【课堂新坐标，同步备课参考】2013-2014学年高中生物（人教版）选修1教师用书：专题5《DNA和蛋白质技术》

课题1DNA的粗提取与鉴定
(教师用书独具)
●课标要求
1．掌握DNA粗提取的方法和过程。
2．了解DNA鉴定的原理。
●课标解读
1．尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取。
2．了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
●教学地位
　课程标准对本课题没有明确的要求，但“DNA粗提取与鉴定”实验难度较低，相对于蛋白质的提取，成功率较高，通过本课题，可使学生体会从生物材料中获取生物大分子的原理及思路。
●教法指导
1．DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，进行该部分教学时，教师应该重点引导学生阅读教材图5—1，让学生根据曲线图自己归纳DNA的溶解度与NaCl溶液浓度之间的关系，进而理解将DNA与其他杂质分开的这种原理。
2．对于将DNA与蛋白质分开的其他方法，原理较简单，可引导学生认识DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性的不同，教材实验设计中的方案二、三正是基于这两种原理进行设计的。
3．对于DNA的鉴定，教师可通过演示实验，或者直接观察教材上的图片，让学生记住鉴定的试剂、条件及出现的现象。
(教师用书独具)
●新课导入建议
　可利用课题背景直接导入。DNA是学生非常熟悉的名词，但学生只是熟悉它的功能、结构及分布等，从来没有见过真正的DNA到底如何，由此引入DNA粗提取的课题。
●教学流程设计
学生课前预习：阅读教材P53－57，填写【课前自主导学】，完成“思考交流”。了解本课题的基础知识。?步骤1：情景导课：以【新课导入建议】引出课题。通过学生阅读、提问进行基础知识部分的教学。?步骤2：通过【课堂互动探究】探究1，明确DNA粗提取的原理，重点是DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度。通过例1检测、巩固。?步骤3：学生阅读教材实验操作部分，熟悉实验流程，思考：选择什么样的材料提取DNA容易获得成功？?
课　标　解　读 重　点　难　点
1.尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取。2.了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。 DNA的粗提取和鉴定方法。(重难点)
提取DNA的方法和原理
1.提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2．DNA粗提取的方法
(1)概念：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
(2)原理
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
3．DNA的特点
(1)溶解性
(2)耐受性
4．DNA的鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
　在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？
【提示】　DNA在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。当NaCl溶液物质的量浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度增加而逐渐降低；当NaCl溶液物质的量浓度高于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度增加而逐渐升高。
实验设计
1.过程
2．操作提示
(1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠 ，防止血液凝固。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用。
1．DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，NaCl溶液的浓度越高，DNA的溶解度越高。(×)
【提示】　当NaCl溶液的浓度低于0.14 mol/L时，随NaCl溶液浓度的升高，DNA的溶解度降低。
2．DNA和蛋白质一样，在60～80 ℃的高温条件下会变性。(×)
【提示】　大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80 ℃以上才会变性。
3．提取洋葱的DNA时，加入一定量的洗涤剂的目的是利于DNA的溶解。(×)
【提示】　洗涤剂的作用是溶解细胞膜，利于DNA的释放。
4．提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替。(×)
【提示】　哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核。
DNA粗提取的原理
【问题导思】　
①在不同浓度的NaCl溶液中，DNA的溶解度如何？
②利用哪些原理可将DNA与其他杂质分离？
1．DNA溶解度
(1)在NaCl溶液中的溶解性
溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 NaCl溶液浓度从2 mol/L降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解
总结 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大②选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的
　(2)在酒精中的溶解性
DNA不溶于酒精，而某些蛋白质能溶于酒精。
2．DNA与蛋白质对蛋白酶、高温、洗涤剂的耐受性
DNA 蛋白质
蛋白酶 没影响 水解
高温 80 ℃以上才会变性 60～80 ℃会变性
洗涤剂 没影响 瓦解细胞膜(破坏膜中的蛋白质分子)
1．利用DNA随NaCl溶液浓度的不同而溶解度不同可粗提取DNA。
2．利用DNA与蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同提取DNA。
3．利用DNA不溶于酒精，而细胞内的其他许多物质可溶于酒精，可进一步提纯DNA。
　(2012·南京高二检测)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些物质溶于酒精溶液。下图为“DNA的粗提取”实验的相关操作步骤，其操作目的错误的是(　　)
A．①是洗涤红细胞、去除红细胞表面的杂质
B．②是稀释NaCl溶液至0.14 mol/L，析出DNA
C．③是选用2 mol/L NaCl溶液，溶解黏稠物中的DNA
D．④是纯化DNA，去除溶于95%酒精的杂质
【审题导析】解答本题的关键是区分①～④烧杯中所添加的试剂及浓度，从而判断相应处理的目的。
【精讲精析】　①中添加的是蒸馏水，目的是使鸡血细胞破碎，A项错误；②是在NaCl溶液中添加蒸馏水，使其浓度降低至0.14 mol/L，此时DNA的溶解度最低，DNA会析出，B项正确；③是将析出的DNA溶解于2 mol/L的NaCl溶液，C项正确；在DNA的NaCl溶液中添加酒精，可除去能溶于95%酒精的杂质，D项正确。
【答案】　A
DNA粗提取和鉴定的实验过程
　　 分析
【问题导思】　
①DNA粗提取的实验步骤如何？
②选择鸡血作实验材料有何优点？
③实验过程中两次加入蒸馏水的目的是什么？
1．实验流程
破碎细胞
甲
　
乙
溶解核内DNA：向上述滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液，玻璃棒沿同一个方向搅拌
　
丙
析出含DNA的黏稠物：向上述滤液中缓缓加入蒸馏水，并用玻璃棒轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当黏稠物不再增加时，停止加水(此时NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L)(如丙图)
　
过滤含DNA的黏稠物：用多层纱布过滤，含DNA的黏稠
物留在纱布上
　
丁
DNA黏稠物再溶解
　
　溶解),\s\do5((如丁图)))
过滤含DNA的2 mol/L NaCl溶液：用两层纱布过滤，滤液中含DNA
戊
　
提取含杂质较少的DNA：向上述滤液倒入等体积的冷却的体积分数为95%酒精溶液，缓慢搅拌，出现白色丝状物，用玻璃棒将丝
己
状物卷起(如戊图)
　
DNA的鉴定：装置如己图
2．实验过程中的部分步骤分析
(1)选取鸡血细胞的原因：鸡血细胞核中的DNA含量丰富，材料易得，并且鸡血细胞容易吸水涨破。而猪、羊等哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，DNA含量少，不适合做实验材料。
(2)实验过程中的几点注意事项
①两次使用蒸馏水的作用：第一次用蒸馏水是使鸡血细胞吸水涨破，提取核DNA；第二次用蒸馏水稀释NaCl溶液，使DNA析出。
②所用的酒精必须充分预冷才能使用，冷酒精与含有DNA的NaCl溶液的体积比是1∶1。
③实验中三次过滤操作的比较
过滤次数 过滤目的
第一次 过滤核外物质，除去不溶的杂质
第二次 过滤除DNA外的其他核内物质，尤其是核蛋白
第三次 过滤DNA滤液
④用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏。
⑤DNA易吸附在玻璃器皿上，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，可减少提取过程中DNA的损失。
(3)实验中六次搅拌的目的
目的
第一次 搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液，加速细胞破裂
第二次 搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速DNA的溶解
第三次 搅拌加蒸馏水的NaCl溶液，均匀稀释以析出更多DNA
第四次 搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速DNA的溶解
第五次 搅拌含DNA的酒精，提取含杂质较少的DNA
第六次 搅拌含DNA白色丝状物的盐溶液，加速DNA的溶解
1．若选取肝脏细胞或植物细胞做实验材料，则必须充分研磨。
2．为了防止采集的血液凝固，应加入抗凝剂——柠檬酸钠。
　某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下。
(一)材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(二)DNA粗提取
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol·L－1NaCl溶液溶解上述絮状物。
(三)DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
(注：“＋”越多表示蓝色越深)
分析上述实验过程，回答下列问题。
(1)该探究性实验课题名称是________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减____________________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2： ____________________。
②针对结论1，请提出合理的解释： ________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高
DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是： ___________________________
________________________，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
【思维导图】　
材料的选取：含DNA多的操作规范：搅拌要缓慢仪器选择：塑料器皿
【精讲精析】　(1)分析表格可知，实验目的在于探究材料的不同和保存温度的不同对DNA提取量的影响。
(2)DNA分子为链状，很容易断裂，所以应缓缓地向一个方向搅拌。
(3)分析表格可看出，同种材料在－20 ℃时DNA提取量较多，不同材料在同种温度下保存时，蒜黄的DNA提取量最多。低温下酶活性较低，DNA降解慢。
(4)根据题意，可用氯仿将DNA溶液中的蛋白质析出，进一步提高DNA的纯度。
