【二轮学案】通过“基因编辑技术”构建PCR类试题解题思维模型——解析高考生物新情境（含答案）

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解析高考生物新情境
通过“基因编辑技术”构建PCR类试题解题思维模型
“核心价值”命题“金线”(为什么考) “知能素养”命题“银线”(考什么)
　　PCR技术是利用DNA半保留复制原理，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。PCR技术应用广泛，可用于新冠病毒的核酸检测，是近几年高考试题的命题热点。 (1)通过分析基因编辑技术的原理和过程，了解此技术在社会实践中的应用。 (2)掌握PCR技术的原理和操作过程。 (3)结合新冠病毒核酸检测，了解PCR技术在生产、生活中的应用。
探究路径(一)　基因编辑技术及其应用
[见识新情境]
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
[追根于教材]
1．从功能上来看，CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，可推测其在细菌中的作用是什么？
提示：切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵，保护自身或清除入侵的病毒DNA)。
2．若用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是什么？
提示：避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
3．CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA的识别序列越短，基因编辑的脱靶率越高。请分析原因。
提示：sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错。
4．通过上述材料，你认为CRISPR/Cas9基因编辑技术在哪些方面有广阔的应用前景。
提示：基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能、构建疾病治疗动物模型等。
探究路径(二) 　PCR技术及其应用
一、PCR技术与病毒检测
[见识新情境]
新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。实时荧光 PCR 扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链 DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR 过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR 检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。
[追根于教材]
1．与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，可能的原因是什么？
提示：Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降。
2．Ct值是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。请推测样本中初始模板数与Ct值的关系。
提示：当样本中初始模板数越多时，Ct值就越小。
3．某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct值≤37判定为阳性，Ct值＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定结果是什么？
提示：阳性。
4．阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有________(填字母)。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR 检测阈值
b．样本被污染，RNA 酶将病毒 RNA 降解
c．病毒发生变异
提示：abc
二、基因定点突变与基因改造
[见识新情境]
重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺
(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
[追根于教材]
1．若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为______才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______(假设引物为单链DNA)。
提示：C—G或T—A　G或A
2．在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生______种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，其原因是什么？______________________
________________________________________。
提示：3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。
3．利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是什么？
提示：M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。
【归纳建模】
串联PCR技术，构建解答PCR类试题思维模型
【类题训练】
1．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是____________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是_____________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA合成cDNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(温度超过90 ℃)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)。
