3.1重组DNA技术的基本工具 生物人教版（2019）必修2(共32张PPT)

(共32张PPT)
第三章
基因工程
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。
大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉，到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
从社会中来
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程
操作对象
操作环境
操作水平
工程实质
基因
体外
DNA分子水平
基因重组
操作结果
定向地改造生物的遗传性状，获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
工程优点
定向改造生物体的性状，目的性强
育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术、基因拼接技术。
1944年
艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1953年
沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年
梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1967年
科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年
科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶。
20世纪70年代初
多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年
伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年
证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
与载体DNA拼接
导入
怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？
苏云金芽孢杆菌
(有抗虫特征)
普通棉花
(无抗虫特征)
Bt抗虫基因
棉花细胞
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
提取
表达
抗虫基因
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
剪
接
运
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
都遵循碱基互补配对原则
DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
基因是控制生物性状的结构与功能单位
遗传信息传递都遵循中心法则
生物界几乎共用一套遗传密码
基因在空间上转移并成功表达
第一节
重组DNA技术的基本工具
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
数千种（限制酶是一类酶）
主要来自原核生物
剪
分子手术刀-限制性内切核酸酶
来源
种类
作用
产生黏性末端或平末端
结果
5’ 3’
3’ 5’
EcoR Ⅰ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
产生黏性末端
黏性末端
Sma Ⅰ限制酶只能识别CCCGGG序列,并在C和G之间切开。
产生平末端
5’ 3’
3’ 5’
平末端
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离出来的，就用字母EcoR表示；
如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR Ⅰ 。。
限制酶的命名
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______
Sma Ⅰ
流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
特点：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
呈现碱基互补对称，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
1、限制性核酸内切酶的“限制性”表现在什么地方？这体现了酶的哪种特性？
表现在两方面：
限制性核酸内切酶只能识别双链DNA分子上某种特定的脱氧核苷酸序列；
只能在识别序列上特定的两个脱氧核苷酸之间进行切割。
2、限制酶在原核生物中的作用是什么？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是一种防御工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，保证自身的安全。
3、为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
因为含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或不具备这种限制酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。（自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。）
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
接
分子缝合针-DNA连接酶
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
作用
种类
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能
结果 大肠杆菌
T4噬菌体
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
1.两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接起来。（ ）
2.T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。（ ）
3.DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。（ ）
小试牛刀
√
×
×
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不同点 模板
过程
结果
用途
催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要模板
以DNA的一条链为模板
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’端，形成磷酸二酯键
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程等
DNA复制
易错点
与DNA相关的几种酶的作用
种类 作用对象 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
DNA水解酶
DNA分子
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA分子片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA分子
氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA分子
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
目的基因如何转移到受体细胞？
利用病毒的侵染能力
利用质粒的转移能力
运
分子运输车-载体
将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
作用
具备条件
（1）载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
（2）要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，需要具备什么条件？
（3）为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
运
分子运输车-载体
将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
作用
具备条件
具有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段插入。
（2）要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，需要具备什么条件？
（3）为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
运
分子运输车-载体
将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
作用
具备条件
具有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段插入。
能在受体细胞内进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
运
分子运输车-载体
将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
作用
具备条件
具有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段插入。
能在受体细胞内进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
具有特殊的标记基因，用于筛选含重组DNA分子的细胞。常见的标记基因有四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。
运
分子运输车-载体
质粒、噬菌体、动植物病毒等
种类
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
质粒来源于细菌、霉菌和酵母菌等的细胞质，对细胞的正常生活几乎没有影响，最常用的是大肠杆菌质粒。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoR I的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
思考·讨论
你从中发现什么现象了？
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶
同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
A. 一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B. 用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ 切割
C. 图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用 EcoRⅠ切割
D. 若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ 酶切位点越多，质粒的热稳定性越高
1.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法错误的是( )
A
2.获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了 。但是使用该法缺点是容易发生 以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
3.选择限制酶切割位点的基本原则：
切割目的基因时： 。
切割质粒时： 。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因、质粒的自身环化，目的基因与质粒反向连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选