高考生物二轮复习专题专练(31)　 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建(含解析）

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高考生物二轮复习专题专练
(31)　 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
从“高度”上研究高考
[典例]　(2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为__________。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用____________酶将载体P切开，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coli DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的____________和______________。选用____________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_____________
____________________________________________________________。
[解析]　(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于A位点和B位点的外侧。(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入Xho Ⅰ和Pst Ⅰ两个酶切位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
[答案]　(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4 DNA　②启动子　终止子　Xho Ⅰ和Pst Ⅰ　钙　(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
从“深度”上提升知能
1．限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
2．基因表达载体的构建过程
从“宽度”上拓展训练
1．如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列(　 )
A．NdeⅠ和BamHⅠ　　　B．NdeⅠ和XbaⅠ
C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：选A　构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。
2．为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合(如图)，然后导入棉花细胞。下列相关叙述错误的是(　 )
A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因
B．与只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ同时处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C．在含卡那霉素培养基上可成活的棉花细胞就是导入了目的基因的棉花细胞
D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
解析：选C　由ACA、GNA、GNA-ACA的示意图可知，应用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因获得GNA-ACA融合基因，A正确；图中质粒与GNA-ACA融合基因上都含有Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞为成功转入目的基因的细胞或含有普通质粒的细胞，C错误；PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，D正确。
3．科学家从某细菌中提取抗烟草花叶病毒基因并转入烟草，来培育转基因抗病毒烟草。如图是转基因抗病毒烟草的部分培育过程，含目的基因的外源DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的切割位点。图中各种限制酶切割后均获得不同的黏性末端，下列有关说法错误的是(　 )
A．为了防止目的基因与质粒反向连接应使用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ切割
B．图中限制酶均能在它们识别序列的中轴线处切割DNA分子
C．图中所使用的质粒是农杆菌的Ti质粒
D．通过烟草花叶病毒的侵染实验可以检测转基因烟草是否培育成功
解析：选B　为了防止目的基因和质粒自身环化和反向连接，应选用EcoRⅠ和HindⅢ对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止反向连接，不使用SmaⅠ是因为其会破坏目的基因和标记基因，A正确；经限制酶沿识别序列的中轴线处切割DNA分子后产生的一般是平末端，若不在中轴线处切割DNA分子则产生黏性末端，B错误；重组质粒能够导入农杆菌进行增殖，所以图中所使用的质粒是农杆菌的Ti质粒，C正确；在个体水平上进行目的基因的检测与鉴定，可以进行抗病鉴定，所以通过烟草花叶病毒的侵染实验可以检测转基因烟草是否培育成功，D正确。
[微课微练·一点一评]
一、选择题
1．(2022·东城区一模)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述错误的是(　 )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上
解析：选B　蓝色玫瑰细胞质基质中的靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子1一同切除，故只能用BamH Ⅰ，B错误；sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。
2．(2022·辽宁三模)ACC合成酶是乙烯合成的关键酶，乙烯的合成会影响番茄的储藏和运输。如图为科学家利用ACC合成酶基因的反向连接构建载体，通过基因工程设计的耐储转基因番茄流程图。下列说法不正确的是(　 )
A．引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键
B．反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，限制了细胞内乙烯的合成
C．可以在培养基中加入氨苄青霉素和四环素，存活下来的细胞内则含有携带目的基因的质粒
D．设计双酶切处理目的基因及载体的目的是更好地保证目的基因的反向连接
解析：选C　引物能与ACC合成酶基因通过碱基互补配对结合定位ACC合成酶基因的位置，因此引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键，A正确；反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，使ACC合成酶基因不能正常表达，限制了细胞内乙烯的合成，B正确；从题图中可知，基因表达载体中ACC合成酶基因破坏了四环素抗性基因，因此含有携带目的基因质粒的细胞能在氨苄青霉素培养基中存活，但不能在四环素培养基中存活，C错误；设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好地保证目的基因的反向连接，D正确。
二、非选择题
3．(2022·菏泽一模)普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)，能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。科研人员通过构建反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如图：
(1)基因表达载体除图示组成外，还有复制原点、______________(答两个)等。①②过程中所用的限制酶分别是________________和________。
(2)PCR技术扩增β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)的原理是______________________，该过程需要根据GhMnaA2基因设计____种引物，为保证GhMnaA2插入到质粒2中，需在引物的______端添加限制酶识别序列。
(3)③过程中用酶切法可鉴定正、反义基因表达载体。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切割正义基因表达载体获得0.1 kb、3.75 kb、5.25 kb、8.6 kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切割反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是____________和____________。
(4)导入细胞内的反义GhMnaA2能阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长的原理是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)为什么不能用GhMnaA2探针进行DNA分子杂交来鉴定基因表达载体是否导入棉花细胞？____________________________________________________________________。
解析：(1)基因表达载体除了图示组成(启动子)外，还应包括复制原点、终止子、标记基因等。结合题图分析可知，①过程中所用的限制酶是HindⅢ、BamHⅠ②过程所用的限制酶是SmaⅠ。(2)PCR技术扩增目的基因的原理是DNA复制；该过程需要根据目的基因(GhMnaA2)两端部分核苷酸序列设计2种引物；DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5′端→3′端方向延伸，为保证GhMnaA2能插入到质粒2中，还需要在引物的5′端添加限制酶识别序列。(3)③过程中，用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切割正义基因表达载体获得0.1 kb、3.75 kb、5.25 kb、8.6 kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切割反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是0.1 kb＋5.25 kb＝5.35 kb、3.75 kb＋8.6 kb＝12.35 kb。(4)(5)参见答案。
答案：(1)终止子、标记基因　HindⅢ、BamHⅠ　SmaⅠ　(2)DNA复制　2　5′　(3)5.35 kb　12.35 kb　(4)由于反义GhMnaA2转录的mRNA能与棉花细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达(翻译)，故导入细胞内的反义GhMnaA2能阻止β-苷露糖苷酶合成，使棉纤维更长　(5)因为棉花细胞中本来就有GhMnaA2，不管是否导入都能与该探针发生碱基互补配对