2023年高考生物全国乙卷真题变式·分层精准练：第12题
一、原题
1．（2023·全国乙卷）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
二、基础
2．（备考2021年新高考生物二轮复习专题15 基因工程和细胞工程）荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体(P1)的筛选和鉴定。部分过程如下图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题。
（1）过程①中用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有 末端，过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，前提是要根据 ，设计出引物，此外还需在引物的一端加上 序列，以便于P1的构建和筛选。
（2）过程③中，质粒P0需用限制酶 切割，才能与扩增出的目的基因在 酶作用下形成P1。
（3）为了筛选出含有质粒P1的菌落，需采用添加 的培养基平板进行培养，在紫外光激发下 的菌落，即为含有P1的菌落。
（4）提取经上述筛选所得菌落的RNA，通过 获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是 。
3．（2017高二下·无锡期中）如图为绿色荧光小鼠制备流程图，Gfp是绿色荧光蛋白基因，请分析回答：
（1）构建表达载体需要的酶是： ，表达载体包含绿色荧光蛋白基因Gfp、 、 、终止子和复制原点等。
（2）图中载体上的Neo基因是一种抗生素抗性基因，图中步骤③所用的G418是一种抗生素(对细胞有毒害作用)，添加G418的目的是 。
（3）图中所用的胚胎干细胞来自 。
（4）图中步骤⑤要将细胞注射入图中囊胚的 位置，图中步骤⑥胚胎移植前要对代孕母鼠用激素处理，目的是 。
（5）可以使用 方法在蛋白质水平上鉴定小鼠是否存在绿色荧光蛋白。
4．（2022高三上·山东月考）绿色荧光蛋白是科学家在水母细胞中发现的由238个氨基酸组成的蛋白质，被广泛应用于分子示踪和生物标记。科研人员利用基因工程获得转基因大肠杆菌，再通过发酵技术生产绿色荧光蛋白。请回答下列问题：
（1）利用PCR从水母基因组中扩增绿色荧光蛋白基因时，需要加入水母基因组DNA、引物、4种脱氧核苷酸、 缓冲液等物质，其中引物的作用是 。
（2）获得转基因大肠杆菌的核心步骤是 ，该过程所需要的酶有 。
（3）为提高转化效率，转化前需用 对大肠杆菌进行处理。
（4）利用转基因大肠杆菌生产绿色荧光蛋白时，培养基应选用 （填“液体培养基”或“固体培养基”），pH应调至 。
5．（2023高二下·哈尔滨期末）“细菌画”是借助微生物培养技术，用表达不同荧光蛋白的转基因细菌在固体培养基上制作图案，从而绘制出精美画作的活动。请分析回答下列问题：
（1）这些细菌能够发光的原因是其细胞内导入了 基因，获取该基因的方法有人工合成、 等。
（2）研究人员获得了足够量的该基因后，下一步需要构建 ，这是培育出转基因细菌的核心工作，该过程用到的工具酶有 。
（3）获得纯净的微生物培养物是绘制精美画作的前提。纯培养物是指由 繁殖所获得的的微生物群体，培养过程中关键是 ，常采用 法对培养基进行灭菌。
（4）最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造现有的绿色荧光蛋白获得黄色荧光蛋白。对荧光蛋白分子的设计和改造过程属于 工程。
三、提高
6．（高中生物人教版（2019）选择性必修三3.2 基因工程的基本操作程序 同步练习）荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体(P1)的筛选和鉴定。部分过程如下图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。请回答下列问题。
（1）过程①中，用EcoRⅤ切割目的基因获得 末端。
（2）过程②是利用 技术，多次循环扩增DNA片段；根据P0上的限制酶切割位点，需要在目的基因两端重设限制酶切割位点，则在扩增目的基因时，设计的引物5'端序列必须是 ，以获得相应的黏性末端，便于P1的构建和筛选。
（3）过程③中，P0需用限制酶 切割，才能与目的基因在 酶的作用下形成P1。
（4）为了筛选出含有P1的菌落，需采用添加 的培养基进行培养，在紫外光激发下 (选填“发出”或“不发出”)绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。
7．（2021高三上·靖远开学考）RGA是一种具有抑制植物生长作用的蛋白质，生长素能通过赤霉素使RGA降解，无赤霉素时，生长素不能引起RGA降解。研究者向拟南芥赤霉素合成缺陷型突变体中转入绿色荧光蛋白（GFP）基因与RGA基因的融合基因，获得转基因拟南芥植株，借助荧光显微镜可以观察转基因拟南芥幼苗根尖细胞中GFP—RGA融合蛋白的表达情况。回答下列问题：
（1）融合基因是将两个或多个基因首尾相连，置于同一套调控序列控制之下而构建的。调控序列包括能驱动基因转录出mRNA的 和能使转录在所需要的地方停下来的 。在GFP—RGA融合基因中，GFP基因的作用是作为 基因。
（2）构建融合基因需要 等工具酶，将融合基因导入拟南芥细胞时常用 法。
（3）转融合基因拟南芥细胞具有 性，因而通过 技术能使其发育成转基因植株。根据题意，写出从细胞或个体水平检测融合基因是否导入成功的方法 。
（4）将成功导入融合基因的拟南芥赤霉素合成缺陷型幼苗均分成甲、乙、丙三组，对其进行下
表所示处理，已知GFP—RGA融合蛋白中，GFP随RGA的分解而分解，预期能观察到绿色荧光的是 组。
组别 甲组 乙组 丙组
处理 保持完整 去幼芽、幼叶 去幼芽、幼叶+生长素
