新人教生物一轮复习课堂互动探究案：12-6基因工程及生物技术的安全性与伦理问题（含答案）
文档属性
| 名称 | 新人教生物一轮复习课堂互动探究案：12-6基因工程及生物技术的安全性与伦理问题（含答案） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 6.4MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-02-27 23:25:22 | ||
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文档简介
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新人教生物一轮复习课堂互动探究案
12-6 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
考点一 基因工程的概念及操作工具
任务驱动·探究突破
任务1 完善基因工程的理论基础
任务2 与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 ________ DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 ________ DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 ________ 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA酶 ________ DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 ________ 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 ________ 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
正确认识限制酶
①限制酶是一类酶，而不是一种酶。
②将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
③不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。
④限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
[名师提醒] 选择限制酶的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切点来确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点来确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
任务3 明确载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
基因载体与膜载体的区别
基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，它能在宿主细胞内稳定存在，并可对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
考向分类·对点落实
考向一 基因工程操作工具的基础考查
1.(不定项选择)用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述正确的是( )
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
2．[经典模拟]如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A.①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
3．[2022·江苏省东台中学高三检测]“工欲善其事，必先利其器”。限制性内切核酸酶、DNA连接酶的发现为DNA切割、连接、功能基因的获得以及表达载体的构建创造了条件，下列关于限制性内切核酸酶和DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．两者都是从原核生物中分离纯化出来的
B．两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变
C．限制性内切核酸酶都能在特定位点切割产生黏性末端
D．T4 DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
4．[经典模拟]已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )
5. (不定项选择)下列关于载体的叙述中，正确的是( )
A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
6．(不定项选择)近年诞生的 CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因定点编辑。 CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(限制性内切核酸酶)和向导RNA，其原理是由向导RNA引导Cas9到一个特定的基因位点进行切割(上述过程见下图)。下列相关叙述不正确的是( )
A．CRISPR/Cas9的组成物质是在核糖体上合成的
B.向导RNA的合成需要逆转录酶的参与
C．基因的定点编辑过程只涉及碱基A—U，G—C的互补配对
D．切割后形成的每个DNA片段均含有两个游离的磷酸基团
考向二 基因工程操作工具的综合考查
7.[2022·湖北高三模拟]大米的铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ为限制酶。
(1)该转基因水稻培育过程中选取目的基因用到的限制酶是____________。这么操作的优点是________________________。(回答3点)
(2)PCR是获取大量目的基因的一种方法，反应体系的成分中有两种引物，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因________________________________；下图展示了用PCR技术从DNA分子中获取铁合蛋白基因的过程，A、B、C、D是四种引物，选择图中的________引物通过PCR三次循环就可将铁合蛋白基因分离出来。
(3)图中④⑤⑥过程，属于________________技术，制备的培养基是由无机营养成分、有机营养成分、________________四部分组成。
考点二 基因工程的基本操作程序及应用
任务驱动·探究突破
任务1 结合抗虫棉的培育过程图填空
(1)从图中可以看出，目的基因是________________，使用的载体是________，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是________________。
(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法：________________________________。
任务2 观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序
基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的T DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
任务3 目的基因的检测和鉴定
任务4 完善基因工程的应用
技术名称 应用
植物基 因工程 培育转基因抗虫植物、转基因抗病植物和转基因________植物，利用转基因改良植物的品质
动物基 因工程 提高动物生长速率，改善畜产品的品质，用转基因动物生产________，用转基因动物作____________的供体
基因治疗 把____________导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗
考向分类·对点落实
考向一 对基因工程的操作程序的考查
1.为使玉米获得抗除草剂性状， 需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是( )
A．筛选1需要用含有氨苄青霉素的培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌
B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织
C．为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的复制原点和启动子之间
D．为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株
2．[经典模拟]如图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是( )
A．过程①需要DNA连接酶
B．过程②需要限制性内切核酸酶
C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同
3. (不定项选择)甲基对硫磷是常见的农药污染物。科研人员尝试改造并分离得到能够降解甲基对硫磷的微生物。下列操作中必需的是( )
A．构建含有甲基对硫磷分解酶基因的表达载体
B．将甲基对硫磷分解酶基因表达载体导入受体菌
C.用甲基对硫磷为唯一碳源的培养基选择所需工程菌
D．提取工程菌的质粒并检测甲基对硫磷基因的含量
考向二 基因工程的综合考查
4.[2022·重庆市江津中学高三模拟]黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因——葡萄糖氧化酶基因(GO)导入棉花，获得抗黄萎病棉花。已知T DNA上的基因在农杆菌中不表达，在植物细胞中可以表达，请将转基因棉花培育步骤补充完整：
(1)构建上图所示重组Ti质粒，用________处理农杆菌，使重组Ti质粒进入农杆菌中，将农杆菌接种到含________的LB液体培养基中振荡培养。培养适宜时间后，离心，去除上清液，加入适量MS液体培养基，可通过测定菌液在600 nm波长处的OD值来确定农杆菌密度是否适宜。
(2)切取经________培养的棉花幼苗的下胚轴，直接转入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用灭菌滤纸吸取下胚轴表面多余菌液，将下胚轴放入愈伤组织诱导培养基中培养2天。2天后，向培养基中加入适量________和青霉素，其目的是筛选出转化成功的棉花细胞和________________。
(3)将所得愈伤组织接种到适宜培养基中培养，诱导形成胚状体，在适宜人工条件下继续发育成棉花幼苗。利用____________技术检测棉花细胞是否合成____________，选出抗黄萎病棉花。通过____________可以从个体水平上鉴定该棉花对黄萎病的抗性。
5．[2022·山东省潍坊市高三模拟]番茄果实后熟问题是影响番茄生产、加工和运输的难题。ACC合成酶(控制其合成的基因在细胞核中)是番茄细胞合成乙烯的关键酶，科学家利用反义基因技术培育出了耐储存、利于长途运输的番茄新品种，具体做法是采用农杆菌转化法将携带有反义ACC合成酶基因的重组质粒M导入番茄栽培品种中，经过卡那霉素筛选后，获得番茄新品种。反义基因是指人工合成出一段与某种基因碱基序列相同的DNA。经过人为操作使之在转录生成mRNA时，模板链与原基因不同。
(1)农杆菌转化法适用的植物种类是______________；重组质粒M中的抗性基因是________________________________________________________________________。
(2)有同学提出若要提取番茄中控制ACC合成酶的基因，只能利用成熟的番茄组织。你认为他的说法是否有道理，作出判断的依据是_______________________________。
(3)ACC合成酶基因在番茄细胞中表达的过程发生在细胞内的________________中；反义ACC合成酶基因转录启动后，检测发现番茄果实中乙烯含量显著降低，推测其机理最可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
考向三 基因工程的应用
6.[天津卷]人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径：
(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是__________(填写字母，单选)。
A．人血细胞启动子
B．水稻胚乳细胞启动子
C．大肠杆菌启动子
D．农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过生物膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与________的生物学功能一致。
考点三 DNA的粗提取与鉴定及PCR技术
任务驱动·探究突破
任务1 完善实验原理
(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA ________ ________
蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐________ 部分发生盐析沉淀 ________
(2)DNA不溶于____________，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
