植物有效成分的提取
1.芳香油概述
〖内容〗
天然香料的来源 ( http: / / www.21cnjy.com )：植物、动物。
不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。
芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。
芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。
2.水蒸气蒸馏法
〖内容〗
原 ( http: / / www.21cnjy.com )理：水蒸气可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。
方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。
水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。
水气蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。
不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作）
3.萃取法
〖内容〗
原理：芳香油易溶于有机 ( http: / / www.21cnjy.com )溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。
方法：原料浸泡在溶剂中→得到浸泡液→有机溶剂挥发→芳香油。
不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质。
4.蒸馏
〖内容〗
蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、接液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮管。
所有仪器必须事先干燥，保证无水。整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接收。安装仪器一般都按照自下而上、从左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/58d066ef7c354179b62330049d542114/10bc8aec878c4ed1858838772323e585.001.jpeg" \* MERGEFORMATINET
具体安装顺序和方法如下：
（1）固定热源──酒精灯。
（2）固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如教科书中图6-2所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。
（3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。
（4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。
（5）连接接液管（或称尾接管）。
（6）将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。
（7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。
蒸馏装置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，防止液体过度沸腾。打开水龙头，缓缓通入冷水，然后开始加热。加热时可以观察到，蒸馏瓶中的液体逐渐沸腾，蒸气逐渐上升，温度计读数也略有上升。当蒸气的顶端达到温度计水银球部位时，温度计读数急剧上升。在整个蒸馏过程中，应保证温度计的水银球上常有因冷凝作用而形成的液滴。控制蒸馏的时间和速度，通常以每秒1～2滴为宜。
5.分液漏斗
〖内容〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/58d066ef7c354179b62330049d542114/14d22a556ca047858f5cda425350b739.001.png" \* MERGEFORMATINET
（1）首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入活塞孔中，以免污染萃取液。
（2）塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液漏斗的顶塞与活塞处是否渗漏，确认不漏水后再使用。
（3）将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体从上部开口处倒入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。
（4）取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧活塞，将分液漏斗略倾斜，前后振荡（开始振荡时要慢）。
（5）振荡后，使漏斗口仍保持原倾斜状态，左手仍握在漏斗活塞处，下部管口指向无人处，用拇指和食指旋开活塞，使其释放出漏斗内的蒸气或产生的气体，以使内外压力平衡，这一步操作也称做“放气”。
（6）重复上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的气体时为止。再将分液漏斗剧烈振荡2～3 min，然后将漏斗放回铁圈中，待液体静置分层。
蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。
6.玫瑰精油的提取
〖步骤 ( http: / / www.21cnjy.com )〗
（1）采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。
（2）装入蒸馏原料：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。
（3）安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上次序安装水蒸气蒸馏装置。
（4）加热蒸馏：控制蒸馏时间和速度（1～2滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。
（5）分离油层：向乳浊液加入NaCl溶液后，利用分液漏斗分离出上面的油层。
（6）除去水分：向油层中加入无水硫酸钠，24h后过滤，得到玫瑰油。
〖关键点〗
（1）0.1g/mL氯化钠溶液：促使油水混合物（乳浊液）中油和水的分离。
（2）无水硫酸钠：吸收油层中的水分。
（3）蒸馏时间不能过短，温度不能过高。
7.橘皮精油的提取
〖步骤 ( http: / / www.21cnjy.com )〗
（1）橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。
（2）石灰水浸泡：用7～8％石灰水浸泡橘皮24h。
（3）清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。
（4）粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。
（5）过滤压榨液：用布袋过滤，滤液再高速离心处理，分离出上层橘皮油。
（6）静置处理：将橘皮油在5～10℃冰箱中静置5～7d，分离出上层澄清橘皮油。
（7）再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。
〖关键点〗
（1）橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。
（2）石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。
（3）小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25％和5％）。
（4）静置处理目的：除去果蜡和水分。
8.胡萝卜素
〖性质〗
橘黄色结 ( http: / / www.21cnjy.com )晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。
〖分类〗
依据碳碳双键的数目划分为α、β、γ 三类。其中最主要的组成成分为β-胡萝卜素。
〖作用〗
（1）治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；
（2）常用于食品色素；
（3）使癌变细胞恢复成正常细胞。
〖提取方法〗
提取β－胡萝卜素的方法主要有三种：
（1）从植物中提取；
（2）从大面积养殖的岩藻中获得；
（3）利用微生物的发酵生产。
9.有机溶剂
〖内容〗
（1）水溶性的： ( http: / / www.21cnjy.com )乙醇、丙酮。
（2）水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等。
