压轴题05 生物技术与工程
生物技术是高考中的重要板块，包括基因工程、细胞工程以及发酵工程、PCR技术应用广泛,可用于新冠病毒的核酸检测等基本内容,是近几年高考试题的命题热点,在考试中经常会与细胞代谢、基因等进行综合考查，难度从简单到困难都有所涉及，需要考生在复习中认真对待。
1. （2022 山东卷）某种类型的白血病由蛋白引发，蛋白可使被蛋白酶识别并降解，药物可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白和。是缺失特定氨基酸序列的，是一种短肽，连接在或的氨基端，使融合蛋白能与含有抗体的介质结合，但不影响或的功能。
（1）为构建重组载体，需先设计引物，通过特异性扩增基因。用于扩增基因的引物需满足的条件是_________。为使产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_________（填“端”或“端”）。
（2）扩增得到的基因经酶切连接插入载体后，与编码的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“”为基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的序列正确，翻译出的融合蛋白中的氨基酸序列正确，但基因对应的氨基酸序列与不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________。修改扩增基因时使用的带有Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_________。
（3）融合蛋白表达成功后，将、、药物和按照图乙中的组合方式分成组。各组样品混匀后分别流经含抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用抗体检测，检测结果如图丙所示。已知和不能降解，由① ② ③ 组结果的差异推测，药物的作用是_________；由② ④ 组或③ ⑤ 组的差异推测，中缺失的特定序列的作用是_________。
（4）根据以上结果推测，药物治疗该病的机理是_________。
【答案】
（1）【答案】两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对；5'端
【解析】引物是能够与母链特定的碱基序列互补配对的单链核酸片段，由于扩增目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链端的碱基序列互补。聚合酶延伸时，将脱氧核苷酸加到引物的端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的端。
（2）【答案】在转录得到的序列中，Ⅰ识别序列的后两个碱基与基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致翻译时核糖体读取的密码子顺序发生改变，从而使翻译出的氨基酸序列改变；在Ⅰ识别序列前后增加碱基，使融合基因中基因的碱基数目加上基因的碱基数为的倍数，从而保证翻译时基因转录出的也能被正确读取
【解析】根据题意，融合基因转录出的序列正确，翻译出的融合蛋白中的氨基酸序列正确，但基因对应的氨基酸序列与不同，说明翻译基因相应的序列时出错。由图甲分析可知，在转录得到的序列（与编码链序列一致）中，Ⅰ识别序列的后两个碱基与基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致翻译时核糖体读取的密码子顺序发生改变，从而使翻译出的氨基酸序列改变。要解决这个问题，可以在扩增时在Ⅰ识别序列前后增加碱基，使融合基因中基因的碱基数目加上基因的碱基数为的倍数，从而保证翻译时基因转录出的也能被正确读取。
（3）【答案】促进与的结合；中缺失的特定序列是与结合的关键序列
【解析】根据图乙分析可知，① 组仅添加，用抗体检测，不出现杂交带；② 组添加和，检测出现杂交带；③ 组添加C、药物和，杂交带更加明显，说明药物的作用是促进与的结合。② ④ 组未添加药物，两组的差异在于添加或；③ ⑤ 组添加了药物，两组的差异也在于添加或；结合图丙可知，② ③ 组使用，出现杂交带；④ ⑤ 组使用，不出现杂交带，据此推测中缺失的特定序列是与结合的关键序列。
（4）【答案】药物促进与的结合，从而促进蛋白被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
【解析】根据（3）的分析推测，药物促进与的结合，从而促进蛋白被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
2. （2022 辽宁卷）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．蛋白胞外段抗原制备，流程如图所示：
Ⅱ．蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图所示：
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是_________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 _________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由_________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化蛋白胞外段。
（3）用蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用_________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的_________中培养，离心收集小鼠的淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到孔板，进行_________培养。用_________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集_________，提取单克隆抗体。
（5）利用蛋白胞外段抗体与药物结合，形成_________，实现特异性治疗。
【答案】
（1）【答案】用于筛选病毒包装细胞 双分子层中
【解析】构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是在含有氨苄青霉素的培养基可以筛选出病毒包装细胞，脂质体是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体双分子层中。
（2）【答案】核酸和蛋白质
【解析】质粒在包装细胞内组装出由核酸和蛋白质组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化蛋白胞外段。
（3）【答案】胰蛋白 二氧化碳培养箱
【解析】小鼠脾组织用胰蛋白酶处理，使其分散，制成细胞悬液，置于含有混合气体（空气和二氧化碳）的二氧化碳培养箱中培养。
（4）【答案】单独 抗原—抗体 细胞培养液
【解析】用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到孔板，每个孔尽量只接种一个杂交细胞，进行单独培养，利用抗原—抗体杂交法筛选，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。
（5）【答案】（抗体—药物偶联物）
【解析】利用蛋白胞外段抗体与药物结合，形成（抗体—药物偶联物），实现特异性治疗。
3. （2021 江苏卷）某小组为研究真菌基因的功能，构建了融合表达蛋白和标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
（1）目的基因的扩增：
① 提取真菌细胞_________，经逆转录获得，进一步获得基因片段。
② 为了获得融合标签的蛋白，设计引物时，不能包含基因终止密码子的编码序列，否则将导致__________________。
③ 热启动可提高扩增效率，方法之一是：先将除聚合酶（酶）以外的各成分混合后，加热到以上再混入酶，然后直接从开始扩增，下列叙述正确的有_________。
．酶最适催化温度范围为
．与常规相比，热启动可减少反应起始时引物错配形成的产物
．两条子链的合成一定都是从端向端延伸
．产物碱基序列的特异性体现了酶的特异性
（2）重组质粒的构建：
① 将Ⅰ切开的载体与添加同源序列的混合，用特定酶处理形成黏性末端，然后降温以促进__________________，形成结合体。将结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的聚合酶及_________酶等，完成质粒的环化。
② 若正确构建的重组质粒仍能被Ⅰ切开，则Ⅰ的酶切位点可能在___________________________。
（3）融合蛋白的表达：
① 用含有尿嘧啶的培养基培养基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________________。
② 若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含标签，说明___________________________，后续实验可借助标签进行蛋白的分离纯化。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的是否插入目的基因分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）【答案】；蛋白上不含标签；
【解析】① 以逆转录获得的方式，要先从真菌细胞中提取基因转录出来的。
② 从构建好的重组质粒上看，序列位于目的基因下游，若基因的转录产物上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对序列的转录产物继续进行翻译，蛋白上就不含标签。
