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2023年高考生物全国甲卷真题变式·分层精准练：第12题
一、原题
1．（2023·全国甲卷）［生物-选修3：现代生物科技专题］
接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1）接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
（2）制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
（3）目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
（4）若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
二、基础
2．（2023·丽江模拟）接种疫苗是预防疾病的措施之一，某种DNA疫苗的制备与使用过程如下图所示，图中①～④代
表过程。
回答下列问题：
（1）上述实验利用M蛋白基因制备DNA疫苗的原因是M蛋白至少具有2个特性，分别是 。
（2）①所需的工具酶有 。需要进行筛选的过程有 （填写编号）。过程②的目的是 。
（3）DNA疫苗在人体中发挥免疫作用的过程是 。
（4）相比于注射M蛋白质，注射DNA疫苗的优点是 。
（5）根据细菌的结构与特性分析，在基因工程中选择细菌作为受体细胞的优点和缺点分别是 。
3．（2022高三下·昆明月考）乳腺炎和口蹄疫分别是由细菌和病毒引起的危害奶牛养殖业的两种疾病。研究者利用生物技术培育出转乳铁蛋白肽（抗细菌）和人干扰素（抗病毒）的双转基因奶牛新品种。如图为基因表达载体。
（1）牛乳铁蛋白肽基因能在转基因奶牛的乳腺细胞表达，人干扰素基因则可在全身细胞表达，这与构建表达载体时 的选择有关。据图可知， 基因最可能同时转录，判断依据是 。用含有新霉素的培养基可筛选出 基因成功表达的细胞。
（2）将基因导入牛胎儿成纤维细胞前，需用 将其处理成单个细胞。成纤维细胞无法直接发育成个体，需要利用 （至少填2项）技术以实现细胞核的全能性。
（3）研究者利用 技术筛选岀 （填“牛乳铁蛋白基因”或“干扰素基因”）成功表达的胚胎进行移植。
4．（2022高三下·昆明月考）生产上可通过基因工程技术获得具有抗虫基因A的棉花。请回答下列问题：
（1）获得转基因抗虫棉的核心步骤是 。为防止酶切产物自身环化及随意连接，该过程需用2种限制酶。在质粒内，每种限制酶最好只有一个切割位点，理由是 。
（2）常利用农杆菌转化法将抗虫基因A导入棉花的原因是 。
（3）下表是检测与鉴定含A基因棉花植株的4种方法，请完善表格。
方法 原理 检测对象
碱基互补配对 基因组DNA
分子杂交 碱基互补配对
抗原-抗体杂交 总DNA
A基因控制合成的蛋白质在昆虫消化道内被水解产生有毒的多肽，导致昆虫死亡 棉花幼苗
（4）上述4种方法中，利用分子杂交技术检出的含A基因棉花植株的比例 （填“小于”等于”或“大于”）抗原—抗体杂交技术检出的比例。
5．（2020高三上·宜宾期末）将乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入酵母菌基因组中，使之在酵母菌细胞中充分表达，获得的产物经纯化后可制成乙型肝炎疫苗。回答下列问题：
（1）获取乙型肝炎病毒表面抗原基因的方法有多种，如可根据表面抗原蛋白质的结构推测 ，进而推测目的基因的脱氧核苷酸序列，再进行人工合成。目的基因合成后可在Taq酶的作用下通过PCR技术大量扩增，该技术的原理是 ；扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成 。
（2）目的基因在导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，该过程的工具酶有 。基因表达载体中RNA聚合酶识别和结合的部位被称为 。
（3）目的基因在受体细胞中是否翻译出蛋白质，可用 技术来检测。若目的基因导入酵母菌细胞后未能稳定维持和表达其遗传特性，其原因可能是 （答出两点即可）。
（4）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是 。
6．（2021·四川模拟）自新型肺炎爆发以来，我国在新型冠状病毒疫苗的研究上走在了世界的前列。常见的疫苗有灭活疫苗、核酸疫苗等多种。回答下列问题：
（1）灭活疫苗是指用 手段使新型冠状病毒 ，但是不破坏其抗原结构，从而能够刺激机体产生免疫应答。
（2）我国科学家陈薇教授将编码新型冠状病毒（RNA病毒）表面抗原的核苷酸序列，与腺病毒（DNA病毒）的核苷酸序列“拼接”在一起，研制出了核酸疫苗。此过程必不可少的酶有 ，腺病毒的作用是 。
（3）若想在短时间内获得大量的核酸疫苗，常用到 反应，其扩增的过程是 （用简练文字和“→”表示）。
（4）若在分子水平上检测该疫苗是否发挥了作用，应该用 对接种者的血清进行检测，若出现了杂交带，说明该疫苗研制成功。
7．（2022高三上·广西月考）转基因耐除草剂玉米C00102.2是北京大北农生物技术有限公司利用农杆菌转化法，将epsps基因和pat基因转到受体玉米DBN567中，使其具有耐除草剂草甘膦和草铵膦的性状。如图表示两种目的基因酶切位点，回答下列问题：
（1）为获得大量的epsps基因和pat基因，可采用PCR技术进行体外扩增，PCR过程利用的原理是 。
（2）若获得图中两个目的基因连接的融合基因，需要使用的工具酶的具体种类是 酶，若将融合基因连接到质粒上，需要使用 （答具体种类）酶对质粒进行切割。
（3）将重组质粒导入处于 的土壤农杆菌中，然后让农杆菌侵染涂抹了酚类化合物的玉米叶片，最终将Ti质粒的 上的融合基因导人玉米染色体DNA上。：
（4）将成功转化的玉米叶片经 两个过程培养成完整植株。为确定该玉米对除草剂的抗性，在个体水平上可采取的方法是 。
8．（2023高三·贵州模拟）玉米是世界上最重要的饲料作物和粮食作物之一、“玉米的祖先”——野生玉米，名叫“大刍草”，经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米，成为世界上最高产的农作物之一、经过长达10年不懈努力，我国中科院科学家从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，克隆出来并将此高蛋白基因转移到玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。
（1）科研人员获得的THP9基因可以利用PCR技术进行大量的扩增，扩增的原理是 。扩增过程中需要具有模板DNA， （写出两种即可）等基本条件才能保证其顺利进行。若科研人员获得了THP9基因对应核苷酸序列，则可利用DNA合成仪直接合成目的基因，该种获取目的基因的方法是 。
（2）构建基因表达载体时，科研人员将THP9基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，一般用相同的限制酶切割目的基因和Ti质粒的T-DNA片段，目的是 。构建成功的基因表达载体应该含有启动子、终止子、 （至少答两种）等结构。
（3）限制酶来源于原核生物，不会切割本身的DNA分子是因为 。
（4）转化后的玉米细胞需要进行植物组织培养才能发育成完整植株。植物组织培养的脱分化和再分化阶段使用的培养基在成分上最主要的区别是 。
（5）为了检测转基因技术是否成功，科研工作者在个体水平上的检测方法是 。
9．（2023·淮北模拟）针对奥密克戎变异株的第四针剂新冠疫苗“威克欣”，是将新冠病毒基因引入昆虫细胞，制备新冠病毒S蛋白。该疫苗注入人体后诱导产生抗体，目前该产品已实现大规模生产。回答以下问题：
（1）新冠病毒基因经过逆转录后形成的 DNA，常采用 技术扩增。
（2）基因工程的核心步骤是 ；该过程需要在目的基因上游和下游分别添加特定的 和终止子，以便使目的基因可以正常 。
（3）若用病毒作为运载体将新冠病毒基因导入昆虫细胞和大肠杆菌，所用的病毒 （填“相同”或“不相同”）。若要通过培养大肠杆菌生产该疫苗，则需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，我们需要对培养基进行 灭菌，当采用平板划线法分离大肠杆菌时，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，目的是 。
10．（）Bt基因是从苏云金杆菌中分离出来的抗虫蛋白基因，因其表达产物Bt抗虫蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的基因。请回答下列问题：
（1）要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性 ，再利用 技术扩增出Bt基因。
（2）构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有 ，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的 上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是 法。利用 法将基因表达载体导入植物细胞是我国科学家独创的方法。
（3）要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做 实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用 方法进行检测。
（4）Ⅳ中产生的细胞团称为 ，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中 的比例，以便获得幼苗。
11．（2021高三上·韬智杯月考）去年年初，国内牛奶制品因为牧草进口成本上涨而涨价的现象引起了人们的关注。紫花苜蓿是一种重要的牧草，某研究团队拟将耐盐基因HLAl导入紫花苜蓿中培育耐盐牧草，具体实验流程如图甲，图乙是载体pCHLAl中T-DNA示意图。回答下列问题：
（1）过程②为 ，是基因工程的核心步骤，此过程需要使用的酶有 。
（2）过程③常用的转化方法是农杆菌转化法，转化是 。
（3）已知Basta是一种除草剂，则为达到培养并筛选的目的，过程④的培养基所含的成分必须含无机营养、有机营养、 。
（4）过程④得到的幼苗 （填“一定”或“一定不”或“不一定”）含有HLAl基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，进行PCR反应所用到的引物应根据 设计。
（5）要检测目的基因是否插入到苜蓿细胞的染色体DNA上，可采用 技术。
（6）判断本实验的目的基因是否表达成功，还应进行 实验。
三、提高
12．（2023·内江模拟）西瓜花叶病毒（WMV）主要侵害西瓜，哈密瓜等各种瓜类作物，会造成瓜类发病，大面积减产。科研工作者以小鼠为实验对象，利用单克隆技术可制备出抗WMV的特异性单抗，用于西瓜花叶病毒的诊断和检测。回答下列问题：
（1）对小鼠进行免疫时，需要以提纯的WMV病毒作为 ，注射到小鼠体内；诱导小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合常用的化学诱导剂是 。
（2）细胞融合实验完成后，融合体系中会出现多种类型细胞，除有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有 ，出现多种类型细胞的原因是 。
（3）制备抗WMV的单克隆抗体过程中，需要进行两次筛选，第一次的目的是筛选出 ，第二次的目的是筛选出 。
（4）抗WMV的单克隆抗体可作为特异性探针，利用抗原—抗体杂交方法找出能与探针特异性结合的 ，进而实现从抗病性强的西瓜植株中获取抗病目的基因，该目的基因能否在其他植物体内稳定存在并遗传的关键是 。
13．番茄中含有丰富的番茄红素，具有较高的营养价值，科研人员拟将抗寒基因（目的基因）转入番茄红素高表达番茄的核基因组中，培育具有抗寒性状的番茄红素高表达番茄，且研究抗寒基因的导入是否影响此番茄中番茄红素的高表达。其基本过程包括目的基因的获取并形成重组DNA、将重组DNA导入农杆菌、受体材料的消毒、转化番茄细胞、番茄细胞大量培养及番茄红素的检测、植株再生和抗寒性状的鉴定等。回答下列问题：
（1）为了获得目的基因，根据 的原理，在冰川冻土中去寻找具有目的基因的细菌，提取并分离出抗寒基因；选用限制酶和DNA连接酶切割并连接形成重组DNA．关于限制酶选择的依据有哪些？ 。
A．目的基因不能破坏 B．质粒上复制起点不能破坏
C．酶切后的黏性末端能互补连接 D．只能选择一种限制酶进行切割
（2）将重组DNA导入农杆菌，并将受体菌接种在 （“含”或“不含”）抗生素的培养液中，置于 上慢速培养一段时间，使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态，便于筛选。
（3）取番茄的幼嫩叶片，经自来水冲洗，先用70%酒精浸泡，再用 浸泡，最后用无菌水冲洗，作为转基因的受体材料。
（4）将消毒后的番茄叶片剪成小片，在导入目的基因的农杆菌溶液中浸泡后，取出并转移至添加有 的MS培养基，使小叶先脱分化形成愈伤组织，适度分化形成特定的番茄细胞并大量培养，提取并检测番茄红素的含量，从而确定抗寒基因的导入是否影响番茄红素的高表达。能影响细胞的生长率和产物合成的因素有 （至少答出两点）。