(3)DNA与二苯胺在沸水浴加热，呈____色。
任务2 实验步骤
①称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
②漏斗中垫________，将研磨液过滤到烧杯中，________ ℃处理，取上清液。
③在上清液中加入体积相等的、预冷的________溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
④取两支20 mL的试管编号A、B，各加入2 mol/L的________溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的________。混匀后，将试管置于________中加热5 min。
⑤结果观察：A试管____________，B试管____________。
任务3 通过PCR技术(多聚酶链式反应)扩增DNA片段
(1)PCR原理：在一定的缓冲溶液中提供______，分别与两条模板链相结合的两种______，四种脱氧核苷酸，耐高温的______，同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR的反应过程
①______：当温度上升到______以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：
②______：系统温度下降至______左右时，两种______通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③______：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(3)结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为______、复性和______三步。
②两引物间固定长度的DNA序列呈______扩增(即______)。
考向分类·对点落实
考向一 对DNA粗提取过程的考查
1.[江苏卷](不定项选择)图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述正确的是( )
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
2．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是( )
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．过滤时用滤纸代替纱布效果更好
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
3．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管 序号 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5分钟 沸水浴5分钟
实验现象
实验结论
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是_________________________________________________，
同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
考向二 对PCR技术的考查
4.目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT－PCR技术。RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．与该mRNA结合的引物，可以是A也可以是B
B.引物A与引物B的基本单位都是脱氧核苷酸
C．过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
D．该反应体系中应加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶等物质
5．荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是( )
A．引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C．若用cDNA(部分基因文库)作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
6．[2022·江苏连云港市高三模拟]常用的PCR技术有实时荧光定量PCR、RT－PCR、重叠延伸PCR等，其中重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理改造，其过程如图所示。回答下列问题：
(1)PCR定点突变需要设计的引物是________________；②过程获得突变产物AD，需要使用的引物是________________。
(2)在第一阶段为获得产物AB和产物CD，必须将引物a、b和引物c、d置于不同反应系统中，这是因为____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)新冠病毒常用“荧光RT－PCR技术”进行检测。
①“荧光RT－PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有__________________________________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
②用________________向微量离心管中依次加入各组分，稍微进行________，使反应液集中在微量离心管底部，将微量离心管放入PCR仪设计好PCR仪的循环程序，进行PCR反应。
考向三 PCR技术的应用
7.[2022·四省八校高三开学考试]用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，实验中设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶的识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是下图中的( )
8．[2022·江苏东台中学高三检测]某新型病毒是一种RNA病毒，医务工作者利用PCR技术进行病毒检测时，所使用的方法中合理的是( )
A．用细菌培养基直接培养被测试者体内获取的病毒样本
B．分析该病毒的RNA序列是设计PCR引物的前提条件
C．PCR扩增过程需使用RNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶
D．在恒温条件下进行PCR扩增以避免温度变化导致酶失活
9．(不定项选择)SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，可用SRY－PCR法鉴定胚胎性别，其基本程序如图。相关说法不正确的是( )
A．PCR扩增的操作步骤依次是：高温变性、中温复性、低温延伸
B．上述过程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．SRY探针能与雄性胚胎样品中DNA配对
考点四 蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器
任务驱动·探究突破
任务1 完善蛋白质工程概念的相关填空
蛋白质工程 具体内容
别称 第二代基因工程
目标 获得____________________的蛋白质
原理 由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从________入手
手段 __________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质
关键技术 ____________
基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
结果 改造了现有蛋白质或制造出____________
任务2 完善蛋白质工程的操作过程
从预期的________________出发→设计预期的________________→推测应有的________________→找到相对应的____________________(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
任务3 完善转基因技术的安全性的相关内容
(1)安全性问题
①________安全：滞后效应、________、营养成分改变等。
②生物安全：对______________的影响等。
③环境安全：对______________的影响等。
(2)理性看待转基因技术
①需要正确的社会舆论导向：____________，不能因噎废食。
②制定____________，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。
[名师提醒] 转基因生物存在安全性问题的原因
(1)目前对基因的结构、调控机制及基因间的相互作用了解有限。
(2)目的基因往往是异种生物的基因。
(3)外源基因插入宿主细胞基因组的部位往往是随机的。
任务4 完善生物武器的相关内容
生物武器的特点
①致病力强、________；②污染面广、危害时间长；③难以防治；④具有一定的________；⑤受____________影响大。
任务5 蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 过 程 预期蛋白质的________→设计预期的蛋白质________→推测应有的氨基酸________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸________(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 ____________的筛选与获取→______________的构建→将目的基因导入________→目的基因的____________
实 质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结 果 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过____________________来实现
任务6 填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义
A.________，B.________，C.____________，
D.________________，E.____________。
考向分类·对点落实
考向一 对蛋白质工程的考查
1.[2022·宁夏石嘴山三中高三月考]目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是( )
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列
③蓝色荧光蛋白基因的合成
④表达出蓝色荧光蛋白
A．①②③④ B．②①③④
C．②③①④ D．④②①③
2．(不定项选择)下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法正确的是( )
A．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
B．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
C．a、b过程分别是转录、翻译
D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
3．[全国卷Ⅱ]已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括____________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：____________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物____________进行鉴定。
考向二 转基因技术安全性的考查
4.(不定项选择)下列关于转基因生物安全性的叙述中，正确的是( )
A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
5．病毒疫苗的研制是现代生物技术应用最广泛的领域，现在研发的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重组技术而建立。请分析并回答下列问题：
(1)第二代疫苗是以编码病毒抗原蛋白的RNA为模板，经__________酶的作用而获得目的基因，再利用____________________这些工具酶来构建重组质粒。形成的重组质粒与经过____________________处理的大肠杆菌细胞混合可转化大肠杆菌，再扩增大肠杆菌以获得大量的抗原蛋白。
(2)在构建好的重组质粒中，引导目的基因表达的序列是__________，它是__________的识别和结合位点。
(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是将编码某种抗原蛋白的DNA注射到动物体内，该DNA可在生物体内______________出相应的抗原蛋白。
(4)现代对于基因工程产品安全性的争论越来越激烈，转基因生物的安全性主要体现在__________、__________、__________三个方面。
[网络建构提升]
[长句应答必备]
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
