2023年高考生物新课标卷真题变式·分层精准练：第6题

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2023年高考生物新课标卷真题变式·分层精准练：第6题
一、原题
1．（2023·新课标卷）某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（　　）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E coli DNA连接酶连接
二、基础
2．下列关于重组DNA技术基本工具的叙述，正确的是（　　）
A．天然质粒能直接作为载体
B．限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成
C．不同限制酶切割DNA分子后产生的黏性末端不同
D．DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸结合到引物链上
3．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是（　　）
A．① B．② C．③ D．④
4．用限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，应选用如图中的Ti质粒是（　　）
注：图中箭头所指的位置是限制酶识别和切割的位点。
A． B．
C． D．
5．下列有关E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶作用的叙述，正确的是（　　）
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．T4 DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端
D．E.coli DNA连接酶连接平末端的效率比较低
6．（2023高二下·渭南期中）如图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是（　　）
A．a与d可以用不同的限制性核酸内切酶进行切割
B．b能识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开
C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对
D．b代表的是限制性核酸内切酶，c代表的是DNA聚合酶
7．（2023高二下·渭南期中）下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是（　　）
A．用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大
C．-CATG↓-和-G↓GATCC-序列被限制性核酸内切酶切出的黏性末端碱基数不同
D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
8．（2023高二下·渭南期中）下列关于限制性核酸内切酶的叙述错误的是（　　）
A．绝大多数的限制酶由原核细胞中获取
B．每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列
C．限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸氢键
D．不同酶切割不同的DNA分子可产生相同的黏性末端
9．如图表示BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列及其切割位点，下列说法正确的是（　　）
A．这两种限制酶切割DNA分子后形成的黏性末端不同
B．这两种限制酶切割获取目的基因时都会破坏2个磷酸二酯键
C．能被BamHⅠ切割的DNA分子，也一定能被Sau3AⅠ切割
D．能被Sau3AⅠ切割的DNA分子，也一定能被BamHⅠ切割
10．如图所示的黏性末端是由几种限制酶作用产生的（　　）
A．1种 B．2种 C．3种 D．4种
11．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为和。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并连接得到重组质粒，下列相关叙述正确的是（　　）
A．酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素
B．目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAG
C．分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒
D．经两种酶处理得到的重组质粒能再被这两种酶所识别
12．有关基因工程中工具的说法，正确的是（　　）
A．限制酶只能识别6个核苷酸组成的序列
B．限制酶与DNA聚合酶的作用部位一样
C．病毒不能作为基因工程的载体
D．DNA连接酶能把黏性末端的氢键连接起来
13．如图所示，下列有关工具酶功能的叙述，错误的是（　　）
A．限制性内切核酸酶可以切断a处 B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开 D．DNA连接酶可以连接c处
14．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是（　　）
A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
15．（2022高三上·长春月考）下列有关基因工程的叙述正确的是（　　）。
A．限制酶只存在于原核生物中，只能识别DNA分子的特定核苷酸序列
B．只有同种限制酶切割的末端才能连接，不同限制酶切割的末端不能连接
C．基因工程中，只能利用天然质粒，质粒上的标记基因用于重组DNA的筛选
D．质粒是独立于拟核DNA和真核细胞核之外的环状双链DNA
16．（2022高三上·大兴期中）基因S与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。如下图，为使S基因按正确方向与质粒连接，选用的限制酶组合是（）
A．XbaⅠ和SalⅠ B．EcoRⅠ和HindⅢ
C．BamHⅠ和HindⅢ D．XbaⅠ和HindⅢ
三、提高
17．如图表示构建基因表达载体所用的质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。据图分析，下列叙述正确的是（　　）
A．使用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割可以防止目的基因自身环化
B．限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，所以没有特异性
C．可以用限制酶Ⅱ切割质粒、限制酶Ⅰ切割目的基因
D．将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建
18．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是（　　）
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长
19．（2022高三上·浙江月考）研究人员用EcoRI和Smal两种限制酶处理某DNA分子，图1为EcoRI切割该DNA分子后的结果；图2是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1号泳道是DNA Marker，2号、3号、4号分别是EcoRI单独处理、Smal单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（　　）
A．据图1可知EcoRI的识别序列为—GAATTC—，切割位点在G和A之间
B．据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在B端，且连着电泳槽的负极
C．据图2可知该DNA分子最可能是含1000个碱基对的环状DNA
D．据图2可知该DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个
20．（2023·泉州模拟）像BclⅠ（-T↓GATCA-）、BglⅡ（-A↓GATCT-）、MboⅠ（-↓GATC-）这样，识别序列不同、，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是（　　）
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclI和BglⅡ BclI和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclI和BglⅡ MboI 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C MboI BclI和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboI再次切开，但可能无法被BclI和BglⅡ再次切开