（5）为了培育成植株，可将愈伤组织先后转移至发芽培养基和生根培养基，进一步发育形成完整植株；也可将愈伤组织 ，提取其中的胚性细胞发育形成 ，经培养可直接形成根芽，从而快速形成试管苗。然后将上述试管苗在适宜的光照、温度和80%以上的 等条件下进行炼苗后室外大量栽培。为了鉴定 ，可提取叶片组织的DNA，采用PCR扩增技术。
（6）为研究转基因番茄中抗寒基因是否成功表达，可有多种方法进行验证：
①取转基因番茄的体细胞，进行低温培养且 处理，再用 方法检测抗寒蛋白是否存在；
②将转基因植株和非转基因植株处于 环境，若 ，基本能确定抗寒的番茄培育成功。
14．（2023·广西模拟）中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友团队提出了一种利用多重基因编辑技术以红果番茄（双子叶植物）为材料，快速定向创制七种不同果色番茄材料的策略。该研究利用多重基因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素合成或代谢的关键基因。下图是科研人员用CRISPR-Cas9基因编辑技术定点敲除目标基因的示意图，请回答下列问题：
（1）CRISPR-Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两部分，其能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA发生 ；Cas9蛋白能使目标DNA中的 （填化学键名称）断裂，从而实现对目标DNA的剪切。
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用的方法是 。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并 ，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。若要检测目的基因在受体细胞中是否成功表达，从转基因的番茄细胞中提取蛋白质，用相应的 进行抗原—抗体杂交。
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞可利用 技术培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有 ，当培养基中的生长素含量 细胞分裂素含量时，主要诱导根原基的形成。
15．（2023·运城模拟）为了提高马铃薯对真菌病害的抗性，某科研小组进行了马铃薯转基因抗病育种的初步研究，其过程如下所示，请将其完善：
（1）从生防木霉菌株中提取总RNA以及通过 过程合成cDNA。
利用PCR技术对目的基因Chi（抗菌基因）进行扩增；PCR产物与PMDTM18－T载体连接，转化到大肠杆菌，获得重组质粒PMDTM18－T－Chi。
（2）植物表达载体的构建（如图所示）：将重组质粒PMDTM18－T－Chi和p33ECR质粒用 （填具体酶）进行酶切，再用T4DNA连接酶连接，得到p33ECR－Chi。此过程中一般会使用高浓度的T4DNA连接酶，T4DNA连接酶的作用是 。表达载体中p35S是 识别和结合的部位。
（3）p33ECR－Chi工程菌的获得：将p33ECR－Chi质粒转化至农杆菌菌株中，在含 的培养基上获得白色菌斑，挑菌落，获得工程菌。
（4）转基因植株的获得：通过农杆菌转化法将Chi基因转化到马铃薯栽培品种试管马铃薯的块茎中。试管马铃薯的块茎是马铃薯遗传转化的理想外植体，分析其具有的优点是 （写出两点）。
（5）对马铃薯进行抗菌检测：从分子水平上可采用 法检测目的基因表达的产物；从个体水平上进行检测的操作是 。
答案解析部分
1．【答案】（1）重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
（2）筛选转化细胞；RNA聚合酶
（3）核染色体 DNA；被标记的目的基因的单链 DNA 片段
（4）①通过使用基因探针，利用分子杂交技术，检测目的基因是否转插入酵母细胞染色体；
②通过使用基因探针，利用核酸分子杂交技术，检测目的基因是否转录形成 mRNA；
③通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测 mRNA 是否翻译形成蛋白质。
【知识点】基因工程的应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。这种疫苗蛋白质注入人体后，可以引起机体产生体液免疫反应，但病毒的遗传物质无法进行复制与表达。
故填：重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖。
（2）基因运载体上的一些抗生素的抗性基因属于标记基因，可用于筛选目的基因是否成功导入受体细胞。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力，当含有抗生素抗性基因的运载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体基中加入该种抗生素，就可以筛选出转入含运载体的受体细胞。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的位点，能驱动基因转录出mRNA，最终翻译形成相应的蛋白质。
故填：筛选转化细胞；RNA聚合酶。
（3）DNA分子杂交技术是把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物荧光素标记，用标记好的基因片段作为探针，与受体细胞的基因组DNA进行杂交。如果有杂交斑，说明目的基因已经成功导入受体细胞内；反之，则说明目的基因没有进入受体细胞。检测的对象是目的基因是否成功插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记的，且顺序已知的，与目的基因可以互补的DNA片段。
故填：核染色体 DNA；被标记的目的基因的单链 DNA 片段。
（4）检测目的基因在受体细胞是否成功表达，除了需要检测目的基因是否插入到染色体外，还需要检查目的基因是否转录出mRNA与表达出相应的蛋白质。检测是否转录出mRNA，用RNA分子杂交技术，检测是否翻译，用抗原-抗体杂交技术。
故填：①通过使用基因探针，利用分子杂交技术，检测目的基因是否转插入酵母细胞染色体；
②通过使用基因探针，利用核酸分子杂交技术，检测目的基因是否转录形成 mRNA；
③通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测 mRNA 是否翻译形成蛋白质。
【分析】 本题考查基因工程的相关步骤，及其每一步骤的具体操作以及操作目的。 基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。其基本流程包括：目的基因的筛选和获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与表达。
（1）疫苗是将病原微生物(如细菌、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性，起抗原作用，进入体内主要是诱导相应抗体和记忆细胞的产生。抗体存留时间短，在一定时间内可以发挥免疫作用，记忆细胞存留时间长，保留了对相应抗原的长期免疫能力。
（2）基因工程中的几种检测方法
2．【答案】（1）M蛋白可以激发人体免疫力；M蛋白对人体没有危害；M蛋白具有特异性
（2）限制酶和DNA连接酶；①③；在细菌中对重组DNA进行扩增
（3）DNA疫苗进入人体细胞中后转录翻译成M蛋白，M蛋白被释放到细胞外后，引起免疫反应，产生抗体和记忆细胞，发挥免疫作用
（4）可以持续产生M蛋白，引起长时间的免疫反应
（5）优点：细菌繁殖快、遗传物质少，结构简单；缺点：细菌是原核生物，没有内质网和高尔基体对M蛋白的加工与运输
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）M蛋白作为DNA疫苗具备特性：免疫原性强，具有特异性，且致病性弱。
（2）①为构建重组DNA过程需要运用到限制酶，获得目的基因，还需要DNA连接酶，将目的基因与质粒载体重组在一起；需要筛选的过程是①和③，①过程从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体，③目的是筛选出有目的基因的重组DNA。过程②的目的是在细菌中对重组DNA进行扩增。
（3）DNA疫苗在人体中发挥免疫作用的过程是病原体抗原DNA即M蛋白基因在人体细胞内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，M蛋白被释放到细胞外后，引起免疫反应，产生抗体和记忆细胞，发挥免疫作用。
（4）注射DNA疫苗的优点是安全性高，生产迅速简便，易于保存运输、产生持久免疫应答。
（5）在基因工程中选择细菌作为受体细胞的优点繁殖速度快，多为单细胞，遗传物质少便于获取目的基因。缺点是细菌为原核细胞，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质修饰、加工，使得表达的蛋白可能不具备生物活性。
【分析】基因工程的基本操作程序：
第一步：目的基因的获取；
第二步：基因表达载体的构建（核心）
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2、常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。
第四步：目的基因的检测和表达
将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用Ca2+处理细胞使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
1、首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
2、其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交（DNA-RNA）技术。
3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
3．【答案】（1）启动子；干扰素基因与新霉素抗性；干扰素基因与新霉素抗性基因均位于同一个启动子和终止子之间；干扰素
（2）胰蛋白酶；核移植、胚胎移植、动物细胞培养等
（3）抗原—抗体杂交；干扰素基因
【知识点】基因工程的原理；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】 (1)构建表达载体时启动子的位置可决定目的基因在何种细胞中表达。据图可知，干扰素基因与新霉素抗性基因均位于相同的启动子和终止子之间，可同时转录，在翻译时，核糖体可识别mRNA上IRES序列的对应部分，启动另一种肽链的合成，使新霉素抗性基因得到表达，因此在含有新霉素的培养基可生存的细胞干扰素基因也已成功表达。
(2)对牛胎儿成纤维细胞用胰蛋白酶处理，可水解细胞间的胶原纤维，使细胞分散。将成纤维细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，卵母细胞的细胞质可诱导已分化的细胞核恢复分裂、分化，并最终发育为新个体，实现动物细胞细胞核的全能性。
(3)牛乳铁蛋白基因在成年牛的乳腺中才能表达，人干扰素基因可在牛全身细胞表达，因此筛选胚胎时可利用抗原—抗体杂交技术筛选干扰素基因成功表达的胚胎。
【分析】1、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
3、动物细胞培养过程：取动物组织块→用机械方法或胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
4、培育双转基因奶牛涉及的生物技术有基因工程、动物细胞培养、核移植、胚胎移植。
4．【答案】（1）基因表达载体的构建；避免切割后导致基因缺失，影响基因的表达
（2）农杆菌Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上
（3）DNA分子杂交；总mRNA；抗原抗体特异性结合；抗虫接种实验
（4）大于
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。该过程为防止酶切产物自身环化及随意连接，需用2种限制酶同时切割质粒及含有目的基因的DNA片段。载体质粒上每种限制酶的切割位点最好只有一个，否则切割后会导致同种限制酶之间的基因缺失，影响基因的表达。
（2）将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，原因是农杆菌具有Ti质粒，Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
（3）第一种方法检测对象是总DNA，依据的原理是碱基互补配对，所以使用的方法是DNA分子杂交技术，该技术利用DNA探针检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因。分子杂交技术可以检测目的基因是否转录出了mRNA，所以需要从转基因生物中提取总mRNA作为检测对象。检测目的基因是否翻译出相关蛋白质，检测的方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，依据的原理是抗原—抗体的特异性结合。第四种方法检测对象是棉花幼苗，而A基因控制合成的蛋白质在昆虫消化道内被水解产生有毒的多肽，导致昆虫死亡，这是从个体生物学水平鉴定目的基因是否成功表达的原理，所以方法是抗虫接种实验。
