课件39张PPT。专题5 DNA和蛋白质技术
课题1 DNA的粗提取与鉴定一、提取DNA的方法和原理
1.思路与方法:
(1)思路:选用一定的___________方法分离具有不同_______
_________的生物大分子。
(2)方法:利用DNA与__________________等在物理和化学性质
方面的差异,提取DNA,去除其他成分。物理或化学物理或化学性质RNA、蛋白质和脂质2.原理:
(1)分离原理:DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的_____溶液
中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的_______就能使____
充分溶解,而使_____沉淀,或者相反,以达到分离的目的。NaCl盐浓度DNA杂质(2)提纯原理:
①DNA不溶于_____溶液,但是细胞中的某些蛋白质则可溶于其
中。
②_______能水解蛋白质,但对DNA没有影响。
③大多数蛋白质不能忍受60℃～80℃的高温而发生变性,而DNA
在_____以上才会变性。
④_______能够瓦解细胞膜,但对DNA没有影响。酒精蛋白酶80℃洗涤剂(3)鉴定:
DNA+_______ 蓝色二苯胺沸水浴_______二、DNA粗提取与DNA鉴定的实验设计
1.提取材料的选取及原则:
(1)选用________相对较高的生物组织。
(2)细胞较容易破碎,其中的____容易提取。DNA含量DNA2.破碎细胞,获取含DNA的滤液:
(1)动物细胞的破碎:
①选材及方法:选用动物细胞作为实验材料时,由于其无
_______,因此可直接采用吸水涨破的方法。
②过程:以鸡血为例
在鸡血细胞液中加入一定量的_______,同时用_______搅拌,细
胞会吸水涨破,然后用_____过滤,过滤后收集滤液即可。细胞壁蒸馏水玻璃棒纱布(2)植物细胞的破碎:
①方法:需要先用_______溶解细胞膜。
②过程:以提取洋葱的DNA为例
在切碎的洋葱中加入一定的_____________,进行充分地搅拌和
_____,过滤后收集研磨液。洗涤剂洗涤剂和食盐研磨3.去除滤液中的杂质:
方案一:利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中_____________,通过
控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
方案二:直接在滤液中加入_______,反应10 min～15 min,嫩肉
粉中的___________能够分解蛋白质。
方案三:将滤液放在___________的恒温水浴箱中保温10 min～
15 min,注意严格控制温度范围。溶解度的不同嫩肉粉木瓜蛋白酶60℃～75℃4.DNA的析出:利用DNA不溶于_______________这一原理,可从
DNA溶液中析出比较纯净的DNA,此时DNA的状态为___________。
5.DNA的鉴定:将呈白色丝状物的DNA溶解于5 mL物质的量浓度
为__________________中,再加入4 mL的_______试剂,沸水浴
加热5 min,冷却后观察溶液的颜色,同时设计不含DNA的NaCl溶
液作为对照。冷却的酒精溶液白色丝状物2 mol/L的NaCl溶液二苯胺三、操作提示
1.以血液为实验材料时,每100 mL血液中需要加入3 g
_________,防止_________。
2.加入洗涤剂后,动作要___________,否则容易产生大量的
_____,不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,
动作要轻缓,以免__________________,导致DNA分子不能形成
_________。
3.鉴定DNA用的染色剂_______试剂要现配现用,否则会影响鉴
定的效果。柠檬酸钠血液凝固轻缓、柔和泡沫加剧DNA分子的断裂絮状沉淀二苯胺【思考辨析】
1.判断正误
(1)用玻璃棒搅拌时,搅拌方向应顺时针和逆时针交替,这样
搅拌更充分。( )
【分析】搅拌时,应缓慢沿一个方向搅拌,防止DNA断裂,以便
获得较完整的DNA。
(2)染色剂二苯胺可用甲基绿染色剂代替。( )
【分析】甲基绿染色剂用来染色后观察DNA的分布,不能用来
进行DNA的鉴定。××(3)利用热变性的原理分离DNA和蛋白质后,可通过过滤将DNA和
蛋白质分开。( )
(4)可将鉴定试剂二苯胺先配制好,低温下保存,方便以后利
用。( )
【分析】二苯胺试剂易变性而失去作用,因此要现配现用。√×2.问题思考
(1)为什么不能用猪的红细胞作为材料来提取DNA?