用适宜浓度的赤霉素溶液处理4 h后，用荧光显微镜观察幼苗根尖是否出现绿色荧光
8．（2023·乌鲁木齐模拟）表面展示技术是通过DNA重组技术，将某种蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而将目的基因的表达产物展示在细胞表面。如下图是含有芽孢表面蛋白基因（cotB）与绿色荧光蛋白基因（gfp）的基因表达载体，Ampr是氨苄青霉素抗性基因。回答下列问题。
（1）由图可知，基因表达载体中cotB基因与基因共用的结构是 。
（2）将导入基因表达载体的芽孢杆菌培养在含 的固体培养基上以获得含有 的受体细胞。
（3）将cotB基因与gfp基因重组的目的是 。
（4）表面展示技术还能应用在酿酒过程中，将酸性蛋白酶基因（pepA）整合到酿酒酵母的特定基因位点，以期在发酵的过程中将发酵液中的蛋白质水解成小分子肽和氨基酸，进而降低酒的浑浊度。
①可通过 技术大量扩增pepA基因，该技术是利用 的原理。
②从酵母细胞中获得质粒以构建基因表达载体，质粒应具备的条件之一是 ，以便外源基因的插入。
③完成重组后，在对目的基因的检测与鉴定中，需在个体水平进行的鉴定是 。
9．（2023·高州模拟）下图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对（bp），质粒有5369个碱基对（bp）。请据图回答问题：
（1）质粒中“氨苄青霉素抗性基因”的作用是 。研究发现复制原点处的A和T特别多，有利于DNA复制时 过程的发生。
（2）限制酶BamHⅠ的识别序列和切割位点是G↓GATCC，该酶切形成的黏性末端是 。过程③所需的工具酶是 。
（3）已知图中质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后进行电泳，出现了一条长度为5300bp的DNA条带，则重组质粒的长度为 的DNA片段条带。
（4）过程①用两种限制酶切割质粒，与单一酶切相比，其优势有 。过程②通过PCR技术实现，进行PCR时，需要在两种引物的 端分别添加BamHⅠ和HindⅢ的识别序列。
（5）将重组质粒导入大肠杆菌前，要用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 ；进行筛选时，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、C源、N源、琼脂等物质外，还要分别添加 。
10．（2021高二下·渭滨期末）转基因技术的应用大大提高了动植物的品质，下图是绿色荧光蛋白转基因克隆猪培育示意图，据图和材料回答下列问题：
（1）过程①需要的工具酶有 。绿色荧光蛋白基因需要导入到成纤维细胞的 上才有可能培育出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
（2）猪胎儿成纤维细胞培养过程中，为了防止培养过程中的污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的 。
（3）通过过程⑤将早期胚胎移植到受体母猪体内能存活的原因是 。
（4）若是想在短期内获得更多的相同的绿色荧光蛋白转基因克隆猪该如何做？
（5）科学家将反义F3H序列导入到康乃馨中，降低了植株中F3H基因的表达量和酶活性，封锁了花青素合成途径，获得花香物质苯甲酸的释放量大大增加的转基因康乃馨。以上说明目的基因除了编码蛋白质的基因外，还可以是 。将目的基因导入植物细胞常用的方法是 。
四、培优
11．（2020高三下·安徽月考）[生物——选修3：现代生物科技专题]
VNN1基因(1542bp)与炎症相关性疾病有关，GFP基因(4735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光。某研究小组进行鼠源GFP－VNN1重组质粒的构建及其功能研究，回答下列问题：
（1）为构建重组质粒，研究小组从数据库查找到VNN1的DNA序列，并设计引物。上游引物：5'－AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC－3'(下划线为Hind III酶切位点)，下游引物：5'－GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA－3'(下划线为BamH I酶切位点)，之后进行PCR扩增，PCR的原理是 。扩增后的VNN1基因要与含GFP基因的载体连接，需用 (填具体酶)切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用 酶处理，构建重组质粒。
（2）GFP基因在重组质粒中可作为 ，其作用是 。用之前相同的限制酶对GFP－VNN1重组质粒切割后，进行电泳鉴定时得到如图1所示的部分条带，结果表明 。
（3）IL－6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应。图2为GFP－VNN1重组质粒对细胞分泌IL－6的影响，由此说明 ；同时发现与正常组比较，空质粒转染组IL－6的表达有轻微升高，造成这种现象的可能原因是 。
12．（2020高三上·如皋开学考）人乳铁蛋白（hLF）对细菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人员开展人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体构建及转染研究，主要流程如下图。RT-PCR过程需先进行逆转录合成DNA，然后再进行PCR。图中Ase I、Nhe I、Sal I、BamH I代表相关限制酶切点，neor为新霉素抗性基因，BLG基因为B乳球蛋白基因，GFP基因为绿色荧光蛋白基因。请回答：
（1）过程①中，不能从人肌肉细胞中提取RNA用于RT-PCR，是因为 。在RT-PCR过程中，加入的引物需在 端添加 两种限制酶的识别序列，以便于hLF基因插入pEB中。
