人教版选修3专题1第二节基因工程的基本操作程序（共44张PPT）
文档属性
| 名称 | 人教版选修3专题1第二节基因工程的基本操作程序（共44张PPT） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 1.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2014-11-09 08:09:32 | ||
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文档简介
课件44张PPT。1.2 基因工程的基本操作程序 乐安一中 黄友元 彩色棉种子中引入了抗虫害基因，因此种植过程中基本不使用农药。后期产品加工过程中也很少需要使用辅助的化学品。因此，彩色棉是真正意义上的“绿色产品”。 该技术将异源染色体小片段整合到受体染色体，获得了耐盐、优质、高产杂种小麦。基因工程：按照人们的意愿，进行严格设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
——是在DNA分子水平的设计和施工，其中变异属于基因重组。细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
——是在细胞（器）水平的操作，其中变异属于染色体变异。1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取；
2、基因表达载体的构建；
3、将目的基因导入受体细胞；
4、目的基因的检测与鉴定；？为什么要有“目的基因的获取”这一步？
基因工程是指按照人们的愿望创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”这里所说的“更符合人们需要”，就是目的。有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
为什么要有“表达载体的构建”这一步？
单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。
为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？
含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核 一、目的基因的获取一、目的基因的获取1、构建基因文库：指将某种生物的不同基因导入受体菌群体中储存，各受体菌分别含不同基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存 基因文库的构建方法（1）基因组文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存（2）cDNA文库的构建-----逆转录法： 真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？思考？编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子 下图表示基因工程中获取同种目的基因DNA片段的不同方法。有关叙述中正确的是
A.①②③片段均不含内含子，但含非编码区
B. ①②③碱基对的排列顺序均相同
C.获取真核生物的目的基因，一般使用方法b
D.这三种方法都用到酶，都是在体外进行D. 为了有效地保存基因文库，可通过细菌的繁殖而使包含各个特定 DNA片段的细菌增多。液体培养不适用于这一目的，因为各个细菌的生存和繁殖能力不同，各个克隆被保存的机会也会因此而不相等。
在固体培养基上每一个细菌单独形成一个菌落，各个细菌并不相互干扰和竞争，因而有利于全部克隆的保存。形成的每一个菌落中大约包含107个细菌，这样一个基因文库中的所有的克隆几乎都扩增了107倍。把培养皿上的细菌全部洗下加以保存，便可以在需要时从中取得任何一个克隆。 （3）基因文库的保存和利用
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能
基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法？为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取可以吗？ 提示：不一定，如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
如果所需要的目的基因序列已知，也可以通过PCR等方式获得。
2、利用PCR技术扩增PCR原理变性PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在耐高温的聚合酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。 氢键单链DNA双链DNA链反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因DNA合成仪合成3、人工合成法推测推测单链DNA合成？上述两种方法获得目的基因与细胞中实际存在的该种基因结构有什么不同一、目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成:反转录法
化学合成法种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库课堂小结：（种类最多）（数量最多）（针对性最强）12．“X基因”是DNA分 “X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
利用PCR技术扩增① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、
_______________、___________ (做启动子)、 ___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNA（含目的基因）四种脱氧核苷酸一对引物耐高温的DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段成百万倍地扩增前提条件：已知基因的核苷酸序列PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口
两个黏性末端两个切口
获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）经此过程，基因表达载体的构建就成功了？同一种 限制酶【注意】 ①切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。
②插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。
③将目的基因导入受体细胞
a．目的：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
b．受体细胞种类不同，导入方法不同
在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。
Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA的可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体特点。二、基因表达载体的构建——核心基因表达载体组成：
有目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；在构建基因表达载体时，主要考虑以下几方面的因素：
（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体内加上的，而细菌无这些细胞器。
（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。
（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。三、将目的基因导入受体细胞—转化
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒
目的基因构建表达载体植物细胞植物细胞染色体DNA新性状农杆菌（2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用于单子叶植物的转化方法胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素 的完全培养基含有四环素的完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆菌 Ca2+ 处理细胞形成感受态细胞检测（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素抗性基因质粒只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌完全培养基导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明： 大肠杆菌的受体细胞含有目的基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理 四、目的基因的检测与鉴定1、检测法：DNA分子杂交如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。DNA分子杂交技术分子探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段（目的基因片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足条件：
（1）必须是单链；
（2）带有容易被检测出来的标记物（如放射性同位素标记）。
核酸分子杂交实质上是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交。四、目的基因的检测与鉴定2、鉴定：（个体水平）
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等四、目的基因的检测与鉴定将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。小结目的基因的获取
①从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）
②利用PCR技术扩增目的基因（变性，复性，延伸）
③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
1）反转录法：2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： ④鸟枪法：
表达载体的构建
基因表达载体的构建基因工程的-------核心。
目的：使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因
启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
终止子：位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。
标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而筛选出来。
目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
1）目的基因导入植物细胞