提示：哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核,因此细胞中无DNA分子。
(2)如果用植物细胞作为实验材料,操作过程和动物细胞有何区别?
提示：因为植物细胞具有细胞壁,不能吸水涨破,因此必须先通过切碎和研磨来破坏细胞壁。一、DNA粗提取的原理【易错提醒】(1)盐析过程DNA的空间结构不变,没有变性,只是溶解度在不同盐浓度下降低,因此改变盐浓度,可重新使DNA溶解。
(2)高温使DNA和蛋白质变性时破坏的键不同。DNA变性时,氢键被破坏,降温时DNA能复性,是可逆过程。而蛋白质变性时往往破坏二硫键,因此蛋白质变性是不可逆的。【典例训练1】如图为DNA的粗提取与鉴定的实验。(1)本实验材料选用鸡血细胞液,而不是鸡全血,主要原因是鸡
血细胞液中 含量较高。
(2)图A所示加入蒸馏水的目的是_______________________。
(3)通过图B所示步骤取得滤液后,再向滤液中加入2 mol/L NaCl
溶液的目的是___________________________________。
(4)图C所示加入蒸馏水的目的是_______________________。
(5)鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA,可用 试剂
进行检验,在沸水浴条件下,可以看到颜色反应为__________
___________________________________________________。【解题关键】解答本题的关键应明确以下三点:
(1)提取DNA常以鸡血作为实验材料;
(2)明确提取DNA的方法;
(3)DNA鉴定的原理为：DNA+二苯胺 蓝色。【解析】本题考查了DNA的粗提取与鉴定的实验原理。(1)鸡血细胞核DNA含量丰富,材料易得;鸡全血包括血浆,而鸡血细胞液为鸡全血除去血浆剩下的部分,其中DNA含量更高,更易提取。(2)如图A所示,鸡血细胞液中加入蒸馏水,细胞吸水涨破而释放出核物质DNA。(3)如图B所示,向滤液中加入2 mol/L NaCl溶液后,DNA溶解而蛋白质析出。(4)如图C所示,含DNA的浓盐水加入蒸馏水,使NaCl溶液浓度降低,从而使DNA溶解度降低而析出DNA。(5)在沸水浴条件下,DNA与二苯胺反应呈蓝色。答案:(1)DNA
(2)使血细胞吸水涨破,释放出核物质DNA
(3)使DNA溶解于NaCl溶液中
(4)使DNA的溶解度下降而析出DNA
(5)二苯胺 蓝色【互动探究】
经过图C操作,是否就会得到白色丝状物?
提示：不会,需再用物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA,并向DNA滤液中加入冷却的酒精溶液,静置2 min～3 min后,才会得到白色丝状物。二、DNA的粗提取和鉴定的实验过程
1.方法步骤:2.实验过程中的各操作的目的:
(1)实验中两次加入蒸馏水的目的不同:
①第一次在第一步中,目的是使鸡血细胞吸水涨破,加水后必须充分搅拌,不应少于5 min,使鸡血细胞充分吸水涨破。
②第二次在第三步中,目的是为了稀释NaCl溶液,使DNA逐渐析出。(2)实验中三次加NaCl溶液的目的:
①在第二步中,加入NaCl溶液后必须充分搅拌,加速染色质中DNA与蛋白质分离,使DNA充分游离并溶解在NaCl溶液中。
②在第五步中,加入NaCl溶液的目的是使DNA溶解。
③在第八步(即DNA鉴定环节)中加NaCl溶液的目的是溶解DNA。(3)实验中六次搅拌的目的:【易错提醒】(1)若选取肝脏细胞或植物细胞,不能直接用蒸馏水和甲苯处理,由于肝组织含较多蛋白质纤维,植物组织有胞间连丝和细胞壁,应先充分研磨。
(2)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布,否则会因DNA被吸附到滤纸上,而导致DNA大量损失。【典例训练2】(2013·江苏高考)某同学用洋葱进行DNA粗提取和鉴定实验,操作错误的是( )
A.加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨
B.用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA
C.加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌
D.加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热【解题关键】解答本题，需要注意以下两点：
(1)明确洗涤剂的作用是使细胞破碎。
(2)明确鉴定DNA和鉴定染色体(质)的染色剂不同，鉴定DNA用二苯胺试剂，鉴定染色体(质)用龙胆紫溶液或醋酸洋红液。【解析】选A。本题考查DNA的粗提取和鉴定实验。A项中，应该是加入洗涤剂和食盐后进行轻缓、充分的搅拌和研磨，故错误。B项中，加入蛋白酶，消除滤液中的蛋白质，用于纯化DNA，故正确。C项中，DNA不溶于酒精溶液，加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌获取的丝状物就是DNA，故正确。D项中，二苯胺试剂用于鉴定DNA，其鉴定过程需要沸水浴加热，故正确。【规律方法】DNA的粗提取实验过程中两次析出DNA的不同点：