（2）过程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是 。
（3）将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细胞应该是导入 的细胞，再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中 ，以筛选出转染成功的细胞。
（4）科研过程中，也可以用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转染后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增后进行DNA电泳，结果如图所示：1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照（提纯的目的基因片段），3号泳道为实验组。请问，标准（Marker）的实质为 ，3号泳道的杂带出现的原因一般有 （在下列选项中选择）。
①模板受到污染 ②引物的特异性不强 ③退火温度偏低 温度偏高
13．（2022高三上·张掖模拟）大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下（图中a链和b链分别是相应基因转录模板链）。分析回答下列问题：
（1）过程①中，PCR扩增sGFP的原理是 ，该过程除需要根据 设计特异性引物序列外，为保证sCFP正确插入质粒中，还需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为 。
（2）过程②需要的工具酶是 。研究中将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是 。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，再加入潮霉素溶液，潮霉素不能与培养基一同灭菌的原因是 。
（4）选择过程③筛选培养得到的不同农杆菌菌落，分别提取细菌质粒DNA，并用BamHI和HindⅢ完全酶切，可以得到 种长度不同的DNA片段。
（5）将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测 筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
14．（2022高二下·盐城期末）为探究某病菌对棉花的侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转化该种病菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，并让其感染棉花植株，主要过程如下图。其中a链和b链分别是相应基因转录的模板链。相关限制酶识别序列和切割位点为：Hid Ⅲ——5 'G↓GATCC3'；BamH Ⅰ——5'A↓AGCTT3'。请回答下列问题：
（1）过程②操作时，除图中标注物质外，还需要用 向微量离心管中加入 、 、 和水。至少需经过 次扩增可获得8条长度为0.7Kb的脱氧核苷酸链。为保证sGFP正确插入到质粒中，还需要在引物1的5'端添加限制酶 的识别序列，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为 。
（2）过程③需要的工具酶是 。经过过程①③可获得长度为 Kb和4.2Kb的两种重组环状DNA．过程⑤中通过 淘汰只导入不符合要求的重组环状DNA的受体菌。
（3）过程④常采用的方法是 。
15．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用____。
A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’
（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有____。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
16．（2022高三上·广东月考）Cre - loxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。科学家把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建如图2所示的表达载体T，在Cre酶的作用下，一部分荧光蛋白基因会被随机地“剪掉”，而剩下的部分得以表达，这样就可以随机呈现不同的颜色。这种利用荧光蛋白“点亮”神经元的大脑成像技术被称为“脑彩虹”，能帮助科学家了解大脑。
（1）loxP序列具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是 （填序号）。
（2）构建表达载体T需要用到 酶，用 法将表达载体T导入小鼠的 细胞中，经筛选后获得细胞中含一个表达载体T的转基因小鼠a（不含Cre酶）。小鼠a的脑组织细胞和其他组织细胞的色彩分别是 和 。
（3）已知两个loxrP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次。研究者将Cre酶基因与病毒基因重组构建Cre病毒，然后将Cre病毒注入细胞中含一个表达载体T的转基因小鼠A体内，出现“脑彩虹”现象，小鼠A的一个脑细胞的色彩为 。
（4）利用上述技术可以培育能够在一个细胞内随机出现两种颜色的“脑彩虹”小鼠，请依据题目信息，简要写出设计思路。
17．（2022高三上·莆田月考）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如图1所示。回答下列问题：
