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第6课时
基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求
1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。
4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 重组DNA技术的基本工具
考点二 基因工程的基本操作程序
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
内容索引
重温高考 真题演练
课时精练
考点一
重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念
归纳 夯实必备知识
别名 技术
操作环境 生物体外
操作对象 ______
操作水平 水平
结果 创造出更符合人们需要的新的 和__________
重组DNA
基因
DNA分子
生物类型
生物产品
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间 。
(2)DNA双螺旋结构的提出和 的证明。
(3)中心法则的确立。
(4) 的破译。
(5)基因转移载体和 的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
转移
半保留复制
遗传密码
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶
(6) 体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9) 技术的发明。
(10) 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
DNA
PCR
基因组编辑
3.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
黏性末端
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
(2)DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
(3)载体
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶 (填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是 ，而DNA聚合酶是把单个的 连接到已有的DNA片段上。② 起作用时需要以一条DNA链为模板，而 不需要模板。
不是
两个DNA片段
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
DNA连接酶
延伸
应用
图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
延伸
应用
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制性内切
核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是 ，根据图示分析回答下列问题：
拓展 提升科学思维
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
提示 限制性内切核酸酶Ⅰ：
限制性内切核酸酶Ⅱ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示 用限制酶Ⅱ切割目的基因，用
限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的
识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是
突破 强化关键能力
注：Y为C或T，R为A或G。
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
√
HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；
Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；
BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；
HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。
2.(不定项)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随
后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
√
质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布；并不是所有的质粒上都有限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制。
与DNA有关的几种酶的比较
归纳
提升
考点二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用 和序列比对工具进行筛选。
归纳 夯实必备知识
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR 和扩增目的基因
a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。
b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种______
、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。
获取
DNA半保留复制
组分
大量复制
缓冲溶液
引物
脱氧
核苷酸
耐高温的
温度
c.PCR扩增的过程
90
单链
50
引物
72
d.PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
③通过构建 来获取目的基因。
琼脂糖凝胶电泳
基因文库
(1)源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈 ，肠道细胞也无特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
(2)源于选择性必修3 P77“相关信息”：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的 。
酸性
短单链核酸
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
启动子
标记基因
(3)构建过程
提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、____________ 显微注射法 处理法
受体细胞 ________________ _______ 原核细胞
花粉管通道法
体细胞或受精卵
受精卵
Ca2＋
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题：
(1)什么是引物？
提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
(2)PCR技术为什么需要引物？
提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
拓展 提升科学思维
(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？
提示 目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。
(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？
提示 两种引物之间不能互补配对。
(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
提示 引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？
提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
3.(不定项)(2023·湖南怀化高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是
A.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分
子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终
止子等结构才能进行转录和翻译
B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链
D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
突破 强化关键能力
√
√
单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；
除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及
其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
4.下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是
A.过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B.过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性
C.抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D.转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
√
题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，A错误；
CaCl2处理只是提高农杆菌细胞细胞膜的通透性，B错误；
抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；
转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染来进行鉴定，D正确。
归纳
提升
(1)PCR技术和
DNA复制的比较
归纳
提升
(2)PCR扩增过程中的循环图示与规律
归纳
提升
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考点三
DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
归纳 夯实必备知识
不溶于
2 mol/L
二苯
胺
(2)操作流程
95%
沸水
注意 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了 原理。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
DNA的热变性
相反
大小和构象
(2)PCR实验操作步骤
微量移液器
底部
离心管
(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______的紫外灯下被检测出来。
300 nm
1.在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？
提示 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(3)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
拓展 提升科学思维
2.如何来评价扩增的效果？
提示 观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
5.(2023·山东济南高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是
A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量
B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加
C.向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质
D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化
√
突破 强化关键能力
洋葱研磨液要用纱布过滤，A错误；
DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA，但提取量不变，B错误；
向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液有利于去除杂质，加入2 mol/
L的NaCl溶液是溶解粗提取的DNA，C错误；
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热，冷却后再观察颜色变化，D正确。
6.(不定项)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述正确的是
A.选用植物细胞提取DNA时需先
研磨破碎细胞
B.图2所示实验操作中有一处明显
错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试
剂出现蓝色
√
√
图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；
图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。
四
重温高考 真题演练
1.(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
1
2
3
4
√
增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；
延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带的产生，B、C错误。
1
2
3
4
2.(2021·山东，13)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
√
1
2
3
4
木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入木瓜蛋白酶后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；
37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；
向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；
1
2
3
4
加入NaCl调节浓度至 2 mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 mol/
L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。故选A。
1
2
3
4
3.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
1
2
3
4
A.①＋③ B.①＋② C.③＋② D.③＋④
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是
√
引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示
1
2
3
4
中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。
4.(2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
1
2
3
4
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由______________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是______
_________________。
磷脂、蛋白质
射线，形成纺锤体
发出星
1
2
3
4
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是