【答案】　(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响　(2)DNA断裂　(3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多　②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢　(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
本 课 知 识 小 结
网 络 构 建
结 论 语 句
1．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。
2．DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，可利用冷却的酒精对提取的DNA进行纯化。
3．用二苯胺鉴定DNA，在沸水浴的条件下呈现蓝色。
4．提取DNA时，破碎动物细胞的方法是用蒸馏水，破碎植物细胞需加入洗涤剂和食盐进行搅拌和研磨。
5．提取DNA的流程是：材料的选取、DNA的释放和溶解、DNA的纯化及DNA的析出与鉴定。
1．由于鸡血没有找到，某同学尝试用猪的血液来代替，但结果没有成功，其最可能的原因是(　　)
A．操作方法不对　　　　 B．猪血含DNA过少
C．NaCl溶液浓度太高 D．加二苯胺过少
【解析】　猪的血液中主要是红细胞，但猪的成熟红细胞中无细胞核，所以猪血细胞中DNA含量低。
【答案】　B
2．(2013·万盛高二检测)若从植物细胞中提取DNA，发现实验效果不好，如看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定时不显示颜色反应等。其可能的原因是(　　)
①植物细胞中DNA含量低　②研磨不充分　③过滤不充分　④95%冷酒精的量过大
A．①② B．③④
C．①④ D．②③
【解析】　研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少；过滤不充分，也会导致提取的DNA量过少；若用于沉淀DNA的酒精量过少，也会导致DNA的沉淀量少，影响实验效果。
【答案】　D
3．若选择的实验材料为植物细胞，破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐。加入洗涤剂的目的是(　　)
A．利于DNA的溶解 B．分离DNA和蛋白质
C．溶解细胞膜 D．溶解蛋白质
【解析】　洗涤剂是一种离子去污剂，能溶解细胞膜， 有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
【答案】　C
4.
4.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，实验原理是利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同来提取的，DNA的溶解度与如图所示曲线的对应点相符合的是(　　)
A．a点浓度最适合析出DNA
B．b点浓度最适合析出DNA
C．c点浓度最适合析出DNA
D．d点浓度最适合析出DNA
【解析】　a、c、d点对应的浓度下，DNA溶解度较高，而b点对应的浓度下，DNA溶解度最低，最适合析出DNA。
【答案】　B
5．(2012·长沙高二测试)与析出DNA黏稠物有关的叙述，不正确的是(　　)
A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B．在操作时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整
C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出
D．当丝状黏稠物不再增加时，此时NaCl溶液的浓度相当于0.14 mol/L
【解析】　加入蒸馏水，降低了NaCl溶液的浓度，DNA的溶解度降低，DNA析出，但蛋白质不能析出。
【答案】　C
6．(2012·湖北八校联考)请回答下列有关细胞和分子生物学技术的问题：
(1)DNA粗提取的实验原理是：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在________mol/L的NaCl溶液中的最低；鉴定DNA所用的试剂是________，沸水浴加热呈________色；实验中使用酒精的目的是__________________________；实验过程中两次用到蒸馏水，第一次目的是使成熟的鸡血红细胞涨破释放出DNA，第二次目的是____________________。
(2)PCR技术的中文全称是________________，在操作过程中需要添加引物，它的化学本质是____________。反应过程中控制不同温度的意义是不同的： 90 ℃以上时____________，双链DNA解聚为单链；50 ℃左右时________，引物与两条单链DNA结合； 72 ℃左右时延伸，Taq DNA聚合酶有最大活性，使DNA新链沿着______________________方向延伸。
(3)血红蛋白的提取和分离试验中，分离纯化常用的方法有凝胶色谱法和电泳法，前者的原理是________________________，后者的原理是__________________，在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是________________________。
【解析】　本题考查DNA和蛋白质技术，解答此题需要对DNA粗提取的原理——DNA在不同浓度的食盐溶液中的溶解度、PCR技术的原理及过程、凝胶色谱法和电泳法分离蛋白质等内容熟练掌握。DNA在NaCl溶液中的溶解度为：NaCl溶液的浓度低于0.14mol/L时，随NaCl溶液浓度升高，DNA的溶解度升高，NaCl溶液的浓度高于0.14mol/L时，随NaCl溶液浓度升高，DNA的溶解度升高，NaCl溶液的浓度等于0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。
鉴定DNA的原理是沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色。DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，故利用酒精可除去溶于酒精的蛋白质。实验中第二次加入蒸馏水的目的是降低NaCl溶液的浓度，以析出DNA；多聚酶链式反应简称PCR技术，该过程中需要加入引物，引物是一小段单链DNA或RNA，实验通过控制温度来控制双链的解聚和聚合，90 ℃以上时变性，DNA解旋，50 ℃左右时复性，DNA恢复双螺旋结构。
DNA子链延伸的方向为子链的5′端向3′端延伸；凝胶色谱法根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质，电泳根据蛋白质分子带电性质的差异及分子大小、形状分离不同的蛋白质；磷酸缓冲液能将pH维持在一定范围内，保证血红蛋白分子的结构和功能。
【答案】　(1)0.14　二苯胺　蓝　除去溶于酒精的蛋白质　稀释NaCl溶液
(2)多聚酶链式反应　DNA或RNA　变性　复性　5′端向3′端
(3)根据相对分子质量的大小分离蛋白质　各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同　让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
7．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验装置，请分析回答问题。
(1)实验材料选用鸡血球液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血球液中有较高含量的________。
(2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水的目的是________________，通过图B所示的步骤取得滤液，再在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是____________________________；图C所示实验步骤中加蒸馏水的目的是________________。
(3)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可滴加____________溶液，结果丝状物被染成浅绿色。
【解析】　“DNA粗提取与鉴定”实验材料选用鸡血球液，而不用鸡全血，主要原因是DNA主要储存于细胞核内，而不在血浆内，使用鸡血球液能提高材料中的细胞数量和DNA含量，从而可以保证实验能提取到较多的DNA。
图A、B、C所示为本实验的三个关键步骤。图A通过添加蒸馏水，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于极度低渗的环境之中，细胞因大量吸水而最终破裂，并释放出胞内物。图B通过纱布过滤使血细胞释放出的DNA滤入收集的滤液中(将大量胶状物滤出)，再在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液使DNA的溶解度增加，即使DNA溶于NaCl溶液。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，如在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度只有水中的1%，而在1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度为水中的2倍。图C在DNA浓盐溶液中加入蒸馏水(大量)，可使溶液的NaCl浓度降至较低，由于DNA在较低浓度的NaCl溶液中溶解度很低(在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，浓度再变小则DNA溶解度将增大)，使DNA低渗析出，经过滤等手段可以收集到DNA。
甲基绿为比较常用的细胞核染色剂，染色后的细胞核、染色体呈绿色，属碱性染料，可以用来鉴定DNA。
【答案】　(1)DNA　(2)使血球破裂　使滤液中的DNA溶于浓盐溶液　使DNA析出　(3)甲基绿
一、选择题
1．关于DNA的粗提取与鉴定的实验，该实验依据的实验原理不包含(　　)
A．DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl溶液浓度的不同而不同
B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA
C．DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于某些有机溶剂
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
【解析】　本实验依据的原理是A、B、D项三个方面，必须明确的是NaCl溶液的浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小，具体操作时用2 mol/L的NaCl溶液，再加水稀释至黏稠物(主要是DNA)不再增多时，此时该溶液浓度即为0.14 mol/L。C项说法正确，但细胞内的大部分物质均可溶于某些有机溶剂，而不溶于水，因此不能以此为原理提取DNA。
【答案】　C
2．(2013·黄山高二检测)在提取DNA的过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是(　　)
A．不易破碎　　　　　　B．减少DNA的损失
C．增加DNA的含量 D．容易刷洗
【解析】　DNA易黏附于玻璃器皿上，造成DNA量的损失。
【答案】　B
3．在DNA的粗提取实验过程中，对DNA提取量影响相对较小的是(　　)
A．使血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等物质
B．搅拌时要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动
C．在析出DNA黏稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直到黏稠物不再增多
D．要用冷酒精沉淀DNA，甚至再将混合物放入冰箱中冷却
【解析】　A项的做法是为了充分释放出核中的DNA分子，使进入滤液中的DNA量尽量的多；C项是让DNA充分沉淀，保证DNA的量；D项的道理同C项。而B项的操作并不能使DNA的量增多或减少。
【答案】　B
4．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品分别是(　　)
