，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】 分离土壤中以尿素为氮源的微生物实验的原理：在以尿素为唯一氮源的培养基上，能分解尿素的微生物能以尿素为氮源生长，其他不能利用尿素的微生物由于缺乏氮源无法生长。选择培养基是否起到选择作用，要有对照，对照组是全营养的培养基。
12．（2021高二下·遂宁期末）下列有关纤维素分解菌和尿素分解菌的叙述，错误的是（ ）
A．尿素分解菌能够在以尿素为唯一氮源的培养基上生长
B．纤维素分解菌能在仅以纤维素为碳源的培养基上生长
C．纤维素分解菌能够分解刚果红染料，从而出现透明圈
D．进行纤维素分解菌选择培养时，通常选用液体培养基
【答案】C
【知识点】尿素分解菌的分离与计数；纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】A、尿素分解菌能分泌脲酶，脲酶能将尿素分解为氨，从而能在仅以尿素为氮源的培养基上生长，A正确；
B、纤维素分解菌可以产生纤维素酶将纤维素分解为葡萄糖，从而纤维素分解菌能在仅以纤维素为碳源的培养基上生长，B正确；
C、纤维素分解菌能够分解纤维素，而不是分解刚果红染料，从而使菌落周围出现透明圈，C错误；
D、选择培养时使用液体培养基可以增加纤维素分解菌的浓度，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、纤维素分解菌的分离：
（1）方法：刚果红染色法。
（2）原理：刚果红会与纤维素形成红色复合物，如果纤维素被降解，则培养基表面会形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）标志：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
（4）操作流程： 土壤取样：富含纤维素的环境→选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量→梯度稀释→涂布平板：将样品涂布在鉴别培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2、 能分解尿素的细菌可以合成脲酶，脲酶能催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源；因此，以尿素为唯一氮源的培养基可以分离出能分解尿素的细菌。
3、菌种分离采用固体培养基，获得单菌落，菌种的扩大培养用液体培养基，增加菌种的数量。
13．（2023高三上·东莞期末）利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下，有关叙述正确的是（ ）
A．大豆、小麦、麦麸为米曲霉大量增殖提供了充足的碳源、氮源、水和无机盐
B．米曲霉发酵过程不断搅拌有利于其通过无氧呼吸快速增殖
C．在发酵池中需加入抗生素才能保证酱油质量
D．酱油的制作是米曲霉、酵母菌等代谢类型不同的微生物共同作用的结果
【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、大豆、小麦、麦麸为米曲霉大量增殖提供了充足的碳源、氮源，A错误；
B、米曲霉发酵过程不断搅拌有利于其通过有氧呼吸快速增殖，B错误；
C、抗生素会抑制细菌增殖，发酵池中不能加入抗生素，C错误；
D、酱油的制作是米曲霉、酵母菌等代谢类型不同的微生物共同作用的结果，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。果酒制作的原理：在有氧条件下进行有氧呼吸、大量繁殖；在无氧条件下，进行酒精发酵。因此，应先通气后密封，通气的目的是让酵母菌大量繁殖，密封的目的是让酵母菌进行酒精发酵。
二、多选题
14．（2022高二下·范县期末）下列有关发酵工程及其应用表述正确的是（ ）
A．发酵工程的菌种，可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种和基因工程育种获得
B．发酵罐培养的环境条件会影响微生物的生长繁殖，不会影响微生物代谢产物的形成
C．分离、提纯产物可以获得微生物细胞本身或者其代谢产物，这是发酵工程的中心环节
D．发酵工程生产的各种各样的食品添加剂可以增加食品营养，改善食品口味、色泽和品质
【答案】A,D
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、用于发酵的菌种可以从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得，A正确；
B、发酵罐培养的环境条件会影响代谢的途径从而影响产物的形成，例如谷氨酸发酵过程中，发酵罐中碳氮比（碳元素与氮元素的比值）为4∶1时，菌体大量繁殖而产生的谷氨酸少；当碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸的合成量大增，B错误；
C、发酵工程的中心环节是发酵过程，C错误；
D、发酵工程生产的各种各样的食品添加剂可以增加食品营养，改善食品口味、色泽和品质，D正确。
故答案为：AD。
【分析】发酵工程的基本操作过程为：
（1）菌种的选育：从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
（2）扩大培养：发酵之前需对菌种进行扩大培养。
（3）培养基的配制：在菌种确定后，要选择原料制备培养基，培养基的配方须经反复试验才能确定。
（4）灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
（5）接种：对发酵过程进行监控和控制，还可以进行反馈控制。
（6）发酵过程：这是发酵工程的中心环节，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加需要的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
（7）产品的分离提纯：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。若产品是代谢物，可采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
15．（2022·山东）啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法正确的是（）
A．用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B．焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C．糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D．通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
【答案】A,C,D
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、赤霉素促进种子萌发，啤酒发酵过程中，用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶，A正确；
B、焙烤的目的是为了加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活，B错误；
C、啤酒的发酵过程为发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵，消毒、终止，糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵，C正确；
D、啤酒酵母双乙酰的形成会影响啤酒的风味及产量，目前通过转基因技术获得的酵母菌双乙酰生成量减少，并且缩短了啤酒的发酵周期，D正确。
故答案为：A、C、D。
【分析】啤酒发酵过程概述：
（1）啤酒的发酵过程分为主发酵和 后发酵两个阶段。主发酵包括发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵，后发酵包括消毒、终止。
（2）主发酵阶段完成酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成
（3）后发酵的条件是低温、密闭的环境下储存一段时间。
（4）焙烤的目的：加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
（5）蒸煮的目的：产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。
16．（2022高二下·常州期末）物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌才能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。下列相关叙述正确的是（ ）
A．步骤③用涂布器蘸取菌液后均匀地涂布在培养基表面
B．乙培养基中的Y物质可能为琼脂
C．步骤5应选择物质S浓度最低的锥形瓶中的菌株
D．物质S诱发细菌发生了突变，提高了其降解S的能力
【答案】B,C
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、步骤③先吸取0.1mL菌液滴在培养基上，再用涂布器蘸取菌液后均匀地涂布在培养基表面，A错误；
B、乙培养基属于固定培养基，乙培养基中的Y物质为琼脂，B正确；
C、由题意可知，该菌株能降解S，在培养基相同的情况下，S浓度越低，说明菌株的降解能力越强，因此步骤5应选择物质S浓度最低的锥形瓶中的菌株，C正确；
D、物质S对细菌进行选择，能够降解S的菌株才能在以S为唯一碳源和氮源的选择培养基上生存，然后筛选出降解S能力强的，D错误。
故答案为：BC。
【分析】稀释涂布平板法：
（1）稀释：将10g淤泥加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL悬液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（2）涂布：取0.1mL的菌液，滴加到培养基表面。涂布器先浸在有酒精的烧杯中，再放在火焰上灼烧，待酒精烧尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂布时转动培养皿，使涂布均匀。
（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱（30~37℃）中培养1~2天 ，在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。
（4）计数：一般选择菌落数在30-300的平板进行计数，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，以减少偶然误差。
17．（2021·安丘模拟）营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法不合理的是（ ）
A．过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同
B．进行过程②培养时必须先将丝绒布转印至基本培养基上顺序不能颠倒
C．统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大
D．营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关
【答案】A,C,D
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、过程①得到的菌落均匀分布，接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分不同，基本培养基中缺乏某种氨基酸，A错误；
B、进行过程②培养时先将丝绒布转印至完全培养基上，可能会携带某种氨基酸进入基本培养基，因此顺序不能颠倒，B正确；
C、统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏小，C错误；
D、若该菌株为原核细胞，则不存在核孔复合体，营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，应是控制该酶合成的基因发生突变，D错误。
故答案为：ACD。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