__________。PCR扩增时，需在__________________________________催化下，在引物____端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
溶解DNA
耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
3′
从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的
1
2
3
4
目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在TaqDNA聚合酶的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
1
2
3
4
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。
1
2
3
4
请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物______；
②PCR目的产物约为______bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是_____(选填序列编号)
a、b
1 100
Q3
1
2
3
4
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________
X蛋白参与中心体的形成
1
2
3
4
PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。
为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列应含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ识别位点，
1
2
3
4
1
2
3
4
根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
1
2
3
4
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_______形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的____倍。
逆转录
32
1
2
3
4
研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)，说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215＝y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32(倍)。
1.判断关于基因工程的基本工具的叙述
(1)限制酶只能用于切割目的基因( )
(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
五分钟 查落实
×
×
×
×
2.判断关于基因工程的基本操作程序的叙述
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因
( )
(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( )
(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( )
(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应
( )
×
×
×
×
3.判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述
(1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存( )
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( )
(3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( )
(4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色( )
×
×
×
×
4.填空默写
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：___________________________________
____________________________________________________________________。
(2)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的 序列，并且使每一条链中特定部位的 断开。
(3)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于________________
。
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
特定核苷酸
磷酸二酯键
重组DNA分子的
筛选
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供
、 、4种 和耐高温的 。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有 等。
(6)(选择性必修3 P81)转化：_______________________________________
。
DNA模板
2种引物
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
启动子、终止子
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞
内维持稳定和表达的过程
五
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1.(2023·湖南常德高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是
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A.甲、乙、丙都属于黏性末端
B.甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C.DNA连接酶的作用位点在图乙中b处
D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
√
甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；
DNA连接酶将两个DNA片段
连接为一个DNA分子，作用
部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；
切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
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2.T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是
A.T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B.T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C.ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D.T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
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√
T4 DNA连接酶有专一性，A错误；
酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；
ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干信息“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；
T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。
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3.(2023·山东日照高三检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是
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A.构建重组DNA时，可用BglⅡ和
Sau3AⅠ切割目的基因所在片段
和P1噬菌体载体
B.构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C.图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D.用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只
能产生一种重组DNA
√
P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；
由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。
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4.下列有关获取目的基因的叙述，错误的是
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
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√
目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；
目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；
来自苏云金杆菌的Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，C正确；
随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。
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5.(2023·河北石家庄高三模拟)如图是快速RT－PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是
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A.逆转录酶具有DNA聚合酶的能力
B.③PCR过程只需要引物b
C.RT－PCR可检测基因表达水平
D.RT－PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
√
③PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与cDNA一致的，B错误。
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6.(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
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√
离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；
细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
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7.(2023·辽宁沈阳高三调研)引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是
A.引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高
B.根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等
C.两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合
D.引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
√
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退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；
根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；
两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；
引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，氢键越多，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。
8.DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是
A.DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢
B.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测
C.拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽
提DNA片段，从而提高回收率
D.新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉
污染
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拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再体积分数为用95%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率，C错误。
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二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
9.(2023·辽宁锦州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。
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下列说法不正确的是
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA
后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原
理都是抗原—抗体杂交
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√
PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；
若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。
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10.(2023·江苏淮安高三模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。
A.应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B.所选用的受体菌含有AmpR和TetR基因
C.用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌
D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
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为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；
