人教版选修1专题2课题1微生物的实验室培养

课件83张PPT。
课题1 微生物的实验室培养一、培养基 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基按成分不同划分天然培养基合成培养基化学成分不恒定的天然有机物牛肉膏蛋白胨培养基、
麦芽汁培养基。用于工业生产化学成分完全了解的物质配制而成的培养基高氏1号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定1.培养基的类型及其应用
按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏 观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定 大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究 按用途不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长选择培养基加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞
加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:
分离杂交瘤细胞【例】以下是单克隆抗体制备流程示意图： 根据培养基的________分类，图中HAT培养基属于________培养基选择用途 2.培养基的化学成分 不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方碳源有机碳无机碳异养微生物自养微生物氮源有机氮无机氮NH3
铵盐
硝酸盐
N2蛋白质
核酸
氨基酸
尿素注：对于异养微生物，含C、N的化合物既为碳源，也是氮源。微生物生长不可缺少的微量有机物
如：维生素、氨基酸、碱基等 生长因子：牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。的水溶性物质。牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素。 氮源、能源、生长因子碳源、能源、生长因子培养基配置原则目的明确营养协调理化条件适宜经济节约根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累如：pH二、无菌技术（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 【2010广州调研】下列实验方法及其结果合理的是
A．稀释的鸡蛋清溶液与蛋白酶混合后用双缩脲试剂检测会发生紫色反应
B．酒精溶液与重铬酸钾溶液混合后在沸水浴条件下才会出现灰绿色
C．在植物组织培养中，可用酒精对外植体进行灭菌
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，在沸水浴条件下溶液呈蓝色（双选）1、常用消毒和灭菌方法煮沸消毒法：巴氏消毒法：化学药剂消毒法：紫外线消毒法：灼烧灭菌 100℃；5-6min；部分细胞和芽孢75℃，30min；80℃，15min；牛奶干热灭菌高压蒸汽灭菌灼烧灭菌干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂（70%酒精等）
紫外线针对不耐高温的液体接种室、超净工作台能耐高温的，需要保持干燥的物品灼烧法
干热灭菌
高压蒸汽灭菌接种工具（接种环等）吸管实验操作者的双手培养皿等玻璃器皿培养基1、消毒方法2、灭菌方法干热灭菌计算?称量?溶化?灭菌?倒平板三、实验操作1、制备培养基【例2】进行细菌接种培养实验时，以下哪个操作步骤是非必要的？
A．双手带上胶手套
B．接种前后都灼烧接种环
C．接种前后都灼烧菌种试管口和待接种斜面
试管口
D．要丢弃带菌培养基前，进行高压蒸汽灭菌
或加热灭菌1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？刚刚不烫手时2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？灼烧灭菌，防止瓶口的微生物的污染有关问题防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。3.为什么将平板倒置？2、纯化大肠杆菌平板划线法稀释涂布平板法平板分离由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，就是菌落。根霉 曲霉 青霉将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______在_______旁冷却接种环，并打开棉塞 将试管口通过火焰 .将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火焰，并塞上棉塞 火焰冷却三至五灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端烧红将平板_____放入培养箱中培养。 倒置 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 避免接种环温度太高，杀死菌种使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 取少量稀释液滴加到培养基表面 灼烧 待酒精燃尽后冷却8～10s 涂布 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀(3)菌种培养：培养基倒置放入37℃的恒温箱中。(4)实验结果观察(5)菌株的保存方法固体斜面培养基甘油管藏搁置斜面课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照 1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；
方法：
⑴抑制大多数微生物不能生长
⑵造成有利于该菌生长的环境，2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、培养基选择分解尿素的微生物的原理？1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。对位训练
1.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是
（ ）
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂
⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不
加硝酸盐
A.①③⑤⑦ B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧ D.①④⑥⑦C注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。㈢.设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
实验组：选择培养基
对照组：牛肉膏蛋白胨培养基
接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。2.判断选择培养基是否具有选择作用1.判断培养基是否被杂菌污染
实验组：接种的培养基
对照组：未接种的培养基（空白对照）
在相同条件下培养，观察未接种的培养基上是否有菌落。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
选肥沃、湿润的土壤。铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
◆称取土壤10g加入90ml无菌水，依次配置一系列梯度的土壤稀释液。[三]样品的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。㈣.取样涂布每个稀释度下涂布3个平板，并对培养皿、试管进行标记㈤.微生物的培养与观察2.观察菌落特征1.培养不同微生物往往需要不同培养温度。微生物的培养与观察（六）菌落计数选取某稀释度下有2-3个平板中菌落数在30-300的平板计数，求菌落数的平均值，再根据公式计算菌种数。三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 本课题知识小结:
1.使用选择培养基的目的是（ 　）
A.培养细菌　　
B.培养真菌　　
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素实践训练CD3.下列说法不正确的是（ 　）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　　）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐BC
课题3
分解纤维素的微生物的分离㈠纤维素与纤维素酶1.纤维素 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。 植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。一.基础知识
土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。 人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。2.纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲 乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在
140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失 讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？㈡.纤维素分解细菌的筛选：
1.方法：
刚果红染色法。
2.原理：
刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3.优点：
该方法可以通过颜色反应直接筛选。二.实验设计与操作
㈠.实验设计：〖旁栏思考题〗本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
提示：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。㈡.操作过程：
1.土壤取样：
采集土样时，应选择富含纤维素的环境。若找不到合适环境，可将滤纸埋在土壤中一个月左右，也会有能分解纤维素的微生物生长。
〖旁栏思考题〗为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
答：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。
〖旁栏思考题〗将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
答：人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。2.选择培养
⑴.选择培养的目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
⑵.制备选择培养基：
①配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
答：是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。
②这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
答：有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。
③你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用
答：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。⑶选择培养：
将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。〖旁栏思考题〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
提示：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养
基上（1）制备鉴别培养基:（2）涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。5.刚果红染色法
方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。
方法二：在 时就加入刚果红。
〖旁栏思考题〗这两种方法各有哪些优点与不足？培养微生物倒平板颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐
刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，
有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。方法一中NaCl溶液的作用？思考： 漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！ 三.结果分析与评价
㈠.实验样品选择可以在树林富含腐殖土中取样，其环境表现为潮湿、枯枝落叶多。分解纤维素的菌数量多。
㈡.提示：利用纤维素分解菌的选择培养基，经富集培养后梯度稀释，经鉴别培养基培养，就能够分离到能够产生透明圈的微生物，它们是纤维素分解菌或者是真菌。
㈢.提示：分解纤维素的微生物有很多，有真菌、放线菌及细菌。
四.课外延伸
阅读“课题延伸”，回答：
1.为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵。
2.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 含量进行定量测定。发酵产纤维素酶液体固体葡萄糖分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法
后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结培养基成分分析鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)