①0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液　②2.00 mol/L的NaCl溶液　③0.14 mol/L的NaCl溶液　④体积分数为95%的冷酒精溶液
A．①③ B．②③
C．②④ D．③④
【解析】　在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA时所有试剂为0.14 mol/L的NaCl溶液，此浓度下DNA的溶解度最低；由于DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精，因此可用体积分数为95%的冷酒精获取较纯净的DNA。
【答案】　D
5．在DNA粗提取与鉴定实验中，将第二次过滤获得的纱布上含有的DNA的黏稠物(含有较多杂质)分别处理如下：
序号 操作过程
① 放入2 mol/L的NaCl溶液，搅拌后过滤
② 再加0.14 mol/L的NaCl溶液，搅拌后过滤
③ 再加入冷却的、同体积的95%酒精溶液，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物
上述操作过程正确的是(　　)
A．①② B．①②③
C．①③ D．②③
【解析】　第二次过滤后纱布上的是粗提取的DNA，此DNA还含有杂质，因此将其溶于2 mol/L的NaCl溶液中，再进行过滤，以除去不溶于2 mol/L的NaCl溶液的杂质。然后向滤液中加入同体积的、冷却的95%酒精即可析出DNA。然后挑出DNA进行鉴定。
【答案】　C
6．(2013·晋中高二检测)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是(　　)
A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物
B．调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质
C．将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色
D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同
【解析】　A项，用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，使DNA析出。B项，NaCl溶液为2 mol/L时，可过滤除去不溶的杂质，木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。C项，在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。D项，如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。
【答案】　B
7．(多选)下表是关于DNA的粗提取与鉴定实验中，所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是(　　)
试剂 操作 作用
A 柠檬酸钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固
B 蒸馏水 与鸡血细胞混合 保持细胞形状
C 蒸馏水 加入到溶解有DNA的NaCl溶液中 析出DNA丝状物
D 冷却的酒精 加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中 产生特定的颜色反应
【解析】　蒸馏水与鸡血细胞混合，目的是破碎细胞，而不是保持细胞形状；冷却的酒精加入到含DNA的NaCl溶液中的目的是使DNA析出。
【答案】　AC
8．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，有两次DNA沉淀析出：①DNA在NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时溶解度最低；②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能够沉淀析出。该实验依据的原理是(　　)
A．两次都是①
B．两次都是②
C．第一次是①，第二次是②
D．第一次是②，第二次是①
【解析】　DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，而高于或低于这一浓度，DNA在NaCl溶液中的溶解度都会增大；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，这样DNA就可以沉淀析出。
【答案】　C
9．“DNA的粗提取与鉴定”实验中有三次过滤：①过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞溶液；②过滤含黏稠物的0.14mol/L的NaCl溶液；③过滤含DNA的2 mol/L的NaCl溶液。以上三次过滤分别为了获得(　　)
A．含核物质的滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液
B．含核物质的滤液、滤液中的黏稠物、含DNA的滤液
C．含核物质的滤液、滤液中的黏稠物、纱布上的黏稠物
D．含较纯的DNA的滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液
【解析】　经蒸馏水稀释，鸡血细胞破裂，溶液中有大量核物质；在0.14 mol/L的NaCl溶液中，DNA析出；在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA充分溶解。
【答案】　A
10．甲、乙两图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置图。相关叙述正确的是(　　)
甲　　　　　　　　乙
A．图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂都为NaCl溶液，但两者浓度不同
B．图乙试管经稍稍加热后即可观察到一支试管中的溶液明显变蓝，另一支试管中的溶液不变蓝
C．图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA析出，并缠绕在玻璃棒上
D．图乙操作中所用的二苯胺需现配现用以达到较好的鉴定效果
【解析】　图甲所示为在95%酒精溶液中DNA析出，图乙试管中为高浓度(2 mol/L)的NaCl溶液，DNA溶解，A项错误；利用二苯胺试剂检测DNA时条件为沸水浴加热，B项错误；图甲中的搅拌操作应缓慢进行，以防止断裂，C项错误；二苯胺试剂最好现配现用，D项正确。
【答案】　D
二、非选择题
11．DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl溶液浓度的变化而变化。
(1)请在下列NaCl溶液中选出能使DNA析出最彻底的一种(　　)和溶解度最高的一种(　　)。(在括号内填选项)
A．0.14 mol/L　　　　　　B．2 mol/L
C．0.15 mol/L D．0.3 mol/L
(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以________，推测溶于酒精中的物质可能有____________________。
(3)利用DNA遇________呈蓝色的特性，将该物质作为鉴定________的试剂。其实验过程中要向放有________的试管中加入4 mL的________________。混合均匀后，将试管置于________________5 min，待试管________，观察试管中溶液颜色的变化，这个实验也说明DNA耐________温。
【解析】　根据实验原理可知，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低；在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最高。DNA存在于染色体上，为了把DNA与其他物质分开，利用DNA不溶于酒精的特性，可除去杂质；利用DNA与二苯胺沸水浴呈蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA。
【答案】　(1)A　B　(2)除去杂质　某些脂质、蛋白质、糖类或其他大分子物质　(3)二苯胺　DNA　DNA　二苯胺试剂　沸水中加热　冷却后　高
12．(2013·张家口高二测试)实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
　试管序号　 A B
1 加2 mol/L NaCl溶液5 mL 加2 mol/L NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
　试管序号　 A B
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5分钟 沸水浴5分钟
实现现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？
________________________。
(3)在沸水中加热的目的是________________，同时说明DNA对高温有较强的________________。
(4)A试管在实验中的作用是________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________有关。
【解析】　本题主要考查DNA分子的鉴定。A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
【答案】　(1)实验现象：A.溶液不变蓝色　B．溶液逐渐变蓝色　实验结论：DNA在沸水浴的情况下与二苯胺反应呈现蓝色　(2)溶液颜色基本不变(不呈浅蓝色)　(3)加快颜色反应速度　耐受性　(4)对照
(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段
(教师用书独具)
●课标要求
　尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作和应用。
●课标解读
1．尝试PCR技术的基本操作。
2．体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。
●教学地位
　PCR技术是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，这一技术广泛应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等领域，是一种常用的分子生物学手段。本课题与必修内容中学习的DNA复制密切相关。
●教法指导
1．对于PCR原理的教学，首先可引导学生回忆必修2中有关DNA复制的知识，在此基础上，学生需进一步了解DNA双链的方向，要学会区分DNA链的3′端和5′端，理解DNA两条链的“反向”，此外还需引导学生了解DNA聚合酶的作用特点，从而引出DNA复制需要引物。接着介绍体外使DNA双链打开的方法，根据酶的作用特点，引导学生认识到在PCR中需要耐高温的DNA聚合酶，再结合专题2中课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq DNA聚合酶的发现过程，帮助学生理解，并加深印象。
2．对于PCR的反应过程的教学，可让学生以阅读为主，认真读图“PCR的反应过程”，教师总结每一个步骤发生的变化，每一步骤的作用，可让学生将每一步的图解转化为文字叙述，以加深学生的印象。
(教师用书独具)
●新课导入建议
　可利用电影《侏罗纪公园》进行导入，科学家在化石中发现了恐龙的DNA，并由此“复活”了恐龙，假如你是科学家，你只发现了少量的DNA，假如直接用这些DNA进行实验，成功率不一定是100%，那么首先要做的是什么工作呢？由此引入PCR技术。
●教学流程设计
学生课前预习：阅读教材P58－63，填写【课前自主导学】，完成“思考交流1、2”。了解本课题的基础知识。?步骤1：情景导课：以【新课导入建议】引出课题。通过学生阅读、提问进行基础知识部分的教学。?步骤2：通过【课堂互动探究】探究1，理解DNA聚合酶的作用特点、引物的作用及PCR技术所需要的条件。通过例1检测、巩固。?步骤3：学生阅读教材PCR的反应过程部分，熟悉反应流程，思考：体外的DNA复制与细胞内的DNA复制有何不同之处？?
课　标　解　读 重　点　难　点
1.尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作。 1.PCR的原理和PCR的基本操作。(重点)
2.体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。 2.PCR的原理。(难点)
PCR技术的原理及条件
1.细胞内DNA复制的条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链 提供DNA复制的模板