（1）构建重组病毒时用的 Hind Ⅲ 和BamH I都是 酶。
（2）为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，选用引物组合 进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因 (填“有”或“没有”)插入病毒ASFV的K基因。
（3）为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种 。支持“重组病毒成功表达”的实验结果为： 。
（4）同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明 。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
答案解析部分
1．【答案】（1）含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
（2）终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【知识点】遗传信息的翻译；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因文库是指含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
故答案为：含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
（2）图中结构是基因表达载体，GFP突变基因是目的基因，目的基因位于启动子和终止子之间，所以初步确定①、②是启动子或者终止子。由于箭头指的是目的基因转录的方向，②位于目的基因的上游，①位于目的基因的下游，所以可判断①是终止子，②是启动子。启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
故答案为：终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
（3）由于密码子具有简并性，不同的密码子可能决定相同的氨基酸，所以GFP突变的基因转录出的mRNA与原来正常基因转录出的mRNA翻译出的蛋白质仍然可能是相同的。因此从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性。
故答案为：密码子具有简并性。
（4）题干信息指出要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，那么就需要将目的基因YFP插入到运载体上构建基因表达载体，再将其导入基因工程中常用的真核生物（如酵母菌）体内从而让目的基因在真核生物体内表达，因此实验思路是：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
故答案为：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
【分析】1、将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包含一种生物所有基因的文库，叫做基因组文库。包含一种生物的一部分基因的文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。
2、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。
3、简并性：绝大多数氨基酸都有几个密码子的现象。意义：（1）当密码子中有一个碱基发生改变时，由于密码子的简并，可能并不会改变其对应的氨基酸。（2）当某种氨基酸使用频率高时，几种不同的密码子都编码一种氨基酸可保证翻译的效率。
2．【答案】（1）平；一段已知目的基因的核苷酸序列；GGATCC
（2）BamHⅠ；DNA连接
（3）四环素；不发出绿色荧光
（4）反转录或逆转录；目的基因未在受体菌转录或未表达
【知识点】基因工程的应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)从表格中看出用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有平末端；PCR扩增目的基因，需要根据一段已知目的基因的核苷酸序列设计出引物；构建P1时，EcoRⅤ会破坏复制原点，Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，所以只能选择BamHⅠ，还需要在引物的一端加上GGATCC序列。(2)限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，而EcoRⅤ酶破坏复制原点，所以需要用BamHⅠ酶进行切割，切割后的目的基因在连接酶的作用下形成P1。(3)为了筛选含有质粒P1的菌落，由于标记基因是四环素抗性基因，所以需采用添加了四环素的培养基平板进行培养，在紫外光激发下，由于使用BamHⅠ酶破坏了GFP基因，故答案为：不发绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。(4)所得菌落的RNA通过逆转录(反转录)获得DNA，再进行PCR扩增；若最终未能检测出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受体菌中转录。
【分析】基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、质粒。
1、基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、质粒；
2、限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