3、完全培养基中含有微生物生长所需要的各种营养成分，基本培养基缺少某种营养成分，通过影印培养法，二者接种的菌种相同，基本培养基上不能生长的菌株即为营养缺陷型菌株。
18．下列有关生物技术和工程的说法正确的是（ ）
A．胚胎工程和基因工程都要利用细胞培养
B．制作果醋时应避免通入空气以保证有关菌种正常代谢
C．测定土壤中能分解尿素的细菌数目，应采用平板划线法
D．DNA粗提取时，用95%的冷却酒精进一步纯化DNA
【答案】A,D
【知识点】尿素分解菌的分离与计数；果酒果醋的制作；DNA的粗提取和鉴定；胚胎工程的概念及其技术
【解析】【解答】A、胚胎工程和基因工程都可获得生物个体，所以都需要利用细胞培养技术，A正确；
B、参与果醋制作的菌种是醋酸菌，其代谢类型是异养需氧型，因此制作果醋时需要持续通入无菌空气，保证醋酸菌正常代谢，B错误；
C、测定土壤中能分解尿素的细菌数目，应采用稀释涂布平板法，C错误；
D、DNA粗提取时，用体积分数为95%的冷却酒精可溶解杂质，析出DNA，因此可进一步纯化DNA，D正确．
故选：AD．
【分析】1、果醋的制作需用醋酸菌，醋酸菌是一种好氧菌，所以在制作过程中需通氧气；当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄糖氧化成醋酸；醋酸菌的呼吸作用为严格的有氧呼吸．
2、稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养；在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落．
平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；在数次划线后培养，可以分离由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的子细胞群，这就是菌落．
三、综合题
19．（2022高三上·河北月考）随着环保要求的不断提高，作为清洁能源的生物气体备受青睐，而这些气体中混有的H2S容易腐蚀运输管道，并且燃烧后会产生污染物二氧化硫，因此需要将其清除。脱去H2S时生物反应体系中生成的副产物Na2S2O3和Na2SO4需要被降解，并且反应过程中钠盐的浓度会不断升高，所以筛选嗜盐和脱硫（脱去Na2S2O3和Na2SO4中的S2- ）性能优越的菌种均势在必行。已知嗜盐脱硫菌的菌落周围有明显的硫沉淀，颜色会由白色渐变为褐色。下表是两个相关的培养基配方。据此分析下列问题：
表1 脱硫富集培养基
NaHCO3 Na2S2O3·5H2O （NH4）2SO4 KNO3 K2HPO4
50g/L 50g/L 1g/L 1g/L 2g/L
表2 嗜盐脱硫选择培养基
NaHCO3 Na2S2O3·5H2O （NH4）2SO4 KNO3 K2HPO4 NaCl 琼脂
50g/L 50g/L 1g/L 1g/L 2g/L 50g/L 20g/L
（1）筛选菌株时，需先在液体富集培养基中培养，该操作的目的是 。
（2）嗜盐脱硫选择培养基按照物理状态划分属于 培养基，制备这种物理状态的培养基的目的是 。
（3）若需要对筛选的菌株进行计数，则应选择的接种方法是 ，使用的接种工具是 ，选取 的菌落作为计数的目的菌株。
（4）进一步研究环境对所筛菌株的影响，绘制曲线如图，则该菌株适宜温度范围是 （填写6℃的温差范围），适宜pH范围是 。
【答案】（1）对脱硫细菌进行富集培养
（2）固体；获得脱硫细菌的菌落，有利于通过菌落特征对其进行筛选
（3）稀释涂布平板法；涂布器；周围有明显的硫沉淀，颜色为褐色
（4）36~42℃；8.5-10.5
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）筛选菌株时，需先在液体富集培养基中培养，该操作的目的是对脱硫细菌进行富集培养，增加其数量，在液体培养基中可以让微生物获得足够的营养满足生长的需求。
（2）嗜盐脱硫选择培养基中有琼脂，按照物理状态划分属于固体培养基。制备固体培养基可以获得嗜盐脱硫细菌的菌落，有利于通过菌落特征对其进行筛选。
（3）稀释涂布平板法不仅可以获得单菌落，而且可以用来计数，该接种方法需要使用的接种工具是涂布器。嗜盐脱硫菌的菌落特征表现为：周围有明显的硫沉淀，颜色由白色渐变为褐色，据此应选菌落周围有明显的硫沉淀，颜色为褐色的菌落的作为目标菌。
（4）根据图示曲线可知，嗜盐和脱硫性能优越的菌种具有高效脱硫的特征，因此应该选择硫浓度下降最为明显的温度和 pH 条件，据图可知，最适温度是 36~42℃，最适 pH 是 8.5-10.5。
【分析】1、筛选步骤需要使用固体培养基；扩增目的菌应该采用液体培养基
2、稀释涂布平板法既能分离微生物也能对微生物进行计数，而平板划线法只能分离微生物。
20．（2022高二下·安康期末）随着石油危机的出现，乙醇作为可再生资源中比较理想的液态燃料正受到人们越来越多的关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富，其主要成分之一是半纤维素。半纤维素容易被酸或者酶水解，其水解产物中的85%~90%为木糖。因此利用木糖发酵生产乙醇具有重要的用研究价值。酵母菌是传统的乙醇生产菌株，因其缺乏转化木糖的酶系而不能很好地利用木糖。自然界中某些酿酒酵母能利用木糖进行酒精发酵，某研究小组欲从土壤中分离这种酵母菌并对产酶活性进行测定，实验基本流程为：取土样→制取土壤悬液→扩大培养→选择培养→菌种分离→酶活性鉴定。回答下列问题；
（1）扩大培养又称富集培养，可增加 ，以确保能从样品中分离得到所需要的微生物。
（2）获得纯净培养物的关键是 。该研究小组将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于 的选择培养基，倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有 两种。若划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其它划线上有菌落。第二划线区域的第一条线上无菌落的原因可能是 。
（3）为进一步确定目的菌株的最佳产酶条件，该研究小组选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素进行实验。其中，培养基初始pH、培养温度会影响菌株产酶主要是因为 。摇床转速因影响 进而影响菌株产酶。
【答案】（1）目的菌株数量
（2）防止外来杂菌的入侵；以木糖为唯一碳源；平板划线法和稀释涂布平板法；接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作（或第一次划线未从第一区域末端开始）
（3）培养基初始pH、培养温度会影响酶活性；溶氧量、菌种获取营养物质的概率
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用
【解析】【解答】(1)扩大培养又称富集培养，一般采用液体培养基，液体培养基能够增加营养物质和菌体的接触，从而达到增加菌种数量的目，以确保能够从样品中分离得到所需微生物。
(2)为获得纯净培养物，必须防止外来杂菌的入侵，否则培养物中会混杂很多不需要的菌种，影响实验效果。由题干“半纤维素容易被酸或者酶水解，其水解产物中的85%~90%为木糖。因此利用木糖发酵生产乙醇具有重要的用研究价值”可知，需要筛选出能分解木糖的目的菌株，因此要将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于以木糖为唯一碳源的选择培养基，倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种。若划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其它划线上有菌落。第二划线区域的第一条线上无菌落的原因是接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作、未从上次划线末端开划线。
(3)培养基初始pH、培养温度会影响酶活性；摇床转速因影响溶氧量、菌种获取营荞物质的几率进而影响菌株产酶。
【分析】1、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
2、发酵工程的基本环节：
（1）选育菌种：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。
（2）扩大培养：在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。扩大培养的原因是：工业发酵罐的体积一般很大，需要接种大量菌种。
（3）配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
（4）灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。灭菌的原因：发酵工程种所用的菌种大多是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大降低。灭菌目的：避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量。
（5）发酵：①场所：发酵罐。②条件控制：a.随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。b.及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
（6）分离、提纯产物：①如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。②如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
21．（2022高二下·范县期末）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，在地球上含量丰富。土壤中某些微生物能够产生纤维素酶分解利用纤维素，帮助人们利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。某科研小组为了将土壤中的分解纤维素细菌纯化培养，进行了如下操作。请回答相关问题：
成分 纤维素粉 NANO3 KH2PO4 KCl 酵母膏 水解酪素
含量（g） 5.0 1.0 1.2 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5
操作 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）上表是纤维素分解菌的选择培养基配方，若根据物理性质划分，该培养基属于 培养基。在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，操作者的双手需要进行清洗和 。
（2）刚果红（简称CR）是一种染料，在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成。下表为鉴别纤维素分解菌的培养基配方。
成分 羧甲基纤维素钠 酵母膏 KH2PO4 琼脂 土豆汁 配制浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌后按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液
含量（g） 5.0~10.0 1 0.25 15 100mL
操作 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
用该培养基来培养纤维素分解菌，培养结果如图（黑点代表菌落）。其中分解纤维素能力最强的是菌落 ，原因是 。
（3）图中图1和图2是分离培养纤维素分解菌的结果图，其对应的接种方法分别是 和 ，接种过程中，图2所示方法接种工具至少需灼烧灭菌 次。
（4）将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释104倍，分别按图1接种方式将0.1mL样品接种到5个培养基上，统计菌落数目为156、158、160，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为 个。若某同学利用相同样品进行接种，只统计出25个菌落，出现该结果的原因是 。
【答案】（1）液体；（酒精）消毒
（2）E；刚果红与纤维素反应形成红色复合物，纤维素分解菌能够分解纤维素，因此纤维素分解菌周围会形成透明圈，且分解能力越强透明圈越大
