课件21张PPT。课题3 血红蛋白的提取和分离一、基础知识：
（一）蛋白质提取和分离原理
（二）蛋白质提取和分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法
2）电泳法
（三）缓冲液的作用二、实验操作－－实验步骤蛋白质提取与分离的依据－－
蛋白质的物理化学性质差异：
1.分子的形状、大小
2.电荷性质和多少
3.溶解度
4.吸附性质
5.对其他分子亲和力 1.凝胶色谱法 （1）原理：
（2）材料：凝胶大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；
小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法概念：2．凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷3）常用电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
聚丙酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 影响蛋白质分子运动速度的因素√√√√√√√由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。
如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）缓冲溶液－－洗脱剂
作用：
配制：
调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。
（模拟生物体内的过程） 思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？血液组成成分阅读思考：
血液由______和________两部分组成。
血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。
该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。1.洗 涤 红 细 胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液
100mL重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白阅读思考：
释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？
为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：
蒸馏水的作用是______________________________。
加入甲苯的作用是____________________________。
充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂3.分离血红蛋白分离过程红细胞
混合液烧杯有机溶剂
血红蛋白4.透析血红蛋白透析的目的是什么？去除血红蛋白中的小分子杂质纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液
“G”表示什么？75代表什么？注意： 色谱柱不能内不能有气泡；
装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶是凝胶装填紧密3.样品的加入和洗脱 1.调液面 2.加样
3.再调液面 4.洗脱 5.收集注意事项1. 红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
2.色谱柱的装填：
装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
3. 凝胶的预处理：
沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。Why？知识总结血红蛋白的提取和分离
