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第2课时
微生物的培养技术及应用
课标要求
1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。
2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。
3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。
4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。
5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一 微生物的培养技术及应用
考点二 微生物的选择培养和计数
内容索引
重温高考 真题演练
课时精练
考点一
微生物的培养技术及应用
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、用途和类型
①概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出的供其_____
的营养基质。
②用途：用以 微生物或积累其 。
归纳 夯实必备知识
营养物质
生长
繁殖
培养、分离、鉴定、保存
代谢物
③种类：按物理性质分
培养基
↓(加入 ，如琼脂)
培养基
液体
凝固剂
固体
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、 、氮源、 。
②其他条件：pH、 和氧气。如下表：
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加_______ pH调至______ pH调至_____ _________ _______
维生素
酸性
中性
或弱碱性
无氧
碳源
无机盐
特殊营养物质
2.无菌技术
(1)目的：获得 的微生物培养物。
(2)关键：防止 污染。
(3)消毒与灭菌的比较
纯净
杂菌
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为 的理化因素 的理化因素
作用程度 杀死物体表面或内部____ 微生物 杀死物体内外的 微生物
芽孢和孢子 一般不能杀灭 能杀灭
温和
强烈
一部
分
所有
(4)注意事项
①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。
②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在
附近进行。
适用对象 实验操作的空间、操作者衣着和双手 微生物培养器皿、接种用具和培养基等
常用方法 消毒法、 消毒法等 灭菌法、 灭菌法、
灭菌法等
煮沸
巴氏
湿热
干热
灼烧
周围的物品
酒精灯火焰
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析
一定形态结构
固体培养基
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
15～20 g琼脂
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法
干热灭菌
酒精灯火焰
灼烧灭菌
平板划线法
恒温培养箱
28
(3)平板划线法操作步骤
下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
拓展 提升科学思维
(1)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：________________
。
d→b→f→a→e→c
→h→g
(2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(4)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示 培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
1.(不定项)在实验室培养微生物，需要人为地为微生物提供适宜的营养和环境条件。下列关于培养基配制的说法正确的是
A.培养基中需要碳源、氮源、水和无机盐齐全
B.培养基中必须添加琼脂
C.培养基制备中均需调节pH至酸性
D.无论哪种培养基均需要灭菌
突破 强化关键能力
√
培养固氮微生物时，培养基中可以不添加氮源，A错误；
只有配制固体(或半固体)培养基时才需要添加琼脂，B错误；
适宜的pH是微生物生长的必需条件，因此配制过程中需要调节pH，但培养霉菌时一般需要将pH调至酸性，C错误；
培养基均需要灭菌，D正确。
2.(2023·辽宁沈阳高三模拟)下列操作不能达到灭菌目的的是
A.使用高压锅处理器皿
B.在火焰上灼烧接种环
C.用干热灭菌箱处理金属用具
D.防疫期间用石炭酸喷洒教室
√
使用高压锅处理器皿，即高压蒸汽灭菌，能达到灭菌的目的，A不符合题意；
在火焰上灼烧接种环，即灼烧灭菌，能达到灭菌的目的，B不符合题意；
用干热灭菌箱处理金属用具，可以达到灭菌的目的，C不符合题意；
防疫期间用石炭酸喷洒教室，属于消毒，不能达到灭菌的目的，D符合题意。
3.(2023·山东东营高三模拟)下图为微生物的实验室培养的有关操作，下列相关叙述错误的是
A.步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B.步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C.图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得单个菌落
D.接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
√
步骤①中，接种前灼烧接种环至变红，目的是杀灭接种环上可能引起污染的微生物，A正确；
步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远，防止受到杂菌污染，B正确；
图中所示的接种方法是平板划线法，目的是使接种的菌种逐渐稀释，经培养后获得由单个细菌繁殖而来的菌落，C正确；
图示的平板划线法不能用于微生物的计数，D错误。
归纳
总结
(1)无菌技术的三个主要注意点
①实验前应对操作空间、操作人员进行消毒，对所用器具和培养基进行灭菌。
②实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作。
③避免已杀菌处理的材料再次污染。
(2)倒平板时的注意事项
①琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固。倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。
②可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
考点二
微生物的选择培养和计数
1.区分选择培养基与鉴别培养基
归纳 夯实必备知识
特定种类的微生物生长
种类 特点 用途 举例
选择培养基 允许 ，同时______________________ _________ 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
抑制或阻止其他种类微
生物生长
提醒 常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
培养基
酒精
冷却
菌液
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
②间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
根据图示问答以下问题：
a.为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。
30～300
b.为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？
提示 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
c.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是 个/mL，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为
个/mL，所以每克样品中的细菌数是 个。
2.34×103
2.34×108
2.34×109
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
脲酶
尿素
(2)实验流程
菌落数目稳定
3～8
稀释涂布平板
30～37
30～300
(3)实验结果分析与评价
对照的培养皿中
无菌落生长
对照的培养皿中
有菌落生长
30～300
选择性必修3 P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的 可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的 性增强，在培养基中加入 培养细菌，若指示剂变 ，可确定该细菌能够分解尿素。
脲酶
碱
酚红指示剂
红
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示 不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
拓展 提升科学思维
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示 作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示 尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落特征。
4.下列有关培养基的叙述正确的是
A.筛选、培养硝化细菌的培养基中不能加入氮源
B.固体培养基中的琼脂能为微生物生长提供碳源
C.在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基
D.培养基中加入刚果红可用于尿素分解菌的鉴定
√
突破 强化关键能力
硝化细菌属于化能合成型自养微生物，因此制备培养硝化细菌的培养基不需要添加碳源，但需要添加氮源，A错误；
固体培养基中的琼脂只是作为凝固剂，不能为微生物生长提供碳源，B错误；
液体培养基可以增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间，所以在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基，C正确；
培养基中加入刚果红可用于纤维素分解菌的鉴定，D错误。
5.(2021·江苏1月适应性考试，14)稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是
A.固体培养基灭菌后，应冷却至50 ℃左右时倒平板
B.倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌的生长
C.稀释涂布平板分离到的单菌落需进一步划线纯化
D.稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数
√
培养基灭菌后需要冷却至50 ℃左右时才能用来倒平板，避免温度过高，A正确；
倒好的平板需要放置一段时间，用以观察培养基是否被杂菌污染，B错误；
稀释涂布平板法分离的单菌落需要用平板划线法进行纯化培养，C正确；
稀释涂布平板法可以计数，也可观察菌落特征进行菌种分离，D正确。
两种纯化方法的比较
归纳
总结
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
两种纯化方法的比较
归纳
总结
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
三
重温高考 真题演练
1.(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
1
2
3
4
√
乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B项错误。
1
2
3
4
2.(2021·北京，12)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是
A.对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B.使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C.用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D.观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
√
1
2
3
4
为避免杂菌污染干扰，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；
葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；
用取样后的棉拭子浸出液在固体培养基上涂布，C错误；
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别，D正确。
1
2
3
4
3.(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区
挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
1
2
3
4
√
温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；
由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；
菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；
刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
1
2
3
4
4.(2022·全国甲，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下：
培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
1
2
3
4
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、
乙两孔。
回答下列问题：
1
2
3
4
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是______。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成_____________
________(答出2种即可)等生物大分子。
石油
DNA、RNA、
蛋白质
培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
1
2
3
4
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
1
2
3
4
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________
N0·2n
由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈“J”型曲线，由于DNA的半保留复制，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt＝N0·λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0·2n。
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
1
2
3
4
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是__________
下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
在无菌条件
分析表格数据可知，实验的结果是：
在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能
力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌
株仍然能降解石油，而B菌株不能
降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
1
2
3
4
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
1
2
3
4
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是_____，理由是________________________________
_______________________________________。
A菌株降解石油的能力高于B菌株，
A
并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
由表格数据可知，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
1
2
3
4
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
1.判断关于培养基的叙述
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( )
(2)培养霉菌时需将培养基的pH调至中性或弱碱性( )
(3)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )
√
五分钟 查落实
×
×
2.判断关于无菌技术的叙述
(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
( )
(2)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( )
(3)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和灭菌( )
√
×
×
3.判断关于微生物的培养与计数的叙述
(1)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数( )
(2)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计( )
(3)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数( )
×
×
×
4.填空默写
(1)(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括 等。
(2)(选择性必修3 P10)获得纯净的微生物培养物的关键是 ，无菌技术除了用来 外，还能
。
(3)(选择性必修3 P12)菌落是指_____________________________________
。采用
法和 法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
水、无机盐、碳源、氮源
防止杂菌污染
防止实验室的培养物被其他外来微生物污染
有效避免操作者自身被微生物感染
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或
内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体
平板划线
稀释涂布平板
(4)(选择性必修3 P16)选择培养基是指_______________________________
。
(5)(选择性必修3 P12)平板冷凝后，要将平板倒置的原因是_____________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________________________。
在微生物学中，将允许特定种类的
微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
平板冷凝后，
皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
(6)(选择性必修3 P13)平板划线操作的第一步灼烧接种环是为了_________
；每次划线前灼烧接种环是为了___
______________________________________________________________
________________________________，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能 。
(7)(选择性必修3 P13)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是 。
避免接种
环上可能存在的微生物污染培养物
杀
死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端
及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
以免接种环温度太高，杀死菌种
(8)(选择性必修3 P13)在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是______________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________。
(9)(选择性必修3 P18)当___________________________________________
，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(10)(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是__________
。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是_____________________________________________
________________________________________________________。
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只
是一个菌落
同时培养灭
菌后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生
配制牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目
四
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1.(2023·山东滨州高三模拟)培养微生物需要提供适宜的培养基。下列关于培养微生物的培养基的叙述，错误的是
A.培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
B.培养基的成分需根据微生物的代谢特点而定
C.培养基需满足各种微生物生长繁殖的需求
D.培养基通常需包含水、无机盐、碳源、氮源等营养物质
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
培养基中含有微生物生长需要的营养物质，还能满足微生物生长对环境的要求，A正确；
配制培养基时，需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质的需要，B正确；
培养基是根据不同微生物的生长繁殖需求进行配制的，不能满足各种微生物生长繁殖的需求，C错误。
1
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13
14