选择：具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。
10.胡萝卜素提取萃取剂的选择
〖 ( http: / / www.21cnjy.com )内容〗
选择具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。
胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它们作萃取剂。
在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂。
11.影响胡萝卜素萃取的因素
( http: / / www.21cnjy.com )主要因素：萃取剂的性质和使用量
次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等
一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥。
12.胡萝卜素提取装置的设计 ( http: / / www.21cnjy.com )
〖内容〗
萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。
为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。
萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。
13.胡萝卜素的提取实验操作
①粉碎：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。
②干燥：脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。
③萃取
④过滤：除去萃取液中的不溶物
⑤浓缩：蒸发出有机溶剂
⑥鉴定：纸层析法
滤纸：18㎝×30㎝
基线：滤纸下端距底边2㎝处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点。
点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取样品进行点样。点样应该快速细致，在基线上形成直径２mm左右的圆点，每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干，注意保持滤纸干燥。等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，至于装有１ｃｍ深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。
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14.水蒸气蒸馏、压榨法、有机溶剂萃取方法的比较
〖内容〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/58d066ef7c354179b62330049d542114/c293194deb034b66b2a9958b7e89fcb7.001.png" \* MERGEFORMATINET微生物的培养与应用
1.培养基
〖定义〗
培养基： ( http: / / www.21cnjy.com )人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。
〖分类〗
（1）培养基按照物理性质可分为：液体培养基、半固体培养基和固体培养基。
在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。
微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。
液体培养基应用于工业或生活生产；固体培养基应用于微生物的分离和鉴定；半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。
（2）按照成分培养基可分为：人工合成培养基和天然培养基。
合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。
天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。
（3）按照培养基的用途，可将培养基分为：选择培养基和鉴别培养基。
选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。
鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。
2.培养基的化学成分
〖内容〗
培养基的化学成分包括：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
（1）碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如、等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
（2）氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如、、、（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用。
（3）培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。
例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物时则需要提供无氧的条件。
3.消毒
〖定义〗
消毒指使 ( http: / / www.21cnjy.com )用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
〖方法〗
消毒方法常用：煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体），高压蒸汽法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。
4.灭菌
〖定义〗
灭菌是指使用强 ( http: / / www.21cnjy.com )烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
〖方法〗
1、接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；
2、玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；
3、培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。
4、表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
5.消毒与灭菌的区别
〖内容〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/df5d375e13d447de89603f9c7fbe3073/8eb1d6dec4ed441da28ef53c992a829b.001.png" \* MERGEFORMATINET HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "../../../微生物的培养与应用.files/image014.jpg" \* MERGEFORMAT \d v:shapes="_x0000_i1032">
6.无菌技术注意事项
〖内容〗
( http: / / www.21cnjy.com ) 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：
1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
2、将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
〖关键点〗
无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。
7.制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
〖内 ( http: / / www.21cnjy.com )容〗
1、总步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
2、倒平板操作的步骤：
（1）将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。
（2）右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。