3、DNA连接酶：缝合DNA片段的磷酸二酯键。
3．【答案】（1）限制性核酸内切酶、DNA连接酶；标记基因；启动子
（2）筛选出导入目的基因的胚胎干细胞
（3）早期胚胎或原始性腺
（4）内细胞团；同期发情处理
（5）抗原—抗体杂交
【知识点】基因工程的应用；胚胎干细胞及其应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)构建表达载体需要的酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，需要用限制性核酸内切酶将目的基因和运载体切开，然后用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来。表达载体包含目的基因绿色荧光蛋白基因Gfp、终止子和复制原点外还需要有启动子和标记基因。（2）因为重组质粒中含有抗生素的抗性基因，所以在步骤③添加G418的目的是筛选出导入目的基因的胚胎干细胞。（3）胚胎干细胞的来源有两个，早期胚胎或原始性腺。（4）步骤⑤导入受体细胞使要将细胞注射入图中囊胚的内细胞团，因为它具有发育的全能性。图中步骤⑥胚胎移植前要对代孕母鼠用激素处理，目的是进行同期发情处理，使生理状况相同。（5）在蛋白质水平上检测目的基因是否表达利用抗原-抗体杂交技术，如果出现杂交带说明表达成功。
【分析】分析题图，①表示基因表达载体的构建过程，②表示将表达载体导入胚胎干细胞，③表示胚胎干细胞的体外培养过程，④表示虫卵，⑤表示将胚胎干细胞团注入囊胚，⑥表示胚胎移植过程。
干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞就是胚胎干细胞。胚胎干细胞具有很强的分化能力，可以无限增加，并且可以分化成全身200多种细胞类型，也就是说它能长成动物的任何组织和器官。
目的基因的鉴定：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其中的遗传特性，只有通过检测和鉴定得知。
①分子检测：检测DNA：DNA分子杂交；检测RNA：分子杂交；检测蛋白质：抗原——抗体
②个体检测：例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
4．【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶；使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
（2）基因表达载体的构建；限制酶、DNA连接酶
（3）Ca2+
（4）液体培养基；中性或弱碱性
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR体系中需要加入DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等物质，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，该过程需要限制酶、DNA连接酶的参与。
（3）受体细胞是细菌时，转化前应用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，提高转化效率。
（4）利用转基因大肠杆菌生产绿色荧光蛋白时，培养基应选用液体培养基，pH应调至中性或弱碱性。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——感受态细胞法：适用于微生物。Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
5．【答案】（1）荧光蛋白；PCR
（2）基因表达载体；限制酶和DNA连接酶
（3）单一个体；防止杂菌污染；湿热灭菌
（4）蛋白质
【知识点】微生物的分离和培养；蛋白质工程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）“细菌画”是用表达不同荧光蛋白的转基因细菌在固体培养基上制作图案，说明这些细菌能够发光的原因是其细胞内导入了荧光蛋白基因，获取该基因的方法有人工合成、PCR扩增等。
故填：荧光蛋白；PCR。
（2）研究人员获得了足够量的该基因后，下一步需要构建基因表达载体，这是培育出转基因细菌的核心工作，该过程需要利用同种限制酶切割载体和目的基因，并用DNA连接酶将二者相连，因此该过程用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。
故填：基因表达载体；限制酶和DNA连接酶。
（3）纯培养物是指由单一个体繁殖所获得的微生物群体，培养过程中关键是防止杂菌污染，常采用湿热灭菌法对培养基进行灭菌。
故填：单一个体；防止杂菌污染；湿热灭菌。
（4） 最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造现有的绿色荧光蛋白获得黄色荧光蛋白。对荧光蛋白分子的设计和改造过程属于蛋白质工程。
故填：蛋白质。
【分析】1、基因工程技术的基本操作流程：
①目的基因的筛选与获取：从已知结构的基因中进行筛选，然后可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
②基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
③将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；导入植物细胞一般选用农杆菌转化法，导入动物细胞采用显微注射技术，导入微生物细胞用钙离子处理使其处于感受态。
④目的基因的检测与鉴定。
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构与功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