2.下列有关传统发酵技术和微生物培养技术中的操作，错误的是
A.制作果酒时，挑选新鲜葡萄，去除枝梗后用清水反复冲洗再榨汁
B.平板划线时，每次划线前后都需将接种环放在酒精灯火焰上灼烧
C.制作泡菜时，加入蔬菜后注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料
D.为判断选择培养基是否起到了选择作用，设置接种普通培养基作对照
1
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14
√
选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄用清水冲洗，再除去枝梗，且不可反复冲洗，以免过多地将葡萄果皮上的野生酵母菌冲洗掉，影响酵母菌的发酵，A错误。
3.(2023·湖南长沙高三检测)平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列叙述正确的是
A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续
划线的操作
C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D.都能在培养基表面形成单个的菌落
√
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平板划线法不需要进行梯度稀释，平板划线法是将菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，A、B错误；
稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面，C错误；
平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落，D正确。
1
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4.下列有关微生物培养的叙述，错误的是
A.涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后用酒精灯外焰灼烧，冷却后再使用
B.纯化培养酵母菌时，培养皿应倒置放入28 ℃左右的培养箱内中培养
24～48 h
C.计数时，可用稀释涂布平板法对需计数的微生物进行计数
D.观察菌落时，应将培养皿皿盖拿掉以利于看清菌落的形态特征
√
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涂布接种时，将涂布器末端浸在盛有酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将蘸有酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后再使用，A正确；
为防止空气中的杂菌污染培养物，观察菌落时，不能将培养皿皿盖拿掉，D错误。
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5.(2023·湖南益阳高三模拟预测)为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。
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下列相关叙述正确的是
A.为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②③
B.图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C.图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D.不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
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为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中①酒精灯(操作需要在酒精灯火焰旁进行，对涂布器进行灼烧灭菌)、③培养基和④涂布器(接种工具)，②接种环是平板划线法接种时需要使用的接种工具，A错误；
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图2中Ⅱ处透明圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；
突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误；
不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果中抑菌圈的大小，D正确。
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6.下图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是
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A.①步骤使用的培养基是已经灭菌的培养基
B.①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C.③到④的过程中，接种环共灼烧了5次
D.④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连
√
接种环在每次划线前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以③到④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，③到④的过程中共需灼烧接种环6次，C项错误。
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7.某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是
A.可得出土壤样液中活菌数大约为5.7×107个/L
B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C.一般选择菌落数在30～300的平板进行计数
D.显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数
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根据题意分析可知，每升样品中的活菌数为(56＋58＋57)÷3÷0.1×
1 000×100＝5.7×107(个)，A项正确；
由于两个或多个细胞连在一起形成一个菌落，所以此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B项正确；
显微镜直接计数法统计的是稀释液中所有个体的数目，即死菌数和活菌数，D项错误。
8.下图为分离以尿素为氮源的微生物的实验结果，下列叙述正确的是
A.图中采用平板划线法接种
B.图中①和②表示尿素培养基长出的菌落
C.图中③④培养基中菌落生长代谢时，会释放CO2
D.实验结果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例较高
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根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A项错误；
由图中①和②的菌落的特征可知，①稀释度为10－6的菌落数明显多于②稀释度为10－7时的菌落数，很可能是由于杂菌污染导致的结果，而不是分离出以尿素为氮源的微生物，B项错误；
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③④培养基中已经分离出由单个细菌繁殖而来的尿素分解菌的菌落，尿素分解菌能分泌脲酶，能够催化尿素分解成氨、二氧化碳和水，C项正确；
根据实验结果，无法判断自然界中能合成脲酶的微生物比例，D项错误。
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二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
9.聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，且废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的流程图如下。
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下列说法正确的是
A.步骤②可用稀释涂布平板法接种到含合成塑料的选择培养基上
B.步骤③需要将接种后的培养基放入恒温箱中倒置培养
C.步骤④所用到的培养基应加入琼脂，以便挑取单菌落获得纯化菌株
D.挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量
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PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，要筛选嗜盐细菌，步骤②可用稀释涂布平板法接种到含盐量较高的选择培养基上，A项错误；
步骤④扩大培养应选用液体培养基，液体培养基中不应加入琼脂，C项错误；
要挑选高产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的嗜盐菌，挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量，最后进行比较，D项正确。
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10.产脂肪酶细菌可用于含油废水的处理。科研人员采用射线照射从土壤中分离的菌株，反复筛选后获得产脂肪酶能力较高的菌株，具体流程如图。下列相关叙述错误的是
A.步骤①取土壤样品灭菌后溶于无菌水中制成菌悬液
B.步骤②的固体平板是以脂肪作为唯一碳源的培养基
C.步骤②射线照射可引起细菌基因突变或染色体变异
D.步骤③透明圈越大的菌落，其脂肪酶活性一定越高
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土壤样品中包含目的菌株，进行灭菌后会杀死所有微生物包括要培养的目的菌株，所以不可以进行灭菌处理，A错误；
要筛选可以产生脂肪酶的细菌，需要用以脂肪作为唯一碳源的固体培养基，B正确；
细菌是原核生物，没有成形的细胞核和染色体，因此用射线照射不会引起细菌染色体变异，C错误；
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透明圈大的菌落，酶活性不一定大，因此对初筛选的透明圈大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活性检测，D错误。
11.(2023·辽宁丹东高三期末)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，a、b、c表示操作步骤，d、e为菌落。下列叙述不正确的是
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下列叙述正确的是
A.图中①②④为基本培养基，③为完全培养基
B.a操作的目的是提高突变率，增加突变株的数量
C.b的正确操作是用涂布器把菌液均匀地涂布在②表面
D.经c过程原位影印及培养后，可从④中挑取d菌落进行纯化培养
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野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，根据题干信息和图形分析，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；