(1)原理不同：第一次析出DNA是利用DNA在0.14 mol/L 的NaCl溶液中溶解度最低的原理，第二次是为了获得较纯净的DNA，利用的是DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出的原理。
(2)纯度不同：第二次析出DNA是在第一次析出的基础上，又进行溶解和再次析出，因此第二次析出的DNA中去掉了更多的杂质，纯度更高。课件39张PPT。课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段一、PCR的原理及反应过程
1.生物体内DNA复制的条件:
(1)原料:______________。
(2)模板:解旋后的每一条________。
(3)酶:打开DNA双链的_______和合成DNA单链的__________。
(4)引物:为DNA聚合酶的起始提供___末端。4种脱氧核苷酸DNA母链解旋酶DNA聚合酶3′2.PCR的概念和原理:
(1)概念:PCR即多聚酶链式反应,是一种体外________________
的技术。它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万
份的DNA拷贝。迅速扩增DNA片段(2)原理:
①DNA变性:在____________的温度范围内,DNA的_______结构
将解体,双链分开,这个过程称为变性。
②DNA复性:当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新
___________,这个过程称为复性。
③DNA合成:DNA聚合酶从引物____端开始延伸DNA链,DNA的合成
方向总是从子链的____端向____端延伸。80℃～100℃双螺旋结合成双链3′5′3′(3)条件:
①原料:_______________。
②模板:热变性解旋后的两条________。
③酶:________________。
④引物:能分别与___________两端互补配对的两种引物,为DNA
聚合酶提供3′末端。
⑤其他条件:需要稳定的_________和能自动调节温度的温控设
备。四种脱氧核苷酸DNA母链耐热的DNA聚合酶两条模板链缓冲溶液3.PCR的反应过程:
变性:当温度上升到___℃以上时,双链DNA解旋,氢键断裂,变为
单链
复性:当温度下降到___℃左右,两种引物通过_____________
分别与两条单链DNA结合
延伸:当温度上升到___℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸
(A,T,G,C)在__________的作用下,根据_____________
原则合成新的DNA链9050碱基互补配对72DNA聚合酶碱基互补配对二、PCR的实验操作
1.实验用具:
(1)PCR仪:该仪器能自动调控_____,实现DNA的扩增。如果没有
PCR仪,可用3个_____水浴锅代替,操作时按程序在3个水浴锅中
来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管:总容积为____mL,实际上是进行PCR反应的场
所。
(3)微量移液器:用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体,每
吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。温度恒温0.52.实验步骤:
准备:按照PCR反应需要的物质和条件,将需要的试剂和仪器准
备好
移液:用___________按照配方在微量离心管中依次加入各试剂
混合:盖严离心管口的盖子,用手指轻弹_________,使反应液混
合均匀
离心:将离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在
___________
反应:将离心管放入______中进行反应微量移液器管的侧壁离心管底部PCR仪3.DNA含量的测定:
(1)原理:利用DNA在_______的紫外线波段有一强烈的吸收峰。
(2)计算公式:
DNA含量(μg/mL)=___________________×稀释倍数。260 nm50×(260 nm的读数)【思考辨析】
1.判断正误
(1)PCR过程中,需要解旋酶打开氢键,使DNA双链解旋为单
链。( )
【分析】PCR的解旋过程是用热变性的原理打开氢键,未用到
DNA解旋酶。
(2)PCR的引物是一段与DNA相配对的RNA片段。( )
【分析】PCR的引物可以是RNA片段,也可以是DNA片段。××(3)复性过程中,DNA母链与新合成的子链形成双螺旋。( )
【分析】复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物
结合。
(4)耐热的DNA聚合酶可以从生活在热泉的细菌中提取。( )×√2.问题思考
(1)PCR反应过程中的温度控制为什么要先高温后低温然后再适当升温?请分析原因。
提示：PCR过程中先高温解旋,后低温使引物与模板结合,然后再适当升温尽量达到TaqDNA聚合酶的最适温度,加快反应速度。
(2)PCR过程中,经过30次循环,一个DNA分子会扩增成多少个?