③．从题干信息可知，“以上再混入酶，然后直接从开始扩增”，故酶最适催化温度范围为左右，错误；
．反应的最初加热过程中，样品温度上升到之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，正确；
．分子复制具有方向性，都是从端向端延伸，正确；
．酶没有特异性，与普通的聚合酶相比，酶更耐高温，错误。
故选。
（2）【答案】黏性末端碱基配对；连接；基因的连接处、基因的内部
【解析】① 从图上看，载体只有一个的酶切位点，故被切开后，载体由环状变为链状，将切开的载体与添加同源序列的混合，用特定酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体与添加同源序列的的黏性末端碱基互补配对。将结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的聚合酶及连接酶等，完成质粒的环化。
② 重组质粒中，载体被切开的位置已经与基因相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒仍能被切开，则的酶切位点可能在基因的连接处或基因内部。
（3）【答案】受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有基因可以长成菌落；融合基因表达（或融合基因正确解码）
【解析】① 筛选目的菌株的机理是：导入了质粒的目的菌株由于含有基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而基因缺失型酵母则不能存活。
② 若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含标签，位于标签上游的基因应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
4. 中国对杏树的栽培已有两千年以上的历史，但对杏果的利用一直停留在鲜食果肉或杏仁上。研究人员不断创新开发，成功酿制出杏果酒，其艳泽淡黄、果香浓郁、营养丰富；检测发现果酒中黄酮达，是目前天然可食植物制品黄酮含量最高的饮品，有抗癌防衰老的性能，突出的功能型饮品。回答下列问题。
（1）杏果酒酿制利用的微生物是_________。发酵生产果酒的过程中，每隔一段时间要进行放气操作，其主要目的是_________。在制作杏果酒中绝大多数其他微生物生长受到抑制的原因是_________。
（2）酿制杏果酒时，需要将温度控制在，温度过高和氧气逸入会导致杏果酒容易变酸，原因是___________________________。
（3）在葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。为了解皮渣中微生物的数量，取皮渣加入无菌水，混匀，用_________（填一种实验仪器）将稀释液均匀接种于培养基表面。倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为、和，则每克皮渣中微生物数量为_________个。
（4）某同学在制作杏醋时，加入醋酸菌液过程中有可能混入乳酸菌（不考虑其他杂菌）。从培养条件的角度分析，请用稀释涂布平板法设计实验，检测是否混入了乳酸菌（注：乳酸菌和醋酸菌的菌落形态相似）。写出大体实验思路并预测实验结果：_________。
【答案】
（1）【答案】酵母菌；排出发酵过程中产生的二氧化碳；在缺氧、呈酸性的发酵液中，绝大多数其他微生物都无法适应这一环境而受到抑制
【解析】酵母菌无氧呼吸产生酒精，所以杏果酒酿制利用的微生物是酵母菌。放气操作是为了排出发酵过程中产生的二氧化碳。在缺氧、呈酸性的发酵液中，绝大多数其他微生物都无法适应这一环境而受到抑制，所以在制作杏果酒中绝大多数其他微生物生长受到抑制。
（2）【答案】较高温度的有氧环境有利于产酸的杂菌生长
【解析】较高温度的有氧环境有利于产酸的杂菌生长，所以酿制杏果酒时，需要将温度控制在，无氧环境。
（3）【答案】涂布器
【解析】稀释涂布平板法需要用涂布器接种微生物。倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为、和，则三个平板中平均菌落数为，每克皮渣中微生物数量为个。
（4）【答案】用稀释涂布平板法制备该醋酸菌液的若干平板，将平板置于无氧环境下继续培养，观察平板上的菌落情况，若平板上有菌落形成则说明混入乳酸菌；反之，则没有混入乳酸菌
【解析】由于乳酸菌是厌氧菌，醋酸菌是好氧菌，所以检测是否混入了乳酸菌的实验思路为：用稀释涂布平板法制备该醋酸菌液的若干平板，将平板置于无氧环境下继续培养，观察平板上的菌落情况，若平板上有菌落形成则说明混入乳酸菌；反之，则没有混入乳酸菌。
5. 氮浓度过高是引起水体富营养化的主要原因之一，严重影响了水生生物的正常生长。为此，科研人员分离纯化出三类细菌，通过这三类细菌的作用，将水体中过量的铵盐、亚硝酸盐及硝酸盐转化为氮气释放到大气中，从而降低了水体的富营养化，反应过程如图，回答下列相关问题：
（1）科研人员在配制筛选亚硝化细菌的培养基时以________________为唯一氮源，采用 ________________方法对培养基进行灭菌。
（2）在培养亚硝化细菌过程中需进行振荡培养，目的是________________________________，培养若干天后，应选择培养瓶中亚硝酸盐含量________________的培养液，采用________________法将其接种于含有格里斯试剂的固体培养基上（注：格里斯试剂可与亚硝酸盐反应生成红色物质），得到分布均匀的单菌落，再选择周围出现红色较深的单菌落，经液体培养使亚硝化细菌的数量进一步扩增。在上述过程中选择周围出现红色较深的单菌落的原因是________________________________________________________________________________________________。
（3）在上述研究的基础上，科研人员又筛选并纯化得到反硝化细菌株，对其产气能力和培养液中硝酸盐含量（用总氮表示）的测定结果如下，据此分析，科研人员在选择反硝化细菌用于水体净化时最好选择________________号菌株，原因是___________________________________。
培养时间
产气情况 产气 产气 产气
菌株 ，，， ，，， ，，，
【答案】
（1）【答案】铵盐 高压蒸汽灭菌
【解析】由题干信息分析可知，该实验的目的是筛选亚硝化细菌的培养基，则培养基配置时应以硝酸盐作为唯一氮源，接种前使用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
（2）【答案】使目的菌与培养液中成分充分接触，增大培养液中含量；显著升高；稀释涂布平板；单菌落周围红色越深（生成的红色物质越多），说明亚硝化细菌转化生成的亚硝酸盐量越高（转化效率越高）
【解析】在培养亚硝化细菌过程中需进行振荡培养，使目的菌与培养液中成分充分接触，增大培养液中含量。因为亚硝化细菌可以将转化为亚硝酸盐，故应选择培养瓶中亚硝酸盐含量显著升高的培养液，由于得到的是分布均匀的单菌落，所以应采用稀释涂布平板法将菌种接种于含有格里斯试剂的固体培养基中。上述过程中选择周围出现红色较深的单菌落的原因是亚硝化细菌可以将转化为亚硝酸盐，而亚硝酸盐可以与格里斯试剂反应生成红色物质，所以红色越深说明产生的亚硝酸盐越多，则亚硝化细菌将转化为亚硝酸盐的能力越强。
（3）【答案】；菌株的产气能力强、降解硝酸盐能
【解析】菌株的产气能力强、降解硝酸盐能力最强，表明其反硝化作用能力最强，故在选择反硝化细菌用于水体净化时最好选择号菌株。
6. 中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友团队提出了一种利用多重基因编辑技术以红果番茄（双子叶植物）为材料，快速定向创制七种不同果色番茄材料的策略。该研究利用多重基因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素合成或代谢的关键基因。下图是科研人员用基因编辑技术定点敲除目标基因的示意图，请回答下列问题：
（1）系统能精准识别相关基因，依据的原理是________________发生碱基互补配对；蛋白能使目标中的________________（填化学键名称）断裂，从而实现对________________（选填“单链”、“双链”、“单链”、“双链”）的剪切。若要插入其他基因，可以利用________________酶将它们连接起来。
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用的方法是________________。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并________________________________，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞具有全能性，在一定的营养和激素等条件下，可以经过 ________________ 的过程形成愈伤组织。当培养基中的________________时，主要诱导根原基的形成。
（4）五彩缤纷的水果和蔬菜不仅给人以美的视觉享受，还能提高消费者的购买欲。在培育彩色番茄的同时我们还需要考虑该策略对番茄的________________等性状无影响。
【答案】
（1）【答案】向导与目标 磷酸二酯键 双链 连接
【解析】由图可知，向导与目标有相应的识别序列能特异性结合，使得系统能精准识别相关基因。蛋白相当于限制性内切酶，能使目标中的磷酸二酯键断开，从而实现对双链的剪切。连接酶具有连接片段的功能。
（2）【答案】农杆菌转化法；将其插入到植物细胞中的染色体的上
【解析】将目的基因导致植物受体细胞，常用农杆菌转化法。该方法可将目的基因插入到植物细胞中的染色体的上。
（3）【答案】脱分化 生长素含量高于细胞分裂素
【解析】高度分化的番茄体细胞经脱分化可形成愈伤组织。当培养基中生长素含量高于细胞分裂素时，主要根的分化，当生长素含量低于细胞分裂素时，主要诱导芽的分化。