紫外线可以提高突变的频率，a操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；
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b操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀的涂布在②培养基表面，C正确；
从图中可看出，d菌落在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明d是氨基酸缺陷型菌落，故经c过程影印及培养后，可从④培养基中挑取d菌落进行纯化培养，D正确。
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12.某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述不正确的是
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A.在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B.等比稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C.振荡的目的是为了增加尿素分解菌的浓度
D.由图示菌落计数结果可知，10克土样中的菌株数约为1.6×106个
√
√
酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取的土壤在倒入锥形瓶过程中被污染，A项正确；
振荡培养的目的是提高培养液
的溶解氧的含量，使菌体充分
接触培养液，提高营养物质的
利用率，C项错误；
由题图分析可知，每克土样中的菌株数为1.6×106个，即10克土样中的菌株数约为1.6×107个，D项错误。
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三、非选择题
13.(2022·全国乙，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
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碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有__________________________________ (答出2点即可)。
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干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键，对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌，湿热灭菌中效果最好的方法)、灼烧灭菌。
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碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是_________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要_________
______(答出2点即可)等营养物质。
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碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
葡萄糖
制糖废液
氮源、无
机盐
分析题干实验结果，以葡萄糖为碳源时，细胞干重最大，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖；以制糖废液为碳源时，S产量最高，故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、生长因子等营养物质。
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(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是____________。
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缺少淀粉酶
由实验结果可知，菌株C可以利用葡萄糖，但在以淀粉为碳源时，菌株C不能生长，说明菌株C无法利用淀粉，分析其原因是菌株C不能合成淀粉酶，导致其无法利用淀粉。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：___________________________
_______________________________________________________________
____________________________。
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碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度
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以制糖废液作为碳源，进一步确定生产S的最适碳源浓度，可以以碳源浓度作为自变量，不同碳源浓度下S产量作为因变量，实验思路为：设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，从而确定最适碳源浓度。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是__________________
__________________。
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碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
料、降低生产成本
减少污染、节省原
14.菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志，也可以用于观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对送检样品进行卫生学评估提供证据。下图是某样品培养简化流程图，请分析回答下列问题：
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(1)该营养琼脂培养基配制过程中，其基本步骤包括按照培养基配方准确计算、称量、溶化、调节pH、______________________法灭菌等。然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，选择此温度的理由是________________
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高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
保证培养基处于溶化状态(在凝固之前接种且不致将培养物烫死)
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配制培养基时应按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，并进行高压蒸汽灭菌；然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，用手触摸不烫手以便于操作，并能保证培养基处于溶化状态，且在凝固之前接种不致将培养物烫死。
(2)实验过程中须将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，其目的是______________________________。从水浴锅取出营养琼脂培养基倒平板适量，稍冷却后移液0.2 mL样品于培养皿进行涂布，涂布时可____________，使涂布更均匀。
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尽量使样品中的微生物细胞分散
转动培养皿
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实验过程中要将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，尽量使样品中的微生物细胞分散；为了使涂布更均匀，涂布时可转动培养皿。
(3)本实验用菌落计数的原理是基于_______________________，运用这种方法统计的结果往往较实际值偏____。具体培养结果如下表。选取菌落数30～300的培养皿作为菌落总数的测定标准。当只有一个稀释浓度的平均菌落数符合此范围，以该培养皿菌落数×稀释倍数报告。当有两个浓度菌落值在30～300之间，报告结果由二者菌落数比值决定，若比值不大于2，则取平均数，且菌落数大于100取两位有效数字，两位之后的数值四舍五入；若比值大于2，则报告稀释度较低(稀释次数越多，稀释度越高)的培养皿菌落数。请填写例次3中“？”处的菌落总数为________。
一个菌落代表一个活菌
小
27 100
例次 不同稀释度平均菌落数 两稀释度菌落数之比 菌落总数/ [CFU/mL(g)]
10－1 10－2 10－3
1 1 365 164 20 — 16 400
2 2 760 295 46 1.6 38 000
3 2 890 271 60 2.2 ？
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根据题意可知，例次3应选取稀释度为10－2的菌落数报告，则例次3菌落总数为271×100＝27 100。
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(4)利用鲜奶进行工业生产酸奶时，不能使用________污染的鲜奶为原料，否则会使乳酸菌生长受到限制；利用______法可以除去鲜奶中的白细胞、杂菌和其他肉眼可见的异物，取其上清液用于发酵制酸奶。
抗生素
离心
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抗生素污染会使乳酸菌生长受到限制，因此不能使用抗生素污染的鲜奶为原料生产酸奶，原料乳中可能含有细胞类物质(如上皮细胞的白细胞等)，其中一些是牛乳中固有的，也有一些是挤奶过程中牛乳受污染而带进牛奶的，为了保证产品获得良好的最终质量，酸乳制作中第一步就是要除去这些污染物质，常利用特别设计的离心机进行离心除去牛乳中的白细胞和其他肉眼可见的异物。
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(5)密封良好的泡菜坛内有时会长一层白膜，这些白膜是________(填“乳酸菌”或“酵母菌”)繁殖产生的。在泡菜腌制过程中坛、蔬菜等均未进行严格灭菌，而在发酵过程中一般不会出现其他杂菌大量繁殖，其原因是_____(填序号)。
①发酵的原料中缺乏杂菌生长需要的各种营养物质
②发酵过程的温度不适合杂菌的生长
③乳酸菌产生较多乳酸，许多好氧菌被杀死
④在自然界中乳酸菌占优势
酵母菌
③
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泡菜发酵利用的菌种是乳酸菌，在发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸及无氧环境不利于其他杂菌的生长，所以发酵过程中一般不用严格灭菌，泡菜坛内表面会长出一层白膜，这些白膜是酵母菌繁殖产生的。第2课时 微生物的培养技术及应用
课标要求 1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一 微生物的培养技术及应用
1．培养基的配制
(1)培养基的概念、用途和类型
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
②用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
③种类：按物理性质分