提示：每循环1次,DNA分子数会变为原来的2倍,因此经过30次循环,会扩增成230个DNA分子。一、生物体内的DNA复制与PCR反应的比较【易错提醒】(1)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,而DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3'端上,需要模板;而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。【典例训练1】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同,它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中,DNA不需要解旋,直接以双链DNA为模板进行复制
A.③④ B.①② C.①③ D.②④【解题关键】解答本题的关键是:明确PCR过程需要人工合成的引物,利用热变性的原理打开DNA的双链。【解析】选C。PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较,主要有两点不同:(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA,长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中,DNA解旋不依赖解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的。【误区警示】无论DNA是在细胞内还是在体外复制的过程都需要解旋,因为只有解旋使碱基暴露,母链才能和子链配对,进行半保留复制。但在细胞内,解旋通过解旋酶完成。生物体外,利用DNA的热变性原理:80～100℃时DNA的双螺旋结构将解体,双链分开。其结果相同,但过程不同。二、PCR操作
1.PCR解旋与复旋的原理:
DNA热变性与复性：2.PCR的反应过程(如图):3.PCR扩增的计算与DNA含量的测定:
(1)理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板,则循环n次后有2n个DNA;若开始有N0个DNA提供模板,则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。(2)DNA含量的测定:
DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定,具体方法如下:【易错提醒】(1)PCR过程中无解旋酶,需要升高温度才能打开氢键,但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键,因此,热变性后是DNA单链,并未分解成单体。
(2)复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键,两条单链之间并未形成氢键,因此复性后,无双链DNA分子形成。【典例训练2】PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,下图表示合成过程,请据图分析回答:(1)A过程高温使DNA变性解旋,对该过程的原理叙述,正确的是
( )
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞的过程完全相同(2)C过程要用到的酶是 。这种酶在高温下仍
保持活性,因此在PCR扩增时可以 加入。PCR反应除提
供酶外,还需要满足的基本条件有:_____________________
_________________________________________________。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记,游离的脱氧核苷酸不做
标记,控制“95℃～55℃～72℃”温度循环3次,则在形成的子
代DNA中含有15N标记的DNA占 。(4)如果模板DNA分子共有a个碱基对,其中含有胞嘧啶m个,则该DNA复制10次,需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个。
(5)PCR中由碱基错配引起的变异属于 。假设对一个DNA进行扩增,第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配,则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占 。【解题关键】首先要明确DNA复制的特点:半保留复制,其次掌握DNA的复制是呈“指数”增长的。此外还要理解DNA复制原则:碱基互补配对原则。【解析】(1)高温所起的作用类似于解旋酶,使双链DNA解聚为
单链。(2)C过程为PCR技术的延伸阶段,当系统温度上升至72℃
左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下合
成新的DNA链。TaqDNA聚合酶是耐热的,高温下不变性,所以一
次性加入即可。PCR即为体外DNA复制,所需条件与体内DNA复制
基本相同,都需要模板、原料、能量、酶,只不过为了便于控制
DNA复制过程,通过设置高温解旋代替了解旋酶的作用,省掉了
解旋酶作用过程中所需能量的供应,同时,加入了与模板链相结
合的引物作为子链延伸的起点,省掉了切除引物的过程,使PCR
过程更简洁。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过3次循环,共产生23个DNA分子,其中有2个DNA分子含有15N标记。(4)在一个双链DNA分子中,(C+T)占碱基总数的一半,故T的数目为a-m,复制10次,相当于新增加了(210-1)个DNA分子,故需补充T的数目为(210-1)(a-m)。(5)基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个DNA进行扩增,第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配,以后按正常配对方式进行扩增,错配链作模板扩增的都是错误的DNA分子,原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的DNA分子,故若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占75%。答案:(1)C
(2)TaqDNA聚合酶 一次 DNA模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
(3)25%
(4)(210-1)(a-m)
