新人教生物一轮复习学案：第36讲 微生物的培养技术及应用（教师版）

新人教生物一轮复习学案
第36讲 微生物的培养技术及应用
【素养目标】　1.基于科学事实，形成培养基的概念，理解培养基的种类、成分及配制配方，并能进行选择培养基配方的设计。(生命观念　科学思维)　2.基于事实和证据，运用归纳的方法概括出无菌技术的种类及常用方法与原理。(科学思维　科学探究)　3.按照实验操作步骤，使用简单的实验器具进行配制培养酵母菌的培养基、平板划线、消毒和灭菌等的纯培养实验操作，如实记录实验数据，并分析得出结论，写出实验报告并与他人进行必要的交流。(科学探究)
考点一　微生物的基本培养技术
1．培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
【拾遗补缺】　来源于选择性必修3 P10“旁栏思考”：培养基中加入氮源的原因是培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
(3)种类
①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净的微生物培养基。
(2)关键：防止杂菌污染。
(3)常用方法：灭菌和消毒。
(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连线)
【拾遗补缺】　源于选择性必修3 P10“相关信息”：生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
3．微生物的纯培养
(1)概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
(2)方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(3)菌落的概念：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(4)酵母菌的纯培养
制备培养基
(配制培养基、灭菌、倒平板)
↓
接种和分离酵母菌
↓
培养酵母菌
(将接种后的平板和一个未接种的平板倒置、培养)
【拾遗补缺】　源于选择性必修3 P13“结果分析”：如果在未接种的培养基表面有菌落，说明培养基被杂菌污染。
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(　　)
(2)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(　　)
(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌(　　)
(4)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧(　　)
(5)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　　)
答案　(1)√　(2)√　(3)×　(4)√　(5)×
1．选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
制备方法 培养基中加入某些化学物质 培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理 依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好或抗性而设计 产生特定的颜色或其他变化
用途 从众多微生物中分离出所需的微生物 鉴别不同种类的微生物
2.消毒和灭菌的辨析
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具
湿热灭菌(如：高压蒸汽灭菌法) 培养基及容器的灭菌
3.归纳概括平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
项目 第一次操作 每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
[典例剖析]
(2022·辽宁卷，15)为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是(　　)
A．航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物
B．细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀
C．在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品
D．采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征
D　[嗜极微生物适应极端环境的特性使它们有在空间暴露环境或地外星球环境中存活的可能，因此航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确；细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀，会腐蚀舱内材料以及设备线路、元器件，B正确；对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测，需要在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品，C正确；航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不需要采用平板划线法，D错误。]
【名师点拨】　掌握信息转化能力
信息提取 信息1：微生物检测
信息2：平板划线法
信息转化 1.取样进行微生物培养
2.航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，可直接培养
素养考查 科学思维：分析与综合能力 科学探究：设计并实施方案的能力
【角度转换】　提升语言表达能力
某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在下一次划线前未将接种环灼烧灭菌。避免此种现象的操作是增大稀释倍数或每次划线前先将接种环灼烧灭菌。
考向一　培养基与无菌技术
1．(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　)
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用高压蒸汽灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
D　[动、植物细胞DNA的提取无须在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养时必须保证环境是无菌、无毒的，因此，为防止微生物的污染需要加入一定量的抗生素，但细菌培养时不能加入抗生素，因为抗生素可能会抑制该细菌的繁殖，B错误；变性蛋白质仍可为微生物提供氮源等，因此可以用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，C错误；微量离心管、细胞培养瓶可用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，D正确。]
