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第1课时
发酵工程的培养基与无菌技术
课标要求
1.概述培养基的类型及用途。
2.阐明无菌技术的操作方法。
3.概述利用平板划线法和稀释涂布平板法，进行微生物分离和纯化。
考点一 发酵工程的培养基
考点二 发酵工程的无菌技术
内容索引
重温高考 真题演练
课时精练
考点一
发酵工程的培养基
培养基
(1)概念：主要是指为人工培养微生物等而制备的，适合微生物等_____
的营养基质。
归纳 夯实必备知识
生长、
繁殖或积累代谢产物
(2)类型
①按成分分类
培养基种类 成分 优点 缺点 用途
天然培养基 或 以及它们的提取物或粗消化物 取材便利、____ 、配制简便 营养成分难以控制，实验结果的重复性较差 工业化生产
合成培养基 准确称量的高纯度_________ 加_______ 化学成分 ，实验可重复性好 配制过程繁琐，成本较高 研究与育种
动植物组织
微生物细胞
营养
丰富
化学试剂
明确
蒸馏水
②按物理状态分类
培养基种类 特点 用途
培养基 不含 ，呈 状态 工业生产
培养基或半固体培养基 含 ，呈_____或半固体状态 微生物的分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
液体
凝固剂
液体
固体
凝固剂(如琼脂)
固体
③按用途分类： 培养基和特殊培养基
基础
特殊培养基种类 选择培养基 鉴别培养基 培养基
用途 将某种或某类 从混杂的微生物中分离出来 快速 不同微生物，也用于 和筛选产生某种________ 的菌种 用于培养营养要求比较苛刻的 微生物。可增加所需微生物的
_____
微生物
分类鉴定
分离
代谢产物
异养
数量
加富
(3)成分
成分 含义 作用 来源
碳源 ___________ _______ 构成生物体的细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、牛肉膏等
氮源 ___________ _______ _______________________ 无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：蛋白胨等
提供碳元素的物质
提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸等物质
无机盐 为微生物提供除碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素 为微生物提供无机营养，调节培养基的pH等 无机化合物：KH2PO4、
K2HPO4、NaCl等
水 生物体含量最高的无机化合物 良好的溶剂，参与化学反应等 培养基、代谢产物
考向 培养基配制及其作用
1.(多选)现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分和含量如下表，假设用这两种培养基分别去分离土壤中的两种微生物，甲、乙适合分离的微生物是
突破 强化关键能力
成分 KH2PO4 MgSO4· 7H2O NaCl CaSO4· 2H2O CaCO3 葡萄糖 纯淀粉
甲培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% 0.5% 2%
乙培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% － －
成分 KH2PO4 MgSO4· 7H2O NaCl CaSO4· 2H2O CaCO3 葡萄糖 纯淀粉
甲培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% 0.5% 2%
乙培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% － －
A.甲培养基适于分离自养型自生固氮菌
B.甲培养基适于分离异养型自生固氮菌
C.乙培养基适于分离自养型自生固氮菌
D.乙培养基适于分离异养型自生固氮菌
√
√
成分 KH2PO4 MgSO4· 7H2O NaCl CaSO4· 2H2O CaCO3 葡萄糖 纯淀粉
甲培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% 0.5% 2%
乙培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% － －
甲培养基中含有的葡萄糖和淀粉是有机物，可以作为碳源和能源，适用于异养微生物生长，由此推出该培养基适于分离异养型的自生固氮菌，A错误，B正确；
乙培养基中不含有机碳源，不含氮源，可用来分离培养自养型的自生固氮菌，C正确，D错误。
2.在微生物培养的过程中，需要通过选择培养或鉴别培养的方法来筛选出目标菌种。下列与之相关的叙述中，不正确的是
A.纤维素分解菌能够分解刚果红染料，从而使菌落周围出现透明圈
B.尿素分解菌能够将尿素分解为氨，从而使酚红指示剂变红
C.在培养基中加入抗生素能够筛选出具有相应抗性的菌株
D.在含有碳酸钙的培养基上生长的乳酸菌菌落周围会出现“溶钙圈”
√
纤维素分解菌能够分解纤维素，在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，A错误；
尿素分解菌能够将尿素分解为氨，使培养基呈碱性，从而使酚红指示剂变红，B正确。
3.(2023·江苏无锡高三模拟)培养微生物需要提供适宜的培养基。下列关于培养微生物的培养基的叙述，错误的是
A.培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
B.培养基的成分需根据微生物的代谢特点而定
C.培养基需满足各种微生物生长繁殖的需求
D.培养基通常需包含水、无机盐、碳源、氮源等营养物质
√
培养基中含有微生物生长需要的营养物质，还能满足微生物生长对环境的要求，A正确；
配制培养基时，需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质的需要，B正确；
培养基是根据不同微生物的生长繁殖需求进行配制的，不能满足各种微生物生长繁殖的需求，C错误。
考点二
发酵工程的无菌技术
1.发酵工程的灭菌方法
(1)化学试剂灭菌法：采用 灭菌的方法。一般不用于培养基灭菌。
(2)射线灭菌法：利用紫外线等产生的 进行灭菌的方法。
(3)干热灭菌法：包括 灭菌法和 法等。
(4)湿热灭菌法：利用 进行灭菌的方法。
(5)过滤除菌法：通过 从而达到除菌目的的方法。
归纳 夯实必备知识
灭菌剂
高能粒子
干热空气
火焰灼烧
饱和蒸汽
过滤阻留微生物
2.发酵工程的灭菌设备
(1)电热鼓风干燥箱： 灭菌设备常用于空的 、金属用具和其他耐高温的物品的灭菌。
(2)高压蒸汽灭菌锅： 灭菌设备，其使用包括加水、 、加热、排空冷空气、 、出锅等步骤。
(3)空气除菌设备。
干热
玻璃器皿
湿热
装锅
保温保压
3.发酵工程的无菌操作器具
(1)接种器具
①接种：是指在 条件下将微生物接入 的操作过程。
②常用的工具有 等，在涂布平板接种时要用 ，穿刺接种时要用接种针，在 或在平板培养基上进行 时要用接种环。
无菌
培养基
玻璃涂布器、接种针、接种环
玻璃涂布器
斜面接种
划线接种
(2)转移器具
①移液管：用来准备移取一定 的溶液或 化学试剂的量器。
②微量取液器：取液量 时使用，分为固定容量的和可调容量的两种。
③超净工作台：是一种经过空气净化而形成 操作环境的设备。优点是操作 。
体积
分装
很少
高洁净
方便
4.微生物接种和传代的无菌技术
(1)穿刺接种：常用于 微生物。
(2)斜面接种：常用的菌种传代和低温下 菌种的方法。
(3)斜面接种和培养酵母菌
①主要目的： 、扩大培养和 等。
②主要步骤：准备接种→ →试管口灭菌→挑取少许菌种→
→培养。
厌氧
保存
菌种转移
保存纯净菌种
接种环灭菌
划线接种
5.微生物分离、纯化和培养的无菌技术
(1)两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
15~20 g琼脂
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)
干热灭菌
酒精灯火焰
灼烧灭菌
平板划线法
恒温培养箱
28
①平板冷凝后，要将平板倒置的原因是什么？
提示 因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
②在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养一段时间，这样做的目的是 。
检测培养基平板灭菌是否合格
③平板划线第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，这样做的目的是什么？
提示 能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
④平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？
提示 最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。
(3)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成 ，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到 作用。
②统计菌落数目一般用 法。
脲酶
催化
涂布平板
③计数：统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中 个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。
④公式： 。
1
30～300
(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数
延伸应用
筛选能高效降解尿素的细菌(目的菌)的培养基成分如下表所示：
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至
1 000 mL
(1)该培养基是如何实现对分解尿素的细菌的筛选的？
提示 该培养基中唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能合成脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。
延伸应用
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至
1 000 mL
(2)如何证明该选择培养基的确起到了筛选作用？
