人教版选修3专题二第二节动物细胞工程（共82张PPT）
文档属性
| 名称 | 人教版选修3专题二第二节动物细胞工程（共82张PPT） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 5.8MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2014-11-28 10:35:39 | ||
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文档简介
课件82张PPT。动物细胞工程2.2 动物细胞工程 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 动物细胞工程常用的技术手段技术：2.2.1动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.
3、原理：细胞增殖2、为什么要培养动物细胞？ 许多动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质量是很少的，需要借助于大规模的动物细胞培养来实现。动物细胞培养技术动物细胞培养技术定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养4：过程图示原代培养强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制 定义：
当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。4、总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养⑴原代培养:
将动物组织消化后的初次培养。
⑵传代培养:
对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。动物组织单个细胞细胞悬液贴壁生长分瓶培养10代细胞50代细胞不死细胞原代培养传代培养胰蛋白酶剪碎加培养液接触抑制少数癌变少数动物细胞培养技术流程 无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、PH、气体环境。5、体外培养动物细胞需要物质和环境条件⑴无菌、无毒的环境
①对培养液、培养用具进行无菌处理；
②在培养液中加抗生素；
③定期更换培养液。⑵充足的营养
葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、
微量元素、血浆或血清⑶温度和PH
适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃ ；适宜的酸碱度：PH = 7.2―7.4
⑷气体环境——“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。
氧气是细胞代谢必须的；
C02的主要作用是维持培养液的PH。
问题3：为什么用胰蛋白酶处理？问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰
蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和
细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体问题8、动物细胞培养的原理：细胞增殖。问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。6.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产
如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
2.应用于基因工程
主要用于作为受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性
4.细胞的生理、药理、病理研究
如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较：二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类： 胚胎细胞核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理： 动物细胞核具有全能性 1996年，英国人Ian Wilmut成功获得体细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物.克隆动物：用核移植的方法得到的动物。4、体细胞核移植过程---克隆动物---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：另一头绵羊的子宫◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：
一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.
二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕
受体多莉羊诞生的意义：
多莉羊在技术上的突破之处在于供核细胞不是胚胎细胞，而是已分化的体细胞。这说明已经分化的动物体细胞核，仍然具有全能性，在合适的条件下，就可以发育成新的个体。
克隆技术在繁育优良家畜、治疗人类遗传病、抢救濒危物种和保护生物多样性等方面有广阔的应用前景。
◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：
◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内 妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养） 1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？核移植流程:1、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。⑴核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？
⑵通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？ MⅡ中期的卵母细胞诱导方法：
物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。P49页讨论⑶在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质绝大部分部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。⑷为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？ 培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，而且细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。⑸你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ 绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。4.体细胞核移植技术的应用前景：1.加速家畜遗传改良的进程2.保护濒危物种3. 生产医用蛋白质及组织器官的移植4.了解胚胎发育和衰老过程；
追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病5、体细胞核移植技术存在的问题 P50（1）成功率非常低
（2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题
成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。1.幼龄与老龄的组织细胞相比较，分化程度低的与分化程度高的细胞比较，哪一种更易于培养？为什么？ 细胞的衰老与动物机体的衰老有密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。
所以，幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更易于培养2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？ 动物细胞培养不需经过脱分化过程。
因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了
要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？ 可以。
卢辛达有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础。
克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。 但是该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？ 从卢辛达耳朵上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织的细胞。
从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。
用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合。
用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。
核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。⑴研究方面：
克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。
⑵应用方面：
生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。1.动物细胞工程技术的基础是：（ ）