D MboI MboI 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
A．A B．B C．C D．D
21．（2023高二下·郑州期中）下图为不同限制性核酸内切膀识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（　　）
A．图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶高
C．酶切时使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用酶Bgl II切出的目的基因与酶BamH I切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开
答案解析部分
1．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、由图可知，酶3切割产生平末端，用E.coliDNA连接酶连接只能连接粘性末端，A错误；
B、质粒用酶3切割产生平末端，目的基因用酶1切割产生粘性末端，末端不同不能用T4 DNA连接酶连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割二者产生的粘性末端不同，既保证质粒和目的基因两侧产生相同的黏性末端，用T4DNA连接酶连接，也能防止目的基因和质粒自我连接，C正确；
D、质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，二者产生的粘性末端相同，质粒和目的基因产生相同的粘性末端，用E.coli DNA连接酶连接不能防止目的基因和质粒自我连接，D错误。
故答案为：C。
【分析】基因工程的基本工具：
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）：
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（一般为6个核苷酸组成），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶：
①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
a、相同点：都缝合磷酸二酯键。
b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
2．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成，B正确；不同的限制酶切割DNA分子后产生的黏性末端可能相同，C错误；DNA连接酶能连接双链DNA片段的黏性末端或平末端，DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到引物链上，D错误。 故答案为：B。
【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
3．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶的作用位点是磷酸二酯键，即图中的②。故答案为：B。
【分析】限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
4．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此构建基因表达载体时，应该将目的基因插入TDNA上，则限制酶XbaⅠ和SacⅠ的切割位点都应该在TDNA上，C项符合题意。 故答案为：C。
【分析】农杆菌转化法（约80%的转基因植物都是用这种方法获得的）
1、农杆菌转化法的具体过程：
（1）利用土壤的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上。
（2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内。
（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内。
（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因。
2、原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。
3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
4、转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
5．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端，A错误，C正确；E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，B错误；E.coli DNA连接酶不能连接平末端，T4 DNA连接酶可连接平末端但效率较低，D错误。 故答案为：C。
【分析】DNA连接酶在基因工程中用于连接经限制性核酸内切酶处理后产生的DNA片段。E coli DNA连接酶和T4DNA连接酶都是常见的DNA连接酶，E coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，T4DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端，但是连接效率较低。
6．【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】分析题图可知，图示表示基因工程中基因表达载体的构建过程。
A、在基因工程，常使用不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒可以防止质粒和目的基因的自身环化以及反向连接，A正确；
B、b为限制性核酸内切酶，能识别特定的核苷酸序列，并将每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，B错误；
C、c为DNA连接酶，可以缝合目的基因和载体质粒之间的缝隙，使两者之间形成磷酸二酯键，故C错误；
D、 b代表的是限制性核酸内切酶，c代表的是DNA连接酶，D错误 。
故答案为：A。
【分析】基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建：（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
3、将目的基因导入受体细胞：（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
7．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，因此要断裂4个磷酸二酯键，A错误；
B、限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大，B正确；
C、-CATG↓-和-G↓GATCC-序列被限制酶切出的黏性末端的碱基数均为四个，C错误；
D、不同的限制性核酸内切酶切割也可能形成相同的末端序列，因此不同限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也能形成重组质粒，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、限制性核酸内切酶：
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
注意：用限制酶切割DNA时，每切开一个切口需要水解两个磷酸二酯键。
2、在基因工程，为了防止质粒和目的基因的自身环化，常使用不同的限制酶切割目的基因和质粒；并且不同的限制酶切割形成的黏性末端的碱基序列可能是相同的，因此它们也能发生重组。
8．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A正确；
B、限制酶具有专一性，能识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割，因此，每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，B正确；
C、限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；
D、不同限制酶识别的是不同的碱基序列，但切割后所产生的粘性末端可能是一样的，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、限制性核酸内切酶：
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