（3）用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
（4）等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。
〖关键点〗
1、培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。这时候可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2、使锥形瓶的瓶口通过火焰，通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3、平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板最好不要用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
8.微生物接种方法
〖内容〗
微生 ( http: / / www.21cnjy.com )物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
〖目的〗
使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。
9.平板划线法
〖定义〗 ( http: / / www.21cnjy.com )
平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
〖步骤〗
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。
3、将试管口通过火焰。
4、将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞。
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
8、将平板倒置放入培养箱中培养。
〖关键点〗
1、操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2、在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。
10.稀释涂布平板法
〖内容〗
( http: / / www.21cnjy.com ) 稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
〖步骤〗
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
2、取少量菌液，滴加到培养基表面。
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
〖关键点〗
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
11.菌种的保存
〖内容 ( http: / / www.21cnjy.com )〗
1、对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法：
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
2、对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
〖关键点〗
1、生物的营养：
营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。
人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。
微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。
2、确定培养基制作是否合格的方法：
将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
12.尿素
〖内容〗
尿素是一 ( http: / / www.21cnjy.com )种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。
尿素最初是从人的尿液中发现的。
13.筛选菌株
〖内容〗
（1） ( http: / / www.21cnjy.com )实验室中微生物的筛选应用的原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
（2）选择性培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据
根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
14.统计菌落数目
〖内容〗
( http: / / www.21cnjy.com )测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物。
〖关键点〗
统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值。
每克样品中的菌落数=（C/V）*M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数。
15.对照实验
对照实 ( http: / / www.21cnjy.com )验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
16.“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验设计
〖内容〗
（1）土壤取样：
同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
（2）样品的稀释：
样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。
测定土壤中细菌的数量，一般选用、、 倍的稀释液进行平板培养；
测定放线菌的数量，一般选用、、倍的稀释液；
测定真菌的数量，一般选用、、倍的稀释液。
（3）微生物的培养与观察：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌30~37℃，1~2天；
放线菌25~28℃，5~7天；
霉菌25~28℃，3~4天；
每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色。
17.纤维素与纤维素酶
〖内容 ( http: / / www.21cnjy.com )〗
1、纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
2、纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1 酶、CX 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。
18.纤维素分解菌的筛选
〖内容〗
1、筛选 ( http: / / www.21cnjy.com )方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
2、刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理：
刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
19.分离分解纤维素的微生物的实验流 ( http: / / www.21cnjy.com )程
〖内容〗
土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
（1）土壤采集：选择富含纤维素的环境。
（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤：倒平板操作→制备菌悬液→涂布平板。
刚果红染色法种类：一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。
〖课题延伸〗
对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。
纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
〖关键点〗
（1）由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从在富含纤维素的环境土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
（2）将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。
（3）两种刚果红染色法的比较：
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