（4）【答案】单果重、单株产量、维生素含量等
【解析】在培育番茄等农产品时，除了要农产品颜色好看，给与人们视觉享受外，还应考虑产量和营养成分等，所以要考虑该策略对番茄的单果重、单株产量、维生素含量等性状有无影响。
7. 疫苗接种是当前新冠肺炎疫情防控工作的一项重要举措。重组腺病毒疫苗研发策略是：将新冠病毒的蛋白基因整合到腺病毒中，形成表达蛋白的重组腺病毒，注射到健康人体内，腺病毒可侵染人体细胞，达到预防新冠病毒感染的效果。回答下列问题。
（1）由于腺病毒分子较大，需采取图所示方法获得重组腺病毒。即：将质粒和质粒共同导入受体细胞中，最终重组在线性分子上，据图推测，所示的原件应该为________________。
（2）将上述重组线性分子（不编码病毒复制必需的蛋白）导入到能表达人体细胞没有的蛋白的细胞系，最终包装成完整的腺病毒。这种方式生产的疫苗由于重组腺病毒________________，从而提高了疫苗的安全性。
（3）重组腺病毒疫苗________________（填“含有“或“不含有“）有活性的病毒。注射进入人体后可经过________________（填“转录”“翻译”或“转录及翻译”）产生相应蛋白发挥抗原作用。人体接种该疫苗后，免疫系统会产生相应的抗体及后者在新型冠状病毒进入人体时，可迅速________________，引发强烈特异性免疫反应。
（4）为了检测疫苗的效果，科学家用不同方式给雪貂接种重组腺病毒疫苗后，感染新冠病毒。一段时间后检测新冠病毒含量，结果如图，说明重组腺病毒疫苗________________，且效果最好的免疫方式是________________。
【答案】
（1）【答案】抗性基因
【解析】根据以上分析可知，图示方法获得重组腺病毒将质粒和质粒共同导入受体细胞中，通过质粒与质粒的左臂和右臂之间的片段互换实现的，故可知质粒的左臂与右臂之间含基因的片段代替了质粒左臂与右臂之间的抗性基因，故对应重组线性分子中的为抗性基因。
（2）【答案】（不编码蛋白从而）不能在人体细胞中复制
【解析】根据题意可知，重组线性分子中不含病毒复制必需的蛋白基因，人体细胞中也不含有蛋白，而作为载体的细胞系中能够表达蛋白，故将这样获得的重组腺病毒疫苗，能够在载体中进行复制，诱导刺激人体产生免疫反应，但无法在人体的宿主细胞内复制，提高了疫苗的安全性。
（3）【答案】不含有 转录及翻译 增殖与分化
【解析】根据重组腺病毒疫苗的构建过程可知，该疫苗不含有活性病毒，但是含有病毒的蛋白基因，因此注射进入人体后可经过转录及翻译过程产生蛋白发挥抗原作用。记忆细胞再次遇到相同抗原时，会迅速增殖与分化，引发强烈特异性免疫反应。
（4）【答案】能有效抑制新冠病毒的复制 滴鼻和口服
【解析】分析题图可知，通过滴鼻和口服、肌肉注射两种方式接种重组腺病毒疫苗的雪貂对比对照组，均能够使雪貂产生对新冠病毒的免疫能力；且题图中显示滴鼻和口服组的新冠病毒相对含量始终最低，说明该免疫方式效果最好。
8. 聚赖氨酸（）能抑制多种微生物的活性，且人体可将其分解为赖氨酸，是一种优良的天然食品防腐剂。科研人员欲从土壤中分离能分泌 的微生物，做了如图所示的实验（Ⅰ表示过程，①③ 表示菌落），已知可使亚甲基蓝褪色，形成透明圈。
（1）实验中需注意无菌操作，下列需要灭菌处理的是_________。（多选）
．土样
．甲培养基
．接种环
．涂布器
（2）图中第Ⅰ步最常用的接种方法是_________。甲培养基能提供目的菌所需的全部营养，其中包括水、碳源、氮源和_________等营养物质。
（3）通过步骤Ⅱ能筛选出产的菌种，因此，乙培养基属于_________培养基，在进行第Ⅲ步接种时，应挑选_________（①②③ ）号菌落。步骤Ⅳ的目的是___________________________。
（4）为检测上述收集到的对不同种类微生物的抑制能力，研究人员将大肠杆菌等菌种分别涂布于某培养基表面，再将浸有不同浓度 的滤纸圆片置于平板培养基表面，培养后测量清晰区的宽度，结果如下表。
清晰区宽度 浓度
微生物 大肠杆菌
沙门氏菌
酿酒酵母
红曲霉
注：“”表示无清晰区，“”表示未进行实验。
结果显示对_________的抑制作用最强，且对四种微生物的抑制效果与浓度_________（正相关负相关）。为使结果更具说服力，还应增加__________________实验。
【分析】1、在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐。另外还需要满足微生物生长对、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的调至酸性，培养细菌时需将调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
2、微生物常见的接种的方法：
① 平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
② 稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养基表面，经培养后可形成单个菌落。
（1）【答案】
【解析】实验中需注意无菌操作，为了防止杂菌污染，实验中所使用的器具、培养基都需要灭菌，土样中含有目的菌株，不能灭菌，否则会杀死目的菌株，培养基需要高压蒸汽灭菌法进行灭菌，接种环和涂布器需要灼烧灭菌。
故选：。
（2）【答案】稀释涂布平板法 无机盐
【解析】由图观察可知，图中菌落均匀分别在培养基表面，故图中第Ⅰ步最常用的接种方法是稀释涂布平板法。甲培养基能提供目的菌所需的全部营养，其中包括水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
（3）【答案】选择；① 分离能分泌的微生物
【解析】通过步骤Ⅱ能筛选出产的菌种，因此，乙培养基属于选择培养基，由图观察可知，图中① 号菌落的透明圈最大，已知可使亚甲基蓝褪色，形成透明圈，这说明透明圈越大，产的能力越强，故在进行第Ⅲ步接种时，应挑选① 号菌落。步骤Ⅳ是利用平板划线法获得单个菌落，其目的是分离能分泌的微生物。
（4）【答案】酿酒酵母；正相关；增加空白对照组增加浓度大于的实验组增加浓度小于的实验组
【解析】由表格中的数据分析可知，在不同浓度的处理下，酿酒酵母清晰区的宽度最大，这说明对酿酒酵母的抑制作用最强，对四种微生物的抑制效果均是随浓度增加，抑制作用增强，因此抑制效果与浓度呈正相关。为使结果更具说服力，还应增加空白对照组，以检验是否有杂菌污染或培养基是否灭菌彻底。
9. 普通棉花中含甘露糖苷酶基因（），能在纤维细胞中特异性表达，产生的甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如图。请分析回答：
（1）纤维细胞启动子的元素组成为_________，基因表达载体除了图示组成外，至少还有__________________等（至少答两个），不能使用质粒中花椰菜病毒启动子的原因是______________________________________________________。
（2）技术扩增甘露糖苷酶基因需要根据_________设计特异性引物序列，假设开始时模板数量为个，扩增个循环，理论上需要的引物数量_________，只含目的基因的片段数量为_________。为保证能插入到质粒中，还需要在引物的_________端添加限制酶识别序列。
（3）为什么不能用探针进行分子杂交来鉴定基因表达载体是否导入棉花细胞？______________________________________________________。
（4）③ 过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用Ⅰ酶和Ⅰ酶切割正义基因表达载体获得、、、四种长度的片段，则用酶切反义基因表达载体获得片段的长度应是_________________和_________________。
（5）导入细胞内的反义能阻止甘露糖甘酶合成，使棉纤维变长的原理是_____________________________________________。
【答案】
【分析】分析题图：① 和② 过程表示基因表达载体的构建过程，在② 过程中，纤维细胞启动子前后含有限制酶 Ⅲ和 Ⅰ的切割位点，因此可以用这两种酶切割；② 是构建反义基因表达载体的过程，反义基因前后有限制酶 Ⅰ的切割位点，因此可以用该酶切割获取目的基因；③ 是扩增、鉴定、筛选反义表达载体；④ 是利用农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞；最后采用植物组织培养技术将受体细胞培养形成植物体。
（1）【答案】、、、、；复制原点、终止子、标记基因；纤维细胞中的聚合酶不能识别和结合花椰菜病毒启动子，反义不能转录产生
【解析】启动子位于基因的首端，是一段特殊的序列，故其基本组成单位是种脱氧核苷酸，元素组成为、、、、；基因表达载体除了图示组成（启动子和目的基因）外，还应包括复制原点、终止子、标记基因，纤维细胞中的聚合酶不能识别和结合花椰菜病毒启动子，反义不能转录产生，不能阻止甘露糖甘酶合成，使棉纤维变长。
（2）【答案】两端部分核苷酸序列；；；
【解析】技术扩增目的基因的原理是复制；该过程除需要根据目的基因（）两端部分核苷酸序列；个分子扩增次需要个引物，若将个分子扩增次，则需要在缓冲液中至少加入个引物，只含目的基因的片段数。开始时模板数量为个，则扩增个循环，理论上需要的引物数量为，只含目的基因的片段数量为（）个。聚合酶只能使新合成的子链从方向延伸，为保证能插入到质粒中，还需要在引物的端添加限制酶识别序列。
（3）【答案】因为棉花细胞中本来就有，不管是否导入都能与该探针发生碱基互补配对
【解析】因为棉花细胞中本来就有，不管是否导入都能与该探针发生碱基互补配对，故不能用探针进行分子杂交来鉴定基因表达载体是否导入棉花细胞。
（4）【答案】
【解析】③ 过程中，用 Ⅰ酶和 Ⅰ酶切正义基因表达载体获得、、、四种长度的片段，则用 Ⅰ酶切反义基因表达载体获得片段的长度应是、。
（5）【答案】反义转录的能与棉花细胞内的转录的互补配对，从而抑制基因的表达（翻译）
【解析】由于反义转录的能与棉花细胞内的转录的互补配对，从而抑制基因的表达（翻译），故导入细胞内的反义能阻止甘露糖甘酶合成，使棉纤维更长。