（4）据表格中信息分析可知，在上述4种方法中，已导入到受体细胞中的目的基因虽然完成转录，但不一定能完成翻译产生相应的蛋白质，所以利用分子杂交技术检出的含A基因棉花植株的比例大于抗原—抗体杂交技术检出的比例。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5．【答案】（1）氨基酸序列；DNA复制；引物
（2）限制性核酸内切酶、DNA连接酶；启动子
（3）抗原一抗体杂交；目的基因未插入到酵母菌的染色体DNA中、目的基因未转录出mRNA（或未转录成功）目的基因未翻译出相应的蛋白质（或未翻译成功）
（4）体内产生的记忆细胞数量增多，免疫预防作用强
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具简介；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据蛋白质的结构可以推测其氨基酸排列顺序，进而推测出mRNA的核糖核苷酸序列，最终推测出目的基因的脱氧核苷酸序列，在此基础上进行人工合成目的基因。PCR技术大量扩增目的基因的原理是DNA双链复制；PCR扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物。（2）构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，该过程需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶；基因表达载体的组成成分包括启动子、终止子、标记基因、目的基因、复制原点等，其中启动子上有RNA聚合酶识别和结合的位点，以启动转录过程。（3）基因表达产生的蛋白质可以用抗原一抗体杂交技术进行检测。若将目的基因导入酵母菌细胞后，没有能够稳定维持和表达其遗传特性，可能的原因是：目的基因未插入到酵母菌的染色体DNA中、目的基因未转录出mRNA(或转录未成功")、目的基因未翻译出相应的蛋白质(或"翻译未成功”)等。（4）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，原因是体内产生的记忆细胞数量增多，免疫预防作用强。
【分析】 1、根据转录、翻译的过程，依据蛋白质的结构可以推测其氨基酸排列顺序，进而推测出mRNA的核糖核苷酸序列，最终推测出目的基因的脱氧核苷酸序列；PCR技术大量扩增目的基因的原理是DNA双链复制；PCR扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物；
2、基因工程的基本工具：（1）限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
（2）DNA连接酶：缝合DNA片段的磷酸二酯键；（3）载体：最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子；
3、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
6．【答案】（1）物理或化学；失去感染能力
（2）逆转录酶、限制酶、DNA连接酶；目的基因的载体（或目的基因的“分子运输车”）
（3）多聚酶链式；受热变性→冷却复性→加热延伸
（4）新型冠状病毒的表面抗原
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）灭活疫苗是指用物理或化学手段使新型冠状病毒失去感染能力，并保持抗原结构，具有抗原的作用，从而能够刺激机体产生免疫应答。
（2）我国科学家陈薇教授将编码新型冠状病毒(RNA病毒)表面抗原的核苷酸序列，与腺病毒(DNA病毒)的核苷酸序列“拼接”在一起，研制出了核酸疫苗。此过程为基因工程技术，故需要的酶有逆转录酶、限制酶、DNA连接酶，腺病毒的作用是目的基因的载体，运载目的基因进入受体细胞。
（3）若想在短时间内获得大量的核酸疫苗，常用到多聚酶链式反应(PCR技术)，其扩增的过程分为个阶段：受热变性是DNA双链解旋为单链，冷却复性是引物与模板链DNA结合，加热延伸是在Taq酶的作用下延伸DNA子链，即受热变性→冷却复性→加热延伸。
（4）若在分子水平上检测该疫苗是否发挥了作用，应该用新型冠状病毒的表面抗原对接种者的血清(抗体主要在血清里)进行检测，若出现了杂交带，说明产生了相应的浆细胞，进而产生了针对新冠病毒的抗体，进一步说明疫苗研制成功。
【分析】1、制备疫苗，使用病毒，需要进行处理，使其丧失感染力。制备相关基因工程里重组载体，需要合成病毒的DNA，借助逆转录酶、限制酶和DNA连接酶构建表达载体。
2、PCR扩增技术中文名称为聚合酶链式反应，关于PCR技术扩增目的基因简介：
（1）原理：DNA双链可以进行半保留复制；
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成；
（3）条件：模板，引物（进行PCR操作的前提），热稳定DNA聚合酶（taqDNA聚合酶）；
（4）特点：使微量的DNA大幅增多。
7．【答案】（1）DNA双链复制
（2）EcoR Ⅰ和DNA连接；BamHⅠ和Xho Ⅰ
（3）感受态；T-DNA
（4）脱分化和再分化；在玉米生长过程中喷洒一定浓度的除草剂草甘膦和草铵膦溶液，观察玉米植株的生长状况
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的基本工具简介；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）一般采用PCR技术对目的基因进行体外扩增，PCR扩增过程利用的是DNA双链复制的原理，可以获得大量epsps基因和pat基因。
（2）若获得图中两个目的基因连接的融合基因，需要将两个目的基因切出相同的黏性末端并用DNA连接酶连接，由图可知两种基因一侧均含有EcoRⅠ酶切位点，因此使用的酶是EcoRⅠ和DNA连接酶。融合基因两侧分别含有BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切位点，故若将融合基因连接到质粒上，需要使用BamHⅠ和Xho Ⅰ酶对质粒进行切割获得融合基因，再用DNA连接酶将融合基因和质粒连接成重组质粒。
（3）将重组质粒导入处于感受态的土壤农杆菌中，该种状态的农杆菌容易吸收外界的重组质粒，因玉米是单子叶植物，土壤农杆菌的感染性差，因此让农杆菌侵染涂抹了酚类化合物的玉米叶片，目的是吸引土壤农杆菌向玉米叶片聚集，最终将Ti质粒T-DNA上的融合基因导入玉米染色体DNA上。
（4）将成功转化的玉米叶片经脱分化获得愈伤组织，再诱导愈伤组织再分化培养成完整植株，为确定该玉米对除草剂的抗性，在个体水平上可采取的方法是在玉米生长过程中喷洒一定浓度的除草剂草甘膦和草铵膦溶液，观察玉米植株的生长状况，若植株正常生长，则说明该玉米转基因成功，具有除草剂抗性。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测有：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA一分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
8．【答案】（1）DNA双链复制；四种脱氧核苷酸、引物、Taq酶；化学合成法
（2）有利于目的基因和载体形成相同的黏性末端，便于目的基因和载体连接；目的基因、标记基因、复制原点
（3）含有某种限制酶的原核生物，其DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
（4）植物激素（或生长素和细胞分裂素）的比例不同
（5）将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写，PCR技术扩增的原理是DNA双链复制。扩增过程中需要具有模板DNA，四种脱氧核苷酸、引物、Taq酶等基本条件才能保证其顺利进行。科研人员利用DNA合成仪直接合成目的基因，该种获取目的基因的方法是化学合成法，该方法许哟啊已知目的基因的序列。
（2）要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。构建基因表达载体时，用相同的限制酶切割目的基因和Ti质粒的T DNA片段，目的是有利于目的基因和载体形成相同的黏性末端，便于目的基因和载体连接。构建成功的基因表达载体应该含有启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等结构，这样的基因表达载体才能行使正常的功能。
（3）限制酶一般来源于原核生物，其DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，故不会切割本身的DNA分子。
（4）生长素和细胞分裂素的比例可影响细胞的分化过程，生长素含量高有利于生根，含量适中适合愈伤组织的形成，植物组织培养的脱分化和再分化阶段使用的培养基在成分上最主要的区别是生长素和细胞分裂素的比例不同。
（5）为了检测转基因技术是否成功，可进行分子水平、个体水平的检测，个体水平上的检测方法是将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量。
【分析】1、基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
2、植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。在组织培养过程中，使用激素的顺序和比例都影响细胞的发育，细胞分裂素与生长素的比值低时有利于根的分化，该比值高时，有利于芽的分化。
9．【答案】（1）PCR
（2）基因表达载体的构建；启动子；转录（表达）
（3）不相同；湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）；划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
【知识点】微生物的分离和培养；PCR技术的基本操作和应用；灭菌技术；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）新冠病毒基因（RNA）在逆转录酶的作用下，经过逆转录后形成的DNA，常采用PCR技术对其进行扩增。
（2）基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，其中核心步骤是基因表达载体的构建；该过程需要在目的基因上游和下游分别添加特定的启动子（它是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录）和终止子（使转录停止），以便使目的基因可以正常转录（表达）。
（3）若用病毒作为运载体将新冠病毒基因导入昆虫细胞和大肠杆菌，因导入的受体细胞不同，所用的病毒不相同；若要通过培养大肠杆菌生产该疫苗，则需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，需要对培养基采用湿热灭菌或高压蒸汽灭菌；当采用平板划线法分离大肠杆菌时，为保证能得到由单个细菌繁殖而来的菌落，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，目的是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。其中人工合成方法中包括反转录法，即可先提取人体细胞中的mRNA，以其作为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA（或DNA）。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术，方法是采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
10．【答案】（1）引物；PCR
（2）TDNA；染色体DNA；农杆菌转化；花粉管通道
（3）抗虫接种；抗原抗体杂交
（4）愈伤组织；生长素和细胞分裂素
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可利用PCR扩增目的基因，该技术需要引物，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性引物(对)。(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有TDNA(可移动的DNA)，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的染色体DNA上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。花粉管通道法是我国科学家独创的将基因表达载体导入植物细胞的方法。(3)要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用抗原抗体杂交方法进行检测。(4)Ⅳ中产生的细胞团称为愈伤组织，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中生长素与细胞分裂素的比例，以便获得幼苗。