（4）在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。传统发酵技术的应用
1.发酵
〖定义〗
通过微生物技术 ( http: / / www.21cnjy.com )的培养来生产大量代谢产物的过程。
〖类型〗
1、有氧发酵：醋酸发酵、谷氨酸发酵；
2、无氧发酵：酒精发酵、乳酸发酵。
2.酵母菌
〖定义〗
酵母菌是兼性厌氧型微生物真菌，属于异养型单细胞真菌。
〖生殖方式〗
出芽生殖（主要）；分裂生殖；孢子生殖。
〖呼吸方式〗
（1）在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。
＋—酶→6＋6
（2）在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。
—酶→2＋2
注：20℃左右最适宜酵母菌繁殖；酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃。
3.葡萄酒发酵过程
仪器消毒→挑选葡萄 ( http: / / www.21cnjy.com )→冲洗→榨汁→酒精发酵→过滤→装瓶。（民间不同的酿酒工艺，其步骤会略有不同）
1、在葡萄酒自然发酵的过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌。
2、冲洗葡萄时：先冲洗，再去梗，否则杂菌易进入葡萄，造成污染。但是也不宜过分冲洗，会将表面的酵母菌洗掉。
3、在发酵过程中，温度控制在18－25℃，随着酒精浓度的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈现深红色。
4、在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。
4.醋酸菌
〖概述〗
醋酸菌是单细胞细菌（原核生物），代谢类型是异养需氧型，生殖方式为二分裂。
〖呼吸方式〗
当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
5.控制醋酸菌发酵条件的作用 ( http: / / www.21cnjy.com )
1、醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。
2、醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。
3、有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。
6.酒精发酵实验流程
〖流程〗
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒。
时间：10-12天
温度：18－25℃
空气：缺氧
〖酒精检验〗
果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。
先在试管中加入发酵液2ml，再滴入物质的量浓度为3mol/L的3滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色
〖辨析〗
1、应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？
应先冲洗，再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
2、应该从哪些方面防止发酵液被污染？
要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
7.醋酸发酵实验流程
〖流程〗
挑选葡萄→冲洗→榨汁→醋酸发酵→果醋。
时间：7-8天
温度：30－35℃
空气：充足的氧
〖装置〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/cdc06193c0ae41df9646a37802e23fdf/8e72d8393669467f872d4dfa74db71fb.001.jpeg" \* MERGEFORMATINET
充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。通入氧气的目的：醋酸菌是异养需氧型细菌，氧气利于醋酸菌的繁殖。
〖辨析〗
1、制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～25℃？而制葡萄醋时，要控制在30～35℃？
温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。
而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。
8.毛霉
〖定义〗
毛霉是一种丝状 ( http: / / www.21cnjy.com )真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。
〖作用〗
多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。
〖原理〗
毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
〖毛霉的生长〗
条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的温度控制在15～18℃，并保持一定的湿度。
来源：（1）来自空气中的毛霉孢子；（2）直接接种优良毛霉菌种；
时间：5天后，豆腐表面丛生直立菌丝。
〖辨析〗
1、豆腐长白毛是怎么一回事？
豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。
2、腐乳外部有一层致密的“皮”，它是怎样形成的？
“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。
9.腐乳制作流程
〖流程〗
让豆腐 ( http: / / www.21cnjy.com )上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。
（1）前期发酵的主要作用：创造条件让毛霉生长；使毛霉形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。
（2）后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。
10.豆腐含水量
将豆腐切成3cm× ( http: / / www.21cnjy.com )3cm×1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。
水分测定方法如下：精确称取经研钵研磨成糊状的样品5～10g(精确到0.02mg)，置于已知重量的蒸发皿中，均匀摊平后，在100～105℃电热干燥箱内干燥4h，取出后置于干燥器内冷却至室温后称重，然后再烘30min，直至所称重量不变为止。
样品水分含量（%）计算公式如下：
（烘干前容器和样品质量－烘干后容器和样品质量）÷烘干前样品质量
11.加盐腌制
〖内容〗
将长满毛霉的豆 ( http: / / www.21cnjy.com )腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。
〖作用〗
（1）抑制微生物的生长，避免腐败变质；
（2）析出水分，使豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂；
（3）调味作用，给腐乳以必要的咸味；
（4）浸提毛霉菌丝上的蛋白酶（使蛋白酶溶解于食盐溶液中，随食盐溶液进入豆腐内部，使蛋白质充分分解为氨基酸）。
〖注意事项〗
注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味
12.配制卤汤
〖内容〗
卤汤直 ( http: / / www.21cnjy.com )接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。
〖作用〗
1、酒的作用：
（1）防止杂菌污染以防腐；
（2）与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味；
（3）酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
2、香辛料的作用：
（1）调味作用；
（2）杀菌防腐作用；
（3）参与并促进发酵过程。
〖注意事项〗
防止杂菌污染：
（1）用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒；
（2）装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
13.乳酸菌
〖内容〗
制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸。分裂方式是二分裂。
反应式为：。