注意：用限制酶切割DNA时，每切开一个切口需要水解两个磷酸二酯键。
2、DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
9．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶BamHⅠ、Sau3AⅠ切割DNA分子后形成的黏性末端相同，A错误；这两种限制酶切割获取目的基因时都会破坏4个磷酸二酯键，B错误；根据图中BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列及其切割位点可知，能被BamHⅠ切割的DNA分子，也一定能被Sau3AⅠ切割，C正确；能被Sau3AⅠ切割的DNA分子，不一定能被BamHⅠ切割，D错误。 故答案为：C。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
10．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成两个相同的黏性末端。图中四个黏性末端中第一个和第二个相同，由同一种限制酶切割产生，所以图中共有3种不同的黏性末端，由3种限制酶切割形成。 故答案为：C。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
11．【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A正确；根据题意可知，限制酶BamHⅠ的识别序列及切割位点为 ，因此目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是，B错误；分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，C错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，D错误。 故答案为：A。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
12．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，B正确；在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，C错误；DNA连接酶可使DNA片段的黏性末端通过磷酸二酯键连接起来，D错误。故答案为：B。
【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
13．【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制性内切核酸酶切割DNA分子时破坏的是DNA链中的磷酸二酯键，如图a处。DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键，因此DNA聚合酶可以连接a处。解旋酶解开碱基对之间的氢键，即使b处解开。DNA连接酶连接的是两个相邻的脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，如a处，而图示的c处连接的是同一个脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖。 故答案为：D。
【分析】生物工程中酶的作用：
1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。
2、DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。
3、限制性核酸内切酶：从DNA链的内部进行切割，分为限制性内切酶和非限制性内切酶。
4、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，既可以用RNA为模板合成DNA，也可以用RNA为模板进行互补链的合成。基因工程中主要功能是利用真核细胞mRNA为模板反转录cDNA，用来建立cDNA文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。
5、RNA聚合酶：主要连接RNA片段之间的磷酸二酯键，用于转录使DNA双链分开以及某条DNA单链转录出RNA，其结合位点在DNA上。
14．【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具简介；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】获取基因a的限制酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，A正确；基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，质粒是基因工程中常用的载体，而不是工具酶，B错误；连接基因a与载体的DNA连接酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，C错误；一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，D错误。 故答案为：A。
【分析】1、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、据图分析，图中①表示一条链上两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，②表示两条链上碱基对之间的氢键。
15．【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、限制酶主要存在于原核生物中，只能识别DNA分子的特定核苷酸序列，A错误；
B、虽然是不同的限制酶，但是切割出来具有相同末端的，因为不同限制酶切割的末端可以连接，B错误；
C、基因工程中，可以利用重组质粒，C错误；
D、质粒是独立于拟核DNA和真核细胞核之外的环状双链DNA ，D正确；
故答案为：D
【分析】（1）限制性核酸内切酶（限制酶）分布：主要是原核生物。作用特点：特异性，即识别特定的核苷酸序列，切割特定的切点。结果：产生黏性末端（碱基互补配对）或平末端。
（2）质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；是细胞染色体外能自我复制的小型环状裸露的双链 DNA 分子。
16．【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、质粒中SalⅠ的酶切位点没有位于启动子和终止子之间，不能选用，A错误；
B、启动子和终止子之间没有EcoRⅠ的酶切位点，B错误；
C、BamHⅠ会破坏目的基因，C错误；
D、为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅡ酶切割S基因的cDNA和载体，D正确。
故答案为：D。
【分析】限制酶的选择原则：根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因 。
17．【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 ，两者产生的黏性末端相同，不能防止目的基因自身环化，A错误；限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，是因为两种标记基因中都含有—GATC—核苷酸序列，限制酶识别切割位点具有特异性，B错误；目的基因只有一端具有GGATCC的片段，只能用限制酶Ⅱ切割。质粒上有两个GATC片段，若用限制酶Ⅱ切割，会将质粒切成两小段，只能用限制酶Ⅰ切割，C错误；用限制酶Ⅰ切割质粒的切割位点在四环素抗性基因内部，所以将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建，D正确。
【分析】限制酶的选择原则：根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因 。
18．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】质粒中含有限制酶HindⅢ和PstⅠ的切割位点，且各含一个，因此用这两种限制酶切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；由图乙可知，限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA，否则会破坏目的基因，B正确；用SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒会导致两个抗性基因均被破坏，无法筛选导入重组DNA的细菌，因此构建重组DNA时，不能选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，C错误；构建基因表达载体时，应该选择HindⅢ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，这样会破坏氯霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 故答案为：C。