【分析】基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
11．【答案】（1）基因表达载体的构建；限制性核酸内切酶（或限制酶）和DNA连接酶
（2）目的基因进入受体细胞内并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
（3）植物激素、Basta
（4）不一定；HLAl基因序列
（5）DNA分子杂交
（6）耐盐检测（或鉴定）
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】图甲中①为目的基因的获取，②为基因表达载体的构建，③为将基因表达载体导入受体细胞，④为组织培养过程。
（1）过程②将目的基因与农杆菌T1质粒重组在一起，为基因表达载体的构建，是基因工程的核心，此过程需要限制酶和DNA连接酶。
（2）将目的基因导入植物细胞，常用农杆菌转化法，转化是指目的基因进入受体细胞内并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（3）据图乙可知，T-DNA中含有除草剂抗性基因，则为达到培养并筛选的目的，过程④为植物组织培养过程，培养基中应含有植物激素以调控组织培养进程，也应含有除草剂Basta来筛选含有目的基因的受体细胞。
（4）由于导入的效率不会是100%，过程④得到的幼苗不一定含有HLAl基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，引物要能与目的基因两条单链的碱基互补，故进行PCR反应的两种引物应根据HLAl的基因序列设计。
（5）检测目的基因是否插入到苜蓿细胞的染色体DNA上，可用放射性同位素标记的目的基因单链做探针，采用DNA分子杂交技术，若出现杂交带，说明目的基因已插入到苜蓿细胞的染色体DNA上。
（6）培育耐盐牧草，最终应进行个体水平的检测，应进行耐盐检测（或鉴定）实验。
【分析】1、基因表达载体的构建：（1）过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。（2）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。（3）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
3、PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
4、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
12．【答案】（1）抗原；聚乙二醇
（2）B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞；细胞融合是随机的，且融合率达不到100%
（3）杂交瘤细胞；能产生所需抗体（抗WMV的抗体）的杂交瘤细胞
（4）基因表达产物；目的基因是否整合到受体细胞的染色体上
【知识点】单克隆抗体的制备过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）对小鼠进行免疫时，需要以提纯的WMV病毒作为抗原，对小鼠进行免疫，进而可获得较多的B淋巴细胞（浆细胞），而后用物理、化学或生物方法诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，其中常用化学诱导剂为聚乙二醇（PEG）。
（2）细胞融合实验完成后，融合体系中会出现多种类型细胞，除有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，若只考虑两两融合，还会出现B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞，为了得到杂交瘤细胞，可利用选择培养基对融合细胞进行初步筛选，之所以出现多种类型细胞，原因是由于细胞融合是随机的，且融合率达不到100%。
（3）制备抗WMV的单克隆抗体过程中，需要进行两次筛选，由于促融后会出现多种类型的细胞，因而第一次的目的是筛选出杂交瘤细胞，由于杂交瘤细胞因为B细胞的种类较多，因而杂交瘤细胞产生的抗体种类较多，因而需要进行第二次筛选，其目的是筛选出能产生所需抗体（抗WMV的抗体）的杂交瘤细胞，而后对该细胞进行大量培养，进而获取单克隆抗体。
（4）抗WMV的单克隆抗体还可作为特异性探针，利用抗原一抗体杂交方法找出能与探针特异性结合的基因表达产物，进而实现从抗病性强的西瓜植株中获取抗病目的基因，该目的基因能否在其他植物体内稳定存在并遗传的关键是目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，而后才能随着受体细胞染色体的复制而复制，进而可以稳定保存。
【分析】1、单克隆抗体的制备： （1）用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。 （2）用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选，才能获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 （4）将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。 （5）从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
2、单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且能大量制备，因此广泛用作诊断试剂。
13．【答案】（1）生物与环境相适应；ABC
（2）含；摇床
（3）10%次氯酸钠（写“次氯酸钠”“氯化汞”也给分）
（4）适当配比的植物生长调节剂；温度、pH、继代培养次数、营养成分等
（5）液体悬浮培养；胚状体；湿度；目的基因是否导入了受体细胞
（6）破壁（“研磨”或“破碎”）；抗原-抗体杂交；低温且相同；转基因植株存活率明显高于非转基因植株
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）为了获取抗寒基因在冰川冻土中有适应寒冷环境的细菌体中提取，利用的是生物物与环境相适应的原理。限制酶选择的原则是不能破坏目的基因；质粒上复制起点不能破坏，否则质粒不能复制；酶切后的黏性末端能互补连接 ，否则质粒和目的基因不能连接；可以选择一种酶或产生相同黏性末端的不同酶切割，A、B、C符合题意，D不符合题意。
故答案为：生物与环境相适应；ABC。
（2）由于普通农杆菌细胞中没有抗生素抗性基因，而导入重组Ti质粒的农杆菌体内有抗生素抗性基因，所以将受体菌接种在含抗生素的培养液中，可以鉴定和筛选导入目的基因的受体菌。农杆菌是好氧菌，所以需要将培养瓶置于摇床上，摇床有利于农杆菌接触充足氧气而大量增殖。
故答案为：含；摇床。
（3）外植体（幼嫩叶片）需要消毒，先用70%酒精浸泡，再用浸泡10%次氯酸钠，杀死部分微生物，避免杂菌污染。
故答案为：10%次氯酸钠（写“次氯酸钠”“氯化汞”也给分）。
（4）植物组织脱分化培养时需加入适当配比的植物生长调节剂，诱导脱分化。能影响细胞的生长率和产物合成的因素有培养基中的温度、pH、继代培养次数、营养成分等。
故答案为：适当配比的植物生长调节剂；温度、pH、继代培养次数、营养成分等。
（5）可将愈伤组织在液体培养液中悬浮培养，提取胚性细胞发育形成胚状体，继而发育成幼苗。炼苗时，提供适宜的光照、温度和80%以上的湿度等条件。为了鉴定目的基因是否导入受体细胞，可用PCR扩增技术，进行DNA分子杂交。
故答案为：液体悬浮培养；胚状体；湿度；目的基因是否导入了受体细胞。
（6）探究抗寒基因是否表达，①将转基因番茄的体细胞，低温培养且破壁处理（目的是去除植物细胞壁），再用抗原-抗体杂交技术检测抗寒蛋白。②从个体水平检测，将转基因植株和非转基因植株处于低温且相同环境，若转基因植株存活率明显高于非转基因植株，说明抗寒番茄培育成功。
故答案为：破壁（“研磨”或“破碎”）；抗原-抗体杂交；低温且相同；转基因植株存活率明显高于非转基因植株。
【分析】1、目的基因的检测与鉴定
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。
2、 植物组织培养技术是指在无菌操作条件下，将植物体的各类结构材料——外植体（根尖、茎段、茎尖、幼叶、幼胚、花药等）接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行离体培养的技术。
14．【答案】（1）碱基互补配对（或特异性结合）；磷酸二酯键
（2）农杆菌转化法；将目的基因插入到植物细胞中的染色体的DNA上；单克隆抗体
（3）植物组织培养；全能性；大于
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）；植物组织培养的影响因素
【解析】【解答】（1）CRISPR-Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两部分，其能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA有相应的识别序列能特异性结合，使得CRISPR-Cas9系统能精准识别相关基因，Cas9蛋白相当于限制性内切酶，能使目标DNA中的磷酸二酯键断裂，从而实现对目标DNA的剪切。
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用农杆菌转化法。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并将目的基因插入到植物细胞中的染色体的DNA上，因而可以使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。若要检测目的基因在受体细胞中是否成功表达，从转基因的番茄细胞中提取蛋白质，用相应的单克隆抗体进行抗原—抗体杂交，进而检测目的基因是否表达。
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞可利用植物组织培养技术培养成完整的植株，该技术的原理是植物细胞的全能性。这是因为植物细胞中含有本物种全套的遗传物质，当培养基中的生长素含量大于细胞分裂素含量时，主要诱导根原基的形成，这应该是由于生长素能促进根的生成。
【分析】1、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
3、植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。嫩枝或分化程度较低的部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，故外植体一般选用嫩枝或分化程度较低的部位成功率更高。植物组织培养中植物激素使用：植物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。当培养基中的生长素含量大于细胞分裂素含量时，主要诱导根原基的形成。
15．【答案】（1）逆转录（反转录）
（2）BamHI和SacI；既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合"双链DNA片段的平末端；RNA聚合酶
（3）氨苄青霉素
（4）取材方便、无需灭菌、周期短、转化效率高和不定芽能直接再生（写两点，合理即可）
（5）抗原—抗体杂交；霉菌接种实验
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）cDNA是以mRNA为模板，通过反（逆）转录过程合成的。
（2）构建基因表达载体时，一般用限制酶对目的基因和载体进行切割，目的基因应插入启动子之后，由图中所示的表达载体组成可以看出，该表达载体构建时所用的限制酶为BamHI和SacI；T4 DNA连接酶的作用是：既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端；p35S是启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
（3）由图示基因表达载体可以看出，p33ECR-Chi的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，因此在筛选该转化菌株时，应将p33ECR-Chi质粒转化至农杆菌的菌株，培养在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选。
（4）试管马铃薯的块茎因其取材方便、无需灭菌、周期短、转化效率高等优点，使得马铃薯成为遗传转化的理想外植体。
（5）对马铃薯进行抗菌检测：从分子水平上可采用抗原——抗体杂交法检测目的基因表达的产物；从个体水平上可采用霉菌接种实验进行检测。
【分析】1、 逆转录是在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。