2．(2023·哈尔滨高三检测)在微生物学中使用选择培养基让特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的过程称为选择培养。关于选择培养的过程及原理，下列描述最完整的是(　　)
A．加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长
B．使用不加氮源的培养基分离固氮菌，源于固氮微生物能利用空气中的氮气
C．使用不加有机碳源的培养基分离自养型微生物
D．使用pH调至酸性的培养基分离耐酸菌
B　[酵母菌和霉菌都是真菌，而青霉素抑制细菌和放线菌的生长，但不能绝对防止细菌生长，A错误；在无氮源的培养基中，固氮微生物能利用空气中的氮气进行生长，而其他微生物不能获取氮源而无法生长，从而分离固氮菌，B正确；自养型微生物包括光能自养型和化能自养型，使用不加有机碳源的培养基分离化能自养型微生物，C错误；耐酸菌的耐酸性也有一定的限度，故应将pH调至适宜酸性范围，D错误。]
考向二　微生物的纯培养
3．(多选)(2022·辽宁卷，18)β 苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β 苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。下列叙述正确的是(　　)
A．所用培养基及接种工具分别采用湿热灭菌和灼烧灭菌
B．通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌
C．还需进行发酵实验检测该酵母菌产β－苯乙醇的能力
D．该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发
ACD　[培养基一般选择高压蒸汽灭菌，接种工具一般用灼烧灭菌，A正确；分离纯化酵母菌，操作如下：配制培养基→灭菌→接种→培养→挑选菌落，B错误；为了筛选得到目的菌，应该进行发酵实验检测该酵母菌产β 苯乙醇的能力，C正确；由题干信息可知，β 苯乙醇是能够赋予白酒特征风味的物质，故该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发，获得更多风味的白酒产品，D正确。]
4．(2022·全国乙卷，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见下表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有______________________________________________________________________(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要__________________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是______________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是____________________________(答出1点即可)。
答案　(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌(湿热灭菌)　(2)葡萄糖　制糖废液　氮源、无机盐、水　(3)缺少淀粉酶　(4)设计一系列浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基分别接种等量的菌株C，在相同且适宜的条件下培养相同时间，测定各培养基中的S产量，S产量最高的培养基对应的制糖废液浓度为生产S的最适碳源浓度。　(5)既有利于减少污染、节省原料又能降低生产成本
解析　(1)通常在实验室培养微生物时，为防止实验用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培养物，需要使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子，即对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。
(2)由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、水等营养物质。
(3)分析题图表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。
(4)要测定生产S的最适制糖废液为碳源的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可设计一系列浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，分别接种等量的菌株C，在相同且适宜的条件下培养相同时间，测定各培养基中的S产量，S产量最高的培养基对应的制糖废液浓度为生产S的最适碳源浓度。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降低生产成本。
考点二　微生物的选择培养和计数
1．选择培养基
(1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源的。
2．稀释涂布平板法步骤
(1)系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
(2)涂布平板操作步骤
3．微生物的数量测定
(1)利用稀释涂布平板法计数
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行计数，并求平均值。
②统计结果往往比实际值少。
(2)利用显微镜直接计数
①需用细菌计数板或血细胞计数板
②统计结果是活菌数和死菌数的总和。
【拾遗补缺】　源于选择性必修3 P18“相关信息”：血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于相对较小的细菌等的计数。
4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
(2)操作步骤
①土壤取样：土壤中的细菌绝大部分分布在距地表3～8 cm的土壤层(酸碱度接近中性)。
②样品的稀释：为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将细菌稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
③微生物的培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
(1)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(　　)
(2)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(　　)
(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(　　)
(4)配制培养不同微生物的培养基时都要将培养基调至中性或弱碱性(　　)
(5)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计(　　)
答案　(1)×　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×