解旋酶 打开DNA双链
4种脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2.PCR技术的原理
(1)概念
PCR即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)原理
①DNA变性：在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为变性。
②DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
③DNA子链合成：DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(3)条件
①模板：DNA。
②引物：能分别与两条模板链相结合的物质。
③原料：四种脱氧核苷酸。
④酶：耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。
⑤其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调控温度的温控设备。
1．什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？
【提示】　所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。
PCR的实验操作
1.过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环大致可分为以下步骤。
(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
(2)复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(3)延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
2．结果
DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
3．DNA含量的测定
(1)原理：利用DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰这一特点进行DNA含量的测定。
(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。
4．实验用具
(1)PCR仪
①作用：自动调控温度，实现DNA扩增。
②替代者：用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可。
(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际是进行PCR反应的场所。
(3)微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头要用一次换一次。
5．操作提示
(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。
(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。
2．PCR循环过程中，变性温度设置95 ℃，时间设置30 s的原因是什么？
【提示】　变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。
1．DNA在体外复制时需要引物，而在细胞内复制时不需要引物。(×)
【提示】　DNA在体内、体外复制均需要引物。
2．PCR技术扩增DNA时需要ATP供能。(×)
【提示】　在PCR反应体系中无需ATP。
3．PCR扩增DNA片段时，引物总是结合在模板链的5′端的。(×)
【提示】　引物结合在模板链的3′端。
4．PCR过程中的DNA解旋需要解旋酶。(×)
【提示】　通过对反应温度的控制实现解旋。
5．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水在使用前必须进行高压灭菌。(√)
PCR技术原理及分析
【问题导思】　
①PCR扩增DNA时为何需要加入引物？
②PCR需要解旋酶吗？
1．PCR原理
(1)扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA单链的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA子链的合成方向总是从5′端向3′端延伸。
(2)热变性
通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。
2．PCR反应过程
(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链(如图)。
(2)复性：系统温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(如图)。
(3)延伸：当系统温度上升到72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链(如图)。
3．PCR扩增的计算与DNA含量的测定
(1)理论上PCR扩增数目的计算
理论上DNA扩增呈指数扩增。若只有一个DNA提供模板，则复制n次后有2n个；若开始有N0个DNA，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
(2)DNA含量的测定
DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：
1．加热变性是由于加热使碱基之间的氢键断开，而不是脱氧核糖与磷酸之间的键断开。
2．引物的作用是结合在模板DNA上，为DNA延伸提供起始位点。
　(2013·马鞍山高二检测)有关PCR技术，下列叙述不正确的是(　　)
A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术
B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内的DNA复制类似
C．PCR反应需在一定的缓冲液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D．PCR反应一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步
【审题导析】本题关键是掌握DNA体外复制具备的条件，以及PCR操作的大致过程。
【精讲精析】　体外扩增DNA需提供：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的Taq DNA聚合酶，同时PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
【答案】　C
细胞内DNA复制和PCR反应的比较
　　
【问题导思】　
①细胞内DNA复制需要哪几种酶？
②细胞内DNA复制和PCR技术有哪些相同点？
体内DNA复制 PCR反应
不同点 场所 细胞内 细胞外
能量 ATP提供能量 不需ATP提供能量
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至90 ℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶
不同点 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃
特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增
不同点 Taq DNA聚合酶 不需要 需要
循环次数 受生物体自身控制 30多次
温度 体内温和条件 高温(可变)
相同点 ①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端
误区表现 错解归因 正确观点
PCR过程需要解旋酶和DNA连接酶 不能正确理解PCR的原理，据DNA的体内复制原理错误类推所致 PCR不需要解旋酶和DNA连接酶，只需要耐高温的Taq DNA聚合酶。PCR以热变性取代解旋酶的作用。PCR的产物只是较短的DNA片段，因而也不需要DNA连接酶
　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(　　)
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中，DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④　　　B．①②　　　C．①③　　　D．②④
【思维导图】　
【精讲精析】　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；(2)PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
【答案】　C
本 课 知 识 小 结
网 络 构 建
结 论 语 句
1．DNA复制需要引物，是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
2．PCR反应需要的条件有模板、引物、耐热的DNA聚合酶、原料(四种脱氧核苷酸)、温度控制设备及一定的缓冲液。
3．PCR每次循环分为变性、复性和延伸三步，对应的温度分别为95 ℃、55 ℃和72 ℃。
4．PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
1．下列说法不正确的是(　　)
A．一条DNA母链只有一个3′端，即羟基末端
B．DNA的两个3′端位于相反的两端
C．Taq DNA聚合酶只能与引物的3′端结合并延伸子链
D．DNA的合成方向是从子链3′端向5′端延伸的
【解析】　我们通常将DNA单链的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端，一个DNA分子有两个3′端和两个5′端，它们分别位于DNA分子的两端，即每一端都有一个3′端和一个5′端。Taq DNA聚合酶只能与引物的3′端结合并开始延伸DNA链，即子链总是从5′端向3′端延伸。
【答案】　D
2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是(　　)
A．92 ℃、50 ℃、72 ℃
B．72 ℃、50 ℃、92 ℃
C．50 ℃、92 ℃、72 ℃
D．80 ℃、50 ℃、72 ℃
【解析】　当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
【答案】　A
3．(2012·北京高二测试)在DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是(　　)
【解析】　PCR反应中DNA扩增是呈指数形式扩增的，可用y＝2n表示，其函数图像与C相符。
【答案】　C
4．假设PCR反应中有2个DNA的片段作为模板，在5次循环后反应物中大约有多少个这样的DNA片段(　　)
A．64　　　　　　 B．32
C．16 D．8
【解析】　理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n个；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2n个。
【答案】　A
5．使用PCR仪的具体实验操作顺序应为(　　)
①设计好PCR仪的循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④①　　　　　B．①⑤③②④
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
【解析】　PCR反应的操作步骤一般分为准备→移液→混合→离心→反应等几步。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。
【答案】　C
6．(2013·唐山高二检测)如图为DNA变性和复性示意图，下列相关说明正确的是(　　)
A．向右的过程为加热(80～100 ℃)变性
B．向左的过程是DNA双链迅速致冷复性
C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同
D．图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3′端
【解析】　DNA在80～100 ℃的温度范围内，双螺旋结构将解体，双链打开；缓慢冷却后，双链又会重新恢复为双螺旋结构；在生物体内DNA解旋是由解旋酶催化的；一个DNA分子只有2个3′端(羟基末端)和2个5′端(磷酸基团末端)。
【答案】　A