提示 同时设置牛肉膏蛋白胨培养基并进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目；若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则证明了选择培养基的确起到了筛选作用。
延伸应用
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至
1 000 mL
(3)如何证明所用的选择培养基没有受到环境污染？
提示 将未接种的上述培养基与接种的上述培养基同时培养，观察是否有菌落的产生；若未接种的培养基无菌落产生，则证明培养基没有受到环境污染。
延伸应用
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至
1 000 mL
(4)若甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的该细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示 不可靠。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布至少3个平板，统计结果后计算平均值。
延伸应用
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至
1 000 mL
②乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。
考向一 发酵工程灭菌的方法设备与无菌技术操作器具
4.下列有关使用高压蒸汽灭菌锅的操作，错误的是
A.加水时，水面应与三角搁架平齐
B.加盖时，将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内
C.加热时，待冷空气完全排尽后关上排气阀
D.切断电源后，打开排气阀使压力表降到零后开盖
突破 强化关键能力
√
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，加水时的水面应与三角搁架平齐，A正确；
加盖时，应该将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，B正确；
加热时，应该等冷空气完全排尽后再关上排气阀，C正确；
切断电源后，应该等压力表降到零后再打开排气阀并开盖，D错误。
5.微生物培养时常利用无菌技术避免杂菌的污染，下列相关叙述错误的是
A.配制好的培养基应放入干热灭菌箱中进行干热灭菌
B.实验中避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触
C.接种前后的接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
D.实验结束后对实验室喷洒石碳酸同时配合紫外线照射
√
对培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，A错误；
为避免杂菌污染，实验中应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触，B正确；
为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，C正确；
紫外线能破坏DNA结构，密闭空间内的空气常采用紫外线照射消毒，喷洒石碳酸同时配合紫外线照射可提高对密闭空间的消毒效果，D正确。
考向二 微生物接种和传代、分离、纯化和培养的无菌技术
6.(2023·江苏南通高三模拟)下图为微生物的实验室培养的有关操作，下列相关叙述错误的是
A.步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B.步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C.图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得单个菌落
D.接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
√
步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远，防止受到杂菌污染，B正确；
图中所示的接种方法是平板划线法，目的是使接种的菌种逐渐稀释，经培养后获得由单个细菌繁殖而来的菌落，C正确；
图示的平板划线法不能用于微生物的计数，D错误。
步骤①中，接种前灼烧接种环至变红，目的是杀灭接种环上可能引起污染的微生物，A正确；
7.(2018·江苏，31)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_____，及时对培养基进行分装，并进行_______________
灭菌。
pH
高压蒸汽(湿热)
配制培养基时，进行计算、称量、溶解、定容后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
50 ℃
倒平板时的培养基温度约为50 ℃，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有_________。
a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d.可以通过逐步提高培养基中的甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
a、b、d
平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a正确；
划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b正确；
挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c错误；
逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得甲醇高耐受菌株，d正确。
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和______供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血球计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_____色细胞的个数应不少于______，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
氧气
无
30
酵母是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30(个)。
三
重温高考 真题演练
1.(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
1
2
3
4
√
5
根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A项正确；
乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B项错误；
1
2
3
4
5
可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C项正确；
可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D项正确。
1
2
3
4
5
2.(2021·山东，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是
A.乙菌的运动能力比甲菌强
B.为不影响菌的运动需选用液体培养基
C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
1
2
3
4
5
√
从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；
为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；
该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生
硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；
微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
1
2
3
4
5
3.(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取
单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
√
1
2
3
4
5
温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；
由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；
菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；
刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
1
2
3
4
5
4.(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是_____(填编号)。
1
2
3
4
5
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
④
1
2
3
4
5
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经__________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌___________________个。
梯度稀释
4.6×105(或460 000)
1
2
3
4
5
利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行梯度稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数在30～300个的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000
＝4.6×105(个)。
1
2
3
4
5