10. 噬菌体辅助连续进化技术（）将生物分子的实验室进化与噬菌体的生命周期结合在一起（该噬菌体的生命周期仅为分钟），使实验室中生物分子的进化速度提高了倍。该技术有望让制药业使用实验室培育出来的蛋白质、核酸等成分按需制药。
噬菌体的增殖依赖于Ⅱ蛋白。技术，首先用某目的基因替换原来的Ⅲ蛋白基因，构建含有目的基因的Ⅲ蛋白缺陷型噬菌体（），然后用侵染培养池中的宿主E.（其质粒中含有与目的基因活性相关联的Ⅲ蛋白基因）。必须进化出有效突变才能启动质粒上Ⅲ蛋白基因的表达，噬菌体才能获得增殖能力并持续侵染其他宿主，从而实现连续进化（过程如图所示）。
请回答以下问题：
（1）获取目的基因后，常用_________技术对其进行快速扩增。构建Ⅲ蛋白缺陷型噬菌体（）的遗传改造过程需要用到的工具酶有__________________，侵染宿主的过程相当于基因工程基本操作程序中的___________________________。
（2）宿主的辅助质粒（）包含有与目的基因活性相关联的Ⅲ蛋白基因，是为了对噬菌体（）进行_________。除此之外，还应包含有_________才能驱动目的基因转录出。
（3）研究人员向的培养池不断引流入新鲜的宿主细胞，并设置培养液流出速度稍快于宿主细胞的增殖速度，其目的是_________________________________________。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的是否插入目的基因——分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了——分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）【答案】；限制酶、连接酶；将目的基因导入受体细胞
【解析】的原理是复制，故目的基因快速扩增方法为（或聚合酶链式反应）技术。基因表达载体的构建过程中需要用到的工具酶有限制性内切酶、连接酶，侵染宿主的过程相当于基因工程基本操作程序中的将目的基因导入受体细胞。
（2）【答案】筛选 启动子
【解析】包含有与目的基因活性相关联的Ⅲ蛋白基因，是为了对噬菌体进行筛选，筛选出有效灾变的噬菌体。启动子是聚合酶识别和结合的位点，能启动转录，要包含有启动子才能驱动目的基因进行转录。
（3）【答案】使获得有效突变的噬菌体在培养池中富集并进行连续进化
【解析】噬菌体是病毒，必须寄生于活细胞才能生存，设置培养液流出速度稍快于宿主细胞的增殖速度，是为了使获得有效突变的噬菌体在培养池中富集并进行连续进化。
11.突变体是研究功能基因组的前提，转座子是基因组中可以移动的序列。科研人员将玉米转座子进行改造，改造后的转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力。转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，只有同时存在和时，才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复。现将玉米转座子引入到水稻的中，构建水稻突变体库，并从中筛选到稳定遗传的矮秆突变株，实验流程如图。
请回答下列问题：
（1）科研人员将和分别导入水稻细胞，获得和的转化植株。
① 首先将构建的转座载体和转座载体分别与_________混合培养。
② 取水稻未成熟种子，消毒后接种于含有植物激素和___________________________的培养基上，诱导产生愈伤组织。因愈伤组织具有__________________特点，常作为基因工程的理想受体材料。
③ 将完成转化的愈伤组织接种于含有_________的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即代。
（2）为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选单拷贝插入，但没有表型突变的和转基因植株，杂交获得代。通过技术从中筛选出目标植株（转座子插入法构建的突变体库中的植株），理论上目标植株占个体总数的_________。请从图中任选一种目标_________（填或），画出其相应亲本植株的基因组成及在染色体的位置。
（3）目标代植株自交获得代，可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体，理由是____________________________________。研究发现有些发生转座的植株并没有表型的变化，请分析原因_______________________________________________________________。
（4）科研人员在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有而无的植株，目的是________________________________，并用做标签在基因组中定位且分离出矮秆基因。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的是否插入目的基因分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因突变与生物性状的关系：
（1）如果基因突变发生在基因的内含子上，在成熟中根本就没有这段序列的话，则很有可能不会改变性状；
（2）由于密码子的简并性（几个密码子都可以编码一个氨基酸的现象），一个碱基突变后，可能其氨基酸还是不变的，这样性状也不会改变；
（3）能合成蛋白的氨基酸可以分成几大类，其中有些氨基酸的性质是很相似的，这些氨基酸互换后对整个蛋白的性质影响不大，或没有影响；
（4）即使突变后的基因产物（蛋白质）的性质发生了改变，还有可能出现一个情况，就是此基因在生物体内有多个拷贝，这样一个基因出现了问题，其他基因补充其不足，还是可以维持相关功能；
（5）性状除了受到基因的控制外还与环境因素有关。
（1）【答案】① 农杆菌
② 蔗糖、大量元素、微量元素、维生素类、琼脂、水；分化程度低，分裂旺盛
③ 潮霉素
【解析】① 识图分析可知，图中构建的基因表达载体用到了质粒，据此推测导入受体细胞选择的是农杆菌转化法，因此首先将构建的转座载体和转座载体分别与农杆菌混合培养。
② 植物组织培养需要的条件，培养基中除了含有植物激素外，还需要一定的营养物质，包括：蔗糖、大量元素、微量元素、维生素类、琼脂、水，诱导产生愈伤组织。愈伤组织是高度液泡化、无定型状态的薄壁细胞，因此其具有分化程度低、分裂能力强的特点，常作为基因工程的理想受体材料。
③ 识图分析可知，构建的基因表达载体中都含有潮霉素抗性基因作为标记基因，因此完成转化的愈伤组织细胞具有潮霉素抗性，可以将其接种于含有潮霉素的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即代。
（2）【答案】；
【解析】根据题意可知，为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选单拷贝插入，但没有表型突变的和转基因植株，即只有插入到一条染色体上的植株和只有插入到另外一条染色体（与插入染色体为同源染色体或者非同源染色体上）上的植株，则植株的基因型如图：或，二者杂交获得代，通过技术从中筛选出目标植株（转座子插入法构建的突变体库中的植株），则植株的基因型为：，那么理论上目标植株占个体总数的。
（3）【答案】第一空：未发生转座时除草剂抗性基因不能正常表达，只有在发生转座后，除草剂抗性基因才会表达
第二空：①插入基因之间的序列，不影响基因的表达；
②插入基因的内含子区域，无突变表型的出现；
③ 某些基因需要外界环境的刺激，才能产生应答表型；
④插入基因的编码序列中，但没有发生移码突变或没有改变编码功能蛋白质的核心氨基酸序列；
⑤ 插入的基因，其功能可通过基因网络的其他路径得以实现
【解析】识图分析可知，构建的含有的基因的表达载体中，基因插入到除草剂抗性基因中，转化得到植株后，经过杂交筛选得到目标代植株，根据题意，同时存在和时，才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复，因此目标代植株自交获得代，未发生转座时除草剂抗性基因不能正常表达，只有在发生转座后，除草剂抗性基因才会表达，故可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体。根据以上分析的关于基因突变与性状的关系可知，发生转座的植株的表型可以没有发生变化，其原因有：①插入基因之间的序列，不影响基因的表达；②插入基因的内含子区域，无突变表型的出现；③ 某些基因需要外界环境的刺激，才能产生应答表型；
④插入基因的编码序列中，但没有发生移码突变或没有改变编码功能蛋白质的核心氨基酸序列；⑤ 插入的基因，其功能可通过基因网络的其他路径得以实现。
（4）【答案】使矮秆突变的性状可以稳定遗传
【解析】根据题意，转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力。转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有而无的植株，则该植株的基因不能转移，那么使矮秆突变的性状可以稳定遗传。
12.幽门螺杆菌（）是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，该菌的基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备疫苗。已知基因表达时，双链的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图；四种限制酶及其识别序列如图；三种质粒如图，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图。回答下列问题：
（1）基因终止子序列位于图中的_________区段，该基因转录时，编码起始密码子的序列位于图中的_________区段。