[等级选考研考向]
1．[2021·广东卷]非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________________________。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有______________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有______________________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是______________________。在分子水平上，可以通过改变____________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
2．[2021·河北卷]采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________________。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是________________________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于__________________________________(写出两点即可)。
3．[2020·江苏卷]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；Taq DNA聚合酶的作用是催化
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
4．[2020·山东卷]水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是__________________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为__________，原因是________________________________________________________________________。
[国考真题研规律]
5．[2021·全国甲卷]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是______________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指________________________________________________________________________
________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
6．[2021·全国乙卷]用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。图中________________________________________________________________________
酶切割后的DNA片段可以用E·coli DNA连接酶连接。图中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指__________________________________________
________________________________________________________________________。
7．[全国卷Ⅰ]基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________和____________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
课堂互动探究案6
考点一
【任务驱动·探究突破】
任务2 磷酸二酯键 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 DNA 磷酸二酯键
【考向分类·对点落实】
1．解析：限制酶识别特定的核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA为主，只在黏性末端出现部分单链，D错误。
答案：ABC
2．解析：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此该酶可作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此该酶可作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此该酶可作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。
答案：C
3．解析：限制性内切核酸酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；限制性内切核酸酶可以切割磷酸二酯键，DNA连接酶可以催化磷酸二酯键的形成，故两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变，B正确；限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端，C错误；T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，D错误。
答案：B
4．解析：根据题意，该DNA用限制酶Ⅰ切割后长度不变，故为环状DNA，根据两酶的作用特点，可知酶切图谱为D。
答案：D
5．解析：运载体与目的基因结合后会形成一个重组DNA分子，A正确；运载体中，对某种限制酶而言，最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点，便于与目的基因定向连接，B正确；目前常用的运载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒，C正确；运载体上要具有某些标记基因，便 于筛选重组DNA分子，D错误。
答案：ABC
6．解析：CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(限制性内切核酸酶)和向导RNA，前者是在核糖体上合成，后者是通过转录形成的，其场所不在核糖体，A错误；向导RNA可通过转录形成，逆转录酶以RNA为模板合成DNA，B错误；向导RNA和目标DNA互补配对过程中，涉及的配对方式有A—U，G—C，T—A，C—G，C错误；由于DNA分子是双链结构，因此切割后形成的每个DNA分子的片段中均含有2个游离的磷酸基团，D正确。
答案：ABC
7．解析：(1)图中①过程为基因表达载体的构建。若选用EcoRⅠ，会破坏目的基因；由于目的基因两侧的酶切位点被Hind Ⅲ、BamHⅠ识别，且质粒中也存在同样的酶切位点，则所选用的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ。使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以避免目的基因和质粒的自身环化，也可以避免反向连接，不用EcoRⅠ，可以防止目的基因被破坏。(2)两种引物之间若能碱基互补配对，会导致引物结合形成双链，进而降低引物与DNA模板链结合的效率。DNA聚合酶不能连接单个的脱氧核苷酸，只能把单个的脱氧核苷酸添加到已有DNA片段的末端，子链延伸方向为5′→3′端。故要扩增目的基因，只能选择引物B和C。(3)据图分析，④⑤⑥过程属于植物组织培养，植物组织培养一般用固体培养基，需要加入琼脂，同时需要控制生长素和细胞分裂素的比例，以调控细胞的分裂和分化。因此制备的培养基是由无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止自身环化，避免反向连接，防止目的基因被破坏 (2)防止引物之间结合形成双链，并因此降低了引物与DNA模板链结合的效率 B和C (3)植物组织培养 激素、琼脂
考点二
【任务驱动·探究突破】
任务1 (1)Bt毒蛋白基因 Ti质粒 农杆菌转化法 (2)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
任务2 (1)PCR 人工合成 基因文库 (2)启动子 标记基因 (3)农杆菌转化法 花粉管通道法 显微注射 (4)DNA分子杂交 分子杂交 抗原—抗体杂交 个体生物学水平
任务3 是否出现杂交带 是否出现杂交带 是否出现杂交带 是否抗虫；是否抗病
任务4 抗除草剂 药物 器官移植 正常基因
【考向分类·对点落实】
1．解析：分析图解可知，该基因工程的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌，A正确；根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织，B正确；为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的启动子、终止子之间，C错误；为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株，D正确。
答案：C
2．解析：过程①仅仅是单链a和单链b之间形成氢键，不需要DNA连接酶，A错误；过程②与过程①的本质相同，故不需要DNA限制性内切核酸酶，B错误；图中显示的是人工合成基因的流程图，因此需要知道目的基因Ⅰ的碱基序列，C正确；形成重组DNA分子的过程中，质粒与目的基因Ⅰ的碱基序列是不可能相同的，D错误。
答案：C
3．解析：要改造能够降解甲基对硫磷的微生物，需要构建含有甲基对硫磷分解酶基因的表达载体，A正确；将甲基对硫磷分解酶基因表达载体导入受体菌，是基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，B正确；甲基对硫磷是一种含碳农药，故用甲基对硫磷为唯一碳源的培养基选择所需工程菌，C正确；目的基因的检测和鉴定应重点监测目的基因的插入与否及插入后的表达结果，可采用DNA分子杂交技术等手段，而非提取工程菌的质粒并检测甲基对硫磷基因的含量，D错误。
答案：ABC
4．解析：(1)质粒的化学本质为DNA，构建重组Ti质粒时，遵循碱基互补配对原则；为了提高转化成功率，先用CaCl2(或Ca2＋)处理农杆菌，使其成为感受态细胞，增加其细胞壁的通透性，使得重组质粒进入农杆菌中。将农杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养，因为质粒中含有抗卡那霉素基因，故以此检测是否成功导入重组质粒。培养适宜时间后，离心，去除上清液，加入适量MS液体培养基进行培养，并通过测定菌液在600 nm波长处的OD值确定农杆菌密度。(2)切取经无菌培养的棉花幼苗的下胚轴，直接转入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用灭菌滤纸吸取下胚轴表面多余菌液，将下胚轴放入愈伤组织诱导培养基中培养2天。2天后，向培养基中加入适量草丁膦和青霉素，加入草丁膦可以筛选出转化成功的棉花细胞，加入青霉素可以抑制农杆菌的生长。(3)将所得愈伤组织接种到适宜培养基中培养诱导形成胚状体，在适宜人工条件下继续发育成棉花幼苗，利用抗原与抗体特异性结合的原理，采用抗原－抗体分子杂交技术检测棉花细胞是否合成葡萄糖氧化酶，选出抗黄萎病棉花。通过病原体感染实验可以从个体水平上鉴定该棉花对黄萎病的抗性。
答案：(1)CaCl2(或Ca2＋) 卡那霉素 (2)无菌 草丁膦 抑制农杆菌生长 (3)抗原－抗体分子杂交 葡萄糖氧化酶 病原体感染实验
5．解析：(1)农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，故农杆菌转化法适用的植物种类是大多数双子叶植物和裸子植物；采用农杆菌转化法将携带有反义ACC合成酶基因的重组质粒M导入番茄栽培品种中，经过卡那霉素筛选后，获得番茄新品种。由以上分析可知，重组质粒M中的抗性基因是卡那霉素抗性基因。(2)控制ACC合成酶的基因几乎存在于番茄的所有细胞中，所以这位同学提出的说法没有道理。(3)ACC合成酶基因在番茄细胞中表达的过程包括基因的转录和翻译，发生在细胞内的细胞核和核糖体中；反义ACC合成酶基因转录启动后反义ACC合成酶基因转录产生的mRNA可与ACC合成酶基因转录产生的mRNA碱基互补配对结合，ACC合成酶的合成受阻，导致乙烯的产生量下降。
答案：(1)大多数双子叶植物和裸子植物 卡那霉素抗性基因 (2)否，控制ACC合成酶的基因几乎存在于番茄的所有细胞中 (3)细胞核和核糖体 反义ACC合成酶基因转录产生的mRNA可与ACC合成酶基因转录产生的mRNA碱基互补配对结合，ACC合成酶的合成受阻，导致乙烯的产生量下降
6．解析：(1)总cDNA是由细胞内mRNA经逆转录获得。DNA两条链是反向平行的，另一条引物扩增方向应向左。(2)据题意可知，启动子具有物种特异性，它应与受体细胞启动子一致，应选B。(3)在农杆菌转化时，加入某物质，其目的应为“促进”或“有利于”转化，推测酚类物质可吸引农杆菌侵染水稻受体细胞。(4)水稻是真核细胞，具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体。Ⅱ途径受体为大肠杆菌，没有上述细胞器。(5)制备的rHSA应具有与HSA相同的生物学功能才具有医用价值。
答案：(1)总RNA(或mRNA)
(2)B (3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化 (4)水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 (5)HSA