1．两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
2.两种微生物计数方法的比较
项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数] 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
注：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。
3．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法 利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法 根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法 如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法 如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
4.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。
[典例剖析]
(多选)(2021·江苏卷，18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是(　　)
A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B．涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL
C．需通过预实验考察辐照时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D．挑取培养基上长出的较大单菌落，给纯化后进行降解效率分析
AB　[制备灭菌培养基的方法为将装入锥形瓶中的培养基和空的培养皿分别进行灭菌，待培养基冷却至50 ℃左右时，将锥形瓶中的培养基分装到灭菌后的培养皿中，A不合理；在统计菌落总数时，应选择菌落数为30～300的平板进行计数，涂布平板时所用的菌液体积为0.1 mL，所以涂布用的菌液浓度应该控制在300～3 000个/mL，B不合理；预实验可以为正式实验摸索条件，确定最佳诱变时间范围，C合理；实验中，可挑取培养基上长出的较大单菌落，进一步纯化后进行降解效果的分析，D合理。]
【名师点拨】掌握信息转化能力
信息提取 信息1：将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上
信息2：辐射时间对存活率的影响
信息转化 1.微生物的选择培养
2.无关变量
素养考查 科学思维：分析与综合能力 科学探究：设计并实施方案能力
【角度转换】　提升语言表达能力
在接种该菌前，通常会随机取若干灭菌后的空白培养基平板先培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
考向一　微生物的选择培养
5．(2023·邵阳高三检测)精氨酸依赖型谷氨酸棒状杆菌缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶，不能在缺少精氨酸的培养基上正常生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸依赖型菌并进行筛选的过程示意图，过程①将紫外线照射处理过的菌液接种在培养基甲上，待培养至菌落不再增加时，将甲中菌落转移到乙培养基中继续培养得到如图所示的结果。下列相关叙述错误的是(　　)
A．野生型菌液的培养皿中不会出现菌落
B．乙培养基与甲相比可能缺少了精氨酸
C．紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生染色体变异
D．乙中的菌落是通过影印法接种获得的，菌落B为鸟氨酸发酵的优良菌种
C　[液体培养基只是用于细菌的快速大量繁殖，如果需要形成菌落，应该接种在固体培养基上，因此野生型菌液的培养皿中不会出现菌落，A正确；图甲平板上有A、B两种菌落，乙平板上只有A菌落，据此推测A菌落可能是野生型谷氨酸棒状杆菌，B菌落是精氨酸依赖型谷氨酸棒状杆菌，乙培养基中可能缺少精氨酸，B正确；谷氨酸棒状杆菌是原核生物，没有染色体，紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生基因突变，不能发生染色体变异，C错误；乙中的菌落是在甲的基础上采用影印法接种培养后得到的结果，由以上分析可知，菌落A是野生型菌种，菌落B为精氨酸依赖型菌株，可作为鸟氨酸发酵的优良菌种，D正确。]
6．(多选)(2023·驻马店高三检测)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，有关叙述错误的是(　　)
A．在配制步骤②、③的培养基时，使用高压蒸汽灭菌以防止杂菌污染
B．步骤③采用稀释涂布平板法接种，其原理是将聚集的细菌分散，以获得单细胞菌落
C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别进行相同条件接种，比较细菌分解尿素的能力
C　[配制培养基时，应使用高压蒸汽灭菌，防止杂菌污染，A正确；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌通过涂布平板法分散，获得单细胞菌落，其接种方法为稀释涂布平板法，B正确；步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，不能加入牛肉膏蛋白胨，C错误；步骤④鉴定细菌分解尿素的能力时，挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。]
考向二　微生物的数量测定
7．(2023·潍坊高三检测)研究人员从青藏高原班戈桥地区的土壤中分离到一株能利用原油为碳源生长的细菌(BGQ 6)，该菌对原油的总降解率为74.14%，且对60种烃类有较高的降解率。下列说法正确的是(　　)
A．利用添加石油的普通培养基能从被石油污染的土壤中筛选BGQ 6
B．由单一的BGQ 6繁殖所获得的群体称为BGQ 6纯培养物
C．可采用平板划线法和稀释涂布平板法对BGQ 6进行计数
D．一般选择菌落数为100～300的平板进行BGQ 6菌落计数
B　[利用以石油为唯一碳源的培养基能从被石油污染的土壤中筛选BGQ 6，A错误；由单一的BGQ 6繁殖所获得的群体称为BGQ 6纯培养物，B正确；接种一般采用平板划线法和稀释涂布平板法，其中平板划线法一般多用于菌种的纯化，可以观察菌落特征，对混合菌进行分离，但不能计数；稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征，C错误；为了保证结果的准确性，一般选择菌落数为30～300的平板进行BGQ 6菌落计数，D错误。]
8．(2023·驻马店高三检测)勤洗手是预防病毒感染的有效措施，某公司推出一款新型免洗洗手凝胶。为衡量该凝胶的清洗效果，研究人员检测了用凝胶洗手前后手部细菌的含量。凝胶洗手前的检测流程见下图。下列叙述错误的是(　　 )
A．统计洗手前手部细菌的数量，选择的接种方法是稀释涂布平板法
B．除图中操作外，还需要设置一组未接种的空白培养基进行培养
C．培养基上的一个菌落只可能来源于样品稀释液中的一个活菌
D．初步判断培养基上菌种的类型，可以用肉眼观察菌落的形状