7．PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答问题。
(1)A过程高温使DNA变性解聚，对该过程的原理叙述，正确的是________。
A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C．该过程不需要解旋酶的作用
D．该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是________________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以________加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有： ________________________。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94 ℃→55 ℃→72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占________。
【解析】　PCR技术用高温使DNA两条链解开，该过程不需要解旋酶的作用。C过程是链的延长，需要DNA聚合酶参与；PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等。循环3次共形成8个DNA分子，其中两个DNA分子含15N标记，占总数的25%。
【答案】　(1)C　(2)DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等　(3)25%
一、选择题
1．(2013·仙桃高二检测)在实验室内模拟生物内的DNA复制，需要哪些条件(　　)
①酶　②游离的脱氧核苷酸　③ATP　④DNA分子　⑤引物　⑥tRNA　⑦适宜的温度　⑧适宜的酸碱度
A．①②③④⑤⑥　　　　　B．②③④⑤⑥⑦
C．②③④⑤⑦⑧ D．①②④⑤⑦⑧
【解析】　体外DNA复制需要的能量来自热能，不需要ATP；tRNA在翻译过程中发挥作用。
【答案】　D
2．当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能开始延伸DNA子链，则延伸的方向是(　　)
A．从5′端延伸DNA子链
B．DNA的合成方向总是从5′端向3′端延伸
C．子链延伸的方向是5′→3′或3′→5′
D．DNA的合成方向总是从3′端向5′端延伸
【解析】　DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
【答案】　B
3．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度冷却至40～60 ℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括(　　)
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．加入引物的量足够多而模板链数量少
D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合
【解析】　DNA双链解开后，经缓慢降温，两条链可以再次结合。
【答案】　D
4．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将(　　)
A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
【解析】　当引物Ⅰ延伸而成的单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物Ⅱ结合进行子链的延伸。
【答案】　B
5．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因不可能是(　　)
A．循环次数不够
B．Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制
C．引物不能与母链结合
D．系统设计欠妥
【解析】　引物设计不合理，可能不与模板DNA链相结合，导致无法进行扩增DNA，而其他选项都可能导致DNA的产量比预期的少。
【答案】　C
6．(2012·长沙高二检测)PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR过程中“温度的控制”的说法错误的是(　　)
A．酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链
B．延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度
C．DNA聚合酶具有耐高温的能力
D．DNA解旋酶具有耐高温的能力
【解析】　PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在复性前，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度。
【答案】　D
7．在PCR扩增的实验中，加入一种提取物(一种模板DNA片段)，但实验得到的产物却有两种DNA。其原因可能是(　　)
A．基因重组
B．TaqDNA聚合酶发生变异
C．基因污染
D．温度过高
【解析】　在PCR过程中若无菌操作不合格，可能会引入其他的DNA片段，导致出现多种产物。
【答案】　C
8．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个(　　)
A．2　　　　B．4　　　　C．6　　　　D．8
【解析】　PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增的片段的特定序列，上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成①和②，第二次循环形成①、②、③、④四个DNA，以此类推4次循环后共形成16个DNA，其中①、②各一个，③、④各三个，⑤共8个。
【答案】　D
9．下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的(　　)
A．②①③④ B．①③④②
C．①②④③ D．①②③④
【解析】　以①链为模板复制而来的DNA应只含有引物Ⅰ(a)；以④链为模板复制而来的只有引物Ⅱ(d)；b、c是以②、③为模板复制而来的。
【答案】　D
10．在基因工程中，把选出的目的基因(共1 000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460个)放入PCR仪中扩增4代，那么，在PCR仪中放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数至少应是(　　)
A．640个 B．8 100个
C．600个 D．8 640个
【解析】　PCR仪中放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数＝a×(2n－1)＝[(2 000－460×2)/2]×(24－1)＝8 100个。
【答案】　B
二、非选择题
11．(2013·黄冈高二期末)在遗传病及刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：________________________________，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。
(4)PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利用DNA的________原理解决了这个问题。
(5)在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是________。
【解析】　(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向为5′→3′端，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH，复性结果为：
　　　HO—A—G—5′
5′—G—G……T—C－3′。
(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。
(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA中各有一条链含32P，若复制n次，共产生子链2n×2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为
2/(2n·2)＝1/2n。
(4)DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对原则把相应的碱基一个个地连接起来。DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。
(5)本题考查了DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。
【答案】　(1)5′—G—A—OH
　　　HO—A—G—5′
5′—G—G……T—C—3′
(2)3′—C—C……A—G—5′
5′—G—G……T—C—3′
5′—G—G……T—C—3′
3′—C—C……A—G—5′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P　1/2n
(4)DNA解旋　热变性　(5)蛋白酶
12．美国科学家穆里斯发明了PCR技术，它是一种DNA“复印机”，可以在数小时内，将一个DNA复制出一千亿个，解决了检测样本扩增的难题。在人类基因组计划实施中，PCR技术使每个核苷酸的识别成本降低至5～10美元，他因发明PCR技术而荣获了诺贝尔奖。
(1)在DNA复制时，需要大量的__________作为原料，在DNA聚合酶的催化作用下，以解旋后的单链为________进行生物合成。
(2)在DNA分子解旋时，必须加热，普通的酶容易________，科学家从温泉中找到了耐95 ℃高温的________，解决了酶重复使用的难题，使链式反应成为可能。每次循环可以分为变性、________和延伸三步。
(3)耐高温酶的发现应用说明了地球生物________的重要，大自然的________库是人类的宝贵财富。
【解析】　PCR技术与体内DNA复制一样，都需要脱氧核苷酸作原料，并以DNA分子的一条链为模板进行复制。不同的是PCR过程中双链的解开是通过控制较高温度实现的，因此PCR过程需要耐热的DNA聚合酶。
【答案】　(1)脱氧核苷酸　模板　(2)变性(失活)　Taq DNA聚合酶　复性　(3)多样性　基因
课题3血红蛋白的提取和分离
(教师用书独具)
●课标要求
　尝试蛋白质的提取和分离。
●课标解读
1．尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。
2．体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
●教学地位
　本课题主要介绍了蛋白质提取和分离的两种重要方法——凝胶色谱法和电泳法，分离蛋白质是分子生物学中经常遇到的问题，如酶的提取和分离。通过本课题的学习，学生可以体会从复杂体系中获取生物大分子的基本思路。
●教法指导
1．在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可结合教材中的插图，让学生先有一个直观的认识，然后再通过板书凝胶颗粒的内部结构，帮助学生理解分子质量不同的蛋白质在色谱柱中的移动路径的长短，从而理解凝胶色谱法的基本原理。教师还可以通过查阅资料，向学生介绍凝胶色谱法的其他用途，以开拓学生视野。
2．缓冲溶液在必修3中学生已经接触过，在本课题中，主要是向学生介绍为什么要使用缓冲溶液，让学生充分理解缓冲溶液的重要性。
3．电泳是学生初次接触的内容，教师可首先介绍电泳的用途，电泳技术广泛应用于生化实验，在分离酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有广泛的用途。再结合学生具有的物理化学知识，帮助学生理解电泳技术的原理。
(教师用书独具)
●新课导入建议
　酶是学生比较熟悉的内容，酶是活细胞产生的，假如我们要从纤维素分解菌细胞内获得某种纤维素酶，就需要利用蛋白质的提取和分离技术，由此导入新课。
●教学流程设计
学生课前预习：阅读教材P64－70，填写【课前自主导学】，完成“思考交流1、2”。了解本课题的基础知识。?步骤1：情景导课：以【新课导入建议】引出课题。通过学生阅读、提问进行基础知识部分的教学。?步骤2：通过【课堂互动探究】探究1，理解凝胶色谱法、电泳分离蛋白质的原理。通过例1检测、巩固。?步骤3：学生阅读教材结合必修内容，了解缓冲溶液的组成，并理解缓冲溶液在蛋白质分离中的重要作用。?