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行______育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以______为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径______的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
诱变
脂肪
较大
1
2
3
4
5
采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株____进行后续相关研究，理由是_________________________
_______________________________________。
B
该菌株增殖速度快，单细胞
蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
5.(2022·全国乙，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有___________________________________(答出2点即可)。
干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键，对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌，湿热灭菌中效果最好的方法)、灼烧灭菌。
1
2
3
4
5
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是__________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要_______
________(答出2点即可)等营养物质。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
葡萄糖
制糖废液
氮源、
无机盐
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
分析题干实验结果，以葡萄糖为碳源时，细胞干重最大，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖；以制糖废液为碳源时，S产量最高，故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、生长因子等营养物质。
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5
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是___________。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
缺少淀粉酶
由实验结果可知，菌株C可以利用葡萄糖，但在以淀粉为碳源时，菌株C不能生长，说明菌株C无法利用淀粉，分析其原因是菌株C不能合成淀粉酶，导致其无法利用淀粉。
1
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5
1
2
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4
5
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：_________________________
____________________________________________________________________________________________。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
设计一系列不同浓度的制糖
废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
以制糖废液作为碳源，进一步确定生产S的最适碳源浓度，可以以碳源浓度作为自变量，不同碳源浓度下S产量作为因变量，实验思路为：设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，从而确定最适碳源浓度。
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是________________
___________________。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
减少污染、节省
原料、降低生产成本
一、易错辨析
1.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
( )
2.倒平板就是等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置( )
3.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )
4.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( )
5.分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )
五分钟 查落实
√
×
×
×
×
二、填空默写
1.培养基的化学成分包括 等。
2.选择培养基是_________________________________________________
。
3.平板冷凝后，要将平板倒置的原因是_____________________________
______________________________________________________________
。
4.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是_____________
。
水、无机盐、碳源、氮源
一种能将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离
出来的特殊培养基
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，
凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基
中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
以免接种环温
度太高，杀死菌种
5.在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是__________________________________________________________
________________________________________________________________
。
6.同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出平均值。
7.绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以 作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
8.当 ，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次
划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终
能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
3
尿素
两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
四
课时精练
一、单项选择题
1.下列有关培养基的叙述，不正确的是
A.纯化微生物和植物组织培养时常用的是固体培养基
B.在固体培养基中加入无菌水稀释，可直接用于扩大化培养细菌
C.根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型
D.用高压蒸汽灭菌法对培养基灭菌时，初期需排气1～2次，否则压力
达到温度达不到
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纯化微生物需要获得单个菌落，用固体培养基，而植物组织培养一般用固体培养基，因为植物需要固定，A正确；
大量培养微生物要用液体培养基，固体培养基用于分离纯化微生物，B错误；
不同细菌的菌落形态、颜色、大小等菌落特征不同，因此根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型，C正确；
用高压蒸汽灭菌法对培养基灭菌时，初期需排气1～2次，排出灭菌锅内的冷空气，否则压力达到温度达不到，D正确。
2.下图表示土壤中微生物为植物提供氮的过程，图中①、②、③分别代表相关物质，下列有关说法，正确的是
A.①是N2、③是NH3，X代表的细菌异化作用类型是需氧型
B.①是NH3、②是 ，固氮菌在生态系统中属于消费者
C.②是NH3、③是 ，X代表的细菌以有机物作为碳源
D.在实验室培养固氮菌可用二氧化碳为碳源的无氮培养基
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①是N2、③是 ，X代表的细菌异化作用方式可能是需氧型，A错误；
①是N2、②是NH3，固氮菌在生态系统中属于消费者，B错误；
②是NH3、③是 ，X表示土壤中的分解者，X代表的细菌以土壤中的有机物为碳源，C正确；
固氮菌属于异养微生物，在实验室培养固氮菌不能用二氧化碳为碳源的无氮培养基，D错误。
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3.下列有关以CO2为唯一碳源的自养微生物所需营养物质的描述中，错误的是
A.铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮素
B.碳源物质不是该微生物的能源物质
C.水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质
D.琼脂是该微生物的营养要素之一
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铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮素，A正确；