考点三
【任务驱动·探究突破】
任务1 (1)溶解 析出 增大 溶解 (2)酒精溶液 (3)蓝
任务2 纱布 4 酒精 NaCl 二苯胺试剂 沸水 不变蓝 变蓝
任务3 (1)DNA模板 引物 DNA聚合酶 (2)变性 90 ℃ 复性 50 ℃ 引物 延伸 耐高温的DNA聚合酶 (3)变性 延伸 指数 2n
【考向分类·对点落实】
1．解析：图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放其中的核物质，图2中加入蒸馏水的目的是降低NaCl的浓度，使DNA的溶解度降低而析出，A错误；DNA溶于水，图1中完成过滤后，DNA溶解于滤液中，需保留滤液，B正确；图2中DNA已析出，则过滤后弃去滤液，保留含DNA的黏稠物，C正确；在图1中鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的杂质蛋白，有利于去除杂质蛋白，D正确。
答案：BCD
2．解析：只要含DNA的生物材料原则上都可进行本实验，只是DNA含量高的成功的可能性更大，所以酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，也可溶解于蒸馏水中，B正确；DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量，C错误；DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，故D正确。
答案：C
3．解析：A、B两试管可形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验的反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
4．解析：通过图示可知，与该mRNA结合的引物是A引物，A错误；引物A与引物B是一段DNA序列，其基本单位都是脱氧核苷酸，B正确；过程Ⅱ为PCR的反应阶段，通过控制温度的变化实现变性、复性、延伸，实现目标序列的循环扩增，C正确；RT－PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、四种脱氧核糖核苷酸、逆转录酶、Taq DNA聚合酶等物质，D正确。
答案：A
5．解析：引物与探针的本质都是核苷酸序列，二者均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B正确；由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，能反映细胞转录的基因种类和水平，所以若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平，C正确；由题图可知，Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，D错误。
答案：D
6．解析：(1)由图中信息可知，定点突变位点在引物b和引物c的结合位点处，而引物a与引物b是合成产物AB的引物，引物c和引物d是合成产物CD的引物，因此需要设计引物b和引物c，使它们不发挥作用才可以得到突变产物AD；②过程获得突变引物AD是由产物AB上链延伸与CD下链延伸得到的，因此需要使用的引物是引物a和引物d。(2)引物是一段DNA，引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对，在一个反应系统中配对后失效。(3)①新冠病毒是RNA病毒，因此在进行RT－PCR时，需要先进行逆转录合成DNA，然后再进行PCR，因此需要逆转录酶，而RT－PCR过程中除原料、模板、能量外，还需要TaqDNA聚合酶以合成子链DNA。②向微量离心管中加入成分时需要用微量移液器；加入到微量离心管后使反应液集中到微量离心管底部的方法是离心。
答案：(1)引物b、引物c 引物a和引物d (2)引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对，在一个反应系统中配对后失效 (3)①逆(反)转录酶、耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) ②微量移液器 离心
7．解析：利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5′端到3′端，据此依题意和图示分析可知，A、B、C均错误，D正确。
答案：D
8．解析：病毒没有细胞结构，不能用培养基直接培养，A错误；PCR进行的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，B正确；RNA病毒的RNA通过PCR扩增需要先进行逆转录形成DNA，然后使用耐高温DNA聚合酶进行DNA复制，不需要使用RNA聚合酶，C错误；根据上述分析可知，PCR扩增过程经历了高温变性、低温复性和中温延伸的过程，而不是在恒温条件下进行的，D错误。
答案：B
9．解析：PCR扩增的操作步骤依次是高温变性、低温复性及适温延伸等，A错误；上述过程需要使用的工具酶之一是耐高温的DNA聚合酶，B错误；PCR技术的原理是DNA双链的复制，其产物是大量的DNA，所以需要以脱氧核苷酸为原料，C错误；SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，SRY探针是用位于Y染色体上的性别决定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探针能与雄性胚胎样品中DNA配对，D正确。
答案：ABC
考点四
【任务驱动·探究突破】
任务1 满足人类生产和生活需求 基因 基因修饰或基因合成 基因工程 新的蛋白质
任务2 蛋白质功能 蛋白质结构 氨基酸序列 脱氧核苷酸序列
任务3 (1)食品 过敏原 生物多样性 生态系统稳定性 (2)趋利避害 政策和法规
任务4 传染性大 潜伏期 自然条件
任务5 功能 结构 序列 序列 目的基因 基因表达载体 受体细胞 检测与鉴定 基因修饰或基因合成
任务6 转录 翻译 分子设计 氨基酸序列 预期功能
【考向分类·对点落实】
1．解析：蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列(基因)或合成新的基因→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质→相应的表达。因此，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列→③蓝色荧光蛋白基因的合成→④表达出蓝色荧光蛋白。
答案：B
2．解析：蛋白质工程中了解蛋白质分子结构如蛋白质的空间结构、氨基酸的排列顺序等，对于合成或改造基因至关重要；蛋白质工程的进行离不开基因工程，对蛋白质的改造是通过对基因的改造来完成的；图中a、b过程分别是转录、翻译过程；蛋白质工程中可根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因。
答案：ACD
3．解析：(1)对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造，可达到改变蛋白质功能的目的。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因，可以对P基因进行修饰改造，也可以用人工方法合成P1基因；中心法则的全部内容包括DNA和RNA的复制、DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质结构和推测氨基酸序列，推测相应的核苷酸序列，并合成基因。经表达产生的蛋白质，还要对其进行生物功能鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
4．解析：为了维护消费者对转基因产品的知情权和选择权，我国对转基因食品和转基因农产品实行了标识制度，A正确；转基因食品上只标明原料来自于转基因生物，并未标明其危害，B错误；为保障转基因生物的安全性，可开展风险评估、预警跟踪和风险管理等措施，C正确；转基因生物是否安全的争论主要集中在它是否能保证食用安全及环境安全上，D正确。
答案：ACD
5．答案：(1)逆转录 限制酶和DNA连接酶 氯化钙溶液(Ca2＋) (2)启动子 RNA聚合酶 (3)转录、翻译 (4)食品安全 生物安全 环境安全
课堂总结 网络聚焦大概念
网络建构提升
①限制性内切核酸 ②DNA连接 ③目的基因 ④基因表达载体 ⑤受体 ⑥目的基因 ⑦热稳定 ⑧医药
历届真题 分类集训培素养
1．解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
2．解析：(1)将某种生物体内的全部DNA提取出来，选用适当的限制酶切割，然后将切割后的DNA片段分别与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体包含了这种生物的所有基因，称为这种生物的基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用到限制酶(或限制性核酸内切酶)和DNA连接酶；构建的重组基因表达载体必须含有标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来。(3)农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，其含有的Ti质粒可携带目的基因进入受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上，因此将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法；采用不育株系作为实验材料的目的是避免转基因植物所含的目的基因通过花粉传播，使目的基因进入近缘作物造成基因污染。(4)与野生型比较，转基因植株无论是地上部分还是地下部分，Cd含量都比野生型高，说明转基因植株对Cd具有更强的富集能力，转基因植物叶片中Cd含量最高，因此对转基因植株的叶进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)根据题意分析，转基因杨树与野生型相比，能通过YCF1将Cd主动运输进入液泡储存，从而更好地适应高Cd环境；相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于对Cd的吸收能力强、植株生长旺盛富集更快、便于后续收集处理。
答案：(1)基因组文库 (2)限制酶(或限制性核酸内切酶)和DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 (3)农杆菌转化法 避免转基因植物所含的目的基因通过花粉传播，使目的基因进入近缘作物造成基因污染 (4)富集能力 叶 (5)通过YCF1将Cd主动运输进入液泡储存 对Cd的吸收能力强、植株生长旺盛富集更快、便于后续收集处理
3．解析：(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′－ 羟基和5′－ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT－，3′端序列应为－TTAA，B正确。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
4．解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
5．解析：(1)用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。(2)利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是TaqDNA聚合酶。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。(3)要扩增病原菌DNA，设计的引物就应该能和病原菌DNA特异性结合。(4)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。
答案：(1)④②③① (2)热稳定DNA聚合酶(Taq酶) 延伸 两种引物分别与两条单链DNA模板结合 (3)病原菌DNA (4)一种在生物体外迅速扩增DNA片段的技术
6．解析：(1)由图可以直接看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端；E·coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中复制。质粒上有限制酶的切割位点，可被限制酶切开并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的选择培养基上进行选择培养的方法可将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)复制 限制酶的切割位点 用含抗生素的培养基进行培养 (4)RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
7．解析：(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库。(2)体内DNA复制时，需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋，而PCR扩增目的基因时，是借助高温加热至90～95 ℃破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时，温度需控制在70～75 ℃，则应使用耐高温的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶，而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