常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。
〖辨析〗
含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。
14.亚硝酸盐
亚硝酸盐为白色粉末 ( http: / / www.21cnjy.com )，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。
（1）测定亚硝酸盐含量的原理：
在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。
（2）膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。
亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。
15.泡菜制作过程
〖流程〗
原料处 ( http: / / www.21cnjy.com )理→盐水配制→装坛→封坛发酵。
〖注意事项〗
（1）盐水配制：清水与盐的质量比为4:1；
（2）将盐水煮沸冷却（防止细菌污染）；
（3）泡菜坛密封（保持无氧环境）。DNA和蛋白质技术
1.提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2.提取DNA的方法
〖概念〗
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
〖原理〗
1、分离：
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
2、提纯：
（1）DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质则可溶于其中。
（2）蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。
（3）大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温而发生变性，而DNA在80℃以上才会变性。
（4）洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
利用以上原理可以将DNA与蛋白质进一步分离。
3、鉴定：在沸水浴的条件下，DNA被二苯胺染成蓝色。
〖步骤〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/2eb29f793dba4631950037ec89b8f7be/81d3bdbbba7c4289a1ff7dcf2f135a43.001.png" \* MERGEFORMATINET
1、防止血凝。
2、加速血细胞破裂。
3、溶解DNA。
4、使2 mol/L的NaCl溶液稀释至0.14 mol/L，促DNA最大限度地析出。
5、使含DNA的黏稠物被留在纱布上。
6、使含DNA的黏稠物尽可能多地溶于溶液中。
7、除去含DNA的滤液中的杂质。
8、提取DNA。
9、A：出现蓝色。B：无变化
3.DNA提取的实验设计
〖实验流程〗
( http: / / www.21cnjy.com )1、实验材料的选取
选用DNA含量相对较高的生物组织。
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液
（1）动物细胞的破碎——以鸡血为例
在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
（2）植物细胞的破碎——以洋葱为例
先将洋葱切碎，然后加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3、去除滤液中的杂质
（1）方案一：通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
（2）方案二：直接向滤液中加入嫩肉粉，反应10min～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
（3）方案三：将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10min～15min，注意严格控制温度范围，使蛋白质沉淀析出而DNA分子还未变性，可以将DNA与蛋白质分离。
4、DNA的进一步提纯
利用DNA不溶于冷却的酒精这一原理，可从冷却的酒精中析出较纯净的DNA，此时DNA的状态为白色丝状。
5、DNA的鉴定
将呈丝状的DNA溶解于5mL物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，冷却后观察溶液的颜色。注意要同时设置对照实验。
〖操作提示〗
（1）以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
（2）加入洗涤剂后，动作要轻缓柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
（3）二苯胺试剂要现配现用。
4.生物体内DNA分子复制的条件
1、四种 ( http: / / www.21cnjy.com )脱氧核苷酸：合成子链的原料。
2、DNA母链：提供了DNA复制的模板。
3、解旋酶：打开了DNA双链。
4、DNA聚合酶：催化合成DNA子链。
5、引物：使DNA聚合酶能够从脱氧核苷酸的3’端开始连接脱氧核苷酸。
5.PCR扩增技术
〖概念〗
PCR即 ( http: / / www.21cnjy.com )多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。
〖原理〗
（1）DNA的热变性：在80～100℃的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
（2）子链的合成：①需要引物；②合成方向总是从子链的5’向3’端延伸。
〖条件〗
（1）DNA模板。
（2）分别与模板DNA两条单链相结合的两种引物。
（3）含有A、T、G、C四种碱基的脱氧核苷酸。
（4）耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。
（5）需要稳定的缓冲液和能严格控制温度的温控设备。
6.PCR反应过程
P ( http: / / www.21cnjy.com )CR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
（1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
（2）复性：当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
（3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
7.PCR技术实验操作
〖实验用具〗
( http: / / www.21cnjy.com )（1）PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
（2）微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行PCR反应的场所。
（3）微量移液器：用于微量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头要随时更换。
〖实验步骤〗
准备→融化→混合→离心→反应。
〖操作提示〗
（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
（2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃ 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
8.DNA含量的测定
（1）原理： ( http: / / www.21cnjy.com )利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。
（2）计算公式：DNA含量（μg/mL）＝50×（260nm的读数）×稀释倍数。
9.凝胶色谱法
〖概念〗
也称 ( http: / / www.21cnjy.com )做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。
〖原理〗
（1）由多糖类化合物构成的凝胶，内部有许多贯穿的通道。
（2）当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。
10.缓冲溶液
〖概念〗
具有缓冲作用的 ( http: / / www.21cnjy.com )溶液称缓冲溶液。
〖作用〗
在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
〖配置〗
由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