A．动物细胞融合
B．胚胎移植
C．动物细胞培养
D．核移植Ｃ课堂练习;2.科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐鼠的子宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是
A.黑、雌 B.褐、雌 C.白、雄 D.黑、雄 A3.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能 A．有选择地繁殖某一性别的家畜
B.繁殖家畜中的优秀个体
C．用于保存物种
D.改变动物的基因型D4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（ ）①无毒的环境 ②无菌的环境 ③培养基需要加入血清 ④温度与动物体温相似 ⑤需要O2，不需要CO2 ⑥CO2能调节培养液PHA、①②③④⑤⑥ B、 ①②③④
C、①③④⑤⑥ D、 ①②③④⑥D5、动物细胞培养的特点 （ ）
①细胞贴壁 ②有丝分裂 ③细胞分化 ④接触抑制 ⑤减数分裂 ⑥原代培养一般传1－10代
A、①②④⑥ B、②③④⑤
C、①③④⑥ D、③④⑤⑥A⑴写出 ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ ｂ 。
⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是
： 。
⑶多莉面部的毛色是 ，判断依据是： 。
⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞核也具有 。
⑸请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义： 。6.世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：核移植胚胎移植卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有启动核基因表达的物质白色多利的核基因全部来自白面绵阳全能性保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官7、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：
（1）容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自______________________。
（2）容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是 ，然后用 酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是 。
动物胚胎或幼龄动物剪碎胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养
（3）培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有 ________________等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第 代，到这时的培养称为__ 。
（4）为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用
处理，然后配置成 ，再分装。
`动物血清10原代培养胰蛋白酶细胞悬浮液2.2.2动物细胞融合与
单克隆抗体1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。
细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合 受精作用-这是一种自然融合2、诱导融合的因素
生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)
化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.
物理法：电激融合病毒颗粒黏 附细胞表面细胞膜连接细胞膜被 病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞补充：①什么是病毒的灭活？ 灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。②灭活病毒诱导细胞融合的原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 ?不灭活行吗？不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。④动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性 把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交细胞。
融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞3.动物细胞融合技术的应用：
⑴突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；
⑵为制造单克隆抗体开辟了新途径 使用相应的抗体检测乙肝病毒——抗原医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图
凡能够引起机体产生特异性
免疫应答的物质叫做抗原。⑴什么是抗原？ 例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备抗原决定簇：
抗原表面具有的某些特定的化学基团，能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗原的重要依据。
各种抗原的决定簇数目不同，同一抗原的决定簇可能有多种。
⑵什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？ 当机体受到抗原刺激剂后由效应B细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白——抗体。
抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。血清抗体（也称多克隆抗体）
由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体。
特点：产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。抗原不纯抗体不纯（3）人们获得抗体的传统方法是?
将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。
如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体。问题（4）：
怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？
什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？ ——肿瘤细胞！单克隆抗体的制备—极富创造性的方案
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。科勒米尔斯坦荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖(5)技术思路的重点 问题: 在培养体系中, 有3种细胞. BB细胞、瘤瘤细胞,和杂交细胞。我们还是拿不到McAb,怎么办? 筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛?单克隆抗体杂交细胞杂交瘤细胞骨髓瘤
细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系提取经过免疫的
B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术1.单克隆抗体的制备过程：特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏度高可大量制备动物特异性免疫
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）
细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）
第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。
选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：3）、为何要进行两次筛选？4）、如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：1）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体已知细胞合成DNA有 D 和 S 两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般DNA不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答： ⑴试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞 2 知识补充⑵设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。
培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。
加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？
融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。
将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.