以CO2为唯一碳源的自养微生物，CO2不是该微生物的能源物质，B正确；
水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质，C正确；
琼脂是凝固剂，不是该微生物的营养要素之一，D错误。
4.下列关于无菌操作技术的说法，正确的是
A.消毒仅能杀死物体表面的芽孢和孢子
B.液态的牛奶可用巴氏消毒法消毒
C.培养皿、胶头吸管可用干热灭菌法灭菌
D.高压蒸汽灭菌时间达到后立即排气降温
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消毒不能杀死物体表面的芽孢和孢子，A错误；
牛奶用巴氏消毒法消毒，B正确；
干热灭菌法适用于玻璃器皿和金属工具，胶头吸管可用高压蒸汽灭菌，C错误；
高压蒸汽灭菌时间达到后待压力降至零时，再打开排气阀排气，D错误。
5.(2023·江苏镇江高三模拟)微生物的计数方法有多种，下列有关叙述错误的是
A.用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目时，需利用鉴别培养基培养后计数
B.用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际少
C.用血球计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室
D.用已知密度红细胞悬液对待测菌液以比例计数法计数时，两种液体需混合
均匀
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测定饮用水中大肠杆菌的数目可取一定量的饮用水，之后按一定倍数稀释，再用加入伊红美蓝的鉴别培养基培养，取黑色金属光泽菌落进行计数，A正确；
微生物接种到固体培养基常用的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中稀释涂布平板法接种可以形成单菌落，所以常用来进行微生物的计数，平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体，由于有时候一个菌落是由多个细胞连在一起形成的，因此导致计数偏小；平板划线法常用来筛选分离微生物，不用于计数，B错误；
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用血细胞计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室，C正确；
将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度，D正确。
6.(2023·江苏泰州高三期末)稀释涂布平板是常用的微生物培养方法，下列相关叙述正确的是
A.灭菌锅中取出的培养基应趁烫时倒平板，如此可对培养皿灭菌
B.稀释涂布平板法不可用于微生物的分离，可用于微生物的计数
C.用此法估测的数值往往偏小，应以菌落数最多的平板计数为准
D.稀释涂布平板法分离到的单菌落需进一步纯化，可用平板划线法
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灭菌锅中取出的培养基应冷却至50 ℃左右时倒平板，A错误；
稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数，B错误；
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，C错误；
稀释涂布平板法分离到的单菌落仍需进一步划线纯化，以获得纯种，D正确。
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7.下列有关微生物培养的叙述，正确的是
A.纯化培养时，对培养皿皿盖做标记，培养皿应倒置放在恒温培养箱内的
摇床上培养
B.涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用
C.培养基采用高压蒸汽灭菌，高压灭菌加热结束后，打开放气阀使压力表
指针回到零后，开启锅盖
D.可用平板划线操作对微生物进行分离和计数
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纯化培养时，培养皿应倒置放在恒温培养箱内静止培养，不需要放在摇床上培养，以免杂菌污染，A错误；
涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用，以免高温将部分微生物杀死，B正确；
高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打开放气阀使压力表指针回到零，C错误；
稀释涂布平板法和平板划线法都能对微生物进行分离纯化，但只有稀释涂布平板法可用于计数，D错误。
8.在做分离“分解尿素的细菌”实验时，甲同学从对应10－6培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述不正确的是
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同
B.可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一样，
则可证明甲同学无误
D.B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，而C选项的没有
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甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作中污染造成的，A正确；
甲同学的实验结果可能是培养基污染造成的，可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，B正确；
如果是甲同学实验操作过程中污染造成的，让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一样，则可证明甲同学无误，C正确；
B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则，D错误。
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二、多项选择题
9.下列关于微生物培养和利用的叙述，正确的是
A.接种前要了解固体培养基是否被污染无需接种无菌水来培育检测
B.接种时连续划线的目的是将聚集的菌体逐步稀释获得单个菌落
C.以尿素为唯一氮源且含刚果红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌
D.利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微
生物
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检测培养基是否被污染，应将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，A正确；
平板划线法的原理是通过连续划线将聚集的菌体逐步稀释以获得单个菌落，B正确；
以尿素为唯一氮源的培养基可选择尿素分解菌，用含酚红指示剂的培养基可鉴别尿素分解菌，C错误；
利用尿素固体培养基可保留利用尿素的微生物，同时抑制或阻止其他微生物生长，而非杀死，D错误。
10.(2023·江苏海门中学高三期末)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，a、b、c表示操作步骤，d、e为菌落。下列叙述正确的是
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A.图中①②④为基本培养基，③为完全培养基
B.a操作的目的是提高突变率，增加突变株的数量
C.b的正确操作是用涂布器把菌液均匀地涂布在②表面
D.经c过程原位影印及培养后，可从④中挑取d菌落进行纯化培养
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野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，根据题干信息和图形分析，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；
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紫外线可以提高突变的频率，a操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；
b操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀地涂布在②培养基表面，C正确；
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从图中可看出，d菌落在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明d是氨基酸缺陷型菌落，故经c过程影印及培养后，可从④培养基中挑取d菌落进行纯化培养，D正确。
11.某生物兴趣小组完成了“分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述正确的是
A.在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B.梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C.振荡的目的是为了增加尿素分解菌的浓度
D.由图示菌落计数结果可知10克土样中的菌株数约为1.6×107个
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酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取的土壤在倒入锥形瓶过程中，土样被污染，A正确；
只用移液管，分度太低，而只用微量移液器，容量又太小，所以梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作，B正确；
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振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的利用率，C错误；
由分析可知，每克土壤中的菌株数为1.6×106，即10克土样中的菌株数约为1.6×107个，D正确。
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三、非选择题