答案：(1)逆转录酶　(2)特异性核苷酸序列　复性　(3)曾感染新冠病毒，已康复　已感染新冠病毒，是患者　(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)
2．(2022·枣庄二模)某科研小组从土壤菌株A、B中分离到同源性为93%的Bt1抗虫基因和Bt2抗虫基因的编码序列，并运用交错延伸PCR技术获得了抗虫性能强的重组B基因，转入烟草获得成功，过程如下图所示。
注：①交错延伸PCR：基因Bt1和Bt2均作为模板，所需引物相同，图中仅表示其中一条链的延伸情况。②EcoRⅠ限制酶的识别序列及切点：。③启动子Pr1a可在烟草叶肉细胞中特异性启动基因的转录。④图中生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的DNA片段，可使植物细胞合成生长素。⑤抗草甘膦基因(oroA)正常表达可使植物对除草剂草甘膦有较好抗性；抗卡那霉素基因(Kanr)正常表达可使细菌对卡那霉素有较好抗性。
(1)若用EcoR Ⅰ和限制酶Xma Ⅰ(　　↓
5′—GCCGGG—3′)双酶切多个目的基因，随机连接________(填“能”或“不能”)避免两个目的基因连接成环。图中所示Ti质粒部分至少含有______个启动子，复制原点是___________酶识别和结合的位点。
(2)在培养愈伤组织的培养基中添加____________可以筛选含有Bt重组基因的细胞。图中生长素合成酶基因是否能促进愈伤组织生根？作出判断并解释____________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)已知交错延伸PCR中所用引物片段均为30个核苷酸，Taq DNA聚合酶在72 ℃下的扩增速度为1 000个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：95 ℃变性30 s,50 ℃复性15 s,72 ℃延伸15 s，共80个循环。第二轮循环后所得重组型子链长度为______个核苷酸。若将复性温度调成55 ℃，则无法得到扩增产物，原因是__________________________________。通过交错延伸PCR获得的重组Bt基因，同时具有Bt1和Bt2基因序列的原因是____________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制酶EcoRⅠ和XmaⅠ的酶切位点不同，切出的黏性末端不同，目的基因两端的黏性末端不同，能避免单个目的基因连接成环，但不能避免两个目的基因中相同的黏性末端相连。图中所示Ti质粒部分含有抗草甘膦基因和抗卡那霉素基因，这两个基因在终止子下游，说明这两个基因中含有自身启动子，此外Ti质粒还有启动子Pr1a，因此Ti质粒至少含有3个启动子；复制原点是DNA开始复制的位点，是解旋酶识别和结合的位点。(2)Ti重组质粒中同时含有Bt重组基因和抗草甘膦基因(oroA)，因此在培养愈伤组织的培养基中添加草甘膦可以筛选含有Bt重组基因的细胞；图中生长素合成酶基因不能促进愈伤组织生根，因为生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的编码区序列，自身无启动子，而启动子Pr1a只在烟草叶肉细胞中特异性启动基因的转录，在愈伤组织细胞中不能启动转录。(3)95 ℃变性30 s,50 ℃复性15 s,72 ℃延伸15 s，可知一次PCR循环耗时1 min，可扩增1 000个碱基，第二轮循环开始模板交错，扩增所得重组型子链长度为500＋引物长度，已知引物片段均为30个核苷酸，所以第二轮循环后所得重组型子链长度为530个核苷酸；若将复性温度调成55 ℃，复性温度过高会引起碱基之间的氢键断裂，导致引物不能与互补DNA链(模板)牢固结合，DNA扩增效率下降；通过交错延伸PCR获得的重组Bt基因，同时具有Bt1和Bt2基因序列的原因是第一轮以Bt1(Bt2)为模板合成的子链片段在第二轮复制时作为引物结合到Bt2(Bt1)的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列。
答案：(1)不能　3　 解旋　(2)草甘膦　不能，因为生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的编码区序列，自身无启动子，而启动子Prla在愈伤组织细胞中不能启动转录　(3)530　引物分子无法与模板DNA结合　第一轮以Bt1(Bt2)为模板合成的子链片段在第二轮复制时作为引物结合到Bt2(Bt1)的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列
3．(2022·山东高考)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______________________________________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是____________________________________________________。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是____________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_______________________________
__________________________________________________________________________。
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物需要满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对，并且是短单链核酸。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸添加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可以看出，P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。解决该问题的修改方案是在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基，使EcoRⅠ识别序列不影响P基因的正常翻译。(3)①组仅添加UBC；②组添加UBC和FLAG-P；③组添加UBC、FLAG-P和药物A；④组添加UBC和FLAG-P△；⑤组添加UBC、FLAG-P△和药物A。按题中所述处理后，①组没出现杂交带，②③组出现杂交带，③组杂交带更加明显，说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组含有FLAG-P，出现杂交带，④⑤组含有FLAG-P△，没出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列的作用是参与P与UBC的结合。(4)根据(3)的分析推测，药物A通过增强P与UBC结合促进P降解，达到治疗该病的目的。