所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B错误；
用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；
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据题图分析可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
11.(2023·辽宁沈阳高三质量监测)科研人员通过PCR技术获得白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列相关叙述正确的是
A.将基因表达载体导入肝细胞经培育获得转基因小鼠
B.利用PCR技术获得白蛋白启动子需要两种引物
C.通过抗原－抗体杂交技术可检测Cre基因是否完成表达
D.将发育到原肠胚时期的重构胚向受体进行移植
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√
将该表达载体导入受精卵以获得转基因小鼠，A错误；
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端(子链的5′端)开始延伸DNA，因此PCR过程中需要添加引物才能完成复制过程，要合成两条子链，需要两种引物，B正确；
Cre基因完成表达的产物是蛋白质，故可通过抗原－抗体杂交技术进行检测，C正确；
胚胎移植需要胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D错误。
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三、非选择题
12.如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
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表1
项目 pIJ702 pZHZ8
BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb
固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL) 0 1 2 5 10
不含质粒的链霉菌生长状况 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － －
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
表2
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的___________断裂，切割形成的末端有__________________两种。
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磷酸二酯键
黏性末端和平末端
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/
SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为______kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是_____________________
____________________________________________________________________。
1.4
pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段
质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4(kb)。
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(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成______过程。
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转化
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在____μg/mL以上，挑
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选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是___________________________
_______________________________________________________________
_________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的_______(填“DNA”或“RNA”)。
根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选
RNA
从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否
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发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。
13.(2021·江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
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(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
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RNA
以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致__________
____________。
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不含tag标签
蛋白M上
从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
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③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有_____。
A.TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为50～60 ℃
B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性
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BC
从题干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增”，故TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为94 ℃左右，A错误；
PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；
DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
TaqDNA聚合酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高温，D错误。故选BC。
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(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进_______________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成质粒的环化。
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DNA连接
黏性末端碱基互补配对
从图上看，载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点，故被SmaⅠ切开后，载体由环状变为链状DNA，将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
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②若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在____________
_________________。
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基因m的连接
处、基因m的内部
重组质粒中，载体A被SmaⅠ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
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(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是_______________________________________________________
_______________________________。
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受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落
筛选目的菌株的机理：导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明____
____________________________________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
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合基因表达(或重组质粒
A－m构建成功)
融
若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)。
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14.如图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
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(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有_____
____的因子。过程①所用到的组织细胞是_______________，③过程的目的是___________________
______，⑤过程常用_____处理大肠杆菌。
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作用
人垂体组织细胞
调控
将平末端处理为黏性
末端
Ca2＋
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有____种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有____种和____种。
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假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示(后面的→均按照顺时针方向)。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培
养基上的目的是筛选__________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是____________________________________
______。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是______________
_______________。
含四环素抗性基因
完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的
质粒)
在丙中能存活，
在乙中不能存活
1
2
3
4
5
6
7
8
9
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14第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
别名 重组DNA技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
结果 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
(5)基因转移载体和限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6)DNA体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)PCR技术的发明。
(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
延伸应用 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
提示 限制性内切核酸酶Ⅰ：
限制性内切核酸酶Ⅱ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示 用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 D
解析 HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。
2．(不定项)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
答案 D
解析 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布；并不是所有的质粒上都有限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制。
归纳提升 与DNA有关的几种酶的比较
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR获取和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
b．PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
c．PCR扩增的过程
d．PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
③通过构建基因文库来获取目的基因。
(1)源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
(2)源于选择性必修3 P77“相关信息”：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题：
(1)什么是引物？
提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
(2)PCR技术为什么需要引物？
提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？
提示 目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。
(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？
提示 两种引物之间不能互补配对。
(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
提示 引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？
提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