（3）稀释涂布平板法；平板划线法；5
（4）1.58×108；涂布器灼烧后未冷却即涂布，高温下纤维素分解菌被烫死；培养液未摇匀即取样，样品中纤维素分解菌过少（其他答案合理即可）
【知识点】微生物的分离和培养；纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】（1）表中培养基不含有琼脂等凝固剂，所以属于液体培养基。为防止杂菌污染，需要将操作的双手清洗并消毒。
(2)纤维素分解菌鉴定的方法是刚果红染色法，其原理是：刚果红与纤维素反应形成红色复合物，纤维素分解菌能够分解纤维素，因此纤维素分解菌周围会形成透明圈，且分解能力越强透明圈越大，图中E菌落透明圈最大，所以分解纤维素能力最强。
(3)图1的接种方法菌落分布均匀，接种方法是稀释涂布平板法，而图2是平板划线法。每次划线前后都需要灼烧接种环，图2一共划线4个区域，所以需要灼烧接种环5次。
(4)5g土壤溶于45mL无菌水，相当于1mL含有0.1g，所以稀释了10倍，根据菌落数目的计算公式每克土壤中活菌数约为（C÷V）×m=（158+156+160）÷3÷0.1×10×104=1.58×108个；如果统计的数目太少，可能的原因有涂布器灼烧后未冷却即涂布，高温下纤维素分解菌被烫死；培养液未摇匀即取样，样品中纤维素分解菌过少。
【分析】1、纤维素分解菌的分离：
（1）方法：刚果红染色法。
（2）原理：刚果红会与纤维素形成红色复合物，如果纤维素被降解，则培养基表面会形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）标志：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 （4）操作流程： 土壤取样：富含纤维素的环境→选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量→梯度稀释→涂布平板：将样品涂布在鉴别培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2、微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
22．（2022高三上·高台开学考）酸菜是经乳酸菌发酵而成的一种发酵食品，制作过程中极易积累亚硝酸盐。一些乳酸菌能合成亚硝酸盐还原酶，能够显著降低亚硝酸盐含量。请回答相关问题。
（1）为获得高产亚硝酸盐还原酶的乳酸菌，某研究组以东北传统自然发酵酸菜为材料进行分离。
①在进行乳酸菌分离纯化时，科研人员将酸菜发酵液稀释后涂布在含溴甲酚绿（遇酸变色）的 （“选择”或“鉴别”）培养基上， （“需氧”或“厌氧”）培养一段时间后，挑取周围变色的单个菌落临时保存。
②在进行高产亚硝酸盐还原酶菌株筛选时，将临时保存的各菌种分别接种到含 的液体培养基中培养一段时间，离心收集上清液，在盐酸酸化条件下，依次加入对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐进行反应，筛选反应显色较 （深、浅）的菌株。
（2）利用筛选得到的菌种进行酸菜腌制，并测定亚硝酸盐含量（单位：mg/kg），结果如下表所示：
1 3 5 7 9 11 13 15
5% 3.8 4.0 10.1 35.7 25.7 11.5 5.7 2.1
10% 3.6 4.1 5.9 17.3 25.3 23.8 13.6 3.8
15% 3.3 3.4 3.5 4.9 8.4 12.9 11.2 3.4
据表分析，亚硝酸盐含量最高时的腌制条件是 。为避免细菌大量繁殖，产生大量的亚硝酸盐，除控制好表中涉及的腌制条件外，还需控制好腌制的 。
（3）有时制作的泡菜会“咸而不酸”，根据泡菜的制作流程及注意事项分析，最可能的原因是 。
【答案】（1）鉴别；厌氧；亚硝酸盐；浅
（2）食盐用量5%，腌制7天；温度
（3）加入的食盐过多，抑制了乳酸菌的生长繁殖
【知识点】亚硝酸盐含量的测定
【解析】【解答】
（1）①溴甲酚绿遇酸变色，可用于鉴定乳酸菌，且乳酸菌是厌氧菌，因此在进行乳酸菌分离纯化时，将酸菜发酵液稀释后涂布在含溴甲酚绿的鉴别培养基上，厌氧培养一段时间后，挑取周围变色的（单个）菌落临时保存。
②在进行高产亚硝酸盐还原酶菌株筛选时，将临时保存的各菌种分别接种到含亚硝酸盐的液体培养基中培养一段时间，离心收集上清液。在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。颜色越浅，说明亚硝酸盐的含量越低，则相应的菌株产亚硝酸盐还原酶的量越多，即要筛选反应显色较浅的菌株。
（2）根据表中数据可知，亚硝酸盐含量最高时的腌制条件是食盐用量5%，腌制7天。腌制的时间、温度和食盐的用量都会影响亚硝酸盐的含量。故为避免细菌大量繁殖，产生大量的亚硝酸盐，除控制好表中涉及的腌制条件外，还需控制好腌制的温度。
（3）泡菜的制作离不开乳酸菌。在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。如果加入的食盐过多，抑制了乳酸菌的生长繁殖，就会出现制作的泡菜“咸而不酸”的现象。
【分析】亚硝酸盐含量的测定：
（1）亚硝酸盐的产生：由硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成。
（2）亚硝酸盐的危害：在特定情况下可转变成致癌物亚硝胺。
（3）亚硝酸盐含量的测定：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐先与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，然后与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色产物，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
23．（2022高三上·银川月考）即墨老酒被评定为中国北方黄酒的“营养酒王”，其酒内含有的糖分、糊精、有机酸、蛋白质、氨基酸、甘油、高级醇、维生素、无机盐等全为天然所得。造老酒的“决窍”主要是守六法：“黍米必齐、曲孽必时、水泉必香、陶器必良、湛炽必洁、火剂必得”；把五关：“煪糜、糖化、发酵、压榨、陈储”。回答下列问题
（1）“曲蘖必时”中的曲蘖特指 （生物），在酿造黄酒过程中该生物的呼吸方式 。
（2）“陶器必良、湛炽必洁”中的“必良”是指酿造、陈储老酒的器具必须 ；”必洁“是指所用器具必须 。
（3）“火剂必得”是指在发酵时必须掌握好火候，该生物发酵所需的适宜温度为 。
（4）“糖化”是指将淀粉等水解为甜味糖，目的是 。
（5）“陈储”是指将榨出的酒放入储酒罐内陈储存放待用，要特别注意密封防止酸酒，导致酸酒的原因 。
【答案】（1）酵母菌；先有氧呼吸再无氧呼吸
（2）密封，不渗漏；；杀菌消毒，防止杂菌污染
（3）18℃-25℃
（4）有利于发酵过程中酵母菌对糖的利用
（5）空气中的醋酸菌和氧气进入，将酒精发酵为醋酸
【知识点】细胞呼吸原理的应用；果酒果醋的制作
【解析】【解答】（1）“曲菜必时"中的曲孽特指酵母菌，在酿造黄酒过程中，先进行有氧呼吸，酵母菌大量繁殖，而后进行无氧呼吸产生酒精。
（2）“陶器必良、湛炽必洁”中的“必良”是指酿造、陈储老酒的器具必须密封，不渗漏；”必洁“是指所用器具必须严格杀菌消毒，由于酿酒过程是酵母菌进行发酵的过程，所以防止杂菌污染可以使酵母菌更好的发挥作用。
（3）“火剂必得”是指控制适宜的温度保证酵母菌发酵所需要的温度等环境条件，酵母菌发酵所需的适宜温度为18℃-25℃。
（4）酵母菌是异养型生物，淀粉分解为甜味糖有利于发酵过程中酵母菌对糖类的利用。
（5）"陈储"是指将榨出的酒放入储酒罐内陈储存放待用，若是密封不好，空气中的醋酸菌和氧气进入，醋酸菌容易将酒精转化为醋酸，会形成"酸酒"，故存放过程要特别注意密封。
【分析】1、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵。温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，20℃左右，酒精发酵时，一般将温度控制在18~25℃，在葡萄酒自然发酵过程当中，其主要作用的是附着在葡萄皮上的野生酵母菌。
2、醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30~35℃。
24．（2022高二下·郑州期末）葡萄酒作为葡萄的主要深加工产品之一，在生产过程中会产生大量的酿酒残渣，每年我国的酿酒残渣量大概有50万吨左右，仅有少量被回收利用，绝大部分用做肥料、饲料甚至被当作垃圾扔掉，造成了资源的极大浪费，也给环境带来了巨大的压力。因此，如何合理利用酿酒葡萄残渣成为葡萄产业发展中亟待解决的问题。请回答下列问题：
（1）制作葡萄酒需要酵母菌，其代谢类型为 ，家中制作葡萄酒时可以不添加酵母菌，原因是 。酿酒时先通气，其中O2的作用是 ，之后需要密封，若密封不严混入空气，发酵液会变酸，其可能原因为 。
（2）可以利用萃取法从葡萄残渣中提取植物油，萃取前将原料干燥和粉碎的目的是 。萃取效率主要取决于 。植物油溶解于有机溶剂后，只需 ，就可以获得纯净的植物芳香油。
（3）为了解残渣中微生物的数量，取10g残渣加入90mL无菌水，混匀、静置 后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为88、92和99，则每克残渣中微生物数量为 个。
（4）酿酒葡萄残渣中膳食纤维含量较高，约占干物质的75%，其中的纤维素可以被纤维素酶水解，纤维素酶是一种复合酶包括C1酶、 和 ，前两种酶使纤维素分解为 。在筛选纤维素分解菌的过程中，发明了 染色法，其原理为 。
（5）有科学家利用黑曲霉菌株发酵酿酒葡萄残渣生产出了果胶酶，果胶酶在果汁生产中有着重要的应用，其作用有 (写出一条）。
【答案】（1）（异养）兼性厌氧型；葡萄皮上附着有野生型酵母菌；促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖；醋酸菌大量繁殖，进行醋酸发酵
（2）充分溶解，提高萃取效率；萃取剂的性质和使用量；蒸发出有机溶剂（过滤、浓缩）
（3）9.3×107
（4）Cx酶；葡萄糖苷酶；纤维二糖；刚果红；刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
（5）分解果胶，瓦解植物细胞壁及胞间层，榨取果汁更容易，提高出汁率；把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清
【知识点】测定某种微生物的数量；果胶酶的活性测定；芳香油的提取；果酒果醋的制作
【解析】【解答】 (1)酵母菌的代谢类型是异养兼性厌氧型，在家庭以葡萄为原料制作葡萄酒时，由于葡萄皮上附着有野生的酵母菌，故可以不添加酵母菌；酿酒时先通气，其中O2的作用是促进酵母菌的有氧呼吸，使其大量繁殖；如果密封不严混人空气，会造成醋酸菌大量增殖，进行醋酸发酵，发酵液会变酸。
(2)萃取前将原料粉碎，能减小原料颗粒大小，使原料与萃取剂充分接触；干燥能降低原料含水量，利于萃取剂溶解植物油。由此可见萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、草取的温度和时间等条件的影响。植物油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂（过滤、浓缩），就可以获得纯净的植物芳香油。
(3)稀释涂布平板法计数时，应统计30-300的菌落数，三个平板中菌落的平均数量为（88+92+99）/3=93，由于该过程是将0.1 mL稀释液接种于培养基上并且进行104倍稀释，10g残渣加入90mL无菌水，此处又稀释10倍，则每克残渣中微生物数量为93÷0.1×104×10=9.3×107个。
(4)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，C1酶和Cx酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将其进一步分解为葡萄糖。在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌，该方法称之为刚果红染色法。
(5)果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶和果胶分解酶，果胶酶在果汁生产中有着重要的应用，其作用有分解果胶，瓦解植物细胞壁及胞间层，榨取果汁更容易，提高出汁率；把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清。