(5)基因突变 75%【变式训练】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4次循环后产物中有5种不同的DNA分子,如图2所示,其中第⑤种DNA分子有几个( )A.2 B.4 C.6 D.8【解析】选D。PCR技术扩增时,由两种引物决定所扩增的片段的特定序列,上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成①和②,第二次循环形成①②③④4个DNA,以此类推,4次循环后共形成16个DNA,其中①②各1个,③④各3个,⑤共8个。课件38张PPT。课题3 血红蛋白的提取和分离一、蛋白质的提取、分离和鉴定的方法
1.凝胶色谱法——血红蛋白的分离方法:
(1)概念:根据_____________的大小分离蛋白质的有效方法,也
称做___________。相对分子质量分配色谱法(2)原理:
①凝胶
②分离原理:
_________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程
_____,移动速度较慢,通过凝胶的时间_____;_____________
_____的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,
路程_____,移动速度较快,通过凝胶的时间_____。多孔球体 多糖类化合物 贯穿的通道 相对分子质量较小较长较长相对分子质量较大较短较短2.缓冲溶液:
(1)作用:在一定范围内,缓冲溶液能够抵制_____________对溶
液pH的影响,维持pH基本不变。
(2)配制:通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,调节缓冲
剂的_________就可以制得___________________的缓冲液。外界的酸和碱使用比例在不同pH范围内使用3.电泳——血红蛋白的分离或鉴定方法:
(1)概念:带电粒子在_____的作用下发生_____的过程。
(2)原理:
①许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有_________
_____,在一定的pH下,这些基团会带上_____或_____。
②在电场的作用下,这些带电分子会向着_________________
_______移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子_______________以及分
子本身的_____、_____的不同,使带电分子产生不同的_____
_____,从而实现样品中各种分子的分离。电场迁移可解离的基团正电负电与其所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度二、蛋白质的提取和分离过程
1.样品处理:血红蛋白由_____肽链组成,包括两条________和
两条________。每条肽链环绕一个___________基团,此基团可
携带_________或_______________。四条α-肽链β-肽链亚铁血红素一分子氧一分子二氧化碳(1)红细胞的洗涤:
①目的:___________。
②方法:去除杂蛋白黄色血浆暗红色
红细胞五倍体积
生理盐水(2)血红蛋白的释放：蒸馏水10(3)分离血红蛋白溶液:
离心后试管中的溶液分为4层,从上往下依次为:
第1层:无色透明的_______。
第2层:脂溶性物质的_______——白色薄层固体。
第3层:_________的水溶液——_____透明液体。
第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中液体用_____过滤,除去_____________,于分液漏斗中
静置片刻后,分出下层的_________液体。甲苯层沉淀层血红蛋白红色滤纸脂溶性沉淀层红色透明(4)透析——粗分离:
①过程:取1 mL的_________溶液装入_______中,将其放入盛有
300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的___________中(pH为
7.0),透析12 h。
②原理:透析袋能使_______自由进出,而将_______保留在袋
内。
③目的:去除_____________________________。血红蛋白透析袋磷酸缓冲液小分子大分子样品中相对分子质量较小的杂质2.纯化——凝胶色谱操作:
制作___________
装填___________:因为干的凝胶和用_____________的凝胶的
体积差别很大,所以装柱前需要根据色谱柱
的内体积计算所需要的凝胶量。在装填色谱
柱时,不得有_____存在。
_________________凝胶色谱柱凝胶色谱柱缓冲液平衡好气泡样品的加入和洗脱3.纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:判断_____的蛋白质
是否达到要求,需要进行蛋白质___________。鉴定方法中使用
最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化纯度的鉴定【思考辨析】
1.判断正误
(1)凝胶色谱法分离蛋白质只根据分子大小,与其携带的电荷
性质和大小无关。( )√(2)不同蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质易通过
凝胶颗粒,先从层析柱洗脱下来。( )
【分析】相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,
路程较长,移动速度较慢,通过凝胶的时间较长,后洗脱下来;而
相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在
凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快,通过凝胶的时间较短,
先洗脱下来。×(3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质移动速度与蛋白质分子
大小和其携带的电荷都有关系。( )
【分析】由于在凝胶中加入了SDS,其所带负电荷的量远远大于
蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷
差别,使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。×(4)透析过程中,用到的透析袋是一层选择半透膜,具有选择透
过性。( )
【分析】透析袋是一层半透膜,小分子能通过,大分子不能通
过。但不是一层选择透过性膜,选择透过性是针对有活性的生
物膜来说的。×2.问题思考
(1)鸟类血液和哺乳动物血液中,最好用哪种血液来提取血红蛋白?为什么?