2、用于治疗疾病和运载药物：
主要用于癌症治疗。
生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。3、单克隆抗体的应用结合同位素的单抗＋抗癌药物-----生物导弹单抗放射性同位素动物细胞工程小结动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用
动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用
单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用
核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用
动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术1．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）
A．结果是相同的
B．杂种细胞的形成过程基本相同
C．操作过程中酶的作用相同
D．诱导融合的手段相同
Ｂ课堂练习;2. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ）
①淋巴细胞
②小鼠骨髓瘤细胞
③B淋巴细胞自身融合细胞
④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞
⑤杂交瘤细胞
A． ②④ B．①③⑤
C． ①②③④ D．②③ C3.科学家用小鼠骨髓癌细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓癌细胞融合的是
A.经过免疫的B淋巴细胞
B.不经过免疫的T淋巴细胞
C.经过免疫的T淋巴细胞
D.不经过免疫的B淋巴细胞AC4．单克隆抗体是指
A、单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体
B、单个B淋巴细胞增殖产生的抗体
C、单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体
D、单个抗体通过克隆化，产生大量抗体5.下列哪一项属于克隆？
A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中
B.将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内
C.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
D.将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系 D 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代506：再见
3、原理：细胞增殖2、为什么要培养动物细胞？ 许多动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质量是很少的，需要借助于大规模的动物细胞培养来实现。动物细胞培养技术动物细胞培养技术定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养4：过程图示原代培养强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制 定义：
当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。4、总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养⑴原代培养:
将动物组织消化后的初次培养。
⑵传代培养:
对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。动物组织单个细胞细胞悬液贴壁生长分瓶培养10代细胞50代细胞不死细胞原代培养传代培养胰蛋白酶剪碎加培养液接触抑制少数癌变少数动物细胞培养技术流程 无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、PH、气体环境。5、体外培养动物细胞需要物质和环境条件⑴无菌、无毒的环境
①对培养液、培养用具进行无菌处理；
②在培养液中加抗生素；
③定期更换培养液。⑵充足的营养
葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、
微量元素、血浆或血清⑶温度和PH
适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃ ；适宜的酸碱度：PH = 7.2―7.4
⑷气体环境——“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。
氧气是细胞代谢必须的；
C02的主要作用是维持培养液的PH。
问题3：为什么用胰蛋白酶处理？问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰
蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和
细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体问题8、动物细胞培养的原理：细胞增殖。问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。6.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产
如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
2.应用于基因工程
主要用于作为受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性
4.细胞的生理、药理、病理研究
如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较：二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类： 胚胎细胞核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理： 动物细胞核具有全能性 1996年，英国人Ian Wilmut成功获得体细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物.克隆动物：用核移植的方法得到的动物。4、体细胞核移植过程---克隆动物---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：另一头绵羊的子宫◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：
一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.
二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕
受体多莉羊诞生的意义：
多莉羊在技术上的突破之处在于供核细胞不是胚胎细胞，而是已分化的体细胞。这说明已经分化的动物体细胞核，仍然具有全能性，在合适的条件下，就可以发育成新的个体。
克隆技术在繁育优良家畜、治疗人类遗传病、抢救濒危物种和保护生物多样性等方面有广阔的应用前景。
◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：
◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内 妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养） 1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？核移植流程:1、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。⑴核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？
⑵通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？ MⅡ中期的卵母细胞诱导方法：
物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。P49页讨论⑶在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质绝大部分部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。⑷为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？ 培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，而且细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。⑸你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ 绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。4.体细胞核移植技术的应用前景：1.加速家畜遗传改良的进程2.保护濒危物种3. 生产医用蛋白质及组织器官的移植4.了解胚胎发育和衰老过程；
追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病5、体细胞核移植技术存在的问题 P50（1）成功率非常低
（2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题
成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。1.幼龄与老龄的组织细胞相比较，分化程度低的与分化程度高的细胞比较，哪一种更易于培养？为什么？ 细胞的衰老与动物机体的衰老有密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。
所以，幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更易于培养2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？ 动物细胞培养不需经过脱分化过程。
因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了
要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？ 可以。
卢辛达有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础。
克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。 但是该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？ 从卢辛达耳朵上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织的细胞。
从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。
用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合。
用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。
核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。⑴研究方面：
克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。
⑵应用方面：
生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。1.动物细胞工程技术的基础是：（ ）
A．动物细胞融合
B．胚胎移植
C．动物细胞培养
D．核移植Ｃ课堂练习;2.科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐鼠的子宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是
A.黑、雌 B.褐、雌 C.白、雄 D.黑、雄 A3.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能 A．有选择地繁殖某一性别的家畜
B.繁殖家畜中的优秀个体
C．用于保存物种
D.改变动物的基因型D4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（ ）①无毒的环境 ②无菌的环境 ③培养基需要加入血清 ④温度与动物体温相似 ⑤需要O2，不需要CO2 ⑥CO2能调节培养液PHA、①②③④⑤⑥ B、 ①②③④
C、①③④⑤⑥ D、 ①②③④⑥D5、动物细胞培养的特点 （ ）
①细胞贴壁 ②有丝分裂 ③细胞分化 ④接触抑制 ⑤减数分裂 ⑥原代培养一般传1－10代
A、①②④⑥ B、②③④⑤
C、①③④⑥ D、③④⑤⑥A⑴写出 ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ ｂ 。
⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是
： 。
⑶多莉面部的毛色是 ，判断依据是： 。
⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞核也具有 。
⑸请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义： 。6.世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：核移植胚胎移植卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有启动核基因表达的物质白色多利的核基因全部来自白面绵阳全能性保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官7、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：
（1）容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自______________________。
（2）容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是 ，然后用 酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是 。
动物胚胎或幼龄动物剪碎胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养
（3）培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有 ________________等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第 代，到这时的培养称为__ 。
（4）为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用
处理，然后配置成 ，再分装。
`动物血清10原代培养胰蛋白酶细胞悬浮液2.2.2动物细胞融合与
单克隆抗体1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。
细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合 受精作用-这是一种自然融合2、诱导融合的因素
生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)
化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.