【分析】1、酵母菌是单细胞真菌，是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵。
2、醋酸菌是好氧菌，当氧气和糖源都充足时能将糖分解成醋酸；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
3、稀释涂布平板法计算公式：每克样品中的菌株数=C/VxM，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液体积（mL），M代表稀释倍数。
4、纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶，C1酶、Cx酶可以把纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶再进一步将纤维二糖分解为葡萄糖，使微生物加以利用。
5、果胶酶：
（1）成分：是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。
（2）作用：果胶可溶性半乳糖醛酸。
（3）应用：降低果汁的黏度，有助于压榨，还能起到澄清作用。
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备考2023年高考生物学二轮复习16 微生物的培养及发酵工程技术
一、单选题
1．（2023高三上·清远期末）下图是研究人员从落叶地的土壤中筛选高效分解纤维素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是（ ）
A．在配制步骤②③的培养基时，高压蒸汽灭菌后将pH调至中性或弱碱性
B．步骤③筛选、纯化的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C．步骤③采用稀释涂布平板法进行接种，并需要加入纤维素作为唯一的碳源
D．步骤④加入的是刚果红染液，可根据菌落与透明圈的直径比来挑选优质菌落
2．（2022高三上·安徽开学考）下列有关微生物的培养、筛选、分离的叙述，错误的是（ ）
A．一定浓度的酒精与水的混合物可作为醋酸菌的发酵底物
B．判断某微生物的类型时，可以不用显微镜观察菌落的形态
C．若培养基上的菌落分布均匀，则是用平板划线法获得的单菌落
D．分离尿素分解菌时，应该从具有红色环带的菌落中挑取菌株
3．（2022高三下·天津月考）某种物质X（一种含有C、H、O、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解X。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解X的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和X，乙的组分为无机盐、水、X和Y。下列相关叙述中错误的是（ ）
A．甲、乙培养基均属于选择培养基，乙培养基组分中的Y物质是琼脂
B．若要筛选高效降解X的细菌菌株，甲、乙培养基中X是唯一的碳源
C．步骤⑤的筛选过程中，各培养瓶中的X溶液要有一定的浓度梯度
D．步骤⑤的筛选过程中，若培养基中的X浓度过高，某菌株对X的降解量可能下降
4．（2022高三上·广东月考）纸片扩散法药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有不同种类抗生素的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。某次实验结果如图，下列有关叙述错误的是（ ）
A．培养基中营养物质除氮源外还有碳源、水和无机盐
B．在图示固体培养基上接种的方法是稀释涂布平板法
C．形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
D．不同抗生素在平板上的扩散速率会影响抑菌圈的大小
5．（2022高二下·扬州期末）利用传统的纯粮固态发酵工艺生产高品质白酒过程中有多种微生物参与：将谷物中的大分子物质分解为小分子糖类等物质的a类菌种、将糖类发酵产生酒精的b类菌种、将酒精转化为醋酸的c类菌种、将酒精和酸性物质等转化为有香味酯的d类菌种。下列说法正确的是（ ）
A．可以使用以纤维素为唯一碳源的培养基来筛选a类菌种
B．产酒过程中需经常搅拌原料以增加b类菌种发酵所需氧气
C．控制温度在18~25℃有利于抑制c类菌种的生长而增加产酒量
D．不同白酒的品质差异只取决于d类菌种
6．（2022高三上·辽宁开学考）很多生活实例中蕴含着微生物发酵的原理。下列相关叙述错误的是（ ）
A．自制葡萄酒在发酵过程中，葡萄汁应装满发酵瓶并加盖以确保无氧
B．夏天开瓶后的红酒容易变酸，是由于空气中的醋酸菌将乙醇变成乙醛而后变为乙酸
C．用巴氏消毒法能对牛奶消毒杀死其中的绝大多数微生物，且不破坏牛奶的营养成分
D．用白萝卜制作泡菜时为缩短腌制时间，可向新坛中添加老坛内已经腌制过的泡菜汁
7．（2022·湖北）灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（ ）
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
8．（2022高二下·扬州期末）丙草胺（C17H26ClNO2）是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组为获得能修复污染土壤的微生物资源，从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株并对其计数，如下图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A．涂布前要了解培养基是否被污染可接种蒸馏水来培养检测
B．利用该方法计数结果往往比显微镜直接计数法偏小
C．以丙草胺为唯一氮源的培养基进行培养可提高降解菌的浓度
D．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数约为1.7×109个
9．（2022·台州模拟）涂布分离法可用于微生物的技术，下列叙述正确的是（ ）
A．选取具有最少菌落数的稀释倍数进行计数
B．严格厌氧微生物的计数宜采用涂布分离法
C．涂布培养基上的菌落数代表样品中的全部菌数
D．样品中待测菌数量多而稀释倍数太小时计数结果会偏小
10．（2022高二下·博罗期中）微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是（ ）
A．在每一区域内画线时接种环上的菌种直接来源于菌液
B．划线操作时应在酒精灯火焰旁边打开皿盖划线接种，接种完后在皿盖上做上相应标记
C．每次划线只能从上一次划线的末端开始，才能确保菌种逐步稀释以得到单菌落
D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
11．（2022·浙江模拟）下列关于“分离以尿素为氮源的微生物”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌
B．液体培养基振荡培养的目的是使微生物均匀分布以便涂布
C．对含有尿素的培养基进行灭菌时，需降低高压蒸汽灭菌的压力与温度
D．称取土壤、稀释土壤溶液、涂布平板这些操作都需要在酒精灯火焰旁进行
12．（2021高二下·遂宁期末）下列有关纤维素分解菌和尿素分解菌的叙述，错误的是（ ）
A．尿素分解菌能够在以尿素为唯一氮源的培养基上生长
B．纤维素分解菌能在仅以纤维素为碳源的培养基上生长
C．纤维素分解菌能够分解刚果红染料，从而出现透明圈
D．进行纤维素分解菌选择培养时，通常选用液体培养基
13．（2023高三上·东莞期末）利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下，有关叙述正确的是（ ）
A．大豆、小麦、麦麸为米曲霉大量增殖提供了充足的碳源、氮源、水和无机盐
B．米曲霉发酵过程不断搅拌有利于其通过无氧呼吸快速增殖
C．在发酵池中需加入抗生素才能保证酱油质量
D．酱油的制作是米曲霉、酵母菌等代谢类型不同的微生物共同作用的结果
二、多选题
14．（2022高二下·范县期末）下列有关发酵工程及其应用表述正确的是（ ）
A．发酵工程的菌种，可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种和基因工程育种获得
B．发酵罐培养的环境条件会影响微生物的生长繁殖，不会影响微生物代谢产物的形成
C．分离、提纯产物可以获得微生物细胞本身或者其代谢产物，这是发酵工程的中心环节
D．发酵工程生产的各种各样的食品添加剂可以增加食品营养，改善食品口味、色泽和品质
15．（2022·山东）啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法正确的是（）
A．用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B．焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C．糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D．通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
16．（2022高二下·常州期末）物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌才能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。下列相关叙述正确的是（ ）
A．步骤③用涂布器蘸取菌液后均匀地涂布在培养基表面
B．乙培养基中的Y物质可能为琼脂
C．步骤5应选择物质S浓度最低的锥形瓶中的菌株
D．物质S诱发细菌发生了突变，提高了其降解S的能力
17．（2021·安丘模拟）营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法不合理的是（ ）
A．过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同
B．进行过程②培养时必须先将丝绒布转印至基本培养基上顺序不能颠倒
C．统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大
D．营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关
18．下列有关生物技术和工程的说法正确的是（ ）
A．胚胎工程和基因工程都要利用细胞培养
B．制作果醋时应避免通入空气以保证有关菌种正常代谢
C．测定土壤中能分解尿素的细菌数目，应采用平板划线法
D．DNA粗提取时，用95%的冷却酒精进一步纯化DNA
三、综合题
19．（2022高三上·河北月考）随着环保要求的不断提高，作为清洁能源的生物气体备受青睐，而这些气体中混有的H2S容易腐蚀运输管道，并且燃烧后会产生污染物二氧化硫，因此需要将其清除。脱去H2S时生物反应体系中生成的副产物Na2S2O3和Na2SO4需要被降解，并且反应过程中钠盐的浓度会不断升高，所以筛选嗜盐和脱硫（脱去Na2S2O3和Na2SO4中的S2- ）性能优越的菌种均势在必行。已知嗜盐脱硫菌的菌落周围有明显的硫沉淀，颜色会由白色渐变为褐色。下表是两个相关的培养基配方。据此分析下列问题：
表1 脱硫富集培养基
NaHCO3 Na2S2O3·5H2O （NH4）2SO4 KNO3 K2HPO4
50g/L 50g/L 1g/L 1g/L 2g/L
表2 嗜盐脱硫选择培养基
NaHCO3 Na2S2O3·5H2O （NH4）2SO4 KNO3 K2HPO4 NaCl 琼脂
50g/L 50g/L 1g/L 1g/L 2g/L 50g/L 20g/L
（1）筛选菌株时，需先在液体富集培养基中培养，该操作的目的是 。
（2）嗜盐脱硫选择培养基按照物理状态划分属于 培养基，制备这种物理状态的培养基的目的是 。
（3）若需要对筛选的菌株进行计数，则应选择的接种方法是 ，使用的接种工具是 ，选取 的菌落作为计数的目的菌株。
（4）进一步研究环境对所筛菌株的影响，绘制曲线如图，则该菌株适宜温度范围是 （填写6℃的温差范围），适宜pH范围是 。