2、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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2023年高考生物全国甲卷真题变式·分层精准练：第12题
一、原题
1．（2023·全国甲卷）［生物-选修3：现代生物科技专题］
接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1）接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
（2）制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
（3）目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
（4）若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
【答案】（1）重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
（2）筛选转化细胞；RNA聚合酶
（3）核染色体 DNA；被标记的目的基因的单链 DNA 片段
（4）①通过使用基因探针，利用分子杂交技术，检测目的基因是否转插入酵母细胞染色体；
②通过使用基因探针，利用核酸分子杂交技术，检测目的基因是否转录形成 mRNA；
③通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测 mRNA 是否翻译形成蛋白质。
【知识点】基因工程的应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。这种疫苗蛋白质注入人体后，可以引起机体产生体液免疫反应，但病毒的遗传物质无法进行复制与表达。
故填：重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖。
（2）基因运载体上的一些抗生素的抗性基因属于标记基因，可用于筛选目的基因是否成功导入受体细胞。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力，当含有抗生素抗性基因的运载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体基中加入该种抗生素，就可以筛选出转入含运载体的受体细胞。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的位点，能驱动基因转录出mRNA，最终翻译形成相应的蛋白质。
故填：筛选转化细胞；RNA聚合酶。
（3）DNA分子杂交技术是把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物荧光素标记，用标记好的基因片段作为探针，与受体细胞的基因组DNA进行杂交。如果有杂交斑，说明目的基因已经成功导入受体细胞内；反之，则说明目的基因没有进入受体细胞。检测的对象是目的基因是否成功插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记的，且顺序已知的，与目的基因可以互补的DNA片段。
故填：核染色体 DNA；被标记的目的基因的单链 DNA 片段。
（4）检测目的基因在受体细胞是否成功表达，除了需要检测目的基因是否插入到染色体外，还需要检查目的基因是否转录出mRNA与表达出相应的蛋白质。检测是否转录出mRNA，用RNA分子杂交技术，检测是否翻译，用抗原-抗体杂交技术。
故填：①通过使用基因探针，利用分子杂交技术，检测目的基因是否转插入酵母细胞染色体；
②通过使用基因探针，利用核酸分子杂交技术，检测目的基因是否转录形成 mRNA；
③通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测 mRNA 是否翻译形成蛋白质。
【分析】 本题考查基因工程的相关步骤，及其每一步骤的具体操作以及操作目的。 基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。其基本流程包括：目的基因的筛选和获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与表达。
（1）疫苗是将病原微生物(如细菌、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性，起抗原作用，进入体内主要是诱导相应抗体和记忆细胞的产生。抗体存留时间短，在一定时间内可以发挥免疫作用，记忆细胞存留时间长，保留了对相应抗原的长期免疫能力。
（2）基因工程中的几种检测方法
二、基础
2．（2023·丽江模拟）接种疫苗是预防疾病的措施之一，某种DNA疫苗的制备与使用过程如下图所示，图中①～④代
表过程。
回答下列问题：
（1）上述实验利用M蛋白基因制备DNA疫苗的原因是M蛋白至少具有2个特性，分别是 。
（2）①所需的工具酶有 。需要进行筛选的过程有 （填写编号）。过程②的目的是 。
（3）DNA疫苗在人体中发挥免疫作用的过程是 。
（4）相比于注射M蛋白质，注射DNA疫苗的优点是 。
（5）根据细菌的结构与特性分析，在基因工程中选择细菌作为受体细胞的优点和缺点分别是 。
【答案】（1）M蛋白可以激发人体免疫力；M蛋白对人体没有危害；M蛋白具有特异性
（2）限制酶和DNA连接酶；①③；在细菌中对重组DNA进行扩增
（3）DNA疫苗进入人体细胞中后转录翻译成M蛋白，M蛋白被释放到细胞外后，引起免疫反应，产生抗体和记忆细胞，发挥免疫作用
（4）可以持续产生M蛋白，引起长时间的免疫反应
（5）优点：细菌繁殖快、遗传物质少，结构简单；缺点：细菌是原核生物，没有内质网和高尔基体对M蛋白的加工与运输
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）M蛋白作为DNA疫苗具备特性：免疫原性强，具有特异性，且致病性弱。
（2）①为构建重组DNA过程需要运用到限制酶，获得目的基因，还需要DNA连接酶，将目的基因与质粒载体重组在一起；需要筛选的过程是①和③，①过程从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体，③目的是筛选出有目的基因的重组DNA。过程②的目的是在细菌中对重组DNA进行扩增。
（3）DNA疫苗在人体中发挥免疫作用的过程是病原体抗原DNA即M蛋白基因在人体细胞内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，M蛋白被释放到细胞外后，引起免疫反应，产生抗体和记忆细胞，发挥免疫作用。
（4）注射DNA疫苗的优点是安全性高，生产迅速简便，易于保存运输、产生持久免疫应答。
（5）在基因工程中选择细菌作为受体细胞的优点繁殖速度快，多为单细胞，遗传物质少便于获取目的基因。缺点是细菌为原核细胞，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质修饰、加工，使得表达的蛋白可能不具备生物活性。
【分析】基因工程的基本操作程序：
第一步：目的基因的获取；
第二步：基因表达载体的构建（核心）
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2、常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。
第四步：目的基因的检测和表达
将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用Ca2+处理细胞使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
1、首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
2、其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交（DNA-RNA）技术。
3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
3．（2022高三下·昆明月考）乳腺炎和口蹄疫分别是由细菌和病毒引起的危害奶牛养殖业的两种疾病。研究者利用生物技术培育出转乳铁蛋白肽（抗细菌）和人干扰素（抗病毒）的双转基因奶牛新品种。如图为基因表达载体。
（1）牛乳铁蛋白肽基因能在转基因奶牛的乳腺细胞表达，人干扰素基因则可在全身细胞表达，这与构建表达载体时 的选择有关。据图可知， 基因最可能同时转录，判断依据是 。用含有新霉素的培养基可筛选出 基因成功表达的细胞。
（2）将基因导入牛胎儿成纤维细胞前，需用 将其处理成单个细胞。成纤维细胞无法直接发育成个体，需要利用 （至少填2项）技术以实现细胞核的全能性。
（3）研究者利用 技术筛选岀 （填“牛乳铁蛋白基因”或“干扰素基因”）成功表达的胚胎进行移植。
【答案】（1）启动子；干扰素基因与新霉素抗性；干扰素基因与新霉素抗性基因均位于同一个启动子和终止子之间；干扰素
（2）胰蛋白酶；核移植、胚胎移植、动物细胞培养等
（3）抗原—抗体杂交；干扰素基因
【知识点】基因工程的原理；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】 (1)构建表达载体时启动子的位置可决定目的基因在何种细胞中表达。据图可知，干扰素基因与新霉素抗性基因均位于相同的启动子和终止子之间，可同时转录，在翻译时，核糖体可识别mRNA上IRES序列的对应部分，启动另一种肽链的合成，使新霉素抗性基因得到表达，因此在含有新霉素的培养基可生存的细胞干扰素基因也已成功表达。
(2)对牛胎儿成纤维细胞用胰蛋白酶处理，可水解细胞间的胶原纤维，使细胞分散。将成纤维细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，卵母细胞的细胞质可诱导已分化的细胞核恢复分裂、分化，并最终发育为新个体，实现动物细胞细胞核的全能性。
(3)牛乳铁蛋白基因在成年牛的乳腺中才能表达，人干扰素基因可在牛全身细胞表达，因此筛选胚胎时可利用抗原—抗体杂交技术筛选干扰素基因成功表达的胚胎。
【分析】1、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
3、动物细胞培养过程：取动物组织块→用机械方法或胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
4、培育双转基因奶牛涉及的生物技术有基因工程、动物细胞培养、核移植、胚胎移植。
4．（2022高三下·昆明月考）生产上可通过基因工程技术获得具有抗虫基因A的棉花。请回答下列问题：
（1）获得转基因抗虫棉的核心步骤是 。为防止酶切产物自身环化及随意连接，该过程需用2种限制酶。在质粒内，每种限制酶最好只有一个切割位点，理由是 。
（2）常利用农杆菌转化法将抗虫基因A导入棉花的原因是 。
（3）下表是检测与鉴定含A基因棉花植株的4种方法，请完善表格。
方法 原理 检测对象
碱基互补配对 基因组DNA
分子杂交 碱基互补配对
抗原-抗体杂交 总DNA
A基因控制合成的蛋白质在昆虫消化道内被水解产生有毒的多肽，导致昆虫死亡 棉花幼苗
（4）上述4种方法中，利用分子杂交技术检出的含A基因棉花植株的比例 （填“小于”等于”或“大于”）抗原—抗体杂交技术检出的比例。
【答案】（1）基因表达载体的构建；避免切割后导致基因缺失，影响基因的表达
（2）农杆菌Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上
（3）DNA分子杂交；总mRNA；抗原抗体特异性结合；抗虫接种实验
（4）大于
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。该过程为防止酶切产物自身环化及随意连接，需用2种限制酶同时切割质粒及含有目的基因的DNA片段。载体质粒上每种限制酶的切割位点最好只有一个，否则切割后会导致同种限制酶之间的基因缺失，影响基因的表达。
（2）将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，原因是农杆菌具有Ti质粒，Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
（3）第一种方法检测对象是总DNA，依据的原理是碱基互补配对，所以使用的方法是DNA分子杂交技术，该技术利用DNA探针检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因。分子杂交技术可以检测目的基因是否转录出了mRNA，所以需要从转基因生物中提取总mRNA作为检测对象。检测目的基因是否翻译出相关蛋白质，检测的方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，依据的原理是抗原—抗体的特异性结合。第四种方法检测对象是棉花幼苗，而A基因控制合成的蛋白质在昆虫消化道内被水解产生有毒的多肽，导致昆虫死亡，这是从个体生物学水平鉴定目的基因是否成功表达的原理，所以方法是抗虫接种实验。
（4）据表格中信息分析可知，在上述4种方法中，已导入到受体细胞中的目的基因虽然完成转录，但不一定能完成翻译产生相应的蛋白质，所以利用分子杂交技术检出的含A基因棉花植株的比例大于抗原—抗体杂交技术检出的比例。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5．（2020高三上·宜宾期末）将乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入酵母菌基因组中，使之在酵母菌细胞中充分表达，获得的产物经纯化后可制成乙型肝炎疫苗。回答下列问题：