11.电泳
〖概念〗
( http: / / www.21cnjy.com )指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
〖原理〗
在一定的pH下，多肽、核酸等具有可解离基团的生物大分子，会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
〖作用〗
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
〖方法〗
常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，测定蛋白质分子量时通常使用十二烷基硫酸钠（SDS）－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
12.血红蛋白的提取和分 ( http: / / www.21cnjy.com )离实验操作
〖实验过程〗
1、样品处理：
通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集血红蛋白溶液。
（1）红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
（4）透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。
目的：将样品中分子量较小的杂质除去。
原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
2、凝胶色谱的操作：
通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：
（1）凝胶色谱柱的制作。
（2）凝胶色谱柱的装填：
①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。
②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在；不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
（3）样品的加入和洗脱
①准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。
③加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶层内。
④洗脱：加入磷酸缓冲液，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
3、蛋白质纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
〖操作提示〗
1、红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。
2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。
3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
4、蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。酶的研究与应用
1.果胶
〖定义〗
植物细胞壁以及胞 ( http: / / www.21cnjy.com )间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水（但和水有较强的结合力）。
在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。
〖鉴别〗
果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。
2.果胶酶
〖定义〗
果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。
果胶酶作用的最适温度为45—50℃、最适pH范围为3.0—6.0。、、等金属离子对酶有抑制作用。
〖来源〗
植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶，通常生产上采用曲霉、青霉等微生物来生产果胶酶。
〖作用〗
1、分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层；提高水果的出汁率
2、使果胶水解为半乳糖醛酸，并使果汁变得澄清。
3.果胶酶在工业中的应用
（ ( http: / / www.21cnjy.com )1）水果中的果胶经果胶酶水解后，可降低果汁的黏度，有助于压榨并提高出汁率。
（2）在进行果汁沉降和离心时，能破坏果汁中悬浮物的稳定性，使其凝聚沉淀，果汁得到澄清。
（3）经果胶酶处理的果汁比较稳定，不再发生混浊，在制备浓缩果汁时尤为重要。
（4）在葡萄酒酿造中加入果胶酶能起到澄清作用，还可促使葡萄汁中的酒石酸发生沉淀。
（5）果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等配合，可降低植物细胞壁中的果胶和纤维素，促进淀粉、脂质、维生素和蛋白质等释放出来，从而提高了饲料的营养价值。
4.酶的活性
酶催化 ( http: / / www.21cnjy.com )一定化学反应的能力。一般用催化反应速度来表示。而反应速度又用单位时间内单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。
影响酶活性的因素：温度、pH、酶的抑制剂、酶的浓度、底物浓度等。
5.探究温度对酶活性的影响
〖实验流程〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/954267c0939b4cf88826aaf6bbaca215/fd45db087d414af9a2e71a9c316a4b39.001.jpg" \* MERGEFORMATINET
〖注意事项〗
（1）在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶的活性。
（2）果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。
（3）与其他工业用酶基本相同，果胶酶的适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用10 ℃作为温度梯度，设置的具体温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃等，也可以尝试以5℃作为温度梯度。
（4）苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水100～200 mL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。
（5）果泥的用量可以采用5 mL左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为2%的果胶酶溶液2 mL。
（6）水浴时间可以为20～30min。
（7）过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。
6.探究pH对酶活性的影响
〖实验流程〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/954267c0939b4cf88826aaf6bbaca215/7b1be4b5854e4934bff3559294aa62a9.001.jpg" \* MERGEFORMATINET
〖注意事项〗
探究pH对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的pH可以通过体积分数为0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。
7.探究果胶酶的用量
〖实验原理〗
在一定的条件下，随着酶浓度的增加，果汁的体积也增加；当酶浓度达到某一数值后，再增加酶的用量，果汁的体积不再改变，此值即是酶的最适用量。
〖实验流程〗
HYPERLINK "http://www.21cnjy.com" INCLUDEPICTURE "http://f1./edu_mobile_upload/954267c0939b4cf88826aaf6bbaca215/ffb8144a3d974543b10500a95374aa79.001.jpg" \* MERGEFORMATINET
〖注意事项〗
本实验研究的变量是果胶酶的用量，其他因素都应保持不变。实验时可以配制同体积不同浓度的果胶酶溶液，也可以配制同浓度不同体积的果胶酶溶液。需要注意的是，反应液的温度和pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。
8.家用洗衣粉
〖内容〗
家用洗衣粉和其他各种家用洗涤剂的成分基本相同，主要含有表面活性剂、水软化剂、碱剂、漂白剂和香精等成分。