20．（2022高二下·安康期末）随着石油危机的出现，乙醇作为可再生资源中比较理想的液态燃料正受到人们越来越多的关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富，其主要成分之一是半纤维素。半纤维素容易被酸或者酶水解，其水解产物中的85%~90%为木糖。因此利用木糖发酵生产乙醇具有重要的用研究价值。酵母菌是传统的乙醇生产菌株，因其缺乏转化木糖的酶系而不能很好地利用木糖。自然界中某些酿酒酵母能利用木糖进行酒精发酵，某研究小组欲从土壤中分离这种酵母菌并对产酶活性进行测定，实验基本流程为：取土样→制取土壤悬液→扩大培养→选择培养→菌种分离→酶活性鉴定。回答下列问题；
（1）扩大培养又称富集培养，可增加 ，以确保能从样品中分离得到所需要的微生物。
（2）获得纯净培养物的关键是 。该研究小组将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于 的选择培养基，倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有 两种。若划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其它划线上有菌落。第二划线区域的第一条线上无菌落的原因可能是 。
（3）为进一步确定目的菌株的最佳产酶条件，该研究小组选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素进行实验。其中，培养基初始pH、培养温度会影响菌株产酶主要是因为 。摇床转速因影响 进而影响菌株产酶。
21．（2022高二下·范县期末）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，在地球上含量丰富。土壤中某些微生物能够产生纤维素酶分解利用纤维素，帮助人们利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。某科研小组为了将土壤中的分解纤维素细菌纯化培养，进行了如下操作。请回答相关问题：
成分 纤维素粉 NANO3 KH2PO4 KCl 酵母膏 水解酪素
含量（g） 5.0 1.0 1.2 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5
操作 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）上表是纤维素分解菌的选择培养基配方，若根据物理性质划分，该培养基属于 培养基。在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，操作者的双手需要进行清洗和 。
（2）刚果红（简称CR）是一种染料，在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成。下表为鉴别纤维素分解菌的培养基配方。
成分 羧甲基纤维素钠 酵母膏 KH2PO4 琼脂 土豆汁 配制浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌后按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液
含量（g） 5.0~10.0 1 0.25 15 100mL
操作 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
用该培养基来培养纤维素分解菌，培养结果如图（黑点代表菌落）。其中分解纤维素能力最强的是菌落 ，原因是 。
（3）图中图1和图2是分离培养纤维素分解菌的结果图，其对应的接种方法分别是 和 ，接种过程中，图2所示方法接种工具至少需灼烧灭菌 次。
（4）将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释104倍，分别按图1接种方式将0.1mL样品接种到5个培养基上，统计菌落数目为156、158、160，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为 个。若某同学利用相同样品进行接种，只统计出25个菌落，出现该结果的原因是 。
22．（2022高三上·高台开学考）酸菜是经乳酸菌发酵而成的一种发酵食品，制作过程中极易积累亚硝酸盐。一些乳酸菌能合成亚硝酸盐还原酶，能够显著降低亚硝酸盐含量。请回答相关问题。
（1）为获得高产亚硝酸盐还原酶的乳酸菌，某研究组以东北传统自然发酵酸菜为材料进行分离。
①在进行乳酸菌分离纯化时，科研人员将酸菜发酵液稀释后涂布在含溴甲酚绿（遇酸变色）的 （“选择”或“鉴别”）培养基上， （“需氧”或“厌氧”）培养一段时间后，挑取周围变色的单个菌落临时保存。
②在进行高产亚硝酸盐还原酶菌株筛选时，将临时保存的各菌种分别接种到含 的液体培养基中培养一段时间，离心收集上清液，在盐酸酸化条件下，依次加入对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐进行反应，筛选反应显色较 （深、浅）的菌株。
（2）利用筛选得到的菌种进行酸菜腌制，并测定亚硝酸盐含量（单位：mg/kg），结果如下表所示：
1 3 5 7 9 11 13 15
5% 3.8 4.0 10.1 35.7 25.7 11.5 5.7 2.1
10% 3.6 4.1 5.9 17.3 25.3 23.8 13.6 3.8
15% 3.3 3.4 3.5 4.9 8.4 12.9 11.2 3.4
据表分析，亚硝酸盐含量最高时的腌制条件是 。为避免细菌大量繁殖，产生大量的亚硝酸盐，除控制好表中涉及的腌制条件外，还需控制好腌制的 。
（3）有时制作的泡菜会“咸而不酸”，根据泡菜的制作流程及注意事项分析，最可能的原因是 。
23．（2022高三上·银川月考）即墨老酒被评定为中国北方黄酒的“营养酒王”，其酒内含有的糖分、糊精、有机酸、蛋白质、氨基酸、甘油、高级醇、维生素、无机盐等全为天然所得。造老酒的“决窍”主要是守六法：“黍米必齐、曲孽必时、水泉必香、陶器必良、湛炽必洁、火剂必得”；把五关：“煪糜、糖化、发酵、压榨、陈储”。回答下列问题
（1）“曲蘖必时”中的曲蘖特指 （生物），在酿造黄酒过程中该生物的呼吸方式 。
（2）“陶器必良、湛炽必洁”中的“必良”是指酿造、陈储老酒的器具必须 ；”必洁“是指所用器具必须 。
（3）“火剂必得”是指在发酵时必须掌握好火候，该生物发酵所需的适宜温度为 。
（4）“糖化”是指将淀粉等水解为甜味糖，目的是 。
（5）“陈储”是指将榨出的酒放入储酒罐内陈储存放待用，要特别注意密封防止酸酒，导致酸酒的原因 。
24．（2022高二下·郑州期末）葡萄酒作为葡萄的主要深加工产品之一，在生产过程中会产生大量的酿酒残渣，每年我国的酿酒残渣量大概有50万吨左右，仅有少量被回收利用，绝大部分用做肥料、饲料甚至被当作垃圾扔掉，造成了资源的极大浪费，也给环境带来了巨大的压力。因此，如何合理利用酿酒葡萄残渣成为葡萄产业发展中亟待解决的问题。请回答下列问题：
（1）制作葡萄酒需要酵母菌，其代谢类型为 ，家中制作葡萄酒时可以不添加酵母菌，原因是 。酿酒时先通气，其中O2的作用是 ，之后需要密封，若密封不严混入空气，发酵液会变酸，其可能原因为 。
（2）可以利用萃取法从葡萄残渣中提取植物油，萃取前将原料干燥和粉碎的目的是 。萃取效率主要取决于 。植物油溶解于有机溶剂后，只需 ，就可以获得纯净的植物芳香油。
（3）为了解残渣中微生物的数量，取10g残渣加入90mL无菌水，混匀、静置 后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为88、92和99，则每克残渣中微生物数量为 个。
（4）酿酒葡萄残渣中膳食纤维含量较高，约占干物质的75%，其中的纤维素可以被纤维素酶水解，纤维素酶是一种复合酶包括C1酶、 和 ，前两种酶使纤维素分解为 。在筛选纤维素分解菌的过程中，发明了 染色法，其原理为 。
（5）有科学家利用黑曲霉菌株发酵酿酒葡萄残渣生产出了果胶酶，果胶酶在果汁生产中有着重要的应用，其作用有 (写出一条）。
答案解析部分
1．【答案】A
【知识点】微生物的分离和培养；纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】A、配制培养基时，调节培养基的pH应在灭菌之前进行，A错误；
B、步骤③筛选、纯化的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，可以获得单细胞菌落，B正确；
C、加入纤维素作为唯一的碳源，能分解纤维素的细菌能利用纤维素存活，不能分解纤维素的细菌由于缺少碳源则会死亡，所以步骤③采用稀释涂布平板法进行接种，并需要加入纤维素作为唯一的碳源，C正确；
D、步骤④加入的是刚果红染液，可根据菌落与透明圈的直径比来挑选优质菌落，透明圈的直径越大，说明分解纤维素的能力越强，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、微生物实验室分离中配制培养基的操作步骤：计算→称量→溶解→调pH→灭菌→倒平板。
3、刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维分解菌。
2．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；尿素分解菌的分离与计数
【解析】【解答】A、果醋的制作过程中，醋酸菌可以利用一定浓度的酒精与水的混合物进行继续发酵，A正确；
B、由于不同菌种形成的菌落形态特征不同，且菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌落的形态特征，B正确；
C、培养基上菌落分布均匀是用稀释涂布平板法获得的单菌落，C错误；
D、分解尿素的细菌在分解尿素时产生氨，氨能使酚红指示剂显红色，从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、当氧气和糖源都充足时，醋酸菌能将糖分解成醋酸；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
2、微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 3、
3、分离分解尿素的细菌：
（1）选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源。
（2）鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高，指示剂变红，说明细菌能分解尿素。
3．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；组织培养基的成分及作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】A、甲、乙培养基均只含有机物X，属于选择培养基，乙培养基组分中除了X外，还加入了Y物质琼脂，从而获得固体培养基，A正确；
B、若要筛选高效降解X的细菌菌株，需要甲、乙培养基中的X是唯一提供碳源的有机物，B正确；
C、步骤⑤中自变量是挑取的不同的菌落，各培养瓶中的X溶液的浓度应该是一致的，C错误；
D、步骤⑤的筛选过程中，若培养基中的X浓度过高，则会导致菌体失水影响菌体的正常生长，因此某菌株对X的降解量可能下降，D正确。
故答案为：C。
【分析】分析题图，通过过程①获得菌悬液，过程②通过选择培养可以使分解X的细菌大量繁殖，过程③通过稀释涂布获得分解X物质的单菌落，过程④再次对各种单萄落进行筛选，经过过程，⑤多次筛选后获得高效降解X的菌体。
4．【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、培养基为微生物提供营养，包括碳源（提供碳元素）、氮源、水、无机盐等等，A正确；
B、结合图示抑菌圈可知，在图示固体培养基上接种的方法是稀释涂布平板法，B正确；
C、形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物不太敏感，导致不能抑制微生物生长，C错误；
D、抗生素抑制细菌的生长，不同抗生素在平板上的扩散速率会影响抑菌圈的大小，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
5．【答案】C
【知识点】培养基对微生物的选择作用；果酒果醋的制作
【解析】【解答】A、分析题意可知，a类菌种可将谷物中的大分子物质分解为小分子糖，并以此作为碳源，故可以使用以谷物为唯一碳源的培养基来筛选a类菌种，A错误；
B、b类菌种可将糖类发酵为酒精，该过程应营造无氧环境，搅拌会增加发酵液中的溶氧量，B错误；
C、结合分析可知，c类菌种主要是醋酸菌，醋酸菌发酵适宜的温度是30～35℃，而b类菌种酒精发酵所需的适宜温度是18~25℃，故控制温度在18~25℃有利于抑制c类菌种的生长而增加产酒量，C正确；