（2）转录产生的前个碱基序列为_________（方向为）。若通过技术大量扩增基因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是_________（方向为，写出端个碱基序列）。
（3）据图、、分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是_________，最适合用作载体的质粒是_________。
（4）图中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的线毡布压在培养基的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基上、结果如图所示）。培养基、中应分别添加_________，符合实验要求的菌落是_________（填写数字），判断依据是_____________________________________________。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的 是否插入目的基因 分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了 分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）【答案】非编码区2 编码区
【解析】在真核细胞的基因结构中，包括编码区和非编码区，其中编码区又分为外显子和内含子，基因的非编码区存在启动子和终止子，启动子和终止子都是一段特殊的序列，属于基因的非编码区，分别位于编码区的上游和下游，所以终止子位于非编码区，基因特录时，起始密码子位于编码区内，紧接着'端。
（2）【答案】
【解析】根据碱基互补配对的原则，与模板连互补，所以转录前个碱基序列为'，利用技术扩增过敏基因的编码区段时，设计引物序列的主要依据是过敏基因编码区两端的部分核苷酸序列，按照碱基互补配对原则，与已知链对应的应为'。
（3）【答案】Ⅰ、Ⅰ 质粒
【解析】基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等，选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，且不破坏目的基因和标记基因；图中质粒上有Ⅰ的酶切位点位于启动子的上游，Ⅰ和Ⅰ的酶切位点会破坏抗性基因，Ⅰ酶切后的黏性末端与Ⅰ酶切黏性末端相同，可能使质粒中的启动子丢失，因此质粒不适合做载体的质粒。质粒上的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，Ⅰ和Ⅰ的酶切位点会破坏抗性基因，Ⅰ酶（单一酶）切后可导致质粒的自身环化和随意连接，故不适合做载体的质粒。质粒上有个的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，Ⅰ的酶切位点会破坏抗性基因，Ⅰ和Ⅰ酶切后的黏性末端不同，可避免质粒的自身环化和随意连接，故质粒是适合做载体的质粒。
（4）【答案】潮霉素、氯霉素；、；菌落、在含潮霉素培养基中能生长，但在含氯霉素培养基中不能生长，说明含有因插入目的基因而丢失氯霉素抗性基因的重组质粒
【解析】为筛选出含有目的基因大肠杆菌（因为该大肠杆菌带有潮霉的抗性基因，氯霉素的抗性基因丢失），故培养基中添加潮霉素和氯霉素，符合要求的菌落，应该能在含有潮霉素的培养基上生长，但不能在含有氯霉素的培养基上生长，依据是Ⅰ和Ⅰ酶切后切除掉了氯霉素抗性基因。
13. 对微生物进行筛选和鉴定时，常用到观察噬菌斑和抑菌圈的方法。分析以下两个实验，回答相关问题：
Ⅰ．噬菌斑，即噬菌体侵染细菌细胞导致宿主细胞溶解死亡时在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑。研究人员欲证明在含有多种噬菌体的原液（溶液）中存在能裂解大肠杆菌的噬菌体，基本步骤如下：
步骤 具体操作
1．培养基制备 制备牛肉膏蛋白胨培养基并灭菌，加入一定量的大肠杆菌
2．获得裂解液 取适量溶液与步骤中培养基混合，适宜温度下振荡培养充足时间后，离心管中离心，得到含噬菌体的裂解液
3．噬菌体检测 在牛肉膏蛋白胨培养基上加入大肠杆菌菌液，将菌液均匀涂布在培养基表面，稍后再向培养基表面分别滴加数小滴裂解液。将平板置于下培养一段时间
Ⅱ．肺结核通常是由结核杆菌感染引发的一种疾病，为比较甲、乙、丙三种药物对肺结核的疗效，科研人员进行了药敏实验，是某种药物对测试菌的最低抑制浓度。实验结果如图所示，其中、、、分别为浸过无菌水、相同浓度的甲、乙和丙的滤纸片。图中深色部分代表抑菌圈，是不生长细菌的地方。
（1）从培养基的物理性质来看步骤中制备的是________培养基，步骤中所用的是_________培养基。培养基与培养皿等器具按要求所采用的灭菌法 _______________（填“相同”或“不同”）。
（2）此实验的预期结果及结论是________。
（3）可用________（填工具名称）将结核杆菌培养液均匀涂布在固体培养基表面进行培养，该培养皿接种菌种并贴上滤纸片后，应________（填“倒置”或“正置”）于条件下培养。由上图可知，三种药物中________（填“甲”“乙”或“丙”）的数值最小，原因是________。
【答案】
【分析】1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生
长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对、特殊营养物质和氧气的要求；
2、实验室常用的灭菌方法：
① 灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
② 干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
③ 高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为，温度为的条件下，维持。
（1）【答案】液体 固体 不同
【解析】由实验步骤可知，取适量溶液与步骤中培养基混合，这说明步骤制备的培养基是液体培养基；步骤中需要将菌液涂布到培养基表面，则所用的培养基是固体培养基。培养基通常使用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，而培养皿等器具通常利用干热灭菌法进行灭菌，故二者按要求所采用的灭菌法不同。
（2）【答案】培养基滴裂解液处有噬菌斑形成，证明裂解液中有侵染大肠杆菌的噬菌体
【解析】由题干信息分析可知，该实验的目的是证明在含有多种噬菌体的原液（溶液）中存在能裂解大肠杆菌的噬菌体，据此推测该实验的预期结果和结论为培养基滴裂解液处有噬菌斑形成，证明裂解液中有侵染大肠杆菌的噬菌体。
（3）【答案】涂布器；倒置；丙； 同浓度下形成的抑菌圈最大
【解析】可用涂布器将结核杆菌培养液均匀涂布在固体培养基表面进行培养，该培养皿接种菌种并贴上滤纸片后，应倒置于条件下培养，这样既能防止培养基中水分过快蒸发，又能防止冷凝形成的水珠倒流污染培养基。由图分析可知，形成的抑菌圈最大，对应的是丙，故在相同浓度时，三种药物中丙形成的抑菌圈最大，因此丙的数值最小。
14. （2022 海南卷）以我国科学家为主的科研团队将（即个基因的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（），诱导其重编程为诱导多能干细胞（），再诱导分化为诱导原始生殖细胞（），然后将注射到孵化天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。
（1）是从孵化天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用_________________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加_________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）体外获取的方法有___________________________（答出种即可）。若要在中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和_________等。启动子是__________________识别和结合的部位，有了它才能驱动______________________________________________________。
（3）细胞和细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是____________________________________。
（4）诱导细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是_________________________________。
（5）该实验流程中用到的生物技术有____________________________________________________（答出点即可）。
【分析】胚胎干细胞（细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为细胞样的细胞，即细胞。
（1）【答案】胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 动物血清
【解析】动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，使细胞分散为单个细胞，获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中添加动物血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）【答案】技术、人工合成法；终止子；聚合酶；目的基因转录出，最终表达出所需要的蛋白质
【解析】体外获取目的基因（）可通过扩增或人工合成法完成。基因表达载体中应包含目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊的序列，是聚合酶识别和结合的部位，具有启动子才能驱动基因转录出，最终获得所需蛋白质。