（1）获取乙型肝炎病毒表面抗原基因的方法有多种，如可根据表面抗原蛋白质的结构推测 ，进而推测目的基因的脱氧核苷酸序列，再进行人工合成。目的基因合成后可在Taq酶的作用下通过PCR技术大量扩增，该技术的原理是 ；扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成 。
（2）目的基因在导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，该过程的工具酶有 。基因表达载体中RNA聚合酶识别和结合的部位被称为 。
（3）目的基因在受体细胞中是否翻译出蛋白质，可用 技术来检测。若目的基因导入酵母菌细胞后未能稳定维持和表达其遗传特性，其原因可能是 （答出两点即可）。
（4）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是 。
【答案】（1）氨基酸序列；DNA复制；引物
（2）限制性核酸内切酶、DNA连接酶；启动子
（3）抗原一抗体杂交；目的基因未插入到酵母菌的染色体DNA中、目的基因未转录出mRNA（或未转录成功）目的基因未翻译出相应的蛋白质（或未翻译成功）
（4）体内产生的记忆细胞数量增多，免疫预防作用强
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具简介；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据蛋白质的结构可以推测其氨基酸排列顺序，进而推测出mRNA的核糖核苷酸序列，最终推测出目的基因的脱氧核苷酸序列，在此基础上进行人工合成目的基因。PCR技术大量扩增目的基因的原理是DNA双链复制；PCR扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物。（2）构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，该过程需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶；基因表达载体的组成成分包括启动子、终止子、标记基因、目的基因、复制原点等，其中启动子上有RNA聚合酶识别和结合的位点，以启动转录过程。（3）基因表达产生的蛋白质可以用抗原一抗体杂交技术进行检测。若将目的基因导入酵母菌细胞后，没有能够稳定维持和表达其遗传特性，可能的原因是：目的基因未插入到酵母菌的染色体DNA中、目的基因未转录出mRNA(或转录未成功")、目的基因未翻译出相应的蛋白质(或"翻译未成功”)等。（4）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，原因是体内产生的记忆细胞数量增多，免疫预防作用强。
【分析】 1、根据转录、翻译的过程，依据蛋白质的结构可以推测其氨基酸排列顺序，进而推测出mRNA的核糖核苷酸序列，最终推测出目的基因的脱氧核苷酸序列；PCR技术大量扩增目的基因的原理是DNA双链复制；PCR扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物；
2、基因工程的基本工具：（1）限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
（2）DNA连接酶：缝合DNA片段的磷酸二酯键；（3）载体：最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子；
3、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
6．（2021·四川模拟）自新型肺炎爆发以来，我国在新型冠状病毒疫苗的研究上走在了世界的前列。常见的疫苗有灭活疫苗、核酸疫苗等多种。回答下列问题：
（1）灭活疫苗是指用 手段使新型冠状病毒 ，但是不破坏其抗原结构，从而能够刺激机体产生免疫应答。
（2）我国科学家陈薇教授将编码新型冠状病毒（RNA病毒）表面抗原的核苷酸序列，与腺病毒（DNA病毒）的核苷酸序列“拼接”在一起，研制出了核酸疫苗。此过程必不可少的酶有 ，腺病毒的作用是 。
（3）若想在短时间内获得大量的核酸疫苗，常用到 反应，其扩增的过程是 （用简练文字和“→”表示）。
（4）若在分子水平上检测该疫苗是否发挥了作用，应该用 对接种者的血清进行检测，若出现了杂交带，说明该疫苗研制成功。
【答案】（1）物理或化学；失去感染能力
（2）逆转录酶、限制酶、DNA连接酶；目的基因的载体（或目的基因的“分子运输车”）
（3）多聚酶链式；受热变性→冷却复性→加热延伸
（4）新型冠状病毒的表面抗原
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）灭活疫苗是指用物理或化学手段使新型冠状病毒失去感染能力，并保持抗原结构，具有抗原的作用，从而能够刺激机体产生免疫应答。
（2）我国科学家陈薇教授将编码新型冠状病毒(RNA病毒)表面抗原的核苷酸序列，与腺病毒(DNA病毒)的核苷酸序列“拼接”在一起，研制出了核酸疫苗。此过程为基因工程技术，故需要的酶有逆转录酶、限制酶、DNA连接酶，腺病毒的作用是目的基因的载体，运载目的基因进入受体细胞。
（3）若想在短时间内获得大量的核酸疫苗，常用到多聚酶链式反应(PCR技术)，其扩增的过程分为个阶段：受热变性是DNA双链解旋为单链，冷却复性是引物与模板链DNA结合，加热延伸是在Taq酶的作用下延伸DNA子链，即受热变性→冷却复性→加热延伸。
（4）若在分子水平上检测该疫苗是否发挥了作用，应该用新型冠状病毒的表面抗原对接种者的血清(抗体主要在血清里)进行检测，若出现了杂交带，说明产生了相应的浆细胞，进而产生了针对新冠病毒的抗体，进一步说明疫苗研制成功。
【分析】1、制备疫苗，使用病毒，需要进行处理，使其丧失感染力。制备相关基因工程里重组载体，需要合成病毒的DNA，借助逆转录酶、限制酶和DNA连接酶构建表达载体。
2、PCR扩增技术中文名称为聚合酶链式反应，关于PCR技术扩增目的基因简介：
（1）原理：DNA双链可以进行半保留复制；
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成；
（3）条件：模板，引物（进行PCR操作的前提），热稳定DNA聚合酶（taqDNA聚合酶）；
（4）特点：使微量的DNA大幅增多。
7．（2022高三上·广西月考）转基因耐除草剂玉米C00102.2是北京大北农生物技术有限公司利用农杆菌转化法，将epsps基因和pat基因转到受体玉米DBN567中，使其具有耐除草剂草甘膦和草铵膦的性状。如图表示两种目的基因酶切位点，回答下列问题：
（1）为获得大量的epsps基因和pat基因，可采用PCR技术进行体外扩增，PCR过程利用的原理是 。
（2）若获得图中两个目的基因连接的融合基因，需要使用的工具酶的具体种类是 酶，若将融合基因连接到质粒上，需要使用 （答具体种类）酶对质粒进行切割。
（3）将重组质粒导入处于 的土壤农杆菌中，然后让农杆菌侵染涂抹了酚类化合物的玉米叶片，最终将Ti质粒的 上的融合基因导人玉米染色体DNA上。：
（4）将成功转化的玉米叶片经 两个过程培养成完整植株。为确定该玉米对除草剂的抗性，在个体水平上可采取的方法是 。
【答案】（1）DNA双链复制
（2）EcoR Ⅰ和DNA连接；BamHⅠ和Xho Ⅰ
（3）感受态；T-DNA
（4）脱分化和再分化；在玉米生长过程中喷洒一定浓度的除草剂草甘膦和草铵膦溶液，观察玉米植株的生长状况
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的基本工具简介；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）一般采用PCR技术对目的基因进行体外扩增，PCR扩增过程利用的是DNA双链复制的原理，可以获得大量epsps基因和pat基因。
（2）若获得图中两个目的基因连接的融合基因，需要将两个目的基因切出相同的黏性末端并用DNA连接酶连接，由图可知两种基因一侧均含有EcoRⅠ酶切位点，因此使用的酶是EcoRⅠ和DNA连接酶。融合基因两侧分别含有BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切位点，故若将融合基因连接到质粒上，需要使用BamHⅠ和Xho Ⅰ酶对质粒进行切割获得融合基因，再用DNA连接酶将融合基因和质粒连接成重组质粒。
（3）将重组质粒导入处于感受态的土壤农杆菌中，该种状态的农杆菌容易吸收外界的重组质粒，因玉米是单子叶植物，土壤农杆菌的感染性差，因此让农杆菌侵染涂抹了酚类化合物的玉米叶片，目的是吸引土壤农杆菌向玉米叶片聚集，最终将Ti质粒T-DNA上的融合基因导入玉米染色体DNA上。
（4）将成功转化的玉米叶片经脱分化获得愈伤组织，再诱导愈伤组织再分化培养成完整植株，为确定该玉米对除草剂的抗性，在个体水平上可采取的方法是在玉米生长过程中喷洒一定浓度的除草剂草甘膦和草铵膦溶液，观察玉米植株的生长状况，若植株正常生长，则说明该玉米转基因成功，具有除草剂抗性。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测有：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA一分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
8．（2023高三·贵州模拟）玉米是世界上最重要的饲料作物和粮食作物之一、“玉米的祖先”——野生玉米，名叫“大刍草”，经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米，成为世界上最高产的农作物之一、经过长达10年不懈努力，我国中科院科学家从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，克隆出来并将此高蛋白基因转移到玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。
（1）科研人员获得的THP9基因可以利用PCR技术进行大量的扩增，扩增的原理是 。扩增过程中需要具有模板DNA， （写出两种即可）等基本条件才能保证其顺利进行。若科研人员获得了THP9基因对应核苷酸序列，则可利用DNA合成仪直接合成目的基因，该种获取目的基因的方法是 。
（2）构建基因表达载体时，科研人员将THP9基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，一般用相同的限制酶切割目的基因和Ti质粒的T-DNA片段，目的是 。构建成功的基因表达载体应该含有启动子、终止子、 （至少答两种）等结构。
（3）限制酶来源于原核生物，不会切割本身的DNA分子是因为 。
（4）转化后的玉米细胞需要进行植物组织培养才能发育成完整植株。植物组织培养的脱分化和再分化阶段使用的培养基在成分上最主要的区别是 。
（5）为了检测转基因技术是否成功，科研工作者在个体水平上的检测方法是 。
【答案】（1）DNA双链复制；四种脱氧核苷酸、引物、Taq酶；化学合成法
（2）有利于目的基因和载体形成相同的黏性末端，便于目的基因和载体连接；目的基因、标记基因、复制原点
（3）含有某种限制酶的原核生物，其DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
（4）植物激素（或生长素和细胞分裂素）的比例不同
（5）将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写，PCR技术扩增的原理是DNA双链复制。扩增过程中需要具有模板DNA，四种脱氧核苷酸、引物、Taq酶等基本条件才能保证其顺利进行。科研人员利用DNA合成仪直接合成目的基因，该种获取目的基因的方法是化学合成法，该方法许哟啊已知目的基因的序列。
（2）要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。构建基因表达载体时，用相同的限制酶切割目的基因和Ti质粒的T DNA片段，目的是有利于目的基因和载体形成相同的黏性末端，便于目的基因和载体连接。构建成功的基因表达载体应该含有启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等结构，这样的基因表达载体才能行使正常的功能。
（3）限制酶一般来源于原核生物，其DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，故不会切割本身的DNA分子。
（4）生长素和细胞分裂素的比例可影响细胞的分化过程，生长素含量高有利于生根，含量适中适合愈伤组织的形成，植物组织培养的脱分化和再分化阶段使用的培养基在成分上最主要的区别是生长素和细胞分裂素的比例不同。
（5）为了检测转基因技术是否成功，可进行分子水平、个体水平的检测，个体水平上的检测方法是将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量。
【分析】1、基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