D、据题意可知，白酒最终产生需要四类菌种的参与，故不同白酒的品种取决于4类菌种，D错误。
故答案为：C。
【分析】 1、选择培养基指在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。
2、分析题意可知，a类菌种能产生酒精，主要是酵母菌；c类菌种可将酒精转化为醋酸，故为醋酸菌。
3、酵母菌是单细胞真菌，是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，酒酿酵母最适生长温度约为28℃。
4、醋酸菌是好氧菌，当氧气和糖源都充足时能将糖分解成醋酸；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
6．【答案】A
【知识点】果酒果醋的制作；泡菜的制作；灭菌技术
【解析】【解答】A、为了防止发酵过程中发酵液溢出，葡萄汁装入发酵瓶时不能装满，要留约1/3的空间，A错误；
B、夏天开瓶后的红酒，在有氧的条件下，空气中的醋酸菌将乙醇变成乙醛而后变为乙酸，导致红酒变酸，B正确；
C、巴氏消毒法是一种低温消毒法，用巴氏消毒法对牛奶消毒既能杀死牛奶中的绝大多数微生物，又不破坏牛奶中的营养成分，C正确；
D、泡菜汁中含有一定量的发酵菌种，所以在腌制过程中，加入一些已经腌制过泡菜汁可缩短腌制时间，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵。温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，20℃左右，酒精发酵时，一般将温度控制在18~25℃，在葡萄酒自然发酵过程当中，其主要作用的是附着在葡萄皮上的野生酵母菌。
2、醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30~35℃。
3、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
7．【答案】D
【知识点】DNA的粗提取和鉴定；动物细胞培养技术；灭菌技术
【解析】【解答】A、动、植物细胞DNA的提取过程不需要在无菌环境，A错误；
B、动物细胞培养基中需要无菌无毒的环境，添加一定量的抗生素，微生物的培养不能加入抗生素，抗生素抑制细菌生长，B错误；
C、培养基一般用湿热灭菌法进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；
D、湿热灭菌法和干热灭菌法都可用来对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
2、DNA粗提取和鉴定过程：
（1）DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
（2）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；
（3）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可.如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜.例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；
（4）DNA的析出与鉴定：（1）将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2~3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分；（2）取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解.然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
3、动物细胞培养：
（1）定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，原理细胞增殖。
（2）动物细胞培养过程：取动物组织块→用机械方法或胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
（3）动物培养条件：
①无菌、无毒的环境：a、消毒、灭菌；b、添加一定量的抗生素；c、定期更换培养液，以清除代谢废物。②营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。③温度和pH。④气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。
（4）注意事项：①动物细胞连续培养50代左右，会出现大量细胞死亡而只有少量细胞生存的现象，这少数细胞的遗传物质发生变化，往往具有癌变的特点。②动物细胞培养基液体，植物细胞培养基固体，培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官。③动物组织处理使细胞分散后的初次培养称为原代培养， 一般传至10代左右便会出现生长停滞。
8．【答案】A
【知识点】测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、涂布前要了解培养基是否被污染可将未接种的培养基在相同条件下培养，观察是否有菌落出现，A错误；
B、该计数方法为稀释涂布平板法，由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故计数结果比显微镜直接计数法偏小，B正确；
C、若以丙草胺作为唯一氮源，则只有具有降解能力的降解菌能够存活，故可以提高降解菌的浓度，C正确；
D、根据5号试管的数据可知，每克土壤中菌株数为（168+175+167）÷3÷0.1×106=1.7×109个，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、稀释涂布平板法：
（1）稀释：将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL悬液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（2）涂布：取0.1mL的菌液，滴加到培养基表面。涂布器先浸在有酒精的烧杯中，再放在火焰上灼烧，待酒精烧尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂布时转动培养皿，使涂布均匀。
（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱（30~37℃）中培养1~2天 ，在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。
（4）计数：一般选择菌落数在30-300的平板进行计数，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，以减少偶然误差。
2、稀释涂布平板法计算公式：每克样品中的菌株数=C/VxM，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液体积（mL），M代表稀释倍数。
9．【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、一般选取平板上菌落数30-300内的平板进行计数，需要合适的稀释度，A错误；
B、稀释涂布平板法会接触到空气，不适宜用于严格厌氧微生物的计数，B错误；
C、涂布培养基上的菌落数代表样品中的全部活菌数，不包括死的菌 ，C错误；
D、样品中待测菌数量多而稀释倍数太小时会有细菌重叠在一起形成一个菌落，计数结果会偏小，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
2、统计菌落数目的方法∶(1)显微镜直接计数法①原理∶利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法∶用计数板计数；③缺点∶不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法）①原理∶当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作∶a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数= ( c+V )×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积( mL ) ，M代表稀释倍数。
10．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、 划线 1时的菌种直接来自于菌液， 2、3、4、5 划线的菌种直接来自上次划线的尾端，A错误；
B、 划线操作时应在酒精灯火焰旁边打开一道缝进行划线接种 ，避免空气中的杂菌污染，B错误；
C、每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。为了得到单菌落，第1区和第5区的划线是不能连接起来的，C正确，D错误；
故答案为：C
【分析】（1）平板划线法接种菌种时在，整个过程中需要防止杂菌污染：
①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
②划线操作在酒精灯火焰旁进行。
③接种环蘸取菌液时，要将试管口通过火焰。
④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
（2）在作第二次划线以及其后的操作时，要从上一次划线的末端开始划线的原因是划线末端含有的细菌数目较少， 每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。
11．【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；尿素分解菌的分离与计数；灭菌技术
【解析】【解答】解：A、在尿素固体培养基上生长的细菌，不一定都是以尿素为氮源的，可能利用空气中的氮气，A不符合题意；
B、振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，所以振荡培养条件下细菌生长速度加快，B不符合题意；
C、对含有尿素的培养基进行灭菌时，不能降低高压蒸汽灭菌的压力与温度，否则达不到灭菌的效果，C不符合题意；
D、为防止杂菌污染，称取土壤、稀释土壤溶液、涂布平板都要在火焰旁进行，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】 分离土壤中以尿素为氮源的微生物实验的原理：在以尿素为唯一氮源的培养基上，能分解尿素的微生物能以尿素为氮源生长，其他不能利用尿素的微生物由于缺乏氮源无法生长。选择培养基是否起到选择作用，要有对照，对照组是全营养的培养基。
12．【答案】C
【知识点】尿素分解菌的分离与计数；纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】A、尿素分解菌能分泌脲酶，脲酶能将尿素分解为氨，从而能在仅以尿素为氮源的培养基上生长，A正确；
B、纤维素分解菌可以产生纤维素酶将纤维素分解为葡萄糖，从而纤维素分解菌能在仅以纤维素为碳源的培养基上生长，B正确；
C、纤维素分解菌能够分解纤维素，而不是分解刚果红染料，从而使菌落周围出现透明圈，C错误；
D、选择培养时使用液体培养基可以增加纤维素分解菌的浓度，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、纤维素分解菌的分离：
（1）方法：刚果红染色法。
（2）原理：刚果红会与纤维素形成红色复合物，如果纤维素被降解，则培养基表面会形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）标志：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
（4）操作流程： 土壤取样：富含纤维素的环境→选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量→梯度稀释→涂布平板：将样品涂布在鉴别培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2、 能分解尿素的细菌可以合成脲酶，脲酶能催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源；因此，以尿素为唯一氮源的培养基可以分离出能分解尿素的细菌。