12.牛奶是适合微生物生长的良好培养基。牛奶在饮用前都要用巴氏消毒法消毒，以杀死有害微生物。某小组为检测自制酸奶是否被杂菌污染，进行了如图所示操作。请回答下列问题：
(1)取最终的牛奶稀释液0.1 mL在培养基上进行涂布，应选择的工具是图2中的_____。
B
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图1表示的是稀释涂布平板法，可以用来分离菌种和对菌种进行计数；图2中A为接种环，B为涂布器，C为滴管，D为接种针。将牛奶稀释液在培养基上进行涂布的方法是稀释涂布平板法，所用的接种工具是涂布器，即图2中的B。
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(2)图1所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为65、63、64，则可以推测每毫升酸奶中所含细菌数为__________，运用这种方法统计的结果往往较实际值______(填“大”或“小”)，如果培养基上出现_______________________的菌落，说明自制酸奶已被杂菌污染。
6.4×107
小
(形状、大小、颜色)不同
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据图分析，图中10 mL酸奶稀释了105倍，最后取了10 mL稀释液中的0.1 mL，因此每毫升酸奶中所含细菌数为(65＋63＋64)
÷3÷0.1×105＝6.4×107。由于经此方法接种培养时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值小。如果培养基上出现(形状、大小、颜色)不同的菌落，说明自制酸奶已被杂菌污染。
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(3)已知酸奶中的有益菌主要是乳酸菌，要进一步分离纯化乳酸菌，应采用图3中______(填字母)所示的划线分离操作，其正确操作过程中，划线工具至少要灼烧______次。
B
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要进一步分离纯化乳酸菌，应采用平板划线法进行操作，图3中操作正确的是B；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，即图3 B中的4次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，以防止造成污染，因此完成划线共需灼烧接种环5次。
13.苯酚(C6H5OH)是重要的化工原料，被广泛应用于工业生产中，易形成污染，具有致癌、致畸和致突变作用。苯酚降解菌能分解工业废水中的苯酚。自然界中能分解苯酚的微生物有几百种，多为细菌、放线菌等。分离和纯化高效降解苯酚的微生物的实验流程如图1所示：
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请回答下列问题：
(1)在制作苯酚降解菌的富集培养基和平板分离培养基时，培养基中应以______为唯一碳源，后者除基本营养成分外，还应添加______(物质)，然后用___________________________(方法)对培养基进行灭菌。
苯酚
琼脂
高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌法)
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本实验的目的是筛选能降解苯酚的微生物，故在配制相应的培养基时，应该以苯酚为唯一碳源，制作成选
择培养基，才可达到筛选的目的。而平板分离培养基与富集培养基相比，平板分离培养基是在培养皿上分离微生物，得到单菌落，故应制成固体培养基，应再添加凝固剂琼脂，制作好的培养基采用高压蒸汽灭菌法(或湿热灭菌法)灭菌。
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(2)用平板划线法分离得到的单个菌落大小、颜色、隆起度等不完全一致的原因是_______________________________________________________
_________________________。
工业废水中能降解苯酚的微生物有多种，不同种类的微生物在
平板上形成的菌落特征不同
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(3)对分离得到的某株苯酚降解菌进行菌株生长及苯酚降解实验，结果如图2所示。实验结果表明此菌株适于降解的苯酚浓度为_____g/L，判断依据是_________________________________________________________。
1.0
此苯酚浓度下菌体繁殖快(或菌体数量最多)，且苯酚的降解率高第1课时 发酵工程的培养基与无菌技术
课标要求 1.概述培养基的类型及用途。2.阐明无菌技术的操作方法。3.概述利用平板划线法和稀释涂布平板法，进行微生物分离和纯化。
考点一 发酵工程的培养基
培养基
(1)概念：主要是指为人工培养微生物等而制备的，适合微生物等生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。
(2)类型
①按成分分类
培养基种类 成分 优点 缺点 用途
天然培养基 动植物组织或微生物细胞以及它们的提取物或粗消化物 取材便利、营养丰富、配制简便 营养成分难以控制，实验结果的重复性较差 工业化生产
合成培养基 准确称量的高纯度化学试剂加蒸馏水 化学成分明确，实验可重复性好 配制过程繁琐，成本较高 研究与育种
②按物理状态分类
培养基种类 特点 用途
液体培养基 不含凝固剂，呈液体状态 工业生产
固体培养基或半固体培养基 含凝固剂(如琼脂)，呈固体或半固体状态 微生物的分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
③按用途分类：基础培养基和特殊培养基
特殊培养基种类 选择培养基 鉴别培养基 加富培养基
用途 将某种或某类微生物从混杂的微生物中分离出来 快速分类鉴定不同微生物，也用于分离和筛选产生某种代谢产物的菌种 用于培养营养要求比较苛刻的异养微生物。可增加所需微生物的数量
(3)成分
成分 含义 作用 来源
碳源 提供碳元素的物质 构成生物体的细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、牛肉膏等
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸等物质 无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：蛋白胨等
无机盐 为微生物提供除碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素 为微生物提供无机营养，调节培养基的pH等 无机化合物：KH2PO4、 K2HPO4、NaCl等
水 生物体含量最高的无机化合物 良好的溶剂，参与化学反应等 培养基、代谢产物
考向 培养基配制及其作用
1．(多选)现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分和含量如下表，假设用这两种培养基分别去分离土壤中的两种微生物，甲、乙适合分离的微生物是( )
成分 KH2PO4 MgSO4· 7H2O NaCl CaSO4· 2H2O CaCO3 葡萄糖 纯淀粉
甲培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% 0.5% 2%
乙培养基 0.02% 0.02% 0.02% 0.01% 0.5% － －
A．甲培养基适于分离自养型自生固氮菌
B．甲培养基适于分离异养型自生固氮菌
C．乙培养基适于分离自养型自生固氮菌
D．乙培养基适于分离异养型自生固氮菌
答案 BC
解析 甲培养基中含有的葡萄糖和淀粉是有机物，可以作为碳源和能源，适用于异养微生物生长，由此推出该培养基适于分离异养型的自生固氮菌，A错误，B正确；乙培养基中不含有机碳源，不含氮源，可用来分离培养自养型的自生固氮菌，C正确，D错误。
2．在微生物培养的过程中，需要通过选择培养或鉴别培养的方法来筛选出目标菌种。下列与之相关的叙述中，不正确的是( )
A．纤维素分解菌能够分解刚果红染料，从而使菌落周围出现透明圈
B．尿素分解菌能够将尿素分解为氨，从而使酚红指示剂变红
C．在培养基中加入抗生素能够筛选出具有相应抗性的菌株
D．在含有碳酸钙的培养基上生长的乳酸菌菌落周围会出现“溶钙圈”
答案 A
解析 纤维素分解菌能够分解纤维素，在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，A错误；尿素分解菌能够将尿素分解为氨，使培养基呈碱性，从而使酚红指示剂变红，B正确。
3．(2023·江苏无锡高三模拟)培养微生物需要提供适宜的培养基。下列关于培养微生物的培养基的叙述，错误的是( )
A．培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
B．培养基的成分需根据微生物的代谢特点而定
C．培养基需满足各种微生物生长繁殖的需求
D．培养基通常需包含水、无机盐、碳源、氮源等营养物质
答案 C
解析 培养基中含有微生物生长需要的营养物质，还能满足微生物生长对环境的要求，A正确；配制培养基时，需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质的需要，B正确；培养基是根据不同微生物的生长繁殖需求进行配制的，不能满足各种微生物生长繁殖的需求，C错误。
考点二 发酵工程的无菌技术
1．发酵工程的灭菌方法
(1)化学试剂灭菌法：采用灭菌剂灭菌的方法。一般不用于培养基灭菌。
(2)射线灭菌法：利用紫外线等产生的高能粒子进行灭菌的方法。
(3)干热灭菌法：包括干热空气灭菌法和火焰灼烧法等。
(4)湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌的方法。
(5)过滤除菌法：通过过滤阻留微生物从而达到除菌目的的方法。
2．发酵工程的灭菌设备
(1)电热鼓风干燥箱：干热灭菌设备常用于空的玻璃器皿、金属用具和其他耐高温的物品的灭菌。
(2)高压蒸汽灭菌锅：湿热灭菌设备，其使用包括加水、装锅、加热、排空冷空气、保温保压、出锅等步骤。
(3)空气除菌设备。
3．发酵工程的无菌操作器具
(1)接种器具
①接种：是指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。