C　[平板划线无法得知稀释倍数，不能用于活菌计数，故统计洗手前手部细菌的数量，选择的接种方法是稀释涂布平板法，A正确；除图中操作外，还需要设置一组未接种的空白培养基进行培养，以验证培养基是否被杂菌污染，B正确；由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上显示的只是一个菌落，故培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个、甚至几个活菌，C错误；由于菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌落的形态特征，D正确。]
(三十六)菌种的活化
1．概念：将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。
2．菌种保存方法：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、－80 ℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。
3．菌种活化的方式
(1)定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；
(2)液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；
(3)沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；
(4)真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿管上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子在颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；
(5)－80 ℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38～40 ℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50～100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养；
(6)液氮超低温冻结法保存菌种复苏与－80 ℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38 ℃～40 ℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50～100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
[对点训练]
1．(2022·临沂高三检测)《齐民要术》记载了许多古人在生产中运用发酵技术加工食品积累的宝贵经验，下列对记载的理解，错误的是(　　)
食品加工 历史记载
酿酒 浸曲发，如鱼眼汤，净淘米八斗，炊作饭，舒令极冷
制醋 大率酒斗，用水三斗，合瓮盛，置日中曝之。七日后当臭，衣生，勿得怪也，但停置，勿移动，挠搅之。数十日，醋成
泡菜制作 作盐水，令极咸，于盐水中洗菜，即内(纳)瓮中。其洗菜盐水，澄取清者，泻著瓮中，令没菜把即止，不复调和
A．“浸曲”发目的是活化酵母菌，此时酵母菌通过有氧呼吸和无氧呼吸释放CO2
B．“舒令极冷”是为了防止蒸熟的米温度过高而杀死酒曲中的酵母菌等微生物
C．“用水三斗”为避免酒精浓度过高杀死醋酸菌而不易形成醋酸菌衣膜
D．“令没菜把即止”主要目的是让蔬菜充分吸收盐分，使风味品质更佳
D　[“浸曲”发的目的是活化酵母菌，使其由休眠状态变为活跃状态，酵母菌可以进行有氧呼吸(产生CO2和水)和无氧呼吸(产生酒精和CO2)，所以都可以释放CO2，A正确；“舒令极冷”是降低米的温度，为了防止蒸熟的米温度过高而杀死酒曲中的酵母菌等微生物，B正确； “用水三斗”可以将酒精吸收，避免酒精浓度过高杀死醋酸菌而不易形成醋酸菌衣膜，C正确；“令没菜把即止”是用水将蔬菜淹没，制造无氧环境，D错误。]
2．(2023·浙江十校联盟高三检测)市场上饮用醋种类繁多，口感不一。某学习小组学习了发酵工程知识后，利用葡萄和糯米酿造果粮复合饮用醋，并设计了如下图加工工艺流程：
注：酒醪是谷物发酵后但尚未进入蒸馏程序之前，所产生的一种浊酒，与酒酿极为类似。
(1)A、B接种的菌种一般要先活化和____________后，再接种于发酵液中，从细胞结构上看，两菌种的主要区别为____________________。C过程为____________________。
(2)酒精发酵的质量决定了醋的品质。为了解酒精发酵进程，可在发酵过程中定期取样，用_____________________________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。选择高产醋杆菌时，可将醋杆菌涂布培养在白色的CaCO3培养基上，并挑选________________________直径的比值大的菌落作为发酵菌种，发酵菌种经扩大培养后再接种至酒醪中进行发酵。若增加接种量和接种不同类型醋杆菌，则可以加快产酸的进程，并抑制________对发酵的影响，从而提高醋酸含量，使口感更纯正。
(3)不同同学最后酿造出的葡萄糯米香醋口感不同，影响其风味的因素可能有_______________________________________________________(写出两点即可)。
答案　(1)扩大培养　A含有成形细胞核，B不含/是否有成形细胞核　提取、分离、纯化、萃取、蒸馏　(2)稀释涂布平板法　透明圈直径与菌落(不耐酸等)　杂菌　(3)菌种的类型、代谢特点，葡萄、糯米的品质，发酵条件的不同等
解析　(1)A是接种酵母菌，B是接种醋酸菌，接种菌种一般要先活化和扩大培养，再接种于发酵液中；酵母菌属于真核生物，醋酸菌属于原核生物，酵母菌含有核膜为界限的细胞核，醋酸菌没有；C过程为分离纯化的过程。
(2)微生物常见的接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，用稀释涂布平板法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。在白色的CaCO3培养基上，透明圈直径与菌落(直径比值)较大的菌落产醋酸的能力强，因此应该将透明圈直径与菌落(直径比值)较大的菌落选择作为发酵菌种。若增加接种量和接种不同类型醋杆菌，则可以加快产酸的进程，并抑制杂菌对发酵的影响，从而提高醋酸含量，使口感更纯正。
(3)不同同学最后酿造出的葡萄糯米香醋口感不同，影响其风味的因素可能有菌种的类型、代谢特点，葡萄、糯米的品质，发酵条件的不同等。
1．(2022·山东卷，14)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是(　　)
A．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B．可用深层通气液体发酵技术提高产量
C．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D．青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