（3）【答案】基因的选择性表达
【解析】据图可知，由细胞诱导形成细胞经过了细胞分化，其根本原因是基因的选择性表达。
（4）【答案】诱导细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（），再诱导分化为诱导原始生殖细胞（）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。
【解析】诱导细胞技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（），再诱导分化为诱导原始生殖细胞（）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。
（5）【答案】基因工程、动物细胞培养
【解析】该实验流程中将基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。
15. （2022 天津卷）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1）如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体中含有（卡那霉素抗性基因）和两个标记基因，为去除筛选效率较低的，应选择引物_________和_________，并在引物的_________（）端引入Ⅰ酶识别序列，进行扩增，产物经酶切、连接后环化成载体。
（2）扩增载体中筛选效率较高的标记基因（链霉素敏感基因）时，引物应包含_________（Ⅰ\rm Hind∕Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体构建高效筛选载体。
（3）将改进的基因整合到载体构建载体。将载体导入链霉素不敏感（由突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体的菌株，应采用含有_________的平板进行初步筛选。
（4）用一定的方法筛选出如下菌株：基因脱离载体并整合到受体菌拟核，且载体上其他片段全部丢失。该菌的表型为_________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
（5）可采用_________技术鉴定成功整合基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：① 目的基因的获取；② 基因表达载体的构建；③ 将目的基因导入受体细胞；④ 目的基因的检测与表达。从分子水平上检测目的基因的方法：（1）分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的是否插入目的基因——分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了——分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。
（1）【答案】
【解析】据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制（卡那霉素抗性基因），需要引物和，因此为去除筛选效率较低的，应选择引物和。时，在引物作用下，聚合酶从引物端开始延伸链，即的合成方向是从子链的端端延伸的，因此在引物的端引入Ⅰ酶识别序列。
（2）【答案】Ⅰ
【解析】据图可知，载体中（链霉素敏感基因）的两侧具有Ⅰ酶识别序列，载体中不含Ⅰ酶识别序列，如果将载体和载体连接形成高效筛选载体时，需要的引物应该含有Ⅰ酶识别序列。
（3）【答案】卡那霉素
【解析】基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体中含有（链霉素敏感基因）和（卡那霉素抗性基因），将载体导入链霉素不敏感（由突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4）【答案】B
【解析】据题意可知，载体导入的时链霉素不敏感（由突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中基因脱离载体并整合到受体菌拟核，且载体上其他片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，正确。
故选：。
（5）【答案】
【解析】通过技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体中或目的基因是否转录出了，因此可采用技术鉴定成功整合基因的菌株。押题专题05 生物技术与工程
生物技术是高考中的重要板块，包括基因工程、细胞工程以及发酵工程、PCR技术应用广泛,可用于新冠病毒的核酸检测等基本内容,是近几年高考试题的命题热点,在考试中经常会与细胞代谢、基因等进行综合考查，难度从简单到困难都有所涉及，需要考生在复习中认真对待。
一、非选择题
1. （2022 山东卷）某种类型的白血病由蛋白引发，蛋白可使被蛋白酶识别并降解，药物可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白和。是缺失特定氨基酸序列的，是一种短肽，连接在或的氨基端，使融合蛋白能与含有抗体的介质结合，但不影响或的功能。
（1）为构建重组载体，需先设计引物，通过特异性扩增基因。用于扩增基因的引物需满足的条件是_________。为使产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_________（填“端”或“端”）。
（2）扩增得到的基因经酶切连接插入载体后，与编码的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“”为基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的序列正确，翻译出的融合蛋白中的氨基酸序列正确，但基因对应的氨基酸序列与不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________。修改扩增基因时使用的带有Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_________。
（3）融合蛋白表达成功后，将、、药物和按照图乙中的组合方式分成组。各组样品混匀后分别流经含抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用抗体检测，检测结果如图丙所示。已知和不能降解，由① ② ③ 组结果的差异推测，药物的作用是_________；由② ④ 组或③ ⑤ 组的差异推测，中缺失的特定序列的作用是_________。
（4）根据以上结果推测，药物治疗该病的机理是_________。
2. （2022 辽宁卷）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．蛋白胞外段抗原制备，流程如图所示：
Ⅱ．蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图所示：
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是_________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 _________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由_________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化蛋白胞外段。
（3）用蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用_________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的_________中培养，离心收集小鼠的淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到孔板，进行_________培养。用_________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集_________，提取单克隆抗体。
（5）利用蛋白胞外段抗体与药物结合，形成_________，实现特异性治疗。
3. （2021 江苏卷）某小组为研究真菌基因的功能，构建了融合表达蛋白和标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
（1）目的基因的扩增：
① 提取真菌细胞_________，经逆转录获得，进一步获得基因片段。
② 为了获得融合标签的蛋白，设计引物时，不能包含基因终止密码子的编码序列，否则将导致__________________。
③ 热启动可提高扩增效率，方法之一是：先将除聚合酶（酶）以外的各成分混合后，加热到以上再混入酶，然后直接从开始扩增，下列叙述正确的有_________。
．酶最适催化温度范围为
．与常规相比，热启动可减少反应起始时引物错配形成的产物
．两条子链的合成一定都是从端向端延伸
．产物碱基序列的特异性体现了酶的特异性
（2）重组质粒的构建：
① 将Ⅰ切开的载体与添加同源序列的混合，用特定酶处理形成黏性末端，然后降温以促进__________________，形成结合体。将结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的聚合酶及_________酶等，完成质粒的环化。
② 若正确构建的重组质粒仍能被Ⅰ切开，则Ⅰ的酶切位点可能在___________________________。
（3）融合蛋白的表达：
① 用含有尿嘧啶的培养基培养基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________________。