9.加酶洗衣粉（酶制剂）
〖定义〗
( http: / / www.21cnjy.com )加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。
酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质。其应用领域遍及轻工、食品、化工、医药、农业以及能源、环境保护等方面。
目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。
其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
〖机理〗
碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质分解成可溶性小分子肽和氨基酸。同样的道理，淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶也能分别将大分子的淀粉、脂肪、纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。
10.探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果
〖实验原理〗
生活中的各种污渍主要是蛋白质、脂质、淀粉等多种不溶于水的有机物，这些有机物能在相应的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的作用下水解成易溶于水的小分子有机物。
〖遵循原则〗
实验变量为洗涤剂，设计时应遵循单一变量原则、对照性原则有效的控制其他变量，如水的用量、污染物的量，所用实验用布的质地大小、两种洗衣粉的用量，搅拌及洗涤时间
〖实验流程〗
（1）实验准备
带有污染物的实验用布的制取：取一定量的污染物制成溶液，取等量的污染物滴加在相同大小、质地的新布上；
称取等量的洗衣粉：用天平准确称取等量普通洗衣粉和加酶洗衣粉；
（2）实验过程
①取两只大烧杯并编号，用量筒分别量500ml蒸馏水放入其中。放入400C的水浴锅保温。
②将制好的污染布和洗衣粉（一组为污染布和普通洗衣粉，另一组为污染布和加酶洗衣粉）分别放入两只烧杯中。
③用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时间后搅拌可重复进行。
④过相同的时间后观察洗涤效果。
〖实验结论〗
加酶洗衣粉的效果好。
11.温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响
〖实验原理〗
酶的催化活性受温度影响，在适宜温度下酶的催化活性最高，温度过低或过高酶的催化能力降低
〖实验材料〗
加酶洗衣粉、天平、白色棉布、1000mL烧杯、玻棒、温度计、滴管、新鲜鸡血、水浴缸、温度分别为5℃、15℃、25℃、35℃的清水。
〖实验流程〗
（1）取10cm×10cm的白色棉布4块，用滴管各滴加5滴新鲜鸡血，晾干备用。
（2）取1000mL烧杯4个，用天平分别称取0.5g加酶洗衣粉，依次倒入4个烧杯中。
（3）将5℃、15℃、25℃、35℃清水各500mL依次倒入4个烧杯中，用玻棒搅拌溶化洗衣粉。
（4）取水浴缸4个，依次倒入5000mL 5℃、15℃、25℃、35℃清水，插入温度计保持恒温。
（5）将4个烧杯分别放到相同水温的水浴缸中，将带鸡血的棉布分别放到烧杯中浸泡20min。
（6）按相同方式用不同玻棒搅拌各棉布，放到水浴缸中。
12.探究不同种类的加酶洗衣粉对同一污物和不同污物洗涤效果的比较
〖实验原理〗
不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶具有专一性，所以对不同污渍洗涤效果不同。
〖实验流程〗
1、取30块大小相同的白棉布，分成6组，每组5块，依次编号1a、1b、1c、1d、1e、2a、2b…6a、6b、6c、6d、6e。
（a为蛋白酶处理组，b为脂肪酶处理组，c为淀粉处理组，d为复合酶处理组，e为普通洗衣粉组）
2、制取带有污染物的实验用布：
给第一组白布滴加鸡血，待血渍扩散停止后，记录血渍面积。
按同样的方法给第2－6组分别滴加牛奶、菜油、番茄汁、墨水、颜料，并记录污渍面积。
3、将上述白棉布分别放入30个已编号的烧杯中，各注入500ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌使白棉布湿透。
4、温度控制：烧杯均放入温度为45度的水浴锅。
5、洗衣粉洗涤：
给1a－6a号烧杯中加入等量的蛋白酶洗衣粉，给1b－6b号烧杯中加入等量的脂肪酶洗衣粉；
给1c－6c号烧杯中加入等量的淀粉酶洗衣粉；
给1d－6d号烧杯中加入等量的复合酶洗衣粉；
给1e－6e号烧杯中加入等量的普通酶洗衣粉；
各烧杯均搅拌洗涤10分钟后，用清水漂洗3次，晾干。
〖实验结果〗
不同种类的洗衣粉对同一污渍或不同污渍洗涤效果的列表比较：
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13.固化酶
〖内容〗
它是通过物 ( http: / / www.21cnjy.com )理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。
14.固定化细胞
被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。
15.酶、固定化酶、固定化细胞的优缺点
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16.固定化酶的应用实例
高果糖浆 ( http: / / www.21cnjy.com )是指果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人类的健康更有益。
能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
17.固定化细胞技术
固定化 ( http: / / www.21cnjy.com )酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。
一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大，而酶分子很小；体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋材料中漏出。
包埋法固定化细胞即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
18.酵母细胞的固定化实验操作
〖实验流程〗
（一）制备固定化酵母细胞
（1）酵母菌的活化
活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。
（2）配制物质的量浓度为0.05mol/L的溶液
（3）配制海藻酸钠溶液
（4）海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合
（5）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的溶液中，并浸泡30min左右。
（二）用固定化酵母细胞发酵
（1）将固定好的酵母细胞用蒸馏水冲洗2-3次。
（2）将150ml质量分数为10％的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h。
〖实验结果〗
（1）观察凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
（2）观察发酵的葡萄糖溶液
利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
〖注意事项〗
（1）配制海藻酸钠溶液：小火、间断加热、定容，如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
（2）海藻酸钠溶液与酶母细胞混合：冷却后再混合，注意混合均匀，不要进入气泡。
（3）制备固定化酵母细胞：高度适宜，并匀速滴入。
（4）配置溶液时，溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果。
（5）刚形成的凝胶珠应在溶液中浸泡一段时间，以便Ca离子与Na离子充分交换，形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成，可用下列方法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果不容易破裂，没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠，还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。
（6）凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。植物的组织培养技术