②常用的工具有玻璃涂布器、接种针、接种环等，在涂布平板接种时要用玻璃涂布器，穿刺接种时要用接种针，在斜面接种或在平板培养基上进行划线接种时要用接种环。
(2)转移器具
①移液管：用来准备移取一定体积的溶液或分装化学试剂的量器。
②微量取液器：取液量很少时使用，分为固定容量的和可调容量的两种。
③超净工作台：是一种经过空气净化而形成高洁净操作环境的设备。优点是操作方便。
4．微生物接种和传代的无菌技术
(1)穿刺接种：常用于厌氧微生物。
(2)斜面接种：常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
(3)斜面接种和培养酵母菌
①主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。
②主要步骤：准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→培养。
5．微生物分离、纯化和培养的无菌技术
(1)两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
请思考以下问题：
①平板冷凝后，要将平板倒置的原因是什么？
提示 因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
②在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
③平板划线第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，这样做的目的是什么？
提示 能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
④平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？
提示 最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。
(3)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
②统计菌落数目一般用涂布平板法。
③计数：统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
④公式：(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。
延伸应用 筛选能高效降解尿素的细菌(目的菌)的培养基成分如下表所示：
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至1 000 mL
(1)该培养基是如何实现对分解尿素的细菌的筛选的？
提示 该培养基中唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能合成脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。
(2)如何证明该选择培养基的确起到了筛选作用？
提示 同时设置牛肉膏蛋白胨培养基并进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目；若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则证明了选择培养基的确起到了筛选作用。
(3)如何证明所用的选择培养基没有受到环境污染？
提示 将未接种的上述培养基与接种的上述培养基同时培养，观察是否有菌落的产生；若未接种的培养基无菌落产生，则证明培养基没有受到环境污染。
(4)若甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的该细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示 不可靠。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布至少3个平板，统计结果后计算平均值。
②乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。
考向一 发酵工程灭菌的方法设备与无菌技术操作器具
4．下列有关使用高压蒸汽灭菌锅的操作，错误的是( )
A．加水时，水面应与三角搁架平齐
B．加盖时，将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内
C．加热时，待冷空气完全排尽后关上排气阀
D．切断电源后，打开排气阀使压力表降到零后开盖
答案 D
解析 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，加水时的水面应与三角搁架平齐，A正确；加盖时，应该将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，B正确；加热时，应该等冷空气完全排尽后再关上排气阀，C正确；切断电源后，应该等压力表降到零后再打开排气阀并开盖，D错误。
5．微生物培养时常利用无菌技术避免杂菌的污染，下列相关叙述错误的是( )
A．配制好的培养基应放入干热灭菌箱中进行干热灭菌
B．实验中避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触
C．接种前后的接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
D．实验结束后对实验室喷洒石碳酸同时配合紫外线照射
答案 A
解析 对培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，A错误；为避免杂菌污染，实验中应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触，B正确；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间内的空气常采用紫外线照射消毒，喷洒石碳酸同时配合紫外线照射可提高对密闭空间的消毒效果，D正确。
考向二 微生物接种和传代、分离、纯化和培养的无菌技术
6．(2023·江苏南通高三模拟)下图为微生物的实验室培养的有关操作，下列相关叙述错误的是( )
A．步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B．步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C．图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得单个菌落
D．接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
答案 D
解析 步骤①中，接种前灼烧接种环至变红，目的是杀灭接种环上可能引起污染的微生物，A正确；步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远，防止受到杂菌污染，B正确；图中所示的接种方法是平板划线法，目的是使接种的菌种逐渐稀释，经培养后获得由单个细菌繁殖而来的菌落，C正确；图示的平板划线法不能用于微生物的计数，D错误。
7．(2018·江苏，31)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的________，及时对培养基进行分装，并进行____________灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有_______。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中的甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血球计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
答案 (1)pH 高压蒸汽(湿热) (2)50 ℃ (3)a、b、d (4)氧气 无 30
解析 (1)配制培养基时，进行计算、称量、溶解、定容后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。(2)倒平板时的培养基温度约为50 ℃，冷凝后倒置培养。(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a正确；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b正确；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c错误；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得甲醇高耐受菌株，d正确。(4)酵母是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30(个)。
1．(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是( )
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
答案 B
解析 根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A项正确；乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B项错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C项正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D项正确。
2.(2021·山东，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是( )
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
答案 B
解析 从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
3.(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案 B
解析 温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