3．(不定项)(2023·湖南怀化高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
答案 BC
解析 单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
4．下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( )
A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
答案 D
解析 题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，A错误；CaCl2处理只是提高农杆菌细胞细胞膜的通透性，B错误；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染来进行鉴定，D正确。
归纳提升 (1)PCR技术和DNA复制的比较
(2)PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
(2)操作流程
注意 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
1．在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？
提示 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。(3)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
2．如何来评价扩增的效果？
提示 观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
5．(2023·山东济南高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量
B．滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加
C．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化
答案 D
解析 洋葱研磨液要用纱布过滤，A错误；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA，但提取量不变，B错误；向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液有利于去除杂质，加入2 mol/L的NaCl溶液是溶解粗提取的DNA，C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热，冷却后再观察颜色变化，D正确。
6．(不定项)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述正确的是( )
A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
答案 AB
解析 图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。
1．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
答案 D
解析 增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带的产生，B、C错误。
2．(2021·山东，13)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A．加入适量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C．加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D．加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案 A
解析 木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入木瓜蛋白酶后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入 NaCl 调节浓度至 2 mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 mol/L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。故选A。
3．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案 B
解析 引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。
4.(2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是______________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是_______________________。PCR扩增时，需在______________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________________________________________________________
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。
答案 (1)磷脂、蛋白质 发出星射线，形成纺锤体 (2)溶解DNA 耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 3′ (3)a、b 1 100 Q3 X蛋白参与中心体的形成 (4)逆转录 32
解析 (2)从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在TaqDNA聚合酶的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列应含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。(4)研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)，说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215＝y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32(倍)。
1．判断关于基因工程的基本工具的叙述
(1)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × )
2．判断关于基因工程的基本操作程序的叙述
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因( × )
(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( × )
(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( × )
(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应( × )
3．判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述
(1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存( × )
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( × )
(3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( × )
(4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色( × )
4．填空默写
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P81)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1．(2023·湖南常德高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
答案 C
解析 甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
2．T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是( )
A．T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B．T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C．ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D．T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
答案 C
解析 T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干信息“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。
3．(2023·山东日照高三检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是( )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
答案 D
解析 P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。
4．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
答案 A
解析 目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。
5．(2023·河北石家庄高三模拟)如图是快速RT－PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是( )
A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力
B．③PCR过程只需要引物b
C．RT－PCR可检测基因表达水平
D．RT－PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
答案 B
解析 ③PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与cDNA一致的，B错误。
6．(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B
解析 离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
7．(2023·辽宁沈阳高三调研)引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是( )
A．引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高
B．根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等
C．两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合
D．引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
答案 B
解析 退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，氢键越多，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。
8．DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是( )
A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢
B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测
C．拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率
D．新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染
答案 C
解析 拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再体积分数为用95%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率，C错误。
二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
9．(2023·辽宁锦州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是( )
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
答案 C
解析 PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。
10．(2023·江苏淮安高三模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是( )
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。
A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B．所选用的受体菌含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
答案 BC
解析 为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B错误；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据题图分析可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
11．(2023·辽宁沈阳高三质量监测)科研人员通过PCR技术获得白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列相关叙述正确的是( )
A．将基因表达载体导入肝细胞经培育获得转基因小鼠
B．利用PCR技术获得白蛋白启动子需要两种引物
C．通过抗原－抗体杂交技术可检测Cre基因是否完成表达
D．将发育到原肠胚时期的重构胚向受体进行移植
答案 BC
解析 将该表达载体导入受精卵以获得转基因小鼠，A错误；DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端(子链的5′端)开始延伸DNA，因此PCR过程中需要添加引物才能完成复制过程，要合成两条子链，需要两种引物，B正确；Cre基因完成表达的产物是蛋白质，故可通过抗原－抗体杂交技术进行检测，C正确；胚胎移植需要胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D错误。
三、非选择题
12．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
项目 pIJ702 pZHZ8
BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb
表1
固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL) 0 1 2 5 10
不含质粒的链霉菌生长状况 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － －
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
表2
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是____________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成________________过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是_____________________________________________________