3、菌种分离采用固体培养基，获得单菌落，菌种的扩大培养用液体培养基，增加菌种的数量。
13．【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、大豆、小麦、麦麸为米曲霉大量增殖提供了充足的碳源、氮源，A错误；
B、米曲霉发酵过程不断搅拌有利于其通过有氧呼吸快速增殖，B错误；
C、抗生素会抑制细菌增殖，发酵池中不能加入抗生素，C错误；
D、酱油的制作是米曲霉、酵母菌等代谢类型不同的微生物共同作用的结果，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。果酒制作的原理：在有氧条件下进行有氧呼吸、大量繁殖；在无氧条件下，进行酒精发酵。因此，应先通气后密封，通气的目的是让酵母菌大量繁殖，密封的目的是让酵母菌进行酒精发酵。
14．【答案】A,D
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、用于发酵的菌种可以从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得，A正确；
B、发酵罐培养的环境条件会影响代谢的途径从而影响产物的形成，例如谷氨酸发酵过程中，发酵罐中碳氮比（碳元素与氮元素的比值）为4∶1时，菌体大量繁殖而产生的谷氨酸少；当碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸的合成量大增，B错误；
C、发酵工程的中心环节是发酵过程，C错误；
D、发酵工程生产的各种各样的食品添加剂可以增加食品营养，改善食品口味、色泽和品质，D正确。
故答案为：AD。
【分析】发酵工程的基本操作过程为：
（1）菌种的选育：从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
（2）扩大培养：发酵之前需对菌种进行扩大培养。
（3）培养基的配制：在菌种确定后，要选择原料制备培养基，培养基的配方须经反复试验才能确定。
（4）灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
（5）接种：对发酵过程进行监控和控制，还可以进行反馈控制。
（6）发酵过程：这是发酵工程的中心环节，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加需要的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
（7）产品的分离提纯：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。若产品是代谢物，可采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
15．【答案】A,C,D
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、赤霉素促进种子萌发，啤酒发酵过程中，用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶，A正确；
B、焙烤的目的是为了加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活，B错误；
C、啤酒的发酵过程为发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵，消毒、终止，糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵，C正确；
D、啤酒酵母双乙酰的形成会影响啤酒的风味及产量，目前通过转基因技术获得的酵母菌双乙酰生成量减少，并且缩短了啤酒的发酵周期，D正确。
故答案为：A、C、D。
【分析】啤酒发酵过程概述：
（1）啤酒的发酵过程分为主发酵和 后发酵两个阶段。主发酵包括发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵，后发酵包括消毒、终止。
（2）主发酵阶段完成酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成
（3）后发酵的条件是低温、密闭的环境下储存一段时间。
（4）焙烤的目的：加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
（5）蒸煮的目的：产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。
16．【答案】B,C
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】A、步骤③先吸取0.1mL菌液滴在培养基上，再用涂布器蘸取菌液后均匀地涂布在培养基表面，A错误；
B、乙培养基属于固定培养基，乙培养基中的Y物质为琼脂，B正确；
C、由题意可知，该菌株能降解S，在培养基相同的情况下，S浓度越低，说明菌株的降解能力越强，因此步骤5应选择物质S浓度最低的锥形瓶中的菌株，C正确；
D、物质S对细菌进行选择，能够降解S的菌株才能在以S为唯一碳源和氮源的选择培养基上生存，然后筛选出降解S能力强的，D错误。
故答案为：BC。
【分析】稀释涂布平板法：
（1）稀释：将10g淤泥加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL悬液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（2）涂布：取0.1mL的菌液，滴加到培养基表面。涂布器先浸在有酒精的烧杯中，再放在火焰上灼烧，待酒精烧尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂布时转动培养皿，使涂布均匀。
（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱（30~37℃）中培养1~2天 ，在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。
（4）计数：一般选择菌落数在30-300的平板进行计数，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，以减少偶然误差。
17．【答案】A,C,D
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】A、过程①得到的菌落均匀分布，接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分不同，基本培养基中缺乏某种氨基酸，A错误；
B、进行过程②培养时先将丝绒布转印至完全培养基上，可能会携带某种氨基酸进入基本培养基，因此顺序不能颠倒，B正确；
C、统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏小，C错误；
D、若该菌株为原核细胞，则不存在核孔复合体，营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，应是控制该酶合成的基因发生突变，D错误。
故答案为：ACD。
【分析】1、培养基为微生物提供生长、繁殖和积累代谢产物的营养物质。营养物质归纳为碳源、氨源、生长因子、无机盐和水。培养基按物理性质可分为固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动。根据化学成分分为合成培养基、天然培养基等；根据用途分为选择培养基、鉴别培养基。
2、稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
3、完全培养基中含有微生物生长所需要的各种营养成分，基本培养基缺少某种营养成分，通过影印培养法，二者接种的菌种相同，基本培养基上不能生长的菌株即为营养缺陷型菌株。
18．【答案】A,D
【知识点】尿素分解菌的分离与计数；果酒果醋的制作；DNA的粗提取和鉴定；胚胎工程的概念及其技术
【解析】【解答】A、胚胎工程和基因工程都可获得生物个体，所以都需要利用细胞培养技术，A正确；
B、参与果醋制作的菌种是醋酸菌，其代谢类型是异养需氧型，因此制作果醋时需要持续通入无菌空气，保证醋酸菌正常代谢，B错误；
C、测定土壤中能分解尿素的细菌数目，应采用稀释涂布平板法，C错误；
D、DNA粗提取时，用体积分数为95%的冷却酒精可溶解杂质，析出DNA，因此可进一步纯化DNA，D正确．
故选：AD．
【分析】1、果醋的制作需用醋酸菌，醋酸菌是一种好氧菌，所以在制作过程中需通氧气；当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄糖氧化成醋酸；醋酸菌的呼吸作用为严格的有氧呼吸．
2、稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养；在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落．
平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；在数次划线后培养，可以分离由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的子细胞群，这就是菌落．
19．【答案】（1）对脱硫细菌进行富集培养
（2）固体；获得脱硫细菌的菌落，有利于通过菌落特征对其进行筛选
（3）稀释涂布平板法；涂布器；周围有明显的硫沉淀，颜色为褐色
（4）36~42℃；8.5-10.5
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】（1）筛选菌株时，需先在液体富集培养基中培养，该操作的目的是对脱硫细菌进行富集培养，增加其数量，在液体培养基中可以让微生物获得足够的营养满足生长的需求。
（2）嗜盐脱硫选择培养基中有琼脂，按照物理状态划分属于固体培养基。制备固体培养基可以获得嗜盐脱硫细菌的菌落，有利于通过菌落特征对其进行筛选。
（3）稀释涂布平板法不仅可以获得单菌落，而且可以用来计数，该接种方法需要使用的接种工具是涂布器。嗜盐脱硫菌的菌落特征表现为：周围有明显的硫沉淀，颜色由白色渐变为褐色，据此应选菌落周围有明显的硫沉淀，颜色为褐色的菌落的作为目标菌。
（4）根据图示曲线可知，嗜盐和脱硫性能优越的菌种具有高效脱硫的特征，因此应该选择硫浓度下降最为明显的温度和 pH 条件，据图可知，最适温度是 36~42℃，最适 pH 是 8.5-10.5。
【分析】1、筛选步骤需要使用固体培养基；扩增目的菌应该采用液体培养基
2、稀释涂布平板法既能分离微生物也能对微生物进行计数，而平板划线法只能分离微生物。
20．【答案】（1）目的菌株数量
（2）防止外来杂菌的入侵；以木糖为唯一碳源；平板划线法和稀释涂布平板法；接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作（或第一次划线未从第一区域末端开始）
（3）培养基初始pH、培养温度会影响酶活性；溶氧量、菌种获取营养物质的概率
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用
【解析】【解答】(1)扩大培养又称富集培养，一般采用液体培养基，液体培养基能够增加营养物质和菌体的接触，从而达到增加菌种数量的目，以确保能够从样品中分离得到所需微生物。
(2)为获得纯净培养物，必须防止外来杂菌的入侵，否则培养物中会混杂很多不需要的菌种，影响实验效果。由题干“半纤维素容易被酸或者酶水解，其水解产物中的85%~90%为木糖。因此利用木糖发酵生产乙醇具有重要的用研究价值”可知，需要筛选出能分解木糖的目的菌株，因此要将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于以木糖为唯一碳源的选择培养基，倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种。若划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其它划线上有菌落。第二划线区域的第一条线上无菌落的原因是接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作、未从上次划线末端开划线。
(3)培养基初始pH、培养温度会影响酶活性；摇床转速因影响溶氧量、菌种获取营荞物质的几率进而影响菌株产酶。