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
19．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、图1中DNA双链片段被切割成两段，该片段序列是—GAATTC—，断开的部位是在G和A碱基之间，A正确；
B、相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，B错误；
C、2号、3号、分别是EcoRI单独处理、Smal单独处理后的电泳结果，两个泳道均只出现一个DNA片段，且分子量是1000，说明该DNA分子最可能是含1000个碱基对的环状DNA，C正确；
D、图2中4号是EcoRI和Smal两种酶共同处理后的电泳结果，显示800bp和200bp两个条带，说明在该DNA分子中，两种限制酶的酶切位点各有一个，D正确。
故答案为：B。
【分析】“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
20．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、切割质粒和切割目的基因用均用BclⅠ和BglⅡ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成的重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确；
B、切割质粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化；切割目的基因用MboⅠ，切割后产生黏性末端，切割后的目的基因可以自我环化，B错误；
C、切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端，形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用，C正确；
D、切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，产生的均为黏末端，切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确。
故答案为：B。
【分析】DNA重组技术至少需要三种工具：限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶、载体。
1、限制性内切核酸酶是基因工程的“分子手术刀”。
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
2、DNA连接酶是基因工程的“分子缝合针”。DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶根据酶的来源不同分为两类：E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶．这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
3、基因进入受体细胞的载体是基因工程的“分子运输车”。常用的载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
21．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、酶具有专一性，限制酶是专门切割DNA序列中一定部位的酶，所以图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列，A正确；
B、由于Not I限制性核酸内切酶识别的序列比其他三种酶的序列长，若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶低，B错误；
C、两种不同的限制酶可产生不同的黏性末端，所以使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，C正确；
D、用酶BglⅡ切出的目的基因与酶BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA分子序列为，6个脱氧核苷酸对序列既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可能被这两种酶切开 ，D正确。
故答案为：B。
【分析】基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
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2023年高考生物新课标卷真题变式·分层精准练：第6题
一、原题
1．（2023·新课标卷）某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（　　）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E coli DNA连接酶连接
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、由图可知，酶3切割产生平末端，用E.coliDNA连接酶连接只能连接粘性末端，A错误；
B、质粒用酶3切割产生平末端，目的基因用酶1切割产生粘性末端，末端不同不能用T4 DNA连接酶连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割二者产生的粘性末端不同，既保证质粒和目的基因两侧产生相同的黏性末端，用T4DNA连接酶连接，也能防止目的基因和质粒自我连接，C正确；
D、质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，二者产生的粘性末端相同，质粒和目的基因产生相同的粘性末端，用E.coli DNA连接酶连接不能防止目的基因和质粒自我连接，D错误。
故答案为：C。
【分析】基因工程的基本工具：
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）：
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（一般为6个核苷酸组成），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶：
①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
a、相同点：都缝合磷酸二酯键。
b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
二、基础
2．下列关于重组DNA技术基本工具的叙述，正确的是（　　）
A．天然质粒能直接作为载体
B．限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成
C．不同限制酶切割DNA分子后产生的黏性末端不同
D．DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸结合到引物链上
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成，B正确；不同的限制酶切割DNA分子后产生的黏性末端可能相同，C错误；DNA连接酶能连接双链DNA片段的黏性末端或平末端，DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到引物链上，D错误。 故答案为：B。
【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
3．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是（　　）
A．① B．② C．③ D．④
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶的作用位点是磷酸二酯键，即图中的②。故答案为：B。
【分析】限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
4．用限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，应选用如图中的Ti质粒是（　　）
注：图中箭头所指的位置是限制酶识别和切割的位点。
A． B．
C． D．
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此构建基因表达载体时，应该将目的基因插入TDNA上，则限制酶XbaⅠ和SacⅠ的切割位点都应该在TDNA上，C项符合题意。 故答案为：C。