答案：(1)基因组文库 部分基因文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
新人教生物一轮复习课堂互动探究案
12-6 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
考点一 基因工程的概念及操作工具
任务驱动·探究突破
任务1 完善基因工程的理论基础
任务2 与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 ________ DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 ________ DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 ________ 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA酶 ________ DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 ________ 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 ________ 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
正确认识限制酶
①限制酶是一类酶，而不是一种酶。
②将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
③不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。
④限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
[名师提醒] 选择限制酶的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切点来确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点来确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
任务3 明确载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
基因载体与膜载体的区别
基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，它能在宿主细胞内稳定存在，并可对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
考向分类·对点落实
考向一 基因工程操作工具的基础考查
1.(不定项选择)用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述正确的是( )
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
2．[经典模拟]如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A.①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
3．[2022·江苏省东台中学高三检测]“工欲善其事，必先利其器”。限制性内切核酸酶、DNA连接酶的发现为DNA切割、连接、功能基因的获得以及表达载体的构建创造了条件，下列关于限制性内切核酸酶和DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．两者都是从原核生物中分离纯化出来的
B．两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变
C．限制性内切核酸酶都能在特定位点切割产生黏性末端
D．T4 DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
4．[经典模拟]已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )
5. (不定项选择)下列关于载体的叙述中，正确的是( )
A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
6．(不定项选择)近年诞生的 CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因定点编辑。 CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(限制性内切核酸酶)和向导RNA，其原理是由向导RNA引导Cas9到一个特定的基因位点进行切割(上述过程见下图)。下列相关叙述不正确的是( )
A．CRISPR/Cas9的组成物质是在核糖体上合成的
B.向导RNA的合成需要逆转录酶的参与
C．基因的定点编辑过程只涉及碱基A—U，G—C的互补配对
D．切割后形成的每个DNA片段均含有两个游离的磷酸基团
考向二 基因工程操作工具的综合考查
7.[2022·湖北高三模拟]大米的铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ为限制酶。
(1)该转基因水稻培育过程中选取目的基因用到的限制酶是____________。这么操作的优点是________________________。(回答3点)
(2)PCR是获取大量目的基因的一种方法，反应体系的成分中有两种引物，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因________________________________；下图展示了用PCR技术从DNA分子中获取铁合蛋白基因的过程，A、B、C、D是四种引物，选择图中的________引物通过PCR三次循环就可将铁合蛋白基因分离出来。
(3)图中④⑤⑥过程，属于________________技术，制备的培养基是由无机营养成分、有机营养成分、________________四部分组成。
考点二 基因工程的基本操作程序及应用
任务驱动·探究突破
任务1 结合抗虫棉的培育过程图填空
(1)从图中可以看出，目的基因是________________，使用的载体是________，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是________________。
(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法：________________________________。
任务2 观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序
基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的T DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
任务3 目的基因的检测和鉴定
任务4 完善基因工程的应用
技术名称 应用
植物基 因工程 培育转基因抗虫植物、转基因抗病植物和转基因________植物，利用转基因改良植物的品质
动物基 因工程 提高动物生长速率，改善畜产品的品质，用转基因动物生产________，用转基因动物作____________的供体
基因治疗 把____________导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗
考向分类·对点落实
考向一 对基因工程的操作程序的考查
1.为使玉米获得抗除草剂性状， 需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是( )
A．筛选1需要用含有氨苄青霉素的培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌
B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织
C．为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的复制原点和启动子之间
D．为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株
2．[经典模拟]如图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是( )
A．过程①需要DNA连接酶
B．过程②需要限制性内切核酸酶
C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同
3. (不定项选择)甲基对硫磷是常见的农药污染物。科研人员尝试改造并分离得到能够降解甲基对硫磷的微生物。下列操作中必需的是( )
A．构建含有甲基对硫磷分解酶基因的表达载体
B．将甲基对硫磷分解酶基因表达载体导入受体菌
C.用甲基对硫磷为唯一碳源的培养基选择所需工程菌
D．提取工程菌的质粒并检测甲基对硫磷基因的含量
考向二 基因工程的综合考查
4.[2022·重庆市江津中学高三模拟]黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因——葡萄糖氧化酶基因(GO)导入棉花，获得抗黄萎病棉花。已知T DNA上的基因在农杆菌中不表达，在植物细胞中可以表达，请将转基因棉花培育步骤补充完整：
(1)构建上图所示重组Ti质粒，用________处理农杆菌，使重组Ti质粒进入农杆菌中，将农杆菌接种到含________的LB液体培养基中振荡培养。培养适宜时间后，离心，去除上清液，加入适量MS液体培养基，可通过测定菌液在600 nm波长处的OD值来确定农杆菌密度是否适宜。
(2)切取经________培养的棉花幼苗的下胚轴，直接转入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用灭菌滤纸吸取下胚轴表面多余菌液，将下胚轴放入愈伤组织诱导培养基中培养2天。2天后，向培养基中加入适量________和青霉素，其目的是筛选出转化成功的棉花细胞和________________。
(3)将所得愈伤组织接种到适宜培养基中培养，诱导形成胚状体，在适宜人工条件下继续发育成棉花幼苗。利用____________技术检测棉花细胞是否合成____________，选出抗黄萎病棉花。通过____________可以从个体水平上鉴定该棉花对黄萎病的抗性。
5．[2022·山东省潍坊市高三模拟]番茄果实后熟问题是影响番茄生产、加工和运输的难题。ACC合成酶(控制其合成的基因在细胞核中)是番茄细胞合成乙烯的关键酶，科学家利用反义基因技术培育出了耐储存、利于长途运输的番茄新品种，具体做法是采用农杆菌转化法将携带有反义ACC合成酶基因的重组质粒M导入番茄栽培品种中，经过卡那霉素筛选后，获得番茄新品种。反义基因是指人工合成出一段与某种基因碱基序列相同的DNA。经过人为操作使之在转录生成mRNA时，模板链与原基因不同。
(1)农杆菌转化法适用的植物种类是______________；重组质粒M中的抗性基因是________________________________________________________________________。
(2)有同学提出若要提取番茄中控制ACC合成酶的基因，只能利用成熟的番茄组织。你认为他的说法是否有道理，作出判断的依据是_______________________________。
(3)ACC合成酶基因在番茄细胞中表达的过程发生在细胞内的________________中；反义ACC合成酶基因转录启动后，检测发现番茄果实中乙烯含量显著降低，推测其机理最可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
考向三 基因工程的应用
6.[天津卷]人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径：
(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是__________(填写字母，单选)。
A．人血细胞启动子
B．水稻胚乳细胞启动子
C．大肠杆菌启动子
D．农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过生物膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与________的生物学功能一致。
考点三 DNA的粗提取与鉴定及PCR技术
任务驱动·探究突破
任务1 完善实验原理
(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA ________ ________
蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐________ 部分发生盐析沉淀 ________
(2)DNA不溶于____________，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
(3)DNA与二苯胺在沸水浴加热，呈____色。
任务2 实验步骤
①称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
②漏斗中垫________，将研磨液过滤到烧杯中，________ ℃处理，取上清液。
③在上清液中加入体积相等的、预冷的________溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