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、碳源、氮源、无机盐。
②其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。如下表：
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加维生素 pH调至酸性 pH调至中性或弱碱性 无氧
2.无菌技术
(1)目的：获得纯净的微生物培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
(3)消毒与灭菌的比较
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为温和的理化因素 强烈的理化因素
作用程度 杀死物体表面或内部一部分微生物 杀死物体内外的所有微生物
芽孢和孢子 一般不能杀灭 能杀灭
适用对象 实验操作的空间、操作者衣着和双手 微生物培养器皿、接种用具和培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法等 湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法等
(4)注意事项
①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
3．微生物的纯培养
(1)概念辨析
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
(3)平板划线法操作步骤
下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：d→b→f→a→e→c→h→g。
(2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(4)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示 培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
1．(不定项)在实验室培养微生物，需要人为地为微生物提供适宜的营养和环境条件。下列关于培养基配制的说法正确的是( )
A．培养基中需要碳源、氮源、水和无机盐齐全
B．培养基中必须添加琼脂
C．培养基制备中均需调节pH至酸性
D．无论哪种培养基均需要灭菌
答案 D
解析 培养固氮微生物时，培养基中可以不添加氮源，A错误；只有配制固体(或半固体)培养基时才需要添加琼脂，B错误；适宜的pH是微生物生长的必需条件，因此配制过程中需要调节pH，但培养霉菌时一般需要将pH调至酸性，C错误；培养基均需要灭菌，D正确。
2．(2023·辽宁沈阳高三模拟)下列操作不能达到灭菌目的的是( )
A．使用高压锅处理器皿
B．在火焰上灼烧接种环
C．用干热灭菌箱处理金属用具
D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
答案 D
解析 使用高压锅处理器皿，即高压蒸汽灭菌，能达到灭菌的目的，A不符合题意；在火焰上灼烧接种环，即灼烧灭菌，能达到灭菌的目的，B不符合题意；用干热灭菌箱处理金属用具，可以达到灭菌的目的，C不符合题意；防疫期间用石炭酸喷洒教室，属于消毒，不能达到灭菌的目的，D符合题意。
3．(2023·山东东营高三模拟)下图为微生物的实验室培养的有关操作，下列相关叙述错误的是( )
A．步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B．步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C．图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得单个菌落
D．接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
答案 D
解析 步骤①中，接种前灼烧接种环至变红，目的是杀灭接种环上可能引起污染的微生物，A正确；步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远，防止受到杂菌污染，B正确；图中所示的接种方法是平板划线法，目的是使接种的菌种逐渐稀释，经培养后获得由单个细菌繁殖而来的菌落，C正确；图示的平板划线法不能用于微生物的计数，D错误。
归纳总结 (1)无菌技术的三个主要注意点
①实验前应对操作空间、操作人员进行消毒，对所用器具和培养基进行灭菌。
②实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作。
③避免已杀菌处理的材料再次污染。
(2)倒平板时的注意事项
①琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固。倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。
②可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
考点二 微生物的选择培养和计数
1．区分选择培养基与鉴别培养基
种类 特点 用途 举例
选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
提醒 常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2．微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
②间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
根据图示问答以下问题：
a．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
b．为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？
提示 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
c．某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是2.34×103个/mL，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为2.34×108个/mL，所以每克样品中的细菌数是2.34×109个。
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
(2)实验流程
(3)实验结果分析与评价
选择性必修3 P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示 不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示 作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示 尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落特征。
4．下列有关培养基的叙述正确的是( )
A．筛选、培养硝化细菌的培养基中不能加入氮源
B．固体培养基中的琼脂能为微生物生长提供碳源
C．在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基
D．培养基中加入刚果红可用于尿素分解菌的鉴定
答案 C
解析 硝化细菌属于化能合成型自养微生物，因此制备培养硝化细菌的培养基不需要添加碳源，但需要添加氮源，A错误；固体培养基中的琼脂只是作为凝固剂，不能为微生物生长提供碳源，B错误；液体培养基可以增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间，所以在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基，C正确；培养基中加入刚果红可用于纤维素分解菌的鉴定，D错误。
5．(2021·江苏1月适应性考试，14)稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是( )
A．固体培养基灭菌后，应冷却至50 ℃左右时倒平板
B．倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌的生长
C．稀释涂布平板分离到的单菌落需进一步划线纯化
D．稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数
答案 B
解析 培养基灭菌后需要冷却至50 ℃左右时才能用来倒平板，避免温度过高，A正确；倒好的平板需要放置一段时间，用以观察培养基是否被杂菌污染，B错误；稀释涂布平板法分离的单菌落需要用平板划线法进行纯化培养，C正确；稀释涂布平板法可以计数，也可观察菌落特征进行菌种分离，D正确。
归纳总结 两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
1．(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是( )
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
答案 B
解析 乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B项错误。
2．(2021·北京，12)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是( )
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
答案 C
解析 为避免杂菌污染干扰，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；用取样后的棉拭子浸出液在固体培养基上涂布，C错误；根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别，D正确。
3．(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案 B
解析 温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
4．(2022·全国甲，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下：
培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题：
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成__________(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是__________
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_____________________________________________________________。
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是__________，理由是____________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
答案 (1)石油 DNA、RNA、蛋白质 (2)N0·2n
(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力 (4)A A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
解析 (1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈“J”型曲线，由于DNA的半保留复制，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt＝N0·λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。(4)由表格数据可知，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