1.细胞分化（选修一）
〖定义〗
( http: / / www.21cnjy.com ) 在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。
〖意义〗
使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。
\2.细胞的全能性（选修一）
〖定 ( http: / / www.21cnjy.com )义〗
具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全能性。
〖关键点〗
全能性在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达（细胞分化），构成不同组织和器官。
3.植物组织培养的基本过程
〖过程〗
离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。
脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。
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〖应用〗
实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。
4.根尖分生组织和愈伤组织的异同
〖内容〗
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5.影响植物组织培养的条件
〖内容〗
1、材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。
菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。
2、营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。
3、激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。
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4、环境条件：PH、温度、光等环境条件。
不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h。
6.菊花的组织培养操作流程
〖内容〗
( http: / / www.21cnjy.com )1、配制MS固体培养基：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。
·使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。
·配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。
·在菊花组织培养中，可以不添加植物激素，因为菊花茎段组织培养比较容易。
·灭菌：高压蒸汽灭菌。
·MS培养基中大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。
·区别：微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。
2、外植体的消毒：（外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段）
选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。
注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。
3、接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。
4、培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h）。
5、移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养基生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。
6、栽培：外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。
7.被子植物的花粉发育
〖内容〗 ( http: / / www.21cnjy.com )
被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。
被子植物花粉的发育要经历四分体时期、单核期和双核期等阶段。在四分体时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是营养细胞，一个是生殖细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。
〖注〗
（1）成熟的花粉粒有两类：
一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；
另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）。
（2）花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的4个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。
（3）同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同。
8.产生花粉植株的两种途 ( http: / / www.21cnjy.com )径
〖内容〗
（1）花粉通过胚状体阶段发育为植物；
（2）花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。
这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
〖注〗
1、无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根；
2、胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。
9.影响花药培养的因素
〖内容〗
诱 ( http: / / www.21cnjy.com )导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素。
（1）亲本的生理状况：花粉早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。
（2）合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。
（3）花蕾：选择完全未开放的花蕾。
（4）亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响。
10.月季的花药培养实验操作
〖 ( http: / / www.21cnjy.com )内容〗
（1）材料的选取：
选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期（单核期）。确定花粉发育时期的最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。
（2）材料的消毒：
通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡大约30s，立即取出，在无菌水中清洗。取出后再用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2-4min（也可用质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液），取出后再用无菌水冲洗3-5次。
（3）接种和培养：
灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。
通常每瓶接种花药7～10个，培养温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。
一般经过20～30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
还需要对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。
11.植物组织培养技术与花药培养 ( http: / / www.21cnjy.com )技术的比较
〖内容〗
相同：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。
不同：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。