④取两支20 mL的试管编号A、B，各加入2 mol/L的________溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的________。混匀后，将试管置于________中加热5 min。
⑤结果观察：A试管____________，B试管____________。
任务3 通过PCR技术(多聚酶链式反应)扩增DNA片段
(1)PCR原理：在一定的缓冲溶液中提供______，分别与两条模板链相结合的两种______，四种脱氧核苷酸，耐高温的______，同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR的反应过程
①______：当温度上升到______以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：
②______：系统温度下降至______左右时，两种______通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③______：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(3)结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为______、复性和______三步。
②两引物间固定长度的DNA序列呈______扩增(即______)。
考向分类·对点落实
考向一 对DNA粗提取过程的考查
1.[江苏卷](不定项选择)图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述正确的是( )
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
2．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是( )
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．过滤时用滤纸代替纱布效果更好
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
3．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管 序号 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5分钟 沸水浴5分钟
实验现象
实验结论
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是_________________________________________________，
同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
考向二 对PCR技术的考查
4.目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT－PCR技术。RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．与该mRNA结合的引物，可以是A也可以是B
B.引物A与引物B的基本单位都是脱氧核苷酸
C．过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
D．该反应体系中应加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶等物质
5．荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是( )
A．引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C．若用cDNA(部分基因文库)作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
6．[2022·江苏连云港市高三模拟]常用的PCR技术有实时荧光定量PCR、RT－PCR、重叠延伸PCR等，其中重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理改造，其过程如图所示。回答下列问题：
(1)PCR定点突变需要设计的引物是________________；②过程获得突变产物AD，需要使用的引物是________________。
(2)在第一阶段为获得产物AB和产物CD，必须将引物a、b和引物c、d置于不同反应系统中，这是因为____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)新冠病毒常用“荧光RT－PCR技术”进行检测。
①“荧光RT－PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有__________________________________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
②用________________向微量离心管中依次加入各组分，稍微进行________，使反应液集中在微量离心管底部，将微量离心管放入PCR仪设计好PCR仪的循环程序，进行PCR反应。
考向三 PCR技术的应用
7.[2022·四省八校高三开学考试]用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，实验中设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶的识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是下图中的( )
8．[2022·江苏东台中学高三检测]某新型病毒是一种RNA病毒，医务工作者利用PCR技术进行病毒检测时，所使用的方法中合理的是( )
A．用细菌培养基直接培养被测试者体内获取的病毒样本
B．分析该病毒的RNA序列是设计PCR引物的前提条件
C．PCR扩增过程需使用RNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶
D．在恒温条件下进行PCR扩增以避免温度变化导致酶失活
9．(不定项选择)SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，可用SRY－PCR法鉴定胚胎性别，其基本程序如图。相关说法不正确的是( )
A．PCR扩增的操作步骤依次是：高温变性、中温复性、低温延伸
B．上述过程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．SRY探针能与雄性胚胎样品中DNA配对
考点四 蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器
任务驱动·探究突破
任务1 完善蛋白质工程概念的相关填空
蛋白质工程 具体内容
别称 第二代基因工程
目标 获得____________________的蛋白质
原理 由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从________入手
手段 __________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质
关键技术 ____________
基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
结果 改造了现有蛋白质或制造出____________
任务2 完善蛋白质工程的操作过程
从预期的________________出发→设计预期的________________→推测应有的________________→找到相对应的____________________(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
任务3 完善转基因技术的安全性的相关内容
(1)安全性问题
①________安全：滞后效应、________、营养成分改变等。
②生物安全：对______________的影响等。
③环境安全：对______________的影响等。
(2)理性看待转基因技术
①需要正确的社会舆论导向：____________，不能因噎废食。
②制定____________，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。
[名师提醒] 转基因生物存在安全性问题的原因
(1)目前对基因的结构、调控机制及基因间的相互作用了解有限。
(2)目的基因往往是异种生物的基因。
(3)外源基因插入宿主细胞基因组的部位往往是随机的。
任务4 完善生物武器的相关内容
生物武器的特点
①致病力强、________；②污染面广、危害时间长；③难以防治；④具有一定的________；⑤受____________影响大。
任务5 蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 过 程 预期蛋白质的________→设计预期的蛋白质________→推测应有的氨基酸________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸________(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 ____________的筛选与获取→______________的构建→将目的基因导入________→目的基因的____________
实 质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结 果 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过____________________来实现
任务6 填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义
A.________，B.________，C.____________，
D.________________，E.____________。
考向分类·对点落实
考向一 对蛋白质工程的考查
1.[2022·宁夏石嘴山三中高三月考]目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是( )
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列
③蓝色荧光蛋白基因的合成
④表达出蓝色荧光蛋白
A．①②③④ B．②①③④
C．②③①④ D．④②①③
2．(不定项选择)下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法正确的是( )
A．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
B．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
C．a、b过程分别是转录、翻译
D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
3．[全国卷Ⅱ]已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括____________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：____________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物____________进行鉴定。
考向二 转基因技术安全性的考查
4.(不定项选择)下列关于转基因生物安全性的叙述中，正确的是( )
A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
5．病毒疫苗的研制是现代生物技术应用最广泛的领域，现在研发的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重组技术而建立。请分析并回答下列问题：
(1)第二代疫苗是以编码病毒抗原蛋白的RNA为模板，经__________酶的作用而获得目的基因，再利用____________________这些工具酶来构建重组质粒。形成的重组质粒与经过____________________处理的大肠杆菌细胞混合可转化大肠杆菌，再扩增大肠杆菌以获得大量的抗原蛋白。
(2)在构建好的重组质粒中，引导目的基因表达的序列是__________，它是__________的识别和结合位点。
(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是将编码某种抗原蛋白的DNA注射到动物体内，该DNA可在生物体内______________出相应的抗原蛋白。
(4)现代对于基因工程产品安全性的争论越来越激烈，转基因生物的安全性主要体现在__________、__________、__________三个方面。
[网络建构提升]
[长句应答必备]
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
[等级选考研考向]