课　标　解　读 重　点　难　点
1.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1.凝胶色谱法的原理和方法。(重点)2.样品的预处理。(难点)3.色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。(难点)
蛋白质的分离
1.依据
2．凝胶色谱法
(1)概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(2)原理
①凝胶
②分离的方法
项目蛋白质类型 进入凝胶内部的程度 路程 移动速度
相对分子质量较小 容易 较长 较慢
相对分子质量较大 无法进入 较短 较快
1．蛋白质的分离过程是怎样的？
【提示】　蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。
缓冲溶液
1.作用
在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
2．配制
由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
3．应用
生物化学的研究中重点关注缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定。
电泳
1.概念
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
2．原理
在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
3．作用过程
各种分子
4．方法
常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
血红蛋白分离及纯度鉴定实验操作
1.过程
(1)样品处理
通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集到血红蛋白溶液。
(2)粗分离
通过透析袋去除血红蛋白溶液中分子量较小的杂质。
(3)纯化
通过凝胶色谱操作分离相对分子质量不同的蛋白质。
(4)纯度鉴定
用SDS—聚丙烯酰胺电泳进行样品纯度鉴定。
2．操作提示
(1)红细胞的洗涤
洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。
(2)色谱柱填料的处理
商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。这种方法不仅时间短，还能除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。
(3)凝胶色谱柱的装填
在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
(4)蛋白质的分离
如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？
【提示】　(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。
(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。
1．凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较小的蛋白质移动路程短，移动速度快。(×)
【提示】　相对分子质量小的蛋白质，移动路程长，移动速度慢。
2．缓冲溶液能保证溶液体系的pH绝对不变。(×)
【提示】　缓冲溶液能使溶液体系的pH维持在某个范围。
3．在电场的作用下，蛋白质分子会向着其所带电荷相同的电极方向移动。(×)
【提示】　向着所带电荷相反的电极方向移动。
4．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带的电荷。(√)
血红蛋白提取和分离的原理
【问题导思】　
①蛋白质的相对分子质量不同，其在凝胶中的运动速度相同吗？
②凝胶色谱法有哪些用途？
③用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的决定因素是什么？
1．蛋白质分离的依据
蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
相对分子质量大 相对分子质量小
直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径 小于凝胶颗粒空隙直径
运动方式 垂直向下运动 无规则的扩散运动
运动速度 较快 较慢
运动路程 较短 较长
洗脱顺序 先从凝胶柱中洗脱出来 后从凝胶柱中洗脱出来
3.电泳
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同 在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子的大小
1．琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。
2．测定蛋白质的相对分子质量常用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的形状。
　
(2012·汕头高二质检)凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，故对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题。
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是__________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由____________________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体__________(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________________________________________________________________________。
【审题导析】蛋白质相对分子质量大的在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。
【精讲精析】　本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项，可按以下思路进行分析。
(1)原理：由于不同蛋白质的相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。
(2)注意事项
①凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。
②凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
③装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。
④样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物质的量浓度为20 mmol /L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。
【答案】　(1)a　a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快　(2)尼龙网和尼龙纱　(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果　(4)相同　保持稳定
提取和分离血红蛋白的实验操作
【问题导思】　
①分离红细胞为何要低速、短时离心？
②血红蛋白释放的原理是什么？
1．样品处理
血红蛋白的释放：
分离血红蛋白溶液：以2 000 r/min的速度离心10 min，取第3层红色透明液体(血红蛋白水溶液)
透析：将盛有1 mL血红蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中透析12 h，去除样品中分子量较小的杂质
2．凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的制作
①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②柱底部制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。
③柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。
④将上述三部分按相应位置组装成一个整体。
(2)凝胶色谱柱装填过程
计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量
　↓
凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液
　↓
固定：将色谱柱垂直固定在支架上
　↓
装填：将凝胶悬液一次性缓慢倒入色谱柱内
　↓
洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密
(3)样品的加入和洗脱
调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面平齐
滴加透析样品：关闭下端出口，用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端
样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
再调整缓冲液面：关闭下端出口，小心加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度
　
洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱
　
收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集
3．血红蛋白纯度鉴定
(1)方法：SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳
(2)过程：安装电泳用的玻璃板→SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备→样品处理→固定凝胶→加样→电泳→剥胶→染色→脱色→观察结果。
分析
血液样品 的处理 ①分层明显―→样品处理完成 ②分层不明 显的原因)\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(洗涤次数少，未能除去血浆 蛋白离心速度过高和时间过长))
凝胶色谱 柱的装填 ①放一支与凝胶柱垂直的日光灯―→直接检查 ②加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖—2 000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整―→装填成功
血红蛋白 的分离 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出―→分离成功
　红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题。
(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：____________、________、________和______________。
(2)实验前取新鲜的血液，切记要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是____________________。
②以上所述的过程即是样品处理，它包括________________、__________________、收集血红蛋白溶液。
(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是________________________。
②透析的原理是____________________。
(4)纯度鉴定时最常用的方法是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
①样品纯化的目的是________________________。