2、植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。在组织培养过程中，使用激素的顺序和比例都影响细胞的发育，细胞分裂素与生长素的比值低时有利于根的分化，该比值高时，有利于芽的分化。
9．（2023·淮北模拟）针对奥密克戎变异株的第四针剂新冠疫苗“威克欣”，是将新冠病毒基因引入昆虫细胞，制备新冠病毒S蛋白。该疫苗注入人体后诱导产生抗体，目前该产品已实现大规模生产。回答以下问题：
（1）新冠病毒基因经过逆转录后形成的 DNA，常采用 技术扩增。
（2）基因工程的核心步骤是 ；该过程需要在目的基因上游和下游分别添加特定的 和终止子，以便使目的基因可以正常 。
（3）若用病毒作为运载体将新冠病毒基因导入昆虫细胞和大肠杆菌，所用的病毒 （填“相同”或“不相同”）。若要通过培养大肠杆菌生产该疫苗，则需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，我们需要对培养基进行 灭菌，当采用平板划线法分离大肠杆菌时，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，目的是 。
【答案】（1）PCR
（2）基因表达载体的构建；启动子；转录（表达）
（3）不相同；湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）；划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
【知识点】微生物的分离和培养；PCR技术的基本操作和应用；灭菌技术；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）新冠病毒基因（RNA）在逆转录酶的作用下，经过逆转录后形成的DNA，常采用PCR技术对其进行扩增。
（2）基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，其中核心步骤是基因表达载体的构建；该过程需要在目的基因上游和下游分别添加特定的启动子（它是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录）和终止子（使转录停止），以便使目的基因可以正常转录（表达）。
（3）若用病毒作为运载体将新冠病毒基因导入昆虫细胞和大肠杆菌，因导入的受体细胞不同，所用的病毒不相同；若要通过培养大肠杆菌生产该疫苗，则需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，需要对培养基采用湿热灭菌或高压蒸汽灭菌；当采用平板划线法分离大肠杆菌时，为保证能得到由单个细菌繁殖而来的菌落，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，目的是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。其中人工合成方法中包括反转录法，即可先提取人体细胞中的mRNA，以其作为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA（或DNA）。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术，方法是采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
10．（）Bt基因是从苏云金杆菌中分离出来的抗虫蛋白基因，因其表达产物Bt抗虫蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的基因。请回答下列问题：
（1）要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性 ，再利用 技术扩增出Bt基因。
（2）构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有 ，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的 上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是 法。利用 法将基因表达载体导入植物细胞是我国科学家独创的方法。
（3）要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做 实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用 方法进行检测。
（4）Ⅳ中产生的细胞团称为 ，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中 的比例，以便获得幼苗。
【答案】（1）引物；PCR
（2）TDNA；染色体DNA；农杆菌转化；花粉管通道
（3）抗虫接种；抗原抗体杂交
（4）愈伤组织；生长素和细胞分裂素
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可利用PCR扩增目的基因，该技术需要引物，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性引物(对)。(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有TDNA(可移动的DNA)，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的染色体DNA上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。花粉管通道法是我国科学家独创的将基因表达载体导入植物细胞的方法。(3)要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用抗原抗体杂交方法进行检测。(4)Ⅳ中产生的细胞团称为愈伤组织，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中生长素与细胞分裂素的比例，以便获得幼苗。
【分析】基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
11．（2021高三上·韬智杯月考）去年年初，国内牛奶制品因为牧草进口成本上涨而涨价的现象引起了人们的关注。紫花苜蓿是一种重要的牧草，某研究团队拟将耐盐基因HLAl导入紫花苜蓿中培育耐盐牧草，具体实验流程如图甲，图乙是载体pCHLAl中T-DNA示意图。回答下列问题：
（1）过程②为 ，是基因工程的核心步骤，此过程需要使用的酶有 。
（2）过程③常用的转化方法是农杆菌转化法，转化是 。
（3）已知Basta是一种除草剂，则为达到培养并筛选的目的，过程④的培养基所含的成分必须含无机营养、有机营养、 。
（4）过程④得到的幼苗 （填“一定”或“一定不”或“不一定”）含有HLAl基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，进行PCR反应所用到的引物应根据 设计。
（5）要检测目的基因是否插入到苜蓿细胞的染色体DNA上，可采用 技术。
（6）判断本实验的目的基因是否表达成功，还应进行 实验。
【答案】（1）基因表达载体的构建；限制性核酸内切酶（或限制酶）和DNA连接酶
（2）目的基因进入受体细胞内并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
（3）植物激素、Basta
（4）不一定；HLAl基因序列
（5）DNA分子杂交
（6）耐盐检测（或鉴定）
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】图甲中①为目的基因的获取，②为基因表达载体的构建，③为将基因表达载体导入受体细胞，④为组织培养过程。
（1）过程②将目的基因与农杆菌T1质粒重组在一起，为基因表达载体的构建，是基因工程的核心，此过程需要限制酶和DNA连接酶。
（2）将目的基因导入植物细胞，常用农杆菌转化法，转化是指目的基因进入受体细胞内并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（3）据图乙可知，T-DNA中含有除草剂抗性基因，则为达到培养并筛选的目的，过程④为植物组织培养过程，培养基中应含有植物激素以调控组织培养进程，也应含有除草剂Basta来筛选含有目的基因的受体细胞。
（4）由于导入的效率不会是100%，过程④得到的幼苗不一定含有HLAl基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，引物要能与目的基因两条单链的碱基互补，故进行PCR反应的两种引物应根据HLAl的基因序列设计。
（5）检测目的基因是否插入到苜蓿细胞的染色体DNA上，可用放射性同位素标记的目的基因单链做探针，采用DNA分子杂交技术，若出现杂交带，说明目的基因已插入到苜蓿细胞的染色体DNA上。
（6）培育耐盐牧草，最终应进行个体水平的检测，应进行耐盐检测（或鉴定）实验。
【分析】1、基因表达载体的构建：（1）过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。（2）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。（3）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
3、PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
4、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
三、提高
12．（2023·内江模拟）西瓜花叶病毒（WMV）主要侵害西瓜，哈密瓜等各种瓜类作物，会造成瓜类发病，大面积减产。科研工作者以小鼠为实验对象，利用单克隆技术可制备出抗WMV的特异性单抗，用于西瓜花叶病毒的诊断和检测。回答下列问题：
（1）对小鼠进行免疫时，需要以提纯的WMV病毒作为 ，注射到小鼠体内；诱导小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合常用的化学诱导剂是 。
（2）细胞融合实验完成后，融合体系中会出现多种类型细胞，除有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有 ，出现多种类型细胞的原因是 。
（3）制备抗WMV的单克隆抗体过程中，需要进行两次筛选，第一次的目的是筛选出 ，第二次的目的是筛选出 。
（4）抗WMV的单克隆抗体可作为特异性探针，利用抗原—抗体杂交方法找出能与探针特异性结合的 ，进而实现从抗病性强的西瓜植株中获取抗病目的基因，该目的基因能否在其他植物体内稳定存在并遗传的关键是 。
【答案】（1）抗原；聚乙二醇
（2）B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞；细胞融合是随机的，且融合率达不到100%
（3）杂交瘤细胞；能产生所需抗体（抗WMV的抗体）的杂交瘤细胞
（4）基因表达产物；目的基因是否整合到受体细胞的染色体上
【知识点】单克隆抗体的制备过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）对小鼠进行免疫时，需要以提纯的WMV病毒作为抗原，对小鼠进行免疫，进而可获得较多的B淋巴细胞（浆细胞），而后用物理、化学或生物方法诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，其中常用化学诱导剂为聚乙二醇（PEG）。
（2）细胞融合实验完成后，融合体系中会出现多种类型细胞，除有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，若只考虑两两融合，还会出现B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞，为了得到杂交瘤细胞，可利用选择培养基对融合细胞进行初步筛选，之所以出现多种类型细胞，原因是由于细胞融合是随机的，且融合率达不到100%。
（3）制备抗WMV的单克隆抗体过程中，需要进行两次筛选，由于促融后会出现多种类型的细胞，因而第一次的目的是筛选出杂交瘤细胞，由于杂交瘤细胞因为B细胞的种类较多，因而杂交瘤细胞产生的抗体种类较多，因而需要进行第二次筛选，其目的是筛选出能产生所需抗体（抗WMV的抗体）的杂交瘤细胞，而后对该细胞进行大量培养，进而获取单克隆抗体。
（4）抗WMV的单克隆抗体还可作为特异性探针，利用抗原一抗体杂交方法找出能与探针特异性结合的基因表达产物，进而实现从抗病性强的西瓜植株中获取抗病目的基因，该目的基因能否在其他植物体内稳定存在并遗传的关键是目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，而后才能随着受体细胞染色体的复制而复制，进而可以稳定保存。