1．[2021·广东卷]非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________________________。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有______________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有______________________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是______________________。在分子水平上，可以通过改变____________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
2．[2021·河北卷]采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________________。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是________________________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于__________________________________(写出两点即可)。
3．[2020·江苏卷]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；Taq DNA聚合酶的作用是催化
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
4．[2020·山东卷]水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是__________________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为__________，原因是________________________________________________________________________。
[国考真题研规律]
5．[2021·全国甲卷]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是______________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指________________________________________________________________________
________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
6．[2021·全国乙卷]用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。图中________________________________________________________________________
酶切割后的DNA片段可以用E·coli DNA连接酶连接。图中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指__________________________________________
________________________________________________________________________。
7．[全国卷Ⅰ]基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________和____________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
课堂互动探究案6
考点一
【任务驱动·探究突破】
任务2 磷酸二酯键 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 DNA 磷酸二酯键
【考向分类·对点落实】
1．解析：限制酶识别特定的核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA为主，只在黏性末端出现部分单链，D错误。
答案：ABC
2．解析：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此该酶可作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此该酶可作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此该酶可作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。
答案：C
3．解析：限制性内切核酸酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；限制性内切核酸酶可以切割磷酸二酯键，DNA连接酶可以催化磷酸二酯键的形成，故两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变，B正确；限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端，C错误；T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，D错误。
答案：B
4．解析：根据题意，该DNA用限制酶Ⅰ切割后长度不变，故为环状DNA，根据两酶的作用特点，可知酶切图谱为D。
答案：D
5．解析：运载体与目的基因结合后会形成一个重组DNA分子，A正确；运载体中，对某种限制酶而言，最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点，便于与目的基因定向连接，B正确；目前常用的运载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒，C正确；运载体上要具有某些标记基因，便 于筛选重组DNA分子，D错误。
答案：ABC
6．解析：CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(限制性内切核酸酶)和向导RNA，前者是在核糖体上合成，后者是通过转录形成的，其场所不在核糖体，A错误；向导RNA可通过转录形成，逆转录酶以RNA为模板合成DNA，B错误；向导RNA和目标DNA互补配对过程中，涉及的配对方式有A—U，G—C，T—A，C—G，C错误；由于DNA分子是双链结构，因此切割后形成的每个DNA分子的片段中均含有2个游离的磷酸基团，D正确。
答案：ABC
7．解析：(1)图中①过程为基因表达载体的构建。若选用EcoRⅠ，会破坏目的基因；由于目的基因两侧的酶切位点被Hind Ⅲ、BamHⅠ识别，且质粒中也存在同样的酶切位点，则所选用的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ。使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以避免目的基因和质粒的自身环化，也可以避免反向连接，不用EcoRⅠ，可以防止目的基因被破坏。(2)两种引物之间若能碱基互补配对，会导致引物结合形成双链，进而降低引物与DNA模板链结合的效率。DNA聚合酶不能连接单个的脱氧核苷酸，只能把单个的脱氧核苷酸添加到已有DNA片段的末端，子链延伸方向为5′→3′端。故要扩增目的基因，只能选择引物B和C。(3)据图分析，④⑤⑥过程属于植物组织培养，植物组织培养一般用固体培养基，需要加入琼脂，同时需要控制生长素和细胞分裂素的比例，以调控细胞的分裂和分化。因此制备的培养基是由无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止自身环化，避免反向连接，防止目的基因被破坏 (2)防止引物之间结合形成双链，并因此降低了引物与DNA模板链结合的效率 B和C (3)植物组织培养 激素、琼脂
考点二
【任务驱动·探究突破】
任务1 (1)Bt毒蛋白基因 Ti质粒 农杆菌转化法 (2)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
任务2 (1)PCR 人工合成 基因文库 (2)启动子 标记基因 (3)农杆菌转化法 花粉管通道法 显微注射 (4)DNA分子杂交 分子杂交 抗原—抗体杂交 个体生物学水平
任务3 是否出现杂交带 是否出现杂交带 是否出现杂交带 是否抗虫；是否抗病
任务4 抗除草剂 药物 器官移植 正常基因
【考向分类·对点落实】
1．解析：分析图解可知，该基因工程的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌，A正确；根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织，B正确；为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的启动子、终止子之间，C错误；为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株，D正确。
答案：C
2．解析：过程①仅仅是单链a和单链b之间形成氢键，不需要DNA连接酶，A错误；过程②与过程①的本质相同，故不需要DNA限制性内切核酸酶，B错误；图中显示的是人工合成基因的流程图，因此需要知道目的基因Ⅰ的碱基序列，C正确；形成重组DNA分子的过程中，质粒与目的基因Ⅰ的碱基序列是不可能相同的，D错误。
答案：C
3．解析：要改造能够降解甲基对硫磷的微生物，需要构建含有甲基对硫磷分解酶基因的表达载体，A正确；将甲基对硫磷分解酶基因表达载体导入受体菌，是基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，B正确；甲基对硫磷是一种含碳农药，故用甲基对硫磷为唯一碳源的培养基选择所需工程菌，C正确；目的基因的检测和鉴定应重点监测目的基因的插入与否及插入后的表达结果，可采用DNA分子杂交技术等手段，而非提取工程菌的质粒并检测甲基对硫磷基因的含量，D错误。
答案：ABC
4．解析：(1)质粒的化学本质为DNA，构建重组Ti质粒时，遵循碱基互补配对原则；为了提高转化成功率，先用CaCl2(或Ca2＋)处理农杆菌，使其成为感受态细胞，增加其细胞壁的通透性，使得重组质粒进入农杆菌中。将农杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养，因为质粒中含有抗卡那霉素基因，故以此检测是否成功导入重组质粒。培养适宜时间后，离心，去除上清液，加入适量MS液体培养基进行培养，并通过测定菌液在600 nm波长处的OD值确定农杆菌密度。(2)切取经无菌培养的棉花幼苗的下胚轴，直接转入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用灭菌滤纸吸取下胚轴表面多余菌液，将下胚轴放入愈伤组织诱导培养基中培养2天。2天后，向培养基中加入适量草丁膦和青霉素，加入草丁膦可以筛选出转化成功的棉花细胞，加入青霉素可以抑制农杆菌的生长。(3)将所得愈伤组织接种到适宜培养基中培养诱导形成胚状体，在适宜人工条件下继续发育成棉花幼苗，利用抗原与抗体特异性结合的原理，采用抗原－抗体分子杂交技术检测棉花细胞是否合成葡萄糖氧化酶，选出抗黄萎病棉花。通过病原体感染实验可以从个体水平上鉴定该棉花对黄萎病的抗性。
答案：(1)CaCl2(或Ca2＋) 卡那霉素 (2)无菌 草丁膦 抑制农杆菌生长 (3)抗原－抗体分子杂交 葡萄糖氧化酶 病原体感染实验
5．解析：(1)农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，故农杆菌转化法适用的植物种类是大多数双子叶植物和裸子植物；采用农杆菌转化法将携带有反义ACC合成酶基因的重组质粒M导入番茄栽培品种中，经过卡那霉素筛选后，获得番茄新品种。由以上分析可知，重组质粒M中的抗性基因是卡那霉素抗性基因。(2)控制ACC合成酶的基因几乎存在于番茄的所有细胞中，所以这位同学提出的说法没有道理。(3)ACC合成酶基因在番茄细胞中表达的过程包括基因的转录和翻译，发生在细胞内的细胞核和核糖体中；反义ACC合成酶基因转录启动后反义ACC合成酶基因转录产生的mRNA可与ACC合成酶基因转录产生的mRNA碱基互补配对结合，ACC合成酶的合成受阻，导致乙烯的产生量下降。
答案：(1)大多数双子叶植物和裸子植物 卡那霉素抗性基因 (2)否，控制ACC合成酶的基因几乎存在于番茄的所有细胞中 (3)细胞核和核糖体 反义ACC合成酶基因转录产生的mRNA可与ACC合成酶基因转录产生的mRNA碱基互补配对结合，ACC合成酶的合成受阻，导致乙烯的产生量下降
6．解析：(1)总cDNA是由细胞内mRNA经逆转录获得。DNA两条链是反向平行的，另一条引物扩增方向应向左。(2)据题意可知，启动子具有物种特异性，它应与受体细胞启动子一致，应选B。(3)在农杆菌转化时，加入某物质，其目的应为“促进”或“有利于”转化，推测酚类物质可吸引农杆菌侵染水稻受体细胞。(4)水稻是真核细胞，具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体。Ⅱ途径受体为大肠杆菌，没有上述细胞器。(5)制备的rHSA应具有与HSA相同的生物学功能才具有医用价值。
答案：(1)总RNA(或mRNA)
(2)B (3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化 (4)水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 (5)HSA
考点三
【任务驱动·探究突破】
任务1 (1)溶解 析出 增大 溶解 (2)酒精溶液 (3)蓝
任务2 纱布 4 酒精 NaCl 二苯胺试剂 沸水 不变蓝 变蓝
任务3 (1)DNA模板 引物 DNA聚合酶 (2)变性 90 ℃ 复性 50 ℃ 引物 延伸 耐高温的DNA聚合酶 (3)变性 延伸 指数 2n