D　[青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用，从而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。]
2．(2022·海南卷，12)为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　)
A．采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B．培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
C　[采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机取样，A正确；牛肉膏蛋白胨培养基中含有细菌生长、繁殖所需要的各种营养成分，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的菌体分散开，从而在培养基表面形成单菌落，C错误；每种细菌具有特定的形态结构，可根据形态学特征进行鉴定，还可借助生物化学的方法进行鉴定，比如某种菌可产生特定的物质，D正确。]
3．(2021·山东卷，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭，硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是(　　)
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
B　[从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。]
4．(2022·河北卷，23)番茄灰霉病菌严重影响番茄生产，枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的生物防治，研究者设计了相关实验。回答下列问题：
(1)检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时，取适量________菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片(直径5 mm)在________菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，数秒后取出滤纸片，培养皿倒置培养后测量________大小以判定抑菌效果。
(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________(填“静置”或“摇床震荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用____________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是_______________________________________。
(3)电泳分离蛋白质混合样品的原理是________________________________________。利用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白分子量时，SDS的作用是________________________________________________________________________。
(4)枯草芽孢杆菌长期保藏时，常以其________作为保藏对象。
答案　(1)番茄灰霉病菌　枯草芽孢杆菌　透明圈　(2)摇床震荡　稀释涂布平板法　用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的酵母菌也计算在内　(3)利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离　SDS带有大量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质无关　(4)菌液
解析　(1)分析题意可知，要检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用，先把适量的番茄灰霉病菌菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片在枯草芽孢杆菌菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，若对番茄灰霉病菌有抑制作用，被覆盖的位置的番茄灰霉病菌就会被杀死，培养皿倒置培养后会出现透明圈，测量透明圈大小以判定抑菌效果的强弱。
(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，采用摇床震荡培养可增大培养液的溶氧量，有利于枯草芽孢杆菌的生长繁殖。培养过程中要抽样检测活菌数量，应该采用稀释涂布平板法，用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的酵母菌也计算在内。
(3)电泳分离蛋白质混合样品的原理是：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。SDS带有大量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质无关。
(4)长期保藏枯草芽孢杆菌，应该将培养的菌液转移到灭菌好的甘油瓶中，与甘油充分混合，放在－20℃的冷冻箱中保存。
5．(2022·广东卷，21)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
(1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________为碳源时生长状况最好。
(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是______________________________________________________。(答一点即可)
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是_________________。
(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有______________________________________。
答案　(1)高压蒸汽灭菌　平板划线　纤维素
(2)培养基的营养成分不能满足部分微生物的营养需求；培养条件不利于微生物繁殖；与其他微生物之间存在互利共生关系
(3)能将动植物遗体残骸中的有机物分解成无机物
(4)耐低温
解析　(1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。
(2)培养基的营养成分不能满足部分微生物的营养需求；培养条件不利于微生物繁殖；与其他微生物之间存在互利共生关系，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。
(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将动植物遗体残骸中的有机物分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。