【分析】1、平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞；③将试管口通过火焰；④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞；⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿；⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连；⑧将平板倒置放入培养箱中培养。稀释涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；②取少量菌液，滴加到培养基表面；③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
2、发酵工程的基本环节：
（1）选育菌种：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。
（2）扩大培养：在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。扩大培养的原因是：工业发酵罐的体积一般很大，需要接种大量菌种。
（3）配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
（4）灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。灭菌的原因：发酵工程种所用的菌种大多是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大降低。灭菌目的：避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量。
（5）发酵：①场所：发酵罐。②条件控制：a.随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。b.及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
（6）分离、提纯产物：①如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。②如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
21．【答案】（1）液体；（酒精）消毒
（2）E；刚果红与纤维素反应形成红色复合物，纤维素分解菌能够分解纤维素，因此纤维素分解菌周围会形成透明圈，且分解能力越强透明圈越大
（3）稀释涂布平板法；平板划线法；5
（4）1.58×108；涂布器灼烧后未冷却即涂布，高温下纤维素分解菌被烫死；培养液未摇匀即取样，样品中纤维素分解菌过少（其他答案合理即可）
【知识点】微生物的分离和培养；纤维素分解菌的分离
【解析】【解答】（1）表中培养基不含有琼脂等凝固剂，所以属于液体培养基。为防止杂菌污染，需要将操作的双手清洗并消毒。
(2)纤维素分解菌鉴定的方法是刚果红染色法，其原理是：刚果红与纤维素反应形成红色复合物，纤维素分解菌能够分解纤维素，因此纤维素分解菌周围会形成透明圈，且分解能力越强透明圈越大，图中E菌落透明圈最大，所以分解纤维素能力最强。
(3)图1的接种方法菌落分布均匀，接种方法是稀释涂布平板法，而图2是平板划线法。每次划线前后都需要灼烧接种环，图2一共划线4个区域，所以需要灼烧接种环5次。
(4)5g土壤溶于45mL无菌水，相当于1mL含有0.1g，所以稀释了10倍，根据菌落数目的计算公式每克土壤中活菌数约为（C÷V）×m=（158+156+160）÷3÷0.1×10×104=1.58×108个；如果统计的数目太少，可能的原因有涂布器灼烧后未冷却即涂布，高温下纤维素分解菌被烫死；培养液未摇匀即取样，样品中纤维素分解菌过少。
【分析】1、纤维素分解菌的分离：
（1）方法：刚果红染色法。
（2）原理：刚果红会与纤维素形成红色复合物，如果纤维素被降解，则培养基表面会形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）标志：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 （4）操作流程： 土壤取样：富含纤维素的环境→选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量→梯度稀释→涂布平板：将样品涂布在鉴别培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2、微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
22．【答案】（1）鉴别；厌氧；亚硝酸盐；浅
（2）食盐用量5%，腌制7天；温度
（3）加入的食盐过多，抑制了乳酸菌的生长繁殖
【知识点】亚硝酸盐含量的测定
【解析】【解答】
（1）①溴甲酚绿遇酸变色，可用于鉴定乳酸菌，且乳酸菌是厌氧菌，因此在进行乳酸菌分离纯化时，将酸菜发酵液稀释后涂布在含溴甲酚绿的鉴别培养基上，厌氧培养一段时间后，挑取周围变色的（单个）菌落临时保存。
②在进行高产亚硝酸盐还原酶菌株筛选时，将临时保存的各菌种分别接种到含亚硝酸盐的液体培养基中培养一段时间，离心收集上清液。在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。颜色越浅，说明亚硝酸盐的含量越低，则相应的菌株产亚硝酸盐还原酶的量越多，即要筛选反应显色较浅的菌株。
（2）根据表中数据可知，亚硝酸盐含量最高时的腌制条件是食盐用量5%，腌制7天。腌制的时间、温度和食盐的用量都会影响亚硝酸盐的含量。故为避免细菌大量繁殖，产生大量的亚硝酸盐，除控制好表中涉及的腌制条件外，还需控制好腌制的温度。
（3）泡菜的制作离不开乳酸菌。在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。如果加入的食盐过多，抑制了乳酸菌的生长繁殖，就会出现制作的泡菜“咸而不酸”的现象。
【分析】亚硝酸盐含量的测定：
（1）亚硝酸盐的产生：由硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成。
（2）亚硝酸盐的危害：在特定情况下可转变成致癌物亚硝胺。
（3）亚硝酸盐含量的测定：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐先与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，然后与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色产物，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
23．【答案】（1）酵母菌；先有氧呼吸再无氧呼吸
（2）密封，不渗漏；；杀菌消毒，防止杂菌污染
（3）18℃-25℃
（4）有利于发酵过程中酵母菌对糖的利用
（5）空气中的醋酸菌和氧气进入，将酒精发酵为醋酸
【知识点】细胞呼吸原理的应用；果酒果醋的制作
【解析】【解答】（1）“曲菜必时"中的曲孽特指酵母菌，在酿造黄酒过程中，先进行有氧呼吸，酵母菌大量繁殖，而后进行无氧呼吸产生酒精。
（2）“陶器必良、湛炽必洁”中的“必良”是指酿造、陈储老酒的器具必须密封，不渗漏；”必洁“是指所用器具必须严格杀菌消毒，由于酿酒过程是酵母菌进行发酵的过程，所以防止杂菌污染可以使酵母菌更好的发挥作用。
（3）“火剂必得”是指控制适宜的温度保证酵母菌发酵所需要的温度等环境条件，酵母菌发酵所需的适宜温度为18℃-25℃。
（4）酵母菌是异养型生物，淀粉分解为甜味糖有利于发酵过程中酵母菌对糖类的利用。
（5）"陈储"是指将榨出的酒放入储酒罐内陈储存放待用，若是密封不好，空气中的醋酸菌和氧气进入，醋酸菌容易将酒精转化为醋酸，会形成"酸酒"，故存放过程要特别注意密封。
【分析】1、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵。温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，20℃左右，酒精发酵时，一般将温度控制在18~25℃，在葡萄酒自然发酵过程当中，其主要作用的是附着在葡萄皮上的野生酵母菌。
2、醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30~35℃。
24．【答案】（1）（异养）兼性厌氧型；葡萄皮上附着有野生型酵母菌；促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖；醋酸菌大量繁殖，进行醋酸发酵
（2）充分溶解，提高萃取效率；萃取剂的性质和使用量；蒸发出有机溶剂（过滤、浓缩）
（3）9.3×107
（4）Cx酶；葡萄糖苷酶；纤维二糖；刚果红；刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
（5）分解果胶，瓦解植物细胞壁及胞间层，榨取果汁更容易，提高出汁率；把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清
【知识点】测定某种微生物的数量；果胶酶的活性测定；芳香油的提取；果酒果醋的制作
【解析】【解答】 (1)酵母菌的代谢类型是异养兼性厌氧型，在家庭以葡萄为原料制作葡萄酒时，由于葡萄皮上附着有野生的酵母菌，故可以不添加酵母菌；酿酒时先通气，其中O2的作用是促进酵母菌的有氧呼吸，使其大量繁殖；如果密封不严混人空气，会造成醋酸菌大量增殖，进行醋酸发酵，发酵液会变酸。
(2)萃取前将原料粉碎，能减小原料颗粒大小，使原料与萃取剂充分接触；干燥能降低原料含水量，利于萃取剂溶解植物油。由此可见萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、草取的温度和时间等条件的影响。植物油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂（过滤、浓缩），就可以获得纯净的植物芳香油。
(3)稀释涂布平板法计数时，应统计30-300的菌落数，三个平板中菌落的平均数量为（88+92+99）/3=93，由于该过程是将0.1 mL稀释液接种于培养基上并且进行104倍稀释，10g残渣加入90mL无菌水，此处又稀释10倍，则每克残渣中微生物数量为93÷0.1×104×10=9.3×107个。
(4)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，C1酶和Cx酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将其进一步分解为葡萄糖。在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌，该方法称之为刚果红染色法。
(5)果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶和果胶分解酶，果胶酶在果汁生产中有着重要的应用，其作用有分解果胶，瓦解植物细胞壁及胞间层，榨取果汁更容易，提高出汁率；把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清。
【分析】1、酵母菌是单细胞真菌，是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵。
2、醋酸菌是好氧菌，当氧气和糖源都充足时能将糖分解成醋酸；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
3、稀释涂布平板法计算公式：每克样品中的菌株数=C/VxM，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液体积（mL），M代表稀释倍数。
4、纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶，C1酶、Cx酶可以把纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶再进一步将纤维二糖分解为葡萄糖，使微生物加以利用。
5、果胶酶：
（1）成分：是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。
（2）作用：果胶可溶性半乳糖醛酸。
（3）应用：降低果汁的黏度，有助于压榨，还能起到澄清作用。
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