常用农杆菌转化法(感染双子叶植 物和裸子植物)，基因枪法，花粉管通道法
（2）将目的基因导入动物细胞：显微注射技术
（3）将目的基因导入微生物细胞：感受态细胞
目的基因的检测与鉴定
1.DNA分子杂交,2.DNA与mRNA分子杂交3.抗原—抗体杂交
包括做抗虫，抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同。
将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。
——是在DNA分子水平的设计和施工，其中变异属于基因重组。细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
——是在细胞（器）水平的操作，其中变异属于染色体变异。1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取；
2、基因表达载体的构建；
3、将目的基因导入受体细胞；
4、目的基因的检测与鉴定；？为什么要有“目的基因的获取”这一步？
基因工程是指按照人们的愿望创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”这里所说的“更符合人们需要”，就是目的。有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
为什么要有“表达载体的构建”这一步？
单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。
为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？
含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核 一、目的基因的获取一、目的基因的获取1、构建基因文库：指将某种生物的不同基因导入受体菌群体中储存，各受体菌分别含不同基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存 基因文库的构建方法（1）基因组文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存（2）cDNA文库的构建-----逆转录法： 真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？思考？编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子 下图表示基因工程中获取同种目的基因DNA片段的不同方法。有关叙述中正确的是
A.①②③片段均不含内含子，但含非编码区
B. ①②③碱基对的排列顺序均相同
C.获取真核生物的目的基因，一般使用方法b
D.这三种方法都用到酶，都是在体外进行D. 为了有效地保存基因文库，可通过细菌的繁殖而使包含各个特定 DNA片段的细菌增多。液体培养不适用于这一目的，因为各个细菌的生存和繁殖能力不同，各个克隆被保存的机会也会因此而不相等。
在固体培养基上每一个细菌单独形成一个菌落，各个细菌并不相互干扰和竞争，因而有利于全部克隆的保存。形成的每一个菌落中大约包含107个细菌，这样一个基因文库中的所有的克隆几乎都扩增了107倍。把培养皿上的细菌全部洗下加以保存，便可以在需要时从中取得任何一个克隆。 （3）基因文库的保存和利用
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能
基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法？为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取可以吗？ 提示：不一定，如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
如果所需要的目的基因序列已知，也可以通过PCR等方式获得。
2、利用PCR技术扩增PCR原理变性PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在耐高温的聚合酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。 氢键单链DNA双链DNA链反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因DNA合成仪合成3、人工合成法推测推测单链DNA合成？上述两种方法获得目的基因与细胞中实际存在的该种基因结构有什么不同一、目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成:反转录法
化学合成法种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库课堂小结：（种类最多）（数量最多）（针对性最强）12．“X基因”是DNA分 “X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
利用PCR技术扩增① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、
_______________、___________ (做启动子)、 ___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNA（含目的基因）四种脱氧核苷酸一对引物耐高温的DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段成百万倍地扩增前提条件：已知基因的核苷酸序列PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口
两个黏性末端两个切口
获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）经此过程，基因表达载体的构建就成功了？同一种 限制酶【注意】 ①切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。
②插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。
③将目的基因导入受体细胞
a．目的：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
b．受体细胞种类不同，导入方法不同
在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。
Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA的可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体特点。二、基因表达载体的构建——核心基因表达载体组成：
有目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；在构建基因表达载体时，主要考虑以下几方面的因素：
（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体内加上的，而细菌无这些细胞器。
（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。
（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。三、将目的基因导入受体细胞—转化
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒
目的基因构建表达载体植物细胞植物细胞染色体DNA新性状农杆菌（2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用于单子叶植物的转化方法胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素 的完全培养基含有四环素的完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆菌 Ca2+ 处理细胞形成感受态细胞检测（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素抗性基因质粒只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌完全培养基导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明： 大肠杆菌的受体细胞含有目的基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理 四、目的基因的检测与鉴定1、检测法：DNA分子杂交如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。DNA分子杂交技术分子探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段（目的基因片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足条件：
（1）必须是单链；
（2）带有容易被检测出来的标记物（如放射性同位素标记）。
核酸分子杂交实质上是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交。四、目的基因的检测与鉴定2、鉴定：（个体水平）
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等四、目的基因的检测与鉴定将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。小结目的基因的获取
①从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）
②利用PCR技术扩增目的基因（变性，复性，延伸）
③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
1）反转录法：2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： ④鸟枪法：
表达载体的构建
基因表达载体的构建基因工程的-------核心。
目的：使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因
启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
终止子：位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。
标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而筛选出来。
目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
1）目的基因导入植物细胞
常用农杆菌转化法(感染双子叶植 物和裸子植物)，基因枪法，花粉管通道法
（2）将目的基因导入动物细胞：显微注射技术
（3）将目的基因导入微生物细胞：感受态细胞
目的基因的检测与鉴定
1.DNA分子杂交,2.DNA与mRNA分子杂交3.抗原—抗体杂交
包括做抗虫，抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同。
将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。