【分析】农杆菌转化法（约80%的转基因植物都是用这种方法获得的）
1、农杆菌转化法的具体过程：
（1）利用土壤的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上。
（2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内。
（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内。
（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因。
2、原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。
3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
4、转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
5．下列有关E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶作用的叙述，正确的是（　　）
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．T4 DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端
D．E.coli DNA连接酶连接平末端的效率比较低
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端，A错误，C正确；E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，B错误；E.coli DNA连接酶不能连接平末端，T4 DNA连接酶可连接平末端但效率较低，D错误。 故答案为：C。
【分析】DNA连接酶在基因工程中用于连接经限制性核酸内切酶处理后产生的DNA片段。E coli DNA连接酶和T4DNA连接酶都是常见的DNA连接酶，E coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，T4DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端，但是连接效率较低。
6．（2023高二下·渭南期中）如图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是（　　）
A．a与d可以用不同的限制性核酸内切酶进行切割
B．b能识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开
C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对
D．b代表的是限制性核酸内切酶，c代表的是DNA聚合酶
【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】分析题图可知，图示表示基因工程中基因表达载体的构建过程。
A、在基因工程，常使用不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒可以防止质粒和目的基因的自身环化以及反向连接，A正确；
B、b为限制性核酸内切酶，能识别特定的核苷酸序列，并将每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，B错误；
C、c为DNA连接酶，可以缝合目的基因和载体质粒之间的缝隙，使两者之间形成磷酸二酯键，故C错误；
D、 b代表的是限制性核酸内切酶，c代表的是DNA连接酶，D错误 。
故答案为：A。
【分析】基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建：（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
3、将目的基因导入受体细胞：（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
7．（2023高二下·渭南期中）下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是（　　）
A．用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大
C．-CATG↓-和-G↓GATCC-序列被限制性核酸内切酶切出的黏性末端碱基数不同
D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，因此要断裂4个磷酸二酯键，A错误；
B、限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大，B正确；
C、-CATG↓-和-G↓GATCC-序列被限制酶切出的黏性末端的碱基数均为四个，C错误；
D、不同的限制性核酸内切酶切割也可能形成相同的末端序列，因此不同限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也能形成重组质粒，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、限制性核酸内切酶：
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
注意：用限制酶切割DNA时，每切开一个切口需要水解两个磷酸二酯键。
2、在基因工程，为了防止质粒和目的基因的自身环化，常使用不同的限制酶切割目的基因和质粒；并且不同的限制酶切割形成的黏性末端的碱基序列可能是相同的，因此它们也能发生重组。
8．（2023高二下·渭南期中）下列关于限制性核酸内切酶的叙述错误的是（　　）
A．绝大多数的限制酶由原核细胞中获取
B．每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列
C．限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸氢键
D．不同酶切割不同的DNA分子可产生相同的黏性末端
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A正确；
B、限制酶具有专一性，能识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割，因此，每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，B正确；
C、限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；
D、不同限制酶识别的是不同的碱基序列，但切割后所产生的粘性末端可能是一样的，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、限制性核酸内切酶：
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
注意：用限制酶切割DNA时，每切开一个切口需要水解两个磷酸二酯键。
2、DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
9．如图表示BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列及其切割位点，下列说法正确的是（　　）
A．这两种限制酶切割DNA分子后形成的黏性末端不同
B．这两种限制酶切割获取目的基因时都会破坏2个磷酸二酯键
C．能被BamHⅠ切割的DNA分子，也一定能被Sau3AⅠ切割
D．能被Sau3AⅠ切割的DNA分子，也一定能被BamHⅠ切割
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶BamHⅠ、Sau3AⅠ切割DNA分子后形成的黏性末端相同，A错误；这两种限制酶切割获取目的基因时都会破坏4个磷酸二酯键，B错误；根据图中BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列及其切割位点可知，能被BamHⅠ切割的DNA分子，也一定能被Sau3AⅠ切割，C正确；能被Sau3AⅠ切割的DNA分子，不一定能被BamHⅠ切割，D错误。 故答案为：C。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
10．如图所示的黏性末端是由几种限制酶作用产生的（　　）
A．1种 B．2种 C．3种 D．4种
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成两个相同的黏性末端。图中四个黏性末端中第一个和第二个相同，由同一种限制酶切割产生，所以图中共有3种不同的黏性末端，由3种限制酶切割形成。 故答案为：C。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