4．(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经_____________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌____________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株____________进行后续相关研究，理由是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)④ (2)梯度稀释 4.6×105(或460 000) (3)诱变 脂肪 较大 (4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析 (2)利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行梯度稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数在30～300个的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝4.6×105(个)。(3)采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。(4)通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
5．(2022·全国乙，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所用的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有_____________________________________________________________(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是______________；用菌株C生产S的最适碳源是______________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要_____________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是__________________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是__________________________。
答案 (1)干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌) (2)葡萄糖 制糖废液 氮源、无机盐
(3)缺少淀粉酶 (4)设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度 (5)减少污染、节省原料、降低生产成本
解析 (1)防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键，对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌，湿热灭菌中效果最好的方法)、灼烧灭菌。(2)分析题干实验结果，以葡萄糖为碳源时，细胞干重最大，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖；以制糖废液为碳源时，S产量最高，故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、生长因子等营养物质。(3)由实验结果可知，菌株C可以利用葡萄糖，但在以淀粉为碳源时，菌株C不能生长，说明菌株C无法利用淀粉，分析其原因是菌株C不能合成淀粉酶，导致其无法利用淀粉。(4)以制糖废液作为碳源，进一步确定生产S的最适碳源浓度，可以以碳源浓度作为自变量，不同碳源浓度下S产量作为因变量，实验思路为：设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，从而确定最适碳源浓度。
一、易错辨析
1．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
2．倒平板就是等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置( × )
3．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( × )
4．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( × )
5．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( × )
二、填空默写
1．培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源等。
2．选择培养基是一种能将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的特殊培养基。
3．平板冷凝后，要将平板倒置的原因是平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4．在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是以免接种环温度太高，杀死菌种。
5．在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
6．同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
7．绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
8．当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
课时精练
一、单项选择题
1．下列有关培养基的叙述，不正确的是( )
A．纯化微生物和植物组织培养时常用的是固体培养基
B．在固体培养基中加入无菌水稀释，可直接用于扩大化培养细菌
C．根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型
D．用高压蒸汽灭菌法对培养基灭菌时，初期需排气1～2次，否则压力达到温度达不到
答案 B
解析 纯化微生物需要获得单个菌落，用固体培养基，而植物组织培养一般用固体培养基，因为植物需要固定，A正确；大量培养微生物要用液体培养基，固体培养基用于分离纯化微生物，B错误；不同细菌的菌落形态、颜色、大小等菌落特征不同，因此根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型，C正确；用高压蒸汽灭菌法对培养基灭菌时，初期需排气1～2次，排出灭菌锅内的冷空气，否则压力达到温度达不到，D正确。
2．下图表示土壤中微生物为植物提供氮的过程，图中①、②、③分别代表相关物质，下列有关说法，正确的是( )
A．①是N2、③是NH3，X代表的细菌异化作用类型是需氧型
B．①是NH3、②是NO，固氮菌在生态系统中属于消费者
C．②是NH3、③是NO，X代表的细菌以有机物作为碳源
D．在实验室培养固氮菌可用二氧化碳为碳源的无氮培养基
答案 C
解析 ①是N2、③是NO，X代表的细菌异化作用方式可能是需氧型，A错误；①是N2、②是NH3，固氮菌在生态系统中属于消费者，B错误；②是NH3、③是NO，X表示土壤中的分解者，X代表的细菌以土壤中的有机物为碳源，C正确；固氮菌属于异养微生物，在实验室培养固氮菌不能用二氧化碳为碳源的无氮培养基，D错误。
3．下列有关以CO2为唯一碳源的自养微生物所需营养物质的描述中，错误的是( )
A．铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮素
B．碳源物质不是该微生物的能源物质
C．水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质
D．琼脂是该微生物的营养要素之一
答案 D
解析 铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮素，A正确；以CO2为唯一碳源的自养微生物，CO2不是该微生物的能源物质，B正确；水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质，C正确；琼脂是凝固剂，不是该微生物的营养要素之一，D错误。
4．下列关于无菌操作技术的说法，正确的是( )
A．消毒仅能杀死物体表面的芽孢和孢子
B．液态的牛奶可用巴氏消毒法消毒
C．培养皿、胶头吸管可用干热灭菌法灭菌
D．高压蒸汽灭菌时间达到后立即排气降温
答案 B
解析 消毒不能杀死物体表面的芽孢和孢子，A错误；牛奶用巴氏消毒法消毒，B正确；干热灭菌法适用于玻璃器皿和金属工具，胶头吸管可用高压蒸汽灭菌，C错误；高压蒸汽灭菌时间达到后待压力降至零时，再打开排气阀排气，D错误。
5．(2023·江苏镇江高三模拟)微生物的计数方法有多种，下列有关叙述错误的是( )
A．用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目时，需利用鉴别培养基培养后计数
B．用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际少
C．用血球计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室
D．用已知密度红细胞悬液对待测菌液以比例计数法计数时，两种液体需混合均匀
答案 B
解析 测定饮用水中大肠杆菌的数目可取一定量的饮用水，之后按一定倍数稀释，再用加入伊红美蓝的鉴别培养基培养，取黑色金属光泽菌落进行计数，A正确；微生物接种到固体培养基常用的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中稀释涂布平板法接种可以形成单菌落，所以常用来进行微生物的计数，平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体，由于有时候一个菌落是由多个细胞连在一起形成的，因此导致计数偏小；平板划线法常用来筛选分离微生物，不用于计数，B错误；用血细胞计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室，C正确；将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度，D正确。
6．(2023·江苏泰州高三期末)稀释涂布平板是常用的微生物培养方法，下列相关叙述正确的是( )
A．灭菌锅中取出的培养基应趁烫时倒平板，如此可对培养皿灭菌
B．稀释涂布平板法不可用于微生物的分离，可用于微生物的计数