② 若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含标签，说明___________________________，后续实验可借助标签进行蛋白的分离纯化。
4. 中国对杏树的栽培已有两千年以上的历史，但对杏果的利用一直停留在鲜食果肉或杏仁上。研究人员不断创新开发，成功酿制出杏果酒，其艳泽淡黄、果香浓郁、营养丰富；检测发现果酒中黄酮达，是目前天然可食植物制品黄酮含量最高的饮品，有抗癌防衰老的性能，突出的功能型饮品。回答下列问题。
（1）杏果酒酿制利用的微生物是_________。发酵生产果酒的过程中，每隔一段时间要进行放气操作，其主要目的是_________。在制作杏果酒中绝大多数其他微生物生长受到抑制的原因是_________。
（2）酿制杏果酒时，需要将温度控制在，温度过高和氧气逸入会导致杏果酒容易变酸，原因是___________________________。
（3）在葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。为了解皮渣中微生物的数量，取皮渣加入无菌水，混匀，用_________（填一种实验仪器）将稀释液均匀接种于培养基表面。倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为、和，则每克皮渣中微生物数量为_________个。
（4）某同学在制作杏醋时，加入醋酸菌液过程中有可能混入乳酸菌（不考虑其他杂菌）。从培养条件的角度分析，请用稀释涂布平板法设计实验，检测是否混入了乳酸菌（注：乳酸菌和醋酸菌的菌落形态相似）。写出大体实验思路并预测实验结果：_________。
5. 氮浓度过高是引起水体富营养化的主要原因之一，严重影响了水生生物的正常生长。为此，科研人员分离纯化出三类细菌，通过这三类细菌的作用，将水体中过量的铵盐、亚硝酸盐及硝酸盐转化为氮气释放到大气中，从而降低了水体的富营养化，反应过程如图，回答下列相关问题：
（1）科研人员在配制筛选亚硝化细菌的培养基时以________________为唯一氮源，采用 ________________方法对培养基进行灭菌。
（2）在培养亚硝化细菌过程中需进行振荡培养，目的是________________________________，培养若干天后，应选择培养瓶中亚硝酸盐含量________________的培养液，采用________________法将其接种于含有格里斯试剂的固体培养基上（注：格里斯试剂可与亚硝酸盐反应生成红色物质），得到分布均匀的单菌落，再选择周围出现红色较深的单菌落，经液体培养使亚硝化细菌的数量进一步扩增。在上述过程中选择周围出现红色较深的单菌落的原因是________________________________________________________________________________________________。
（3）在上述研究的基础上，科研人员又筛选并纯化得到反硝化细菌株，对其产气能力和培养液中硝酸盐含量（用总氮表示）的测定结果如下，据此分析，科研人员在选择反硝化细菌用于水体净化时最好选择________________号菌株，原因是___________________________________。
培养时间
产气情况 产气 产气 产气
菌株 ，，， ，，， ，，，
6. 中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友团队提出了一种利用多重基因编辑技术以红果番茄（双子叶植物）为材料，快速定向创制七种不同果色番茄材料的策略。该研究利用多重基因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素合成或代谢的关键基因。下图是科研人员用基因编辑技术定点敲除目标基因的示意图，请回答下列问题：
（1）系统能精准识别相关基因，依据的原理是________________发生碱基互补配对；蛋白能使目标中的________________（填化学键名称）断裂，从而实现对________________（选填“单链”、“双链”、“单链”、“双链”）的剪切。若要插入其他基因，可以利用________________酶将它们连接起来。
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用的方法是________________。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并________________________________，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞具有全能性，在一定的营养和激素等条件下，可以经过 ________________ 的过程形成愈伤组织。当培养基中的________________时，主要诱导根原基的形成。
（4）五彩缤纷的水果和蔬菜不仅给人以美的视觉享受，还能提高消费者的购买欲。在培育彩色番茄的同时我们还需要考虑该策略对番茄的________________等性状无影响。
7. 疫苗接种是当前新冠肺炎疫情防控工作的一项重要举措。重组腺病毒疫苗研发策略是：将新冠病毒的蛋白基因整合到腺病毒中，形成表达蛋白的重组腺病毒，注射到健康人体内，腺病毒可侵染人体细胞，达到预防新冠病毒感染的效果。回答下列问题。
（1）由于腺病毒分子较大，需采取图所示方法获得重组腺病毒。即：将质粒和质粒共同导入受体细胞中，最终重组在线性分子上，据图推测，所示的原件应该为________________。
（2）将上述重组线性分子（不编码病毒复制必需的蛋白）导入到能表达人体细胞没有的蛋白的细胞系，最终包装成完整的腺病毒。这种方式生产的疫苗由于重组腺病毒________________，从而提高了疫苗的安全性。
（3）重组腺病毒疫苗________________（填“含有“或“不含有“）有活性的病毒。注射进入人体后可经过________________（填“转录”“翻译”或“转录及翻译”）产生相应蛋白发挥抗原作用。人体接种该疫苗后，免疫系统会产生相应的抗体及后者在新型冠状病毒进入人体时，可迅速________________，引发强烈特异性免疫反应。
（4）为了检测疫苗的效果，科学家用不同方式给雪貂接种重组腺病毒疫苗后，感染新冠病毒。一段时间后检测新冠病毒含量，结果如图，说明重组腺病毒疫苗________________，且效果最好的免疫方式是________________。
8. 聚赖氨酸（）能抑制多种微生物的活性，且人体可将其分解为赖氨酸，是一种优良的天然食品防腐剂。科研人员欲从土壤中分离能分泌 的微生物，做了如图所示的实验（Ⅰ表示过程，①③ 表示菌落），已知可使亚甲基蓝褪色，形成透明圈。
（1）实验中需注意无菌操作，下列需要灭菌处理的是_________。（多选）
．土样
．甲培养基
．接种环
．涂布器
（2）图中第Ⅰ步最常用的接种方法是_________。甲培养基能提供目的菌所需的全部营养，其中包括水、碳源、氮源和_________等营养物质。
（3）通过步骤Ⅱ能筛选出产的菌种，因此，乙培养基属于_________培养基，在进行第Ⅲ步接种时，应挑选_________（①②③ ）号菌落。步骤Ⅳ的目的是___________________________。
（4）为检测上述收集到的对不同种类微生物的抑制能力，研究人员将大肠杆菌等菌种分别涂布于某培养基表面，再将浸有不同浓度 的滤纸圆片置于平板培养基表面，培养后测量清晰区的宽度，结果如下表。
清晰区宽度 浓度
微生物 大肠杆菌
沙门氏菌
酿酒酵母
红曲霉
注：“”表示无清晰区，“”表示未进行实验。
结果显示对_________的抑制作用最强，且对四种微生物的抑制效果与浓度_________（正相关负相关）。为使结果更具说服力，还应增加__________________实验。
9. 普通棉花中含甘露糖苷酶基因（），能在纤维细胞中特异性表达，产生的甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如图。请分析回答：
（1）纤维细胞启动子的元素组成为_________，基因表达载体除了图示组成外，至少还有__________________等（至少答两个），不能使用质粒中花椰菜病毒启动子的原因是______________________________________________________。
（2）技术扩增甘露糖苷酶基因需要根据_________设计特异性引物序列，假设开始时模板数量为个，扩增个循环，理论上需要的引物数量_________，只含目的基因的片段数量为_________。为保证能插入到质粒中，还需要在引物的_________端添加限制酶识别序列。
（3）为什么不能用探针进行分子杂交来鉴定基因表达载体是否导入棉花细胞？______________________________________________________。
（4）③ 过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用Ⅰ酶和Ⅰ酶切割正义基因表达载体获得、、、四种长度的片段，则用酶切反义基因表达载体获得片段的长度应是_________________和_________________。
（5）导入细胞内的反义能阻止甘露糖甘酶合成，使棉纤维变长的原理是_____________________________________________。
10. 噬菌体辅助连续进化技术（）将生物分子的实验室进化与噬菌体的生命周期结合在一起（该噬菌体的生命周期仅为分钟），使实验室中生物分子的进化速度提高了倍。该技术有望让制药业使用实验室培育出来的蛋白质、核酸等成分按需制药。
噬菌体的增殖依赖于Ⅱ蛋白。技术，首先用某目的基因替换原来的Ⅲ蛋白基因，构建含有目的基因的Ⅲ蛋白缺陷型噬菌体（），然后用侵染培养池中的宿主E.（其质粒中含有与目的基因活性相关联的Ⅲ蛋白基因）。必须进化出有效突变才能启动质粒上Ⅲ蛋白基因的表达，噬菌体才能获得增殖能力并持续侵染其他宿主，从而实现连续进化（过程如图所示）。
请回答以下问题：