②血红蛋白有什么特点____________________。
这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ ________________________。
【解析】　本题主要考查蛋白质提取和分离的相关知识，具体分析如下：
【答案】　(1)样品处理　粗分离　纯化　纯度鉴定　(2)①防止血液的凝固　②红细胞的洗涤　血红蛋白的释放　(3)①除去相对分子质量较小的杂质　②透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内
(4)①通过凝胶色谱法将相对分子质量与血红蛋白不同的杂质蛋白除去　②血红蛋白呈现红色　在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液；同时通过观察颜色使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
本 课 知 识 小 结
网 络 构 建
结 论 语 句
1．凝胶色谱法分离蛋白质取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的路程较短，移动速度快；相对分子质量较小的，路程较长，移动速度慢。
2．缓冲液能在一定范围内抵制外界酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
3．电泳时，带电分子会向其所带电荷相反的电极移动。
4．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
5．血红蛋白溶液离心后分为四层，从上到下依次为：无色透明的甲苯层、白色薄层固体(脂溶性物质的沉淀层)、红色透明液体(血红蛋白的水溶液)和其他杂质的暗红色沉淀物。
1．(2013·安顺高二测试)凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是(　　)
A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小
B．根据蛋白质相对分子质量的大小
C．根据蛋白所带电荷的多少
D．根据蛋白质溶解度的大小
【解析】　凝胶色谱法是根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质的一种方法。
【答案】　B
2．利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来(　　)
A．相对分子质量大的　　　 B．溶解度高的
C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的
【解析】　相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
【答案】　A
3．关于电泳的说法不正确的是(　　)
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少
D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小
【解析】　蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
【答案】　C
4．样品的加入和洗脱的操作不正确的是(　　)
A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D．用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
【解析】　加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。
【答案】　A
5．在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲溶液，起到的作用是(　　)
A．使酶的活性最高 B．使蛋白质的活性最高
C．维持蛋白质所带电荷 D．使蛋白质带上电荷
【解析】　加缓冲液的目的是维持蛋白质所带电荷不发生改变，而不是使蛋白质带上电荷。
【答案】　C
6．下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入(图Ⅰ)和洗脱(图Ⅱ)示意图。请据图回答下列问题：
　　　　　　　　　图Ⅰ　　　　　图Ⅱ
(1)在加样品示意图中，正确的顺序是_________。
(2)用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是：
①____________________；
②____________________；
③____________________。
(3)等样品__________________后，加入缓冲溶液。待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一管，连续收集。
【解析】　在装填好的色谱柱中加入样品时，先打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意加入时要使吸管管口沿管壁环绕移动，贴着管壁加样，以免破坏凝胶面(④)，加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入之后，关闭下端出口(①)，接着采用同样的方法加入缓冲液到适当高度(②)，连接缓冲溶液洗脱瓶进行洗脱(④)。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
【答案】　(1)④→①→②→③
(2)①不要破坏凝胶表面　②贴着管壁加样　③使吸管管口沿着管壁环绕移动
(3)完全进入凝胶层　红色的蛋白质　5
7．下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题。
　　　　　　　　　甲　　　　　　乙
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________；乙装置中，C溶液的作用是____________________。
(3)甲装置用于________，目的是____________________。
用乙装置分离蛋白质的方法叫________________，是根据____________________分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时，待________________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。
【解析】　(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是磷酸缓冲液；乙装置中，C溶液的作用是洗脱血红蛋白。(3)甲装置用于透析(粗分离)，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。用乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(4)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。
【答案】　(1)运输　(2)磷酸缓冲液　洗脱血红蛋白　(3)透析(粗分离)　去除样品中分子量较小的杂质　凝胶色谱法　相对分子质量的大小　(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端
一、选择题
1．凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是(　　)
A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径
B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C．将酶或细胞固定在凝胶中
D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
【解析】　凝胶的种类较多，但每一种凝胶内部都有孔隙，其共同点是改变蛋白质分子通过凝胶时的路径。
【答案】　A
2．(2013·咸阳高二检测)下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是(　　)
A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，最后流出
C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其空隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
【解析】　凝胶内部微细的多孔网状结构，若空隙过大，所有蛋白质分子都能进入，不能起到分离的作用。
【答案】　C
3．用凝胶色谱法分离蛋白质的实验中，相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为图中哪一个(　　)
【解析】　题图所示，相对分子质量较大的蛋白质容易通过凝胶间隙，先被洗脱出来；相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部，后被洗脱出来。
【答案】　B
4．血红蛋白的提取和分离一般分为四步，符合要求的是(　　)
A．粗分离→样品处理→纯化→纯度鉴定
B．粗分离→纯化→样品处理→纯度鉴定
C．样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
D．纯化→纯度鉴定→粗分离→样品处理
【解析】　血红蛋白的提取和分离一般可分为四大步，包括样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品处理；再经过透析法去除小分子的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量与血红蛋白不同的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
【答案】　C
5．电泳实现样品中各种蛋白质分子的分离是利用了(　　)
A．各种分子带电性质的差异
B．分子本身的大小不同
C．分子形状的不同
D．以上都正确
【解析】　电泳是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
【答案】　D
6．(2013·包头高二测试)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法加入SDS的作用是(　　)
A．增大蛋白质的相对分子质量
B．改变蛋白质的形状
C．掩盖不同种蛋白质间的电荷差别
D．减少蛋白质的相对分子质量
【解析】　SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖不同种蛋白质间的电荷差。
【答案】　C
7．有关缓冲溶液的说法不正确的是(　　)
A．缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH恒定不变
B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液
D．生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的
【解析】　缓冲溶液对外界酸碱的缓冲作用是有限的，它只能使溶液pH在一定范围内保持相对稳定。
【答案】　A
8．(2012·开封高二检测)在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析，正确的是(　　)
A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水
D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
【解析】　本题主要考查了血红蛋白提取和分离中的样品处理。洗涤红细胞的目的主要是除去血浆中的杂蛋白；洗涤时离心速度过高，时间过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程用到的是质量分数为0.9%的NaCl溶液。
【答案】　D
9．在血红蛋白分离过程中，如果红色区带歪曲、散乱、变宽，与其有关的是(　　)
A．血红蛋白释放　　　B．色谱柱的装填
C．洗脱过程 D．样品的处理
【解析】　如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
【答案】　B