【考向分类·对点落实】
1．解析：图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放其中的核物质，图2中加入蒸馏水的目的是降低NaCl的浓度，使DNA的溶解度降低而析出，A错误；DNA溶于水，图1中完成过滤后，DNA溶解于滤液中，需保留滤液，B正确；图2中DNA已析出，则过滤后弃去滤液，保留含DNA的黏稠物，C正确；在图1中鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的杂质蛋白，有利于去除杂质蛋白，D正确。
答案：BCD
2．解析：只要含DNA的生物材料原则上都可进行本实验，只是DNA含量高的成功的可能性更大，所以酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，也可溶解于蒸馏水中，B正确；DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量，C错误；DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，故D正确。
答案：C
3．解析：A、B两试管可形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验的反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
4．解析：通过图示可知，与该mRNA结合的引物是A引物，A错误；引物A与引物B是一段DNA序列，其基本单位都是脱氧核苷酸，B正确；过程Ⅱ为PCR的反应阶段，通过控制温度的变化实现变性、复性、延伸，实现目标序列的循环扩增，C正确；RT－PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、四种脱氧核糖核苷酸、逆转录酶、Taq DNA聚合酶等物质，D正确。
答案：A
5．解析：引物与探针的本质都是核苷酸序列，二者均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B正确；由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，能反映细胞转录的基因种类和水平，所以若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平，C正确；由题图可知，Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，D错误。
答案：D
6．解析：(1)由图中信息可知，定点突变位点在引物b和引物c的结合位点处，而引物a与引物b是合成产物AB的引物，引物c和引物d是合成产物CD的引物，因此需要设计引物b和引物c，使它们不发挥作用才可以得到突变产物AD；②过程获得突变引物AD是由产物AB上链延伸与CD下链延伸得到的，因此需要使用的引物是引物a和引物d。(2)引物是一段DNA，引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对，在一个反应系统中配对后失效。(3)①新冠病毒是RNA病毒，因此在进行RT－PCR时，需要先进行逆转录合成DNA，然后再进行PCR，因此需要逆转录酶，而RT－PCR过程中除原料、模板、能量外，还需要TaqDNA聚合酶以合成子链DNA。②向微量离心管中加入成分时需要用微量移液器；加入到微量离心管后使反应液集中到微量离心管底部的方法是离心。
答案：(1)引物b、引物c 引物a和引物d (2)引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对，在一个反应系统中配对后失效 (3)①逆(反)转录酶、耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) ②微量移液器 离心
7．解析：利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5′端到3′端，据此依题意和图示分析可知，A、B、C均错误，D正确。
答案：D
8．解析：病毒没有细胞结构，不能用培养基直接培养，A错误；PCR进行的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，B正确；RNA病毒的RNA通过PCR扩增需要先进行逆转录形成DNA，然后使用耐高温DNA聚合酶进行DNA复制，不需要使用RNA聚合酶，C错误；根据上述分析可知，PCR扩增过程经历了高温变性、低温复性和中温延伸的过程，而不是在恒温条件下进行的，D错误。
答案：B
9．解析：PCR扩增的操作步骤依次是高温变性、低温复性及适温延伸等，A错误；上述过程需要使用的工具酶之一是耐高温的DNA聚合酶，B错误；PCR技术的原理是DNA双链的复制，其产物是大量的DNA，所以需要以脱氧核苷酸为原料，C错误；SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，SRY探针是用位于Y染色体上的性别决定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探针能与雄性胚胎样品中DNA配对，D正确。
答案：ABC
考点四
【任务驱动·探究突破】
任务1 满足人类生产和生活需求 基因 基因修饰或基因合成 基因工程 新的蛋白质
任务2 蛋白质功能 蛋白质结构 氨基酸序列 脱氧核苷酸序列
任务3 (1)食品 过敏原 生物多样性 生态系统稳定性 (2)趋利避害 政策和法规
任务4 传染性大 潜伏期 自然条件
任务5 功能 结构 序列 序列 目的基因 基因表达载体 受体细胞 检测与鉴定 基因修饰或基因合成
任务6 转录 翻译 分子设计 氨基酸序列 预期功能
【考向分类·对点落实】
1．解析：蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列(基因)或合成新的基因→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质→相应的表达。因此，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列→③蓝色荧光蛋白基因的合成→④表达出蓝色荧光蛋白。
答案：B
2．解析：蛋白质工程中了解蛋白质分子结构如蛋白质的空间结构、氨基酸的排列顺序等，对于合成或改造基因至关重要；蛋白质工程的进行离不开基因工程，对蛋白质的改造是通过对基因的改造来完成的；图中a、b过程分别是转录、翻译过程；蛋白质工程中可根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因。
答案：ACD
3．解析：(1)对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造，可达到改变蛋白质功能的目的。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因，可以对P基因进行修饰改造，也可以用人工方法合成P1基因；中心法则的全部内容包括DNA和RNA的复制、DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质结构和推测氨基酸序列，推测相应的核苷酸序列，并合成基因。经表达产生的蛋白质，还要对其进行生物功能鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
4．解析：为了维护消费者对转基因产品的知情权和选择权，我国对转基因食品和转基因农产品实行了标识制度，A正确；转基因食品上只标明原料来自于转基因生物，并未标明其危害，B错误；为保障转基因生物的安全性，可开展风险评估、预警跟踪和风险管理等措施，C正确；转基因生物是否安全的争论主要集中在它是否能保证食用安全及环境安全上，D正确。
答案：ACD
5．答案：(1)逆转录 限制酶和DNA连接酶 氯化钙溶液(Ca2＋) (2)启动子 RNA聚合酶 (3)转录、翻译 (4)食品安全 生物安全 环境安全
课堂总结 网络聚焦大概念
网络建构提升
①限制性内切核酸 ②DNA连接 ③目的基因 ④基因表达载体 ⑤受体 ⑥目的基因 ⑦热稳定 ⑧医药
历届真题 分类集训培素养
1．解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
2．解析：(1)将某种生物体内的全部DNA提取出来，选用适当的限制酶切割，然后将切割后的DNA片段分别与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体包含了这种生物的所有基因，称为这种生物的基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用到限制酶(或限制性核酸内切酶)和DNA连接酶；构建的重组基因表达载体必须含有标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来。(3)农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，其含有的Ti质粒可携带目的基因进入受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上，因此将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法；采用不育株系作为实验材料的目的是避免转基因植物所含的目的基因通过花粉传播，使目的基因进入近缘作物造成基因污染。(4)与野生型比较，转基因植株无论是地上部分还是地下部分，Cd含量都比野生型高，说明转基因植株对Cd具有更强的富集能力，转基因植物叶片中Cd含量最高，因此对转基因植株的叶进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)根据题意分析，转基因杨树与野生型相比，能通过YCF1将Cd主动运输进入液泡储存，从而更好地适应高Cd环境；相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于对Cd的吸收能力强、植株生长旺盛富集更快、便于后续收集处理。
答案：(1)基因组文库 (2)限制酶(或限制性核酸内切酶)和DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 (3)农杆菌转化法 避免转基因植物所含的目的基因通过花粉传播，使目的基因进入近缘作物造成基因污染 (4)富集能力 叶 (5)通过YCF1将Cd主动运输进入液泡储存 对Cd的吸收能力强、植株生长旺盛富集更快、便于后续收集处理
3．解析：(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′－ 羟基和5′－ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT－，3′端序列应为－TTAA，B正确。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
4．解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
5．解析：(1)用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。(2)利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是TaqDNA聚合酶。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。(3)要扩增病原菌DNA，设计的引物就应该能和病原菌DNA特异性结合。(4)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。
答案：(1)④②③① (2)热稳定DNA聚合酶(Taq酶) 延伸 两种引物分别与两条单链DNA模板结合 (3)病原菌DNA (4)一种在生物体外迅速扩增DNA片段的技术
6．解析：(1)由图可以直接看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端；E·coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中复制。质粒上有限制酶的切割位点，可被限制酶切开并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的选择培养基上进行选择培养的方法可将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)复制 限制酶的切割位点 用含抗生素的培养基进行培养 (4)RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
7．解析：(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库。(2)体内DNA复制时，需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋，而PCR扩增目的基因时，是借助高温加热至90～95 ℃破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时，温度需控制在70～75 ℃，则应使用耐高温的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶，而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
答案：(1)基因组文库 部分基因文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
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