（1）获取目的基因后，常用_________技术对其进行快速扩增。构建Ⅲ蛋白缺陷型噬菌体（）的遗传改造过程需要用到的工具酶有__________________，侵染宿主的过程相当于基因工程基本操作程序中的___________________________。
（2）宿主的辅助质粒（）包含有与目的基因活性相关联的Ⅲ蛋白基因，是为了对噬菌体（）进行_________。除此之外，还应包含有_________才能驱动目的基因转录出。
（3）研究人员向的培养池不断引流入新鲜的宿主细胞，并设置培养液流出速度稍快于宿主细胞的增殖速度，其目的是_________________________________________。
11.突变体是研究功能基因组的前提，转座子是基因组中可以移动的序列。科研人员将玉米转座子进行改造，改造后的转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力。转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，只有同时存在和时，才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复。现将玉米转座子引入到水稻的中，构建水稻突变体库，并从中筛选到稳定遗传的矮秆突变株，实验流程如图。
请回答下列问题：
（1）科研人员将和分别导入水稻细胞，获得和的转化植株。
① 首先将构建的转座载体和转座载体分别与_________混合培养。
② 取水稻未成熟种子，消毒后接种于含有植物激素和___________________________的培养基上，诱导产生愈伤组织。因愈伤组织具有__________________特点，常作为基因工程的理想受体材料。
③ 将完成转化的愈伤组织接种于含有_________的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即代。
（2）为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选单拷贝插入，但没有表型突变的和转基因植株，杂交获得代。通过技术从中筛选出目标植株（转座子插入法构建的突变体库中的植株），理论上目标植株占个体总数的_________。请从图中任选一种目标_________（填或），画出其相应亲本植株的基因组成及在染色体的位置。
（3）目标代植株自交获得代，可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体，理由是____________________________________。研究发现有些发生转座的植株并没有表型的变化，请分析原因_______________________________________________________________。
（4）科研人员在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有而无的植株，目的是________________________________，并用做标签在基因组中定位且分离出矮秆基因。
12. 幽门螺杆菌（）是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，该菌的基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备疫苗。已知基因表达时，双链的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图；四种限制酶及其识别序列如图；三种质粒如图，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图。回答下列问题：
（1）基因终止子序列位于图中的_________区段，该基因转录时，编码起始密码子的序列位于图中的_________区段。
（2）转录产生的前个碱基序列为_________（方向为）。若通过技术大量扩增基因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是_________（方向为，写出端个碱基序列）。
（3）据图、、分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是_________，最适合用作载体的质粒是_________。
（4）图中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的线毡布压在培养基的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基上、结果如图所示）。培养基、中应分别添加_________，符合实验要求的菌落是_________（填写数字），判断依据是_____________________________________________。
13. 对微生物进行筛选和鉴定时，常用到观察噬菌斑和抑菌圈的方法。分析以下两个实验，回答相关问题：
Ⅰ．噬菌斑，即噬菌体侵染细菌细胞导致宿主细胞溶解死亡时在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑。研究人员欲证明在含有多种噬菌体的原液（溶液）中存在能裂解大肠杆菌的噬菌体，基本步骤如下：
步骤 具体操作
1．培养基制备 制备牛肉膏蛋白胨培养基并灭菌，加入一定量的大肠杆菌
2．获得裂解液 取适量溶液与步骤中培养基混合，适宜温度下振荡培养充足时间后，离心管中离心，得到含噬菌体的裂解液
3．噬菌体检测 在牛肉膏蛋白胨培养基上加入大肠杆菌菌液，将菌液均匀涂布在培养基表面，稍后再向培养基表面分别滴加数小滴裂解液。将平板置于下培养一段时间
Ⅱ．肺结核通常是由结核杆菌感染引发的一种疾病，为比较甲、乙、丙三种药物对肺结核的疗效，科研人员进行了药敏实验，是某种药物对测试菌的最低抑制浓度。实验结果如图所示，其中、、、分别为浸过无菌水、相同浓度的甲、乙和丙的滤纸片。图中深色部分代表抑菌圈，是不生长细菌的地方。
（1）从培养基的物理性质来看步骤中制备的是________培养基，步骤中所用的是_________培养基。培养基与培养皿等器具按要求所采用的灭菌法 _______________（填“相同”或“不同”）。
（2）此实验的预期结果及结论是________。
（3）可用________（填工具名称）将结核杆菌培养液均匀涂布在固体培养基表面进行培养，该培养皿接种菌种并贴上滤纸片后，应________（填“倒置”或“正置”）于条件下培养。由上图可知，三种药物中________（填“甲”“乙”或“丙”）的数值最小，原因是________。
14. （2022 海南卷）以我国科学家为主的科研团队将（即个基因的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（），诱导其重编程为诱导多能干细胞（），再诱导分化为诱导原始生殖细胞（），然后将注射到孵化天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。
（1）是从孵化天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用_________________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加_________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）体外获取的方法有___________________________（答出种即可）。若要在中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和_________等。启动子是__________________识别和结合的部位，有了它才能驱动______________________________________________________。
（3）细胞和细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是____________________________________。
（4）诱导细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是_________________________________。
（5）该实验流程中用到的生物技术有_____________________________________________（答出点即可）。
15. （2022 天津卷）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1）如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体中含有（卡那霉素抗性基因）和两个标记基因，为去除筛选效率较低的，应选择引物_________和_________，并在引物的_________（）端引入Ⅰ酶识别序列，进行扩增，产物经酶切、连接后环化成载体。
（2）扩增载体中筛选效率较高的标记基因（链霉素敏感基因）时，引物应包含_________（Ⅰ\rm Hind∕Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体构建高效筛选载体。
（3）将改进的基因整合到载体构建载体。将载体导入链霉素不敏感（由突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体的菌株，应采用含有_________的平板进行初步筛选。
（4）用一定的方法筛选出如下菌株：基因脱离载体并整合到受体菌拟核，且载体上其他片段全部丢失。该菌的表型为_________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
（5）可采用_________技术鉴定成功整合基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