10．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是(　　)
A．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中
B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内
D．若用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远
【解析】　由于丙的相对分子质量大于戊，因此离心时若戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中；凝胶色谱法分离蛋白质时相对分子质量越大，移动速度越快；乙的相对分子质量小于丙，若丙在袋内，乙不一定在袋内；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，分子的迁移率完全取决于分子的大小，甲移动的最远，丙最近，因此甲与丙形成的电泳带相距最远。
【答案】　A
二、非选择题
11．(2013·鄂尔多斯高二期末)凝胶色谱技术是二十世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被广泛应用于多个领域，请回答有关问题。
(1)若选用Sephadex G－100，则G表示________________________________。
(2)通过凝胶色谱法可将从红细胞中分离出的血红蛋白样品进一步__________，在血红蛋白的提取和分离实验中有以下操作，试回答：
①实验时要对采集到的血液中的红细胞进行洗涤，洗涤的目的是________________________________________________________________________。
②在__________________作用下，红细胞会破裂释放出血红蛋白。
③将释放出的血红蛋白收集到透析袋中透析，这是样品的__________，而透析的目的是____________________________________。
④实验最后经过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行________________________________________________________________________
______________________。
(3)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现气泡必须重装。这是因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【解析】　本题考查血红蛋白的分离和提取。血红蛋白分离和提取实验的操作分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步。整个实验的原理是依据蛋白质的各种特性分离蛋白质。
【答案】　(1)凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围
(2)纯化　①去除血浆蛋白　②蒸馏水和甲苯　③粗分离　去除相对分子质量较小的杂质　④纯度鉴定
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
12．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。
(1)将实验流程补充完整。
(2)凝胶色谱法的基本原理是根据____________________分离蛋白质。
(3)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤干净的标志是________________________________________________________________________。
(4)分离血红蛋白时，由上到下第________层是血红蛋白的水溶液。
(5)下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________。
(6)如果红色区带________________，说明色谱柱制作成功。
【答案】　(1)血红蛋白的释放　凝胶色谱柱的装填　(2)相对分子质量的大小
(3)杂蛋白(或血浆蛋白)　离心后的上清液中没有黄色
(4)三　(5)④①②③
(6)均匀一致地移动
DNA与蛋白质分离的方法总结
1.不同浓度NaCl溶液中的溶解度
NaCl溶液 酒精(体积分数为95%的冷酒精)
DNA 不溶
蛋白质 NaCl溶液从2 mol/L逐渐稀释的过程中溶解度逐渐增大 某些蛋白质可溶
　DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度不同，可以利用不同浓度NaCl溶液来选择析出或溶解DNA，从而得到DNA或蛋白质。
2．电泳的方法
利用DNA与蛋白质带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使两者在同一电场下迁移速度不同，从而实现样品中DNA与蛋白质的分离。
　(多选)下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有(　　)
A．提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞
B．用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质
C．蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA
D．蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化
【解析】　A选项，在提取DNA时，如果是用动物的细胞需要用蒸馏水涨破，如果用植物细胞则不需要，而是用洗涤剂瓦解细胞膜。B选项，用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤出蛋白质，再降低NaCl溶液的浓度，析出DNA。C选项，透析用以除去小分子物质，DNA是大分子物质。D选项，电泳是分离纯化的常规方法，比如用聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化。
【答案】　BD
DNA粗提取、PCR技术、蛋白质
　　 分离比较
分离DNA PCR技术 分离蛋白质
实验原理 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精 利用DNA热变性原理体外扩增DNA 依据相对分子质量的大小不同来分离蛋白质
实验过程 选取材料→破碎细胞释放DNA→除杂→DNA析出与鉴定 变性→复性→延伸 样品处理→凝胶色谱操作
实验结果 获得较纯净的DNA 获得大量DNA片段 相对分子质量不同的蛋白质得以分离
实践意义 为DNA研究打下基础 解决了DNA研究中材料不足的问题 为蛋白质的研究和利用提供了原材料
　现代生物学已向两个方面发展，宏观研究的水平为生态系统水平，微观研究的水平为分子水平，对于分子的研究，其物质的提取和分离显得尤为重要。下面是物质提取和分离的相关问题，请回答。
(一)DNA分子的提取和分离
(1)在提取菜花细胞中的DNA时，采用的是研磨法，为什么不能像用鸡血那样，用蒸馏水使其破裂？
________________________
(2)在提取实验过程中用到两种浓度的NaCl溶液，说明其作用。
①2 mol/L NaCl溶液： ____________________；
②0.14 mol/L NaCl溶液： ____________________。
(3)在整个操作过程中，每100 mL血液中加入3 g柠檬酸钠的作用是____________________。
(4)鉴定DNA所用的试剂： ____________________。
(二)血红蛋白的提取和分离
(1)在血红蛋白的提取和分离过程中，粗分离、纯化和纯度鉴定时，都会用到缓冲溶液，其作用是________________________________。
(2)在洗脱过程中，对洗脱液的流速要求稳定的目的是
________________________。
【解析】　(一)(1)DNA分子提取中理想的材料为富含DNA的细胞，动物中鸡血红细胞具有细胞核，放入蒸馏水中会使细胞涨破释放出DNA，而植物细胞中含有细胞壁不能因吸水而涨破。(2)实验过程中两次用到NaCl溶液，初次为2 mol/L的NaCl溶液，用于溶解DNA，而0.14 mol/L的NaCl溶液会使DNA析出。(3)为了防止凝血现象的发生应加入柠檬酸钠。(4)鉴定DNA所用的试剂为二苯胺试剂。
(二)(1)为保持蛋白质的生理活性，防止变性，从而用缓冲液保持pH的恒定。(2)洗脱液的流速变化过快，使操作压变化过大，从而使洗脱物质的下降速率变化过大，导致分离纯化不充分。
【答案】　(一)(1)植物细胞具有细胞壁，不会吸水涨破，只有通过研磨，才能释放出DNA。
(2)①溶解DNA分子，过滤并除去不溶于NaCl溶液的杂质　②使DNA分子析出，过滤并除去溶于NaCl溶液中的杂质
(3)防止出现凝血　(4)二苯胺试剂
(二)(1)维持血红蛋白环境中pH的稳定
(2)维持操作压的稳定
凝胶色谱法与电泳法比较
凝胶色谱法 电泳法
原理 根据相对分子质量大小进行分离 根据相对分子质量大小和带电性质进行分离
介质 凝胶柱、缓冲液 电极、缓冲液
特点 相对分子质量较小的分子进入凝胶内部，路程长，移动慢；较大的在外部移动，路程短，移动快 分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度
结果 物质分离
　(2013·武汉高二测试)有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是(　　)
A．它们都是分离蛋白质的重要方法
B．它们的原理相同
C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要
D．以上说法都正确
【解析】　凝胶色谱法和电泳法都能实现蛋白质分离；凝胶色谱法利用蛋白质相对分子质量大小分离蛋白质，而电泳则依据待分离分子的带电情况、分子大小、形状等分离；二者均需在缓冲溶液中进行，目的是保证蛋白质的活性。
【答案】　A
1．在DNA的粗提取和鉴定的实验中，提取鸡血细胞的核物质和析出含DNA的黏稠物的操作过程中均用到蒸馏水，其作用在于(　　)
A．前者用来溶解血细胞，后者用来溶解DNA
B．前者使DNA从核中分离出来，后者使DNA析出
C．前者用来分离细胞核和细胞质，后者用来提取DNA
D．前者使血细胞吸水破裂，后者用来稀释NaCl溶液
【解析】　第一次是为了破坏细胞，使DNA出来；第二次是为了降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。
【答案】　D
2．以下对DNA和血红蛋白的提取与分离(鉴定)实验的分析正确的是(　　)
A．都要用猪血细胞来做实验
B．在DNA的粗提取与鉴定实验中，有两次DNA析出，所依据的原理相同
C．在实验中都要进行除杂处理，以便得到较纯净的DNA或血红蛋白
D．将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后呈现蓝色
【解析】　猪的红细胞中无细胞核，不能用以提取DNA；提取DNA时，第一次析出DNA是利用DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度低的原理，第二次则是利用DNA不溶于冷酒精的原理；DNA遇二苯胺要沸水浴加热才能变蓝。
【答案】　C
3．进行DNA鉴定来确定亲子关系，首先要进行DNA提取，提取前常用蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理的目的是(　　)
A．除去血细胞表面的蛋白质
B．除去血浆中的蛋白质
C．除去染色体上的蛋白质
D．除去血细胞中所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯
【解析】　蛋白水解酶水解蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯。
【答案】　D
4．(2013·呼和浩特高二测试)提取DNA通常用鸡血，而不用猪血，二者的区别是(　　)
①猪的红细胞无细胞壁
②鸡的红细胞有细胞核
③猪的红细胞无细胞器
④鸡的红细胞有线粒体、核糖体等的细胞器
⑤猪的红细胞无线粒体但有核糖体
⑥猪的红细胞进行无氧呼吸
A．①②④⑤　　　　　　　 B．②③④⑤
C．②③④⑥ D．③④⑤⑥
【解析】　猪的红细胞与鸡的红细胞相比，二者均无细胞壁，猪的红细胞无