11．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为和。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并连接得到重组质粒，下列相关叙述正确的是（　　）
A．酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素
B．目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAG
C．分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒
D．经两种酶处理得到的重组质粒能再被这两种酶所识别
【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A正确；根据题意可知，限制酶BamHⅠ的识别序列及切割位点为 ，因此目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是，B错误；分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，C错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，D错误。 故答案为：A。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
12．有关基因工程中工具的说法，正确的是（　　）
A．限制酶只能识别6个核苷酸组成的序列
B．限制酶与DNA聚合酶的作用部位一样
C．病毒不能作为基因工程的载体
D．DNA连接酶能把黏性末端的氢键连接起来
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，B正确；在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，C错误；DNA连接酶可使DNA片段的黏性末端通过磷酸二酯键连接起来，D错误。故答案为：B。
【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
13．如图所示，下列有关工具酶功能的叙述，错误的是（　　）
A．限制性内切核酸酶可以切断a处 B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开 D．DNA连接酶可以连接c处
【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制性内切核酸酶切割DNA分子时破坏的是DNA链中的磷酸二酯键，如图a处。DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键，因此DNA聚合酶可以连接a处。解旋酶解开碱基对之间的氢键，即使b处解开。DNA连接酶连接的是两个相邻的脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，如a处，而图示的c处连接的是同一个脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖。 故答案为：D。
【分析】生物工程中酶的作用：
1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。
2、DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。
3、限制性核酸内切酶：从DNA链的内部进行切割，分为限制性内切酶和非限制性内切酶。
4、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，既可以用RNA为模板合成DNA，也可以用RNA为模板进行互补链的合成。基因工程中主要功能是利用真核细胞mRNA为模板反转录cDNA，用来建立cDNA文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。
5、RNA聚合酶：主要连接RNA片段之间的磷酸二酯键，用于转录使DNA双链分开以及某条DNA单链转录出RNA，其结合位点在DNA上。
14．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是（　　）
A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具简介；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】获取基因a的限制酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，A正确；基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，质粒是基因工程中常用的载体，而不是工具酶，B错误；连接基因a与载体的DNA连接酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，C错误；一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，D错误。 故答案为：A。
【分析】1、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、据图分析，图中①表示一条链上两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，②表示两条链上碱基对之间的氢键。
15．（2022高三上·长春月考）下列有关基因工程的叙述正确的是（　　）。
A．限制酶只存在于原核生物中，只能识别DNA分子的特定核苷酸序列
B．只有同种限制酶切割的末端才能连接，不同限制酶切割的末端不能连接
C．基因工程中，只能利用天然质粒，质粒上的标记基因用于重组DNA的筛选
D．质粒是独立于拟核DNA和真核细胞核之外的环状双链DNA
【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、限制酶主要存在于原核生物中，只能识别DNA分子的特定核苷酸序列，A错误；
B、虽然是不同的限制酶，但是切割出来具有相同末端的，因为不同限制酶切割的末端可以连接，B错误；
C、基因工程中，可以利用重组质粒，C错误；
D、质粒是独立于拟核DNA和真核细胞核之外的环状双链DNA ，D正确；
故答案为：D
【分析】（1）限制性核酸内切酶（限制酶）分布：主要是原核生物。作用特点：特异性，即识别特定的核苷酸序列，切割特定的切点。结果：产生黏性末端（碱基互补配对）或平末端。
（2）质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；是细胞染色体外能自我复制的小型环状裸露的双链 DNA 分子。
16．（2022高三上·大兴期中）基因S与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。如下图，为使S基因按正确方向与质粒连接，选用的限制酶组合是（）
A．XbaⅠ和SalⅠ B．EcoRⅠ和HindⅢ
C．BamHⅠ和HindⅢ D．XbaⅠ和HindⅢ
【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、质粒中SalⅠ的酶切位点没有位于启动子和终止子之间，不能选用，A错误；
B、启动子和终止子之间没有EcoRⅠ的酶切位点，B错误；
C、BamHⅠ会破坏目的基因，C错误；
D、为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅡ酶切割S基因的cDNA和载体，D正确。
故答案为：D。
【分析】限制酶的选择原则：根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因 。
三、提高
17．如图表示构建基因表达载体所用的质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。据图分析，下列叙述正确的是（　　）
A．使用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割可以防止目的基因自身环化
B．限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，所以没有特异性
C．可以用限制酶Ⅱ切割质粒、限制酶Ⅰ切割目的基因
D．将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建
【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 ，两者产生的黏性末端相同，不能防止目的基因自身环化，A错误；限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，是因为两种标记基因中都含有—GATC—核苷酸序列，限制酶识别切割位点具有特异性，B错误；目的基因只有一端具有GGATCC的片段，只能用限制酶Ⅱ切割。质粒上有两个GATC片段，若用限制酶Ⅱ切割，会将质粒切成两小段，只能用限制酶Ⅰ切割，C错误；用限制酶Ⅰ切割质粒的切割位点在四环素抗性基因内部，所以将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建，D正确。