1．判断关于培养基的叙述
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( √ )
(2)培养霉菌时需将培养基的pH调至中性或弱碱性( × )
(3)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( × )
2．判断关于无菌技术的叙述
(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
(2)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( × )
(3)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和灭菌( × )
3．判断关于微生物的培养与计数的叙述
(1)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数( × )
(2)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计( × )
(3)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数( × )
4．填空默写
(1)(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源等。
(2)(选择性必修3 P10)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。
(3)(选择性必修3 P12)菌落是指分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(4)(选择性必修3 P16)选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(5)(选择性必修3 P12)平板冷凝后，要将平板倒置的原因是平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(6)(选择性必修3 P13)平板划线操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(7)(选择性必修3 P13)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是以免接种环温度太高，杀死菌种。
(8)(选择性必修3 P13)在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(9)(选择性必修3 P18)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(10)(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是同时培养灭菌后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是配制牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目。
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1．(2023·山东滨州高三模拟)培养微生物需要提供适宜的培养基。下列关于培养微生物的培养基的叙述，错误的是( )
A．培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
B．培养基的成分需根据微生物的代谢特点而定
C．培养基需满足各种微生物生长繁殖的需求
D．培养基通常需包含水、无机盐、碳源、氮源等营养物质
答案 C
解析 培养基中含有微生物生长需要的营养物质，还能满足微生物生长对环境的要求，A正确；配制培养基时，需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质的需要，B正确；培养基是根据不同微生物的生长繁殖需求进行配制的，不能满足各种微生物生长繁殖的需求，C错误。
2．下列有关传统发酵技术和微生物培养技术中的操作，错误的是( )
A．制作果酒时，挑选新鲜葡萄，去除枝梗后用清水反复冲洗再榨汁
B．平板划线时，每次划线前后都需将接种环放在酒精灯火焰上灼烧
C．制作泡菜时，加入蔬菜后注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料
D．为判断选择培养基是否起到了选择作用，设置接种普通培养基作对照
答案 A
解析 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄用清水冲洗，再除去枝梗，且不可反复冲洗，以免过多地将葡萄果皮上的野生酵母菌冲洗掉，影响酵母菌的发酵，A错误。
3．(2023·湖南长沙高三检测)平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列叙述正确的是( )
A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作
C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D．都能在培养基表面形成单个的菌落
答案 D
解析 平板划线法不需要进行梯度稀释，平板划线法是将菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，A、B错误；稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面，C错误；平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落，D正确。
4．下列有关微生物培养的叙述，错误的是( )
A．涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后用酒精灯外焰灼烧，冷却后再使用
B．纯化培养酵母菌时，培养皿应倒置放入28 ℃左右的培养箱内中培养24～48 h
C．计数时，可用稀释涂布平板法对需计数的微生物进行计数
D．观察菌落时，应将培养皿皿盖拿掉以利于看清菌落的形态特征
答案 D
解析 涂布接种时，将涂布器末端浸在盛有酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将蘸有酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后再使用，A正确；为防止空气中的杂菌污染培养物，观察菌落时，不能将培养皿皿盖拿掉，D错误。
5．(2023·湖南益阳高三模拟预测)为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。下列相关叙述正确的是( )
A．为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②③
B．图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C．图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
答案 D
解析 为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中①酒精灯(操作需要在酒精灯火焰旁进行，对涂布器进行灼烧灭菌)、③培养基和④涂布器(接种工具)，②接种环是平板划线法接种时需要使用的接种工具，A错误；图2中Ⅱ处透明圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误；不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果中抑菌圈的大小，D正确。
6．下图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是( )
A．①步骤使用的培养基是已经灭菌的培养基
B．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C．③到④的过程中，接种环共灼烧了5次
D．④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连
答案 C
解析 接种环在每次划线前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以③到④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，③到④的过程中共需灼烧接种环6次，C项错误。
7．某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是( )
A．可得出土壤样液中活菌数大约为5.7×107个/L
B．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C．一般选择菌落数在30～300的平板进行计数
D．显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数
答案 D
解析 根据题意分析可知，每升样品中的活菌数为(56＋58＋57)÷3÷0.1×1 000×100＝5.7×107(个)，A项正确；由于两个或多个细胞连在一起形成一个菌落，所以此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B项正确；显微镜直接计数法统计的是稀释液中所有个体的数目，即死菌数和活菌数，D项错误。
8．下图为分离以尿素为氮源的微生物的实验结果，下列叙述正确的是( )
A．图中采用平板划线法接种
B．图中①和②表示尿素培养基长出的菌落
C．图中③④培养基中菌落生长代谢时，会释放CO2
D．实验结果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例较高
答案 C
解析 根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A项错误；由图中①和②的菌落的特征可知，①稀释度为10－6的菌落数明显多于②稀释度为10－7时的菌落数，很可能是由于杂菌污染导致的结果，而不是分离出以尿素为氮源的微生物，B项错误；③④培养基中已经分离出由单个细菌繁殖而来的尿素分解菌的菌落，尿素分解菌能分泌脲酶，能够催化尿素分解成氨、二氧化碳和水，C项正确；根据实验结果，无法判断自然界中能合成脲酶的微生物比例，D项错误。
二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
9．聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，且废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的流程图如下。下列说法正确的是( )
A．步骤②可用稀释涂布平板法接种到含合成塑料的选择培养基上
B．步骤③需要将接种后的培养基放入恒温箱中倒置培养
C．步骤④所用到的培养基应加入琼脂，以便挑取单菌落获得纯化菌株
D．挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量
答案 BD
解析 PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，要筛选嗜盐细菌，步骤②可用稀释涂布平板法接种到含盐量较高的选择培养基上，A项错误；步骤④扩大培养应选用液体培养基，液体培养基中不应加入琼脂，C项错误；要挑选高产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的嗜盐菌，挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量，最后进行比较，D项正确。
10．产脂肪酶细菌可用于含油废水的处理。科研人员采用射线照射从土壤中分离的菌株，反复筛选后获得产脂肪酶能力较高的菌株，具体流程如图。下列相关叙述错误的是( )
A．步骤①取土壤样品灭菌后溶于无菌水中制成菌悬液