答案：(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基　(3)增强FLAG-P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
[应用、创新考法增分训练]
题组一　关注生产生活，分析解决问解
1．(2022·苏州模拟)北魏贾思勰的《齐民要术》已记载泡菜制作的方法。泡菜是使用低浓度的盐水，再经乳酸菌发酵，制成的一种带酸味的腌制品。只要乳酸含量达到一定的浓度，并使泡菜隔绝空气，就可以达到久贮的目的。下列关于泡菜的叙述，错误的是(　 )
A．泡菜酸味的口感主要来源于乳酸菌发酵后产生的乳酸
B．腌制泡菜时盐水没过全部菜料，盖上坛盖再用水密封泡菜坛
C．泡菜腌制过程中乳酸和亚硝酸盐的含量会先增加后减少再趋于稳定
D．可通过观、品、闻等方式，判断泡菜腌制是否成熟
解析：选C　在制作泡菜时，选用乳酸菌，乳酸菌为厌氧生物，在无氧条件下将葡萄糖分解成乳酸使泡菜带酸味，A正确。腌制泡菜时泡菜坛要装至八成满，盐水没过全部菜料，盖上坛盖再用水密封泡菜坛，可利用水隔绝空气，从而创造无氧条件，B正确。在泡菜腌制过程中亚硝酸盐的含量会先增加后减少再趋于稳定；乳酸的含量先持续增加，最后趋于稳定，C错误。可通过观(观察泡菜的颜色)、品(尝口感)、闻(酸味)等方式，判断泡菜腌制是否成熟，D正确。
2．(2022·青岛一模)发酵制氢技术是我国为早日实现“碳中和”开发的新能源技术之一。传统农业中，水稻、小麦的秸秆常被焚烧，既产生浓烟污染环境，又增加了CO2排放，某研究团队将秸秆制成发酵液培养某种细菌，进行发酵制氢。下列说法错误的是(　 )
A．水稻、小麦的秸秆中富含纤维素，可为产氢细菌提供碳源和氮源
B．鉴定该细菌是否为纤维素分解菌，可在培养基中加入刚果红试剂
C．底物浓度、温度、pH等是影响发酵产氢量的重要因素
D．与传统农业相比，发酵制氢技术既能减少CO2的排放量又能获得新能源
解析：选A　纤维素的组成元素为C、H、O，可以为产氢细菌提供碳源，无法提供氮源，A错误。
3．(2022·山东高考)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是(　 )
A．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B．可用深层通气液体发酵技术提高产量
C．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D．青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
解析：选D　提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
4．黑胫病对甘蓝型油菜的危害十分严重，黑芥能抗黑胫病，两者不能直接杂交。为解决该问题，科研人员通过如图所示过程获得抗病品系。据图分析，下列相关叙述不正确的是(　 )
A．最终获得的抗病植株具有完整的甘蓝型油菜和黑芥的遗传信息
B．过程①可使用纤维素酶，过程②可利用PEG进行诱导
C．过程③发生脱分化，过程④体现出植物细胞具有全能性
D．黑芥与甘蓝型油菜存在生殖隔离
解析：选A　在培养过程中用紫外线照射黑芥，使其染色体断裂，最终获得的抗病植株可能并不具有黑芥的完整遗传信息，A错误；植物细胞壁的主要成分是纤维素，过程①去除植物细胞壁，可使用纤维素酶，过程②诱导原生质体融合，可利用PEG进行诱导，B正确；过程③发生脱分化，形成愈伤组织，过程④筛选出的融合细胞长成植物体，体现出植物细胞具有全能性，C正确；黑芥与甘蓝型油菜是两个物种，存在生殖隔离，D正确。
题组二　关注人体健康，体现责任担当
5．研究人员将人的多能干细胞通过体细胞诱导培养出全能干细胞(相当于受精卵发育3天的状态)，使得“成年”版本的细胞逆向转化为具有更多可能性的“婴儿期”版本的细胞。该全能干细胞比囊胚期细胞(相当于受精卵发育5～6天的状态)具有更强的发育潜力。下列说法错误的是(　 )
A．培养全能干细胞时需将其置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中
B．多能干细胞具有分化成多种细胞组织的潜能，但不具有发育成完整个体的能力
C．囊胚期细胞的内细胞团将发育成胎盘和胎膜
D．患者利用自身全能干细胞诱导得到的器官进行移植可以更好地避免免疫排斥反应
解析：选C　动物细胞培养，需将其置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2恒温培养箱中培养，A正确；多能干细胞具有分化成多种细胞组织的潜能，但不具有发育成完整个体的能力，B正确；囊胚期细胞的滋养层将发育成胎盘和胎膜，C错误；利用自身全能干细胞诱导得到的器官进行移植可以更好地避免免疫排斥反应，D正确。
6．我国科学家从新冠肺炎康复患者外周血单个核细胞(PBMC)中获取新冠病毒的抗体DNA，插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，通过侵染宿主菌构建基因文库后，最终获得全人源抗新冠病毒单克隆抗体。下列说法错误的是(　 )
A．该种单克隆抗体可作为药物用于新冠肺炎的治疗
B．研制获得该种单克隆抗体的过程，需要对B淋巴细胞进行大规模体外培养
C．研制获得该种单克隆抗体的过程，应用了基因工程和发酵工程技术
D．该种单克隆抗体并非在人体中表达，可能因空间结构改变而失去特异性
解析：选B　该种单克隆抗体可作为药物用于新冠肺炎的治疗，A正确；B淋巴细胞不能无限增殖，所以不能进行大规模体外培养，B错误；该过程获取新冠病毒的抗体DNA，插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，应用了基因工程技术，侵染宿主菌表达单克隆抗体应用了发酵工程技术，C正确；该种单克隆抗体在宿主菌中表达，因为宿主菌没有高尔基体和内质网，不能对抗体进行加工，可能会因特定的空间结构不能形成而失去特异性，D正确。
题组三　引入科普情境，增长知识见识