【分析】限制酶的选择原则：根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因 。
18．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是（　　）
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】质粒中含有限制酶HindⅢ和PstⅠ的切割位点，且各含一个，因此用这两种限制酶切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；由图乙可知，限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA，否则会破坏目的基因，B正确；用SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒会导致两个抗性基因均被破坏，无法筛选导入重组DNA的细菌，因此构建重组DNA时，不能选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，C错误；构建基因表达载体时，应该选择HindⅢ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，这样会破坏氯霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 故答案为：C。
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
19．（2022高三上·浙江月考）研究人员用EcoRI和Smal两种限制酶处理某DNA分子，图1为EcoRI切割该DNA分子后的结果；图2是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1号泳道是DNA Marker，2号、3号、4号分别是EcoRI单独处理、Smal单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（　　）
A．据图1可知EcoRI的识别序列为—GAATTC—，切割位点在G和A之间
B．据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在B端，且连着电泳槽的负极
C．据图2可知该DNA分子最可能是含1000个碱基对的环状DNA
D．据图2可知该DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、图1中DNA双链片段被切割成两段，该片段序列是—GAATTC—，断开的部位是在G和A碱基之间，A正确；
B、相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，B错误；
C、2号、3号、分别是EcoRI单独处理、Smal单独处理后的电泳结果，两个泳道均只出现一个DNA片段，且分子量是1000，说明该DNA分子最可能是含1000个碱基对的环状DNA，C正确；
D、图2中4号是EcoRI和Smal两种酶共同处理后的电泳结果，显示800bp和200bp两个条带，说明在该DNA分子中，两种限制酶的酶切位点各有一个，D正确。
故答案为：B。
【分析】“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
20．（2023·泉州模拟）像BclⅠ（-T↓GATCA-）、BglⅡ（-A↓GATCT-）、MboⅠ（-↓GATC-）这样，识别序列不同、，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是（　　）
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclI和BglⅡ BclI和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclI和BglⅡ MboI 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C MboI BclI和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboI再次切开，但可能无法被BclI和BglⅡ再次切开
D MboI MboI 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
A．A B．B C．C D．D
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、切割质粒和切割目的基因用均用BclⅠ和BglⅡ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成的重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确；
B、切割质粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化；切割目的基因用MboⅠ，切割后产生黏性末端，切割后的目的基因可以自我环化，B错误；
C、切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端，形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用，C正确；
D、切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，产生的均为黏末端，切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确。
故答案为：B。
【分析】DNA重组技术至少需要三种工具：限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶、载体。
1、限制性内切核酸酶是基因工程的“分子手术刀”。
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
2、DNA连接酶是基因工程的“分子缝合针”。DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶根据酶的来源不同分为两类：E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶．这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
3、基因进入受体细胞的载体是基因工程的“分子运输车”。常用的载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
21．（2023高二下·郑州期中）下图为不同限制性核酸内切膀识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（　　）
A．图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶高
C．酶切时使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用酶Bgl II切出的目的基因与酶BamH I切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、酶具有专一性，限制酶是专门切割DNA序列中一定部位的酶，所以图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列，A正确；
B、由于Not I限制性核酸内切酶识别的序列比其他三种酶的序列长，若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶低，B错误；
C、两种不同的限制酶可产生不同的黏性末端，所以使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，C正确；
D、用酶BglⅡ切出的目的基因与酶BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA分子序列为，6个脱氧核苷酸对序列既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可能被这两种酶切开 ，D正确。
故答案为：B。
【分析】基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
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