【分析】1、单克隆抗体的制备： （1）用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。 （2）用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选，才能获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 （4）将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。 （5）从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
2、单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且能大量制备，因此广泛用作诊断试剂。
13．番茄中含有丰富的番茄红素，具有较高的营养价值，科研人员拟将抗寒基因（目的基因）转入番茄红素高表达番茄的核基因组中，培育具有抗寒性状的番茄红素高表达番茄，且研究抗寒基因的导入是否影响此番茄中番茄红素的高表达。其基本过程包括目的基因的获取并形成重组DNA、将重组DNA导入农杆菌、受体材料的消毒、转化番茄细胞、番茄细胞大量培养及番茄红素的检测、植株再生和抗寒性状的鉴定等。回答下列问题：
（1）为了获得目的基因，根据 的原理，在冰川冻土中去寻找具有目的基因的细菌，提取并分离出抗寒基因；选用限制酶和DNA连接酶切割并连接形成重组DNA．关于限制酶选择的依据有哪些？ 。
A．目的基因不能破坏 B．质粒上复制起点不能破坏
C．酶切后的黏性末端能互补连接 D．只能选择一种限制酶进行切割
（2）将重组DNA导入农杆菌，并将受体菌接种在 （“含”或“不含”）抗生素的培养液中，置于 上慢速培养一段时间，使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态，便于筛选。
（3）取番茄的幼嫩叶片，经自来水冲洗，先用70%酒精浸泡，再用 浸泡，最后用无菌水冲洗，作为转基因的受体材料。
（4）将消毒后的番茄叶片剪成小片，在导入目的基因的农杆菌溶液中浸泡后，取出并转移至添加有 的MS培养基，使小叶先脱分化形成愈伤组织，适度分化形成特定的番茄细胞并大量培养，提取并检测番茄红素的含量，从而确定抗寒基因的导入是否影响番茄红素的高表达。能影响细胞的生长率和产物合成的因素有 （至少答出两点）。
（5）为了培育成植株，可将愈伤组织先后转移至发芽培养基和生根培养基，进一步发育形成完整植株；也可将愈伤组织 ，提取其中的胚性细胞发育形成 ，经培养可直接形成根芽，从而快速形成试管苗。然后将上述试管苗在适宜的光照、温度和80%以上的 等条件下进行炼苗后室外大量栽培。为了鉴定 ，可提取叶片组织的DNA，采用PCR扩增技术。
（6）为研究转基因番茄中抗寒基因是否成功表达，可有多种方法进行验证：
①取转基因番茄的体细胞，进行低温培养且 处理，再用 方法检测抗寒蛋白是否存在；
②将转基因植株和非转基因植株处于 环境，若 ，基本能确定抗寒的番茄培育成功。
【答案】（1）生物与环境相适应；ABC
（2）含；摇床
（3）10%次氯酸钠（写“次氯酸钠”“氯化汞”也给分）
（4）适当配比的植物生长调节剂；温度、pH、继代培养次数、营养成分等
（5）液体悬浮培养；胚状体；湿度；目的基因是否导入了受体细胞
（6）破壁（“研磨”或“破碎”）；抗原-抗体杂交；低温且相同；转基因植株存活率明显高于非转基因植株
【知识点】植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）为了获取抗寒基因在冰川冻土中有适应寒冷环境的细菌体中提取，利用的是生物物与环境相适应的原理。限制酶选择的原则是不能破坏目的基因；质粒上复制起点不能破坏，否则质粒不能复制；酶切后的黏性末端能互补连接 ，否则质粒和目的基因不能连接；可以选择一种酶或产生相同黏性末端的不同酶切割，A、B、C符合题意，D不符合题意。
故答案为：生物与环境相适应；ABC。
（2）由于普通农杆菌细胞中没有抗生素抗性基因，而导入重组Ti质粒的农杆菌体内有抗生素抗性基因，所以将受体菌接种在含抗生素的培养液中，可以鉴定和筛选导入目的基因的受体菌。农杆菌是好氧菌，所以需要将培养瓶置于摇床上，摇床有利于农杆菌接触充足氧气而大量增殖。
故答案为：含；摇床。
（3）外植体（幼嫩叶片）需要消毒，先用70%酒精浸泡，再用浸泡10%次氯酸钠，杀死部分微生物，避免杂菌污染。
故答案为：10%次氯酸钠（写“次氯酸钠”“氯化汞”也给分）。
（4）植物组织脱分化培养时需加入适当配比的植物生长调节剂，诱导脱分化。能影响细胞的生长率和产物合成的因素有培养基中的温度、pH、继代培养次数、营养成分等。
故答案为：适当配比的植物生长调节剂；温度、pH、继代培养次数、营养成分等。
（5）可将愈伤组织在液体培养液中悬浮培养，提取胚性细胞发育形成胚状体，继而发育成幼苗。炼苗时，提供适宜的光照、温度和80%以上的湿度等条件。为了鉴定目的基因是否导入受体细胞，可用PCR扩增技术，进行DNA分子杂交。
故答案为：液体悬浮培养；胚状体；湿度；目的基因是否导入了受体细胞。
（6）探究抗寒基因是否表达，①将转基因番茄的体细胞，低温培养且破壁处理（目的是去除植物细胞壁），再用抗原-抗体杂交技术检测抗寒蛋白。②从个体水平检测，将转基因植株和非转基因植株处于低温且相同环境，若转基因植株存活率明显高于非转基因植株，说明抗寒番茄培育成功。
故答案为：破壁（“研磨”或“破碎”）；抗原-抗体杂交；低温且相同；转基因植株存活率明显高于非转基因植株。
【分析】1、目的基因的检测与鉴定
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。
2、 植物组织培养技术是指在无菌操作条件下，将植物体的各类结构材料——外植体（根尖、茎段、茎尖、幼叶、幼胚、花药等）接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行离体培养的技术。
14．（2023·广西模拟）中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友团队提出了一种利用多重基因编辑技术以红果番茄（双子叶植物）为材料，快速定向创制七种不同果色番茄材料的策略。该研究利用多重基因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素合成或代谢的关键基因。下图是科研人员用CRISPR-Cas9基因编辑技术定点敲除目标基因的示意图，请回答下列问题：
（1）CRISPR-Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两部分，其能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA发生 ；Cas9蛋白能使目标DNA中的 （填化学键名称）断裂，从而实现对目标DNA的剪切。
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用的方法是 。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并 ，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。若要检测目的基因在受体细胞中是否成功表达，从转基因的番茄细胞中提取蛋白质，用相应的 进行抗原—抗体杂交。
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞可利用 技术培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有 ，当培养基中的生长素含量 细胞分裂素含量时，主要诱导根原基的形成。
【答案】（1）碱基互补配对（或特异性结合）；磷酸二酯键
（2）农杆菌转化法；将目的基因插入到植物细胞中的染色体的DNA上；单克隆抗体
（3）植物组织培养；全能性；大于
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）；植物组织培养的影响因素
【解析】【解答】（1）CRISPR-Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两部分，其能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA有相应的识别序列能特异性结合，使得CRISPR-Cas9系统能精准识别相关基因，Cas9蛋白相当于限制性内切酶，能使目标DNA中的磷酸二酯键断裂，从而实现对目标DNA的剪切。
（2）研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用农杆菌转化法。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并将目的基因插入到植物细胞中的染色体的DNA上，因而可以使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。若要检测目的基因在受体细胞中是否成功表达，从转基因的番茄细胞中提取蛋白质，用相应的单克隆抗体进行抗原—抗体杂交，进而检测目的基因是否表达。
（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞可利用植物组织培养技术培养成完整的植株，该技术的原理是植物细胞的全能性。这是因为植物细胞中含有本物种全套的遗传物质，当培养基中的生长素含量大于细胞分裂素含量时，主要诱导根原基的形成，这应该是由于生长素能促进根的生成。
【分析】1、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
3、植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。嫩枝或分化程度较低的部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，故外植体一般选用嫩枝或分化程度较低的部位成功率更高。植物组织培养中植物激素使用：植物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。当培养基中的生长素含量大于细胞分裂素含量时，主要诱导根原基的形成。
15．（2023·运城模拟）为了提高马铃薯对真菌病害的抗性，某科研小组进行了马铃薯转基因抗病育种的初步研究，其过程如下所示，请将其完善：
（1）从生防木霉菌株中提取总RNA以及通过 过程合成cDNA。
利用PCR技术对目的基因Chi（抗菌基因）进行扩增；PCR产物与PMDTM18－T载体连接，转化到大肠杆菌，获得重组质粒PMDTM18－T－Chi。
（2）植物表达载体的构建（如图所示）：将重组质粒PMDTM18－T－Chi和p33ECR质粒用 （填具体酶）进行酶切，再用T4DNA连接酶连接，得到p33ECR－Chi。此过程中一般会使用高浓度的T4DNA连接酶，T4DNA连接酶的作用是 。表达载体中p35S是 识别和结合的部位。
（3）p33ECR－Chi工程菌的获得：将p33ECR－Chi质粒转化至农杆菌菌株中，在含 的培养基上获得白色菌斑，挑菌落，获得工程菌。
（4）转基因植株的获得：通过农杆菌转化法将Chi基因转化到马铃薯栽培品种试管马铃薯的块茎中。试管马铃薯的块茎是马铃薯遗传转化的理想外植体，分析其具有的优点是 （写出两点）。
（5）对马铃薯进行抗菌检测：从分子水平上可采用 法检测目的基因表达的产物；从个体水平上进行检测的操作是 。
【答案】（1）逆转录（反转录）
（2）BamHI和SacI；既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合"双链DNA片段的平末端；RNA聚合酶
（3）氨苄青霉素
（4）取材方便、无需灭菌、周期短、转化效率高和不定芽能直接再生（写两点，合理即可）
（5）抗原—抗体杂交；霉菌接种实验
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）cDNA是以mRNA为模板，通过反（逆）转录过程合成的。
（2）构建基因表达载体时，一般用限制酶对目的基因和载体进行切割，目的基因应插入启动子之后，由图中所示的表达载体组成可以看出，该表达载体构建时所用的限制酶为BamHI和SacI；T4 DNA连接酶的作用是：既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端；p35S是启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
（3）由图示基因表达载体可以看出，p33ECR-Chi的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，因此在筛选该转化菌株时，应将p33ECR-Chi质粒转化至农杆菌的菌株，培养在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选。
（4）试管马铃薯的块茎因其取材方便、无需灭菌、周期短、转化效率高等优点，使得马铃薯成为遗传转化的理想外植体。
（5）对马铃薯进行抗菌检测：从分子水平上可采用抗原——抗体杂交法检测目的基因表达的产物；从个体水平上可采用霉菌接种实验进行检测。
【分析】1、 逆转录是在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。
2、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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