_______________________________________________________________________________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的__________(填“DNA”或“RNA”)。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)1.4 pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段 (3)转化 (4)5 根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选 RNA
解析 (2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4(kb)。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。
13．(2021·江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞__________________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致__________________。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有__________。
A．TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为50～60 ℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在__________
_______________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明_____________________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
答案 (1)①RNA ②蛋白M上不含tag标签
③BC (2)①黏性末端碱基互补配对 DNA连接 ②基因m的连接处、基因m的内部 (3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落 ②融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)
解析 (1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③从题干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增”，故TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为94 ℃左右，A错误；PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；TaqDNA聚合酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高温，D错误。故选BC。(2)①从图上看，载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点，故被SmaⅠ切开后，载体由环状变为链状DNA，将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被SmaⅠ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理：导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)。
14．如图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是________________________________________________________，③过程的目的是________________________，⑤过程常用____________________________________处理大肠杆菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和________种。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选______________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是_______________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是______________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)调控作用 人垂体组织细胞 将平末端处理为黏性末端 Ca2＋ (2)9 3 3 (3)含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒) 在丙中能存活，在乙中不能存活
解析 (2)假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示(后面的→均按照顺时针方向)。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
别名 ________技术
操作环境 生物体外
操作对象
操作水平 ________水平
结果 创造出更符合人们需要的新的________________和________________
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间________。
(2)DNA双螺旋结构的提出和______________的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)________________的破译。
(5)基因转移载体和________________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6)________体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)________技术的发明。
(10)________________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶________(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是________________，而DNA聚合酶是把单个的______________连接到已有的DNA片段上。②________________起作用时需要以一条DNA链为模板，而________________不需要模板。
延伸应用 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
2．(不定项)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
归纳提升 与DNA有关的几种酶的比较
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞_______________或获得预期________________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知________________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用________________和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR________和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据________________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种________与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行________________的技术。
b．PCR反应的条件：一定的______________、DNA模板、2种______________、4种________________、________________DNA聚合酶，以及能自动调控__________的仪器。
c．PCR扩增的过程
d．PCR产物的鉴定：常采用________________来鉴定。
③通过构建____________来获取目的基因。
(1)源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈________，肠道细胞也无特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
(2)源于选择性必修3 P77“相关信息”： 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的________________。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、___________ 显微注射法 ____处理法
受体细胞 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题：
(1)什么是引物？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(2)PCR技术为什么需要引物？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
3．(不定项)(2023·湖南怀化高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
4．下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( )
A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
归纳提升 (1)PCR技术和DNA复制的比较
(2)PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
(2)操作流程
注意 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了________________原理。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的________________等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______的紫外灯下被检测出来。
1．在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
2．如何来评价扩增的效果？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
5．(2023·山东济南高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量
B．滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加
C．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化
6．(不定项)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述正确的是( )
A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
1．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
2．(2021·山东，13)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A．加入适量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C．加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D．加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
3．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
4. (2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是_____________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是______________________
_______________________________________________________________________________。
PCR扩增时，需在____________________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__________________________________ ______________________________________
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经______________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。
1．判断关于基因工程的基本工具的叙述
(1)限制酶只能用于切割目的基因( )
(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
2．判断关于基因工程的基本操作程序的叙述
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因( )
(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( )
(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( )
(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应( )
3．判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述
(1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存( )
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( )
(3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( )
(4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色( )
4．填空默写
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：___________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的________________序列，并且使每一条链中特定部位的______________________断开。
(3)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于________________________________。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供______________、________________、4种________________和耐高温的________________。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有________________等。
(6)(选择性必修3 P81)转化：_______________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