6．【答案】（1）平
（2）PCR；GATC
（3）BamHⅠ；DNA连接
（4）四环素；不发出
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)根据表中EcoRⅤ的识别序列及切割位点可知，该酶切割目的基因获得平末端。(2)体外扩增目的基因可采用PCR技术；由P0上的限制酶切割位点分析可知，若用限制酶Sau3AⅠ切割会同时破坏GFP基因和四环素抗性基因，而用限制酶BamHⅠ切割只会破坏GFP基因，因此过程③中，P0需用限制酶BamHⅠ切割，由于Sau3AⅠ和BamHⅠ切割形成的黏性末端相同，都是5'-GATC-3'，由此可知，该过程设计的引物5'端序列必须是GATC，以获得相应的黏性末端，便于P1的构建和筛选。(3)P0用BamHⅠ切割与目的基因在DNA连接酶的作用下形成 P1。(4)用限制酶BamHⅠ切割P0会破坏GFP基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此为了筛选出含有P1的菌落，需采用添加四环素的培养基进行培养，在紫外光激发下不发出绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。
【分析】 1、两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
2、PCR扩增技术中文名称为聚合酶链式反应，关于PCR技术扩增目的基因简介：
（1）原理：DNA双链可以进行半保留复制；
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成；
（3）条件：模板，引物（进行PCR操作的前提），热稳定DNA聚合酶（taqDNA聚合酶）；
（4）特点：使微量的DNA大幅增多。
3、限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
7．【答案】（1）启动子；终止子；标记
（2）限制酶、DNA连接酶；农杆菌转化
（3）全能；植物组织培养；在荧光显微镜下观察幼苗根尖细胞，若观察到绿色荧光，则说明融 合基因导入成功
（4）乙
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）
能驱动基因转录出mRNA的是启动子，能使转录在所需要的地方停下来的是终止子。在GFP—RGA融合基因中，GFP基因是绿色荧光蛋白基因，其作用是作为标记基因。
（2）
根据题意，融合基因是将两个或多个基因首尾相连，故构建融合基因时需要限制酶、DNA连接酶等工具酶，将基因表达载体导入植物细胞用农杆菌转化法，所以将融合基因导入拟南芥细胞时常用农杆菌转化法。
（3）
转融合基 因拟南芥细胞具有全能性，因而通过植物组织培养技术能使其发育成转基因植株。从个体水平检测融合基 因是否导入成功的实验思路：在荧光显微镜下观察幼苗根尖细胞，若观察到绿色荧光，则说明融合基因导入成功。
（4）
分析题干可知，植物中的生长素能通过赤霉素使RGA降解，在导入了绿色荧光蛋白（GFP）基因的转基因拟南芥植株中，GFP随RGA的分解而分解，则不能在荧光显微镜下观察到绿色。幼芽和幼叶是生长素的主要产生部位，甲组和丙组都有生长素，故能使被赤霉素处理过的植株中的RGA降解，GFP也随之分解，不能出现绿色荧光；而乙组去幼芽、幼叶，不能合成生长素，故不能使被赤霉素处理过的植株中的RGA降解；预期能观察到绿色荧光的是乙组。
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测及个体水平上的鉴定如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
8．【答案】（1）启动子和终止子
（2）氨苄青霉素；基因表达载体（目的基因表达载体和不含目的基因的载体）
（3）通过绿色荧光确定融合蛋白成功表达
（4）PCR；DNA复制；含有一个至多个限制酶酶切位点；检测使用转基因酿酒酵母进行发酵比传统酵母发酵是否可以降低酒的浑浊度
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，则需要将cotB和gfp一起表达，因此共用的结构是一个启动子和终止子，才能通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达。
（2）由于表达载体中含有Ampr基因，则若转基因成功，能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以可以将芽孢杆菌接种在含有氨苄青霉素的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的选择培养；培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含空载体（不含目的基因的载体、不含外源基因的载体）的单菌落，故该固体培养基上以获得含有基因表达载体（或目的基因表达载体）不含目的基因的载体的受体细胞。
（3）绿色荧光蛋白基因（gfp）能合成绿色荧光蛋白，将cotB基因与gfp基因重组的目的是通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达。
（4）①可通过PCR技术大量扩增pepA基因，该技术是利用DNA复制的原理。
②从酵母细胞中获得质粒以构建基因表达载体，质粒应具备的条件之一是含有一个至多个限制酶酶切位点，以便外源基因的插入。
③完成重组后，在对目的基因的检测与鉴定中，需在个体水平进行的鉴定是检测使用转基因酿酒酵母进行发酵比传统酵母发酵是否可以降低酒的浑浊度。