B．步骤②的固体平板是以脂肪作为唯一碳源的培养基
C．步骤②射线照射可引起细菌基因突变或染色体变异
D．步骤③透明圈越大的菌落，其脂肪酶活性一定越高
答案 ACD
解析 土壤样品中包含目的菌株，进行灭菌后会杀死所有微生物包括要培养的目的菌株，所以不可以进行灭菌处理，A错误；要筛选可以产生脂肪酶的细菌，需要用以脂肪作为唯一碳源的固体培养基，B正确；细菌是原核生物，没有成形的细胞核和染色体，因此用射线照射不会引起细菌染色体变异，C错误；透明圈大的菌落，酶活性不一定大，因此对初筛选的透明圈大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活性检测，D错误。
11．(2023·辽宁丹东高三期末)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，a、b、c表示操作步骤，d、e为菌落。下列叙述不正确的是( )
A．图中①②④为基本培养基，③为完全培养基
B．a操作的目的是提高突变率，增加突变株的数量
C．b的正确操作是用涂布器把菌液均匀地涂布在②表面
D．经c过程原位影印及培养后，可从④中挑取d菌落进行纯化培养
答案 A
解析 野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，根据题干信息和图形分析，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；紫外线可以提高突变的频率，a操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；b操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀的涂布在②培养基表面，C正确；从图中可看出，d菌落在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明d是氨基酸缺陷型菌落，故经c过程影印及培养后，可从④培养基中挑取d菌落进行纯化培养，D正确。
12．某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述不正确的是( )
A．在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B．等比稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C．振荡的目的是为了增加尿素分解菌的浓度
D．由图示菌落计数结果可知，10克土样中的菌株数约为1.6×106个
答案 CD
解析 酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取的土壤在倒入锥形瓶过程中被污染，A项正确；振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的利用率，C项错误；由题图分析可知，每克土样中的菌株数为1.6×106个，即10克土样中的菌株数约为1.6×107个，D项错误。
三、非选择题
13．(2022·全国乙，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有_________________________________________________________________ (答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是______________；用菌株C生产S的最适碳源是______________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要______________________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是___________________________
_______________________________________________________________________________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：____________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是__________________________________。
答案 (1)干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌) (2)葡萄糖 制糖废液 氮源、无机盐 (3)缺少淀粉酶 (4)设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度 (5)减少污染、节省原料、降低生产成本
解析 (1)防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键，对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌，湿热灭菌中效果最好的方法)、灼烧灭菌。(2)分析题干实验结果，以葡萄糖为碳源时，细胞干重最大，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖；以制糖废液为碳源时，S产量最高，故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、生长因子等营养物质。(3)由实验结果可知，菌株C可以利用葡萄糖，但在以淀粉为碳源时，菌株C不能生长，说明菌株C无法利用淀粉，分析其原因是菌株C不能合成淀粉酶，导致其无法利用淀粉。(4)以制糖废液作为碳源，进一步确定生产S的最适碳源浓度，可以以碳源浓度作为自变量，不同碳源浓度下S产量作为因变量，实验思路为：设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，从而确定最适碳源浓度。
14．菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志，也可以用于观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对送检样品进行卫生学评估提供证据。下图是某样品培养简化流程图，请分析回答下列问题：
(1)该营养琼脂培养基配制过程中，其基本步骤包括按照培养基配方准确计算、称量、溶化、调节pH、____________________法灭菌等。然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，选择此温度的理由是______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)实验过程中须将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，其目的是__________________________________。从水浴锅取出营养琼脂培养基倒平板适量，稍冷却后移液0.2 mL样品于培养皿进行涂布，涂布时可______________，使涂布更均匀。
(3)本实验用菌落计数的原理是基于__________________________________，运用这种方法统计的结果往往较实际值偏________。具体培养结果如下表。选取菌落数30～300的培养皿作为菌落总数的测定标准。当只有一个稀释浓度的平均菌落数符合此范围，以该培养皿菌落数×稀释倍数报告。当有两个浓度菌落值在30～300之间，报告结果由二者菌落数比值决定，若比值不大于2，则取平均数，且菌落数大于100取两位有效数字，两位之后的数值四舍五入；若比值大于2，则报告稀释度较低(稀释次数越多，稀释度越高)的培养皿菌落数。请填写例次3中“？”处的菌落总数为________。
例次 不同稀释度平均菌落数 两稀释度菌落数之比 菌落总数/ [CFU/mL(g)]
10－1 10－2 10－3
1 1 365 164 20 — 16 400
2 2 760 295 46 1.6 38 000
3 2 890 271 60 2.2 ？
(4)利用鲜奶进行工业生产酸奶时，不能使用________污染的鲜奶为原料，否则会使乳酸菌生长受到限制；利用________法可以除去鲜奶中的白细胞、杂菌和其他肉眼可见的异物，取其上清液用于发酵制酸奶。
(5)密封良好的泡菜坛内有时会长一层白膜，这些白膜是____________(填“乳酸菌”或“酵母菌”)繁殖产生的。在泡菜腌制过程中坛、蔬菜等均未进行严格灭菌，而在发酵过程中一般不会出现其他杂菌大量繁殖，其原因是________(填序号)。
①发酵的原料中缺乏杂菌生长需要的各种营养物质
②发酵过程的温度不适合杂菌的生长
③乳酸菌产生较多乳酸，许多好氧菌被杀死
④在自然界中乳酸菌占优势
答案 (1)高压蒸汽灭菌(湿热灭菌) 保证培养基处于溶化状态(在凝固之前接种且不致将培养物烫死) (2)尽量使样品中的微生物细胞分散 转动培养皿 (3)一个菌落代表一个活菌 小 27 100 (4)抗生素 离心 (5)酵母菌 ③
解析 (1)配制培养基时应按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，并进行高压蒸汽灭菌；然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，用手触摸不烫手以便于操作，并能保证培养基处于溶化状态，且在凝固之前接种不致将培养物烫死。(2)实验过程中要将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，尽量使样品中的微生物细胞分散；为了使涂布更均匀，涂布时可转动培养皿。(3)根据题意可知，例次3应选取稀释度为10－2的菌落数报告，则例次3菌落总数为271×100＝27 100。(4)抗生素污染会使乳酸菌生长受到限制，因此不能使用抗生素污染的鲜奶为原料生产酸奶，原料乳中可能含有细胞类物质(如上皮细胞的白细胞等)，其中一些是牛乳中固有的，也有一些是挤奶过程中牛乳受污染而带进牛奶的，为了保证产品获得良好的最终质量，酸乳制作中第一步就是要除去这些污染物质，常利用特别设计的离心机进行离心除去牛乳中的白细胞和其他肉眼可见的异物。(5)泡菜发酵利用的菌种是乳酸菌，在发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸及无氧环境不利于其他杂菌的生长，所以发酵过程中一般不用严格灭菌，泡菜坛内表面会长出一层白膜，这些白膜是酵母菌繁殖产生的。第2课时 微生物的培养技术及应用
课标要求 1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一 微生物的培养技术及应用
1．培养基的配制
(1)培养基的概念、用途和类型
①概念：人们按照微生物对________________的不同需求，配制出的供其________________的营养基质。
②用途：用以____________________________微生物或积累其________。
③种类：按物理性质分
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、______、氮源、______。
②其他条件：pH、________________和氧气。如下表：
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加____________ pH调至__________ pH调至________
2.无菌技术
(1)目的：获得________的微生物培养物。
(2)关键：防止________污染。
(3)消毒与灭菌的比较
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为________的理化因素 ________的理化因素
作用程度 杀死物体表面或内部________微生物 杀死物体内外的________微生物
芽孢和孢子 一般不能杀灭 能杀灭
适用对象 实验操作的空间、操作者衣着和双手 微生物培养器皿、接种用具和培养基等
常用方法 __________消毒法、__________消毒法等 ________灭菌法、________灭菌法、________灭菌法等
(4)注意事项