物理法：电激融合病毒颗粒黏 附细胞表面细胞膜连接细胞膜被 病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞补充：①什么是病毒的灭活？ 灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。②灭活病毒诱导细胞融合的原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 ?不灭活行吗？不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。④动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性 把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交细胞。
融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞3.动物细胞融合技术的应用：
⑴突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；
⑵为制造单克隆抗体开辟了新途径 使用相应的抗体检测乙肝病毒——抗原医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图
凡能够引起机体产生特异性
免疫应答的物质叫做抗原。⑴什么是抗原？ 例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备抗原决定簇：
抗原表面具有的某些特定的化学基团，能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗原的重要依据。
各种抗原的决定簇数目不同，同一抗原的决定簇可能有多种。
⑵什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？ 当机体受到抗原刺激剂后由效应B细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白——抗体。
抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。血清抗体（也称多克隆抗体）
由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体。
特点：产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。抗原不纯抗体不纯（3）人们获得抗体的传统方法是?
将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。
如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体。问题（4）：
怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？
什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？ ——肿瘤细胞！单克隆抗体的制备—极富创造性的方案
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。科勒米尔斯坦荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖(5)技术思路的重点 问题: 在培养体系中, 有3种细胞. BB细胞、瘤瘤细胞,和杂交细胞。我们还是拿不到McAb,怎么办? 筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛?单克隆抗体杂交细胞杂交瘤细胞骨髓瘤
细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系提取经过免疫的
B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术1.单克隆抗体的制备过程：特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏度高可大量制备动物特异性免疫
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）
细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）
第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。
选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：3）、为何要进行两次筛选？4）、如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：1）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体已知细胞合成DNA有 D 和 S 两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般DNA不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答： ⑴试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞 2 知识补充⑵设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。
培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。
加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？
融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。
将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.
2、用于治疗疾病和运载药物：
主要用于癌症治疗。
生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。3、单克隆抗体的应用结合同位素的单抗＋抗癌药物-----生物导弹单抗放射性同位素动物细胞工程小结动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用
动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用
单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用
核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用
动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术1．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）
A．结果是相同的
B．杂种细胞的形成过程基本相同
C．操作过程中酶的作用相同
D．诱导融合的手段相同
Ｂ课堂练习;2. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ）
①淋巴细胞
②小鼠骨髓瘤细胞
③B淋巴细胞自身融合细胞
④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞
⑤杂交瘤细胞
A． ②④ B．①③⑤
C． ①②③④ D．②③ C3.科学家用小鼠骨髓癌细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓癌细胞融合的是
A.经过免疫的B淋巴细胞
B.不经过免疫的T淋巴细胞
C.经过免疫的T淋巴细胞
D.不经过免疫的B淋巴细胞AC4．单克隆抗体是指
A、单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体
B、单个B淋巴细胞增殖产生的抗体
C、单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体
D、单个抗体通过克隆化，产生大量抗体5.下列哪一项属于克隆？
A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中
B.将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内
C.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
D.将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系 D 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代506：再见