【分析】1、基因表达载体的构建：（1）过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。（2）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。（3）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
9．【答案】（1）便于筛选目的基因是否导入受体细胞；解旋
（2）—CTAG；DNA连接酶
（3）6020bp
（4）可以避免目的基因自身环化；可使目的基因定向插入到运载体中；5'
（5）使大肠杆菌处于感受态（或处于容易吸收DNA的状态）；四环素、氨苄青霉素
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）氨苄青霉素抗性基因属于标记基因，质粒中标记基因的作用都是，便于筛选目的基因是否导入受体细胞；AT碱基对之间形成两个氢键，C和G之间形成三个氢键，AT对多便于解旋。
（2）限制酶BamH的识别序列和切割位点是G↓GATCC，则该酶切割DNA后形成的黏性末端是—CTAG，过程③表示切割后的目的基因和质粒发生重组，该过程需要DNA连接酶。
（3） 根据题意可知，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对 (bp），质粒有5369个碱基对 (bp)，质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后进行电泳，出现了一条长度为5300bp的DNA条带，说明5300bp的DNA条带是原质粒中切去部分片段的质粒；重组质粒的长度=5300+720=6020kb。
（4）用同一种酶切割目的基因和质粒，可形成相同的黏性末端，在质粒和目的基因连接的时候可能出现反向连接，目的基因和质粒也能出现自身环化的可能性；故用两种限制酶切割质粒，与单一酶切相比，可以避免目的基因自身环化；可使目的基因定向插入到运载体中。
（5）CaCl2处理大肠杆菌后，大肠杆菌会处于容易吸收DNA的状态，也即是处于感受态。图中的标记基因有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因已经被破坏，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、C源、N源、琼脂等物质外，分别添加四环素、氨苄青霉素，选择抗氨苄青霉素而不抗四环素的即为需要的目的菌株。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3、“分子缝合针”-DNA连接酶
两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。②区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
10．【答案】（1）限制酶和DNA连接酶；染色体DNA
（2）抗生素
（3）受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应
（4）对早期胚胎进行分割移植
（5）调控作用因子；农杆菌转化法
【知识点】动物细胞培养技术；胚胎移植；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）过程①表示基因表达载体的构建，需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。绿色荧光蛋白基因需要导入到成纤维细胞的染色体DNA上才有可能培育出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
（2）猪胎儿成纤维细胞培养过程中，培养液中通常加入抗生素的目的是防止培养液被污染，培养液含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。
（3）早期胚胎移植时，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体母猪体内的存活提供了可能。
（4）来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，所以将早期胚胎进行胚胎分割移植可以获得更多相同的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
（5）科学家将反义F3H序列导入到康乃馨中，降低了植株中F3H基因的表达量和酶活性，封锁了花青素合成途径，获得花香物质苯甲酸的释放量大大增加的转基因康乃馨。以上说明目的基因除了编码蛋白质的基因外，还可以是调控作用因子。因为导入的对象是植物细胞，而土壤农杆菌易侵染植物细胞，故一般用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。
【分析】1、基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
2、动物细胞培养条件：
（1）营养：培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，通常需要加入血清等天然成分。
（2）无菌、无毒的环境。
（3）温度、pH和渗透压。
（4）气体环境：氧气是细胞代谢所必需的，二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH。动物细胞培养需要将培养瓶置于含95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养。
11．【答案】（1）DNA双链复制；HindⅢ酶和BamH Ⅰ酶；DNA连接
（2）标记基因；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来；VNN1基因已插入到含GFP基因的载体中
（3