提示：哺乳动物血液。由于哺乳动物成熟红细胞中没有细胞核,容易获得血红蛋白。
(2)红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白,还含有细胞破碎物、脂质、甲苯等有机溶剂。怎样除去这些杂质呢?
提示：红细胞破碎混合液→中速长时离心(2 000 r/min×
10 min)→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白。一、血红蛋白的提取和分离的原理
1.蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析:2.电泳方法:【易错提醒】(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需要事先处理;电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。
(2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小,而非所带电荷的性质和分子的形状。【典例训练1】(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述,不正确的是( )
A.洗涤红细胞时,使用生理盐水可防止红细胞破裂
B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少
C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D.在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中,血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢【解题关键】解答本题的关键是明确以下三点:
(1)洗涤过程的目的和注意事项。
(2)红细胞适合作为本实验的材料的特点。
(3)洗脱过程中哪种分子移动更快。【解析】选D。本题考查血红蛋白的提取及凝胶色谱法分离蛋白质的原理。相对分子质量越大的蛋白质通过凝胶色谱柱的速度越快,故D错误。A正确,洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化,加入的是生理盐水,缓慢搅拌10 min,低速短时间离心,重复洗涤三次,直至上清液不再呈现黄色,表明红细胞已洗涤干净。B正确,哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器,提纯时杂蛋白较少。C正确,血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液(如果操作都正确,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出),这使得血红蛋白的分离过程非常直观,简化了操作。【变式训练】以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是( )
A.红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水,重复洗涤3次
B.将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12小时
C.凝胶装填在色谱柱内要均匀,不能有气泡存在
D.蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较大的移动速度慢【解析】选C。红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水,重复洗涤3次的目的是除去杂蛋白。透析时使用物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液,而不是用0.9%的NaCl溶液。蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较大的在凝胶外部移动,移动速度快。在装填凝胶柱时,不能有气泡存在,气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。二、提取和分离血红蛋白的实验操作
1.样品处理:2.凝胶色谱操作:
(1)凝胶色谱柱的装填:用蒸馏水溶胀凝胶→均匀装填色谱柱→在约50 cm高的操作压下,用300 mL的物质的量浓度为
20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h,使凝胶装填紧密。
(2)打开流出口,使缓冲液与凝胶面平齐,关闭出口。
(3)样品的加入和洗脱。【易错提醒】(1)小心加入磷酸缓冲液到适当高度后,再连接缓冲液洗脱瓶,打开下端出口,进行洗脱,不能边加缓冲液边洗脱,这样会扰乱洗脱顺序。
(2)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,再用试管收集流出液,此时收集到的才是纯度较高的血红蛋白溶液。【典例训练2】下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置,请回答下列问题:(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分,其
在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。
(2)甲装置中,B是血红蛋白溶液,则A是 ;乙装置中,
C溶液的作用是 。
(3)甲装置用于 ,目的是______________________
__________________________________________________。
用乙装置分离蛋白质的方法叫________________________,
是根据__________________________分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时,待______________________时,
用试管收集流出液,每5 mL收集一管,连续收集。【解题关键】(1)理解凝胶柱作用的原理:依据蛋白质分子在其中的移动路径不同导致的不同洗脱顺序来分离不同大小的分子;
(2)分析磷酸缓冲液的作用:抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变;
(3)掌握蛋白质的分离与提取所用到的方法:离心法和透析法。【解析】(1)血红蛋白能携带氧气,体现了蛋白质具有运输功能。
(2)甲装置中,B是血红蛋白溶液,则A是磷酸缓冲液;乙装置中,C溶液的作用是洗脱血红蛋白。
(3)甲装置用于透析(粗分离),目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。用乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法,是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(4)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每
5 mL收集一管,连续收集。答案:(1)运输
(2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白
(3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质
凝胶色谱法 相对分子质量的大小
(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端【误区警示】(1)在血红蛋白的提取和分离中,缓冲液能维持溶液酸碱度稳定,但缓冲液作用的pH范围有一定限度。
(2)离心过程的主要目的是去除脂质等脂溶性物质,而透析过程主要目的是去除小分子水溶性物质,这两个过程都属于粗分离,洗脱过程是更进一步的分离纯化过程。