①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与________________接触。
②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在__________________附近进行。
3．微生物的纯培养
(1)概念辨析
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
(3)平板划线法操作步骤
下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：________________________________。
(2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(4)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
1．(不定项)在实验室培养微生物，需要人为地为微生物提供适宜的营养和环境条件。下列关于培养基配制的说法正确的是( )
A．培养基中需要碳源、氮源、水和无机盐齐全
B．培养基中必须添加琼脂
C．培养基制备中均需调节pH至酸性
D．无论哪种培养基均需要灭菌
2．(2023·辽宁沈阳高三模拟)下列操作不能达到灭菌目的的是( )
A．使用高压锅处理器皿
B．在火焰上灼烧接种环
C．用干热灭菌箱处理金属用具
D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
3．(2023·山东东营高三模拟)下图为微生物的实验室培养的有关操作，下列相关叙述错误的是( )
A．步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B．步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C．图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得单个菌落
D．接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
归纳总结 (1)无菌技术的三个主要注意点
①实验前应对操作空间、操作人员进行消毒，对所用器具和培养基进行灭菌。
②实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作。
③避免已杀菌处理的材料再次污染。
(2)倒平板时的注意事项
①琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固。倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。
②可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
考点二 微生物的选择培养和计数
1．区分选择培养基与鉴别培养基
种类 特点 用途 举例
选择培养基 允许___________________________ _____________，同时_____________ _________________________ 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
提醒 常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2．微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
②间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
根据图示问答以下问题：
a．为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。
b．为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
c．某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是________个/mL，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为_______个/mL，所以每克样品中的细菌数是_______个。
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
(2)实验流程
(3)实验结果分析与评价
选择性必修3 P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的__________可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的________性增强，在培养基中加入________________培养细菌，若指示剂变________，可确定该细菌能够分解尿素。
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4．下列有关培养基的叙述正确的是( )
A．筛选、培养硝化细菌的培养基中不能加入氮源
B．固体培养基中的琼脂能为微生物生长提供碳源
C．在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基
D．培养基中加入刚果红可用于尿素分解菌的鉴定
5．(2021·江苏1月适应性考试，14)稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是( )
A．固体培养基灭菌后，应冷却至50 ℃左右时倒平板
B．倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌的生长
C．稀释涂布平板分离到的单菌落需进一步划线纯化
D．稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数
归纳总结 两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
1．(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是( )
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
2．(2021·北京，12)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是( )
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
3.(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
4．(2022·全国甲，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下：
培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题：
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成__________(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是__________
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_____________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是__________，理由是____________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
1．判断关于培养基的叙述
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( )
(2)培养霉菌时需将培养基的pH调至中性或弱碱性( )
(3)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )
2．判断关于无菌技术的叙述
(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( )
(2)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( )
(3)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和灭菌( )
3．判断关于微生物的培养与计数的叙述
(1)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数( )
(2)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计( )
(3)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数( )
4．填空默写
(1)(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括________________________等。
(2)选择性必修3 P10)获得纯净的微生物培养物的关键是________________________，无菌技术除了用来____________________________外，还能________________________________。
(3)(选择性必修3 P12)菌落是指_____________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
采用______________法和____________________法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(4)(选择性必修3 P16)选择培养基是指_______________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(5)(选择性必修3 P12)平板冷凝后，要将平板倒置的原因是_____________________________。
(6)(选择性必修3 P13)平板划线操作的第一步灼烧接种环是为了________________________；每次划线前灼烧接种环是为了___________________________________________________，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能_________________________________________________________________。
(7)(选择性必修3 P13)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是_____________
_______________________________________________________________________________。
(8)(选择性必修3 P13)在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(9)(选择性必修3 P18)当________________________________________________________，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(10)(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是_________________________。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是_________________________________________
_______________________________________________________________________________。