C．用此法估测的数值往往偏小，应以菌落数最多的平板计数为准
D．稀释涂布平板法分离到的单菌落需进一步纯化，可用平板划线法
答案 D
解析 灭菌锅中取出的培养基应冷却至50 ℃左右时倒平板，A错误；稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数，B错误；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，C错误；稀释涂布平板法分离到的单菌落仍需进一步划线纯化，以获得纯种，D正确。
7．下列有关微生物培养的叙述，正确的是( )
A．纯化培养时，对培养皿皿盖做标记，培养皿应倒置放在恒温培养箱内的摇床上培养
B．涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用
C．培养基采用高压蒸汽灭菌，高压灭菌加热结束后，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
D．可用平板划线操作对微生物进行分离和计数
答案 B
解析 纯化培养时，培养皿应倒置放在恒温培养箱内静止培养，不需要放在摇床上培养，以免杂菌污染，A错误；涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用，以免高温将部分微生物杀死，B正确；高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打开放气阀使压力表指针回到零，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法都能对微生物进行分离纯化，但只有稀释涂布平板法可用于计数，D错误。
8．在做分离“分解尿素的细菌”实验时，甲同学从对应10－6培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述不正确的是( )
A．甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同
B．可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染
C．让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一样，则可证明甲同学无误
D．B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，而C选项的没有
答案 D
解析 甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作中污染造成的，A正确；甲同学的实验结果可能是培养基污染造成的，可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，B正确；如果是甲同学实验操作过程中污染造成的，让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一样，则可证明甲同学无误，C正确；B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则，D错误。
二、多项选择题
9．下列关于微生物培养和利用的叙述，正确的是( )
A．接种前要了解固体培养基是否被污染无需接种无菌水来培育检测
B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌体逐步稀释获得单个菌落
C．以尿素为唯一氮源且含刚果红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌
D．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
答案 AB
解析 检测培养基是否被污染，应将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，A正确；平板划线法的原理是通过连续划线将聚集的菌体逐步稀释以获得单个菌落，B正确；以尿素为唯一氮源的培养基可选择尿素分解菌，用含酚红指示剂的培养基可鉴别尿素分解菌，C错误；利用尿素固体培养基可保留利用尿素的微生物，同时抑制或阻止其他微生物生长，而非杀死，D错误。
10．(2023·江苏海门中学高三期末)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，a、b、c表示操作步骤，d、e为菌落。下列叙述正确的是( )
A．图中①②④为基本培养基，③为完全培养基
B．a操作的目的是提高突变率，增加突变株的数量
C．b的正确操作是用涂布器把菌液均匀地涂布在②表面
D．经c过程原位影印及培养后，可从④中挑取d菌落进行纯化培养
答案 BCD
解析 野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，根据题干信息和图形分析，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；紫外线可以提高突变的频率，a操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；b操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀地涂布在②培养基表面，C正确；从图中可看出，d菌落在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明d是氨基酸缺陷型菌落，故经c过程影印及培养后，可从④培养基中挑取d菌落进行纯化培养，D正确。
11．某生物兴趣小组完成了“分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述正确的是( )
A．在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B．梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C．振荡的目的是为了增加尿素分解菌的浓度
D．由图示菌落计数结果可知10克土样中的菌株数约为1.6×107个
答案 ABD
解析 酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取的土壤在倒入锥形瓶过程中，土样被污染，A正确；只用移液管，分度太低，而只用微量移液器，容量又太小，所以梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作，B正确；振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的利用率，C错误；由分析可知，每克土壤中的菌株数为1.6×106，即10克土样中的菌株数约为1.6×107个，D正确。
三、非选择题
12．牛奶是适合微生物生长的良好培养基。牛奶在饮用前都要用巴氏消毒法消毒，以杀死有害微生物。某小组为检测自制酸奶是否被杂菌污染，进行了如图所示操作。请回答下列问题：
(1)取最终的牛奶稀释液0.1 mL在培养基上进行涂布，应选择的工具是图2中的__________。
(2)图1所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为65、63、64，则可以推测每毫升酸奶中所含细菌数为__________，运用这种方法统计的结果往往较实际值________(填“大”或“小”)，如果培养基上出现__________的菌落，说明自制酸奶已被杂菌污染。
(3)已知酸奶中的有益菌主要是乳酸菌，要进一步分离纯化乳酸菌，应采用图3中______(填字母)所示的划线分离操作，其正确操作过程中，划线工具至少要灼烧______次。
答案 (1)B (2)6.4×107 小 (形状、大小、颜色)不同 (3)B 5
解析 (1)图1表示的是稀释涂布平板法，可以用来分离菌种和对菌种进行计数；图2中A为接种环，B为涂布器，C为滴管，D为接种针。将牛奶稀释液在培养基上进行涂布的方法是稀释涂布平板法，所用的接种工具是涂布器，即图2中的B。(2)据图分析，图中10 mL酸奶稀释了105倍，最后取了10 mL稀释液中的0.1 mL，因此每毫升酸奶中所含细菌数为(65＋63＋64)÷3÷0.1×105＝6.4×107。由于经此方法接种培养时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值小。如果培养基上出现(形状、大小、颜色)不同的菌落，说明自制酸奶已被杂菌污染。(3)要进一步分离纯化乳酸菌，应采用平板划线法进行操作，图3中操作正确的是B；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，即图3 B中的4次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，以防止造成污染，因此完成划线共需灼烧接种环5次。
13．苯酚(C6H5OH)是重要的化工原料，被广泛应用于工业生产中，易形成污染，具有致癌、致畸和致突变作用。苯酚降解菌能分解工业废水中的苯酚。自然界中能分解苯酚的微生物有几百种，多为细菌、放线菌等。分离和纯化高效降解苯酚的微生物的实验流程如图1所示：
请回答下列问题：
(1)在制作苯酚降解菌的富集培养基和平板分离培养基时，培养基中应以________为唯一碳源，后者除基本营养成分外，还应添加__________(物质)，然后用____________(方法)对培养基进行灭菌。
(2)用平板划线法分离得到的单个菌落大小、颜色、隆起度等不完全一致的原因是________________________________________________________________________。
(3)对分离得到的某株苯酚降解菌进行菌株生长及苯酚降解实验，结果如图2所示。实验结果表明此菌株适于降解的苯酚浓度为________g/L，判断依据是___________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)苯酚 琼脂 高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌法) (2)工业废水中能降解苯酚的微生物有多种，不同种类的微生物在平板上形成的菌落特征不同 (3)1.0 此苯酚浓度下菌体繁殖快(或菌体数量最多)，且苯酚的降解率高
解析 (1)本实验的目的是筛选能降解苯酚的微生物，故在配制相应的培养基时，应该以苯酚为唯一碳源，制作成选择培养基，才可达到筛选的目的。而平板分离培养基与富集培养基相比，平板分离培养基是在培养皿上分离微生物，得到单菌落，故应制成固体培养基，应再添加凝固剂琼脂，制作好的培养基采用高压蒸汽灭菌法(或湿热灭菌法)灭菌。