7．(2022·天津一模)菌种M和菌种N在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状的融合菌，进行了如图所示的实验。已知菌种M为组氨酸依赖(组氨酸合成相关基因突变为B－)，菌种N为色氨酸依赖(色氨酸合成相关基因突变为A－)，下列分析错误的是(　 )
A．菌种M和N可通过人工诱变和选择性培养筛选获得
B．用PEG诱导融合之前需要先去除菌种M和N的细胞壁
C．用缺少两种氨基酸的选择培养基X筛选出杂种融合菌
D．培养基用平板划线法接种，得到单菌落便于计数
解析：选D　人工诱变可获得不同类型的突变体，再利用选择培养基从中选取组氨酸依赖型和色氨酸依赖型的菌种，即为M、N菌种，A正确；M、N菌均为有细胞结构的微生物，细胞壁会阻碍细胞融合，因此需在PEG融合诱导前去除菌种M和N的细胞壁，B正确；培养基X筛选的菌种是M菌和N菌融合后的细胞，杂种融合菌既含有A＋基因又含有B＋基因，培养基中不添加组氨酸和色氨酸就能生长，故培养基X中应不添加组氨酸和色氨酸，C正确；培养基用稀释涂布平板法接种，得到单菌落便于计数，D错误。
8．如图是我国科学家制备小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞的相关研究流程，其中Oct4基因在维持胚胎干细胞全能性和自我更新中发挥重要作用。下列叙述正确的是(　 )
A．从小鼠卵巢中获取的卵母细胞可以直接用于过程①
B．推测Oct4基因的表达有利于延缓衰老
C．单倍体胚胎干细胞与成体干细胞类似，可诱导分化成各种功能的组织和器官
D．孤雄单倍体胚胎干细胞由重组细胞减数分裂而来，其核遗传物质由精子提供
解析：选B　卵母细胞要培养到减数分裂Ⅱ的中期才具备受精的能力，在受精作用过程中完成减数分裂Ⅱ，所以过程①选取的卵子应该是处于减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，A错误；Oct4基因在维持胚胎干细胞全能性和自我更新中发挥重要作用，据此可推测，Oct4基因的表达有利于延缓衰老，B正确；单倍体胚胎干细胞类似于正常胚胎干细胞，具有发育的全能性，可诱导分化成各种功能的细胞、组织和器官，而成体干细胞来源于已经分化组织中的未分化细胞，如造血干细胞，其只能分化为特定的组织和器官的细胞，C错误；孤雄单倍体胚胎干细胞由重组细胞经过有丝分裂而来，其核遗传物质由注入Oct4转基因的精子提供，D错误。
9．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是(　 )
A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果
B．引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基
C．①过程需要先加热至90～95 ℃后再冷却至50～60 ℃
D．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
解析：选D　PCR过程中DNA单链延伸的方向是沿着引物的5′端向3′端延伸，据此可分析，PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果，A正确；根据突变位点的产生可推知，引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基，B正确；①过程包含双螺旋解开的过程，即氢键断裂，可通过先加热至90～95 ℃完成，而后再冷却至50～60 ℃使氢键形成，为子链的延伸做准备，C正确；②过程为子链延伸的过程，该过程需要利用AB上链和CD下链之间的互补配对实现子链的延伸过程，D错误。
10．(2022·德州三模)基因敲减主要是指从转录水平或翻译水平使基因表达失活的技术，其中RNA干扰技术是常用的基因敲减技术，该技术首先要根据目的基因序列设计出反义RNA和正义RNA构建成双链RNA(shRNA)，然后用相关酶切割shRNA形成反义RNA片段，其可与目的基因转录的mRNA碱基互补配对，进而诱导相关酶水解mRNA，实现对基因的敲减。为检测设计出的shRNA是否能成功敲减基因还需要利用荧光酶报道基因系统进行验证。如图1表示敲减载体构建，图2表示荧光酶报道基因系统检测的原理。
(1)据图1分析，若要从含shRNA基因的DNA分子中扩增出shRNA基因并能使其在受体细胞中表达，需要用到的引物是______________，为使扩增出的shRNA基因能够和质粒构建敲减载体，在设计引物时需在引物的______(填“5′”或“3′”)端分别添加______________酶能够识别的序列。
(2)已知mRNA末端缺失会导致mRNA水解。荧光酶报道基因与欲敲减的目的基因串联可构成荧光酶报道基因系统，荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子，其原因是_________________________________________________________。
(3)荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功，其机理是____________________________________________________。
解析：(1)若要从含shRNA基因的DNA分子中扩增出shRNA基因并能使其在受体细胞中表达，则应包含启动子、终止子序列，且应在模板的3′端结合引物，故需要用到的引物是引物2、引物5；分析题意可知，shRNA是根据目的基因序列设计出反义RNA和正义RNA构建而成的，结合图1中限制酶的位置及切割位点可知，使扩增出的shRNA基因能够和质粒构建敲减载体，在设计引物时需在引物的5′端分别添加BamHⅠ、HindⅢ酶能够识别的序列。(2)终止子是一段特殊的DNA序列，位于基因的下游，转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联，故荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子。(3)结合题意，若敲减载体能够敲除目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光出现，故荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功。
答案：(1)引物2、引物5　5′　BamHⅠ、HindⅢ
(2)转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联　(3)若敲减载体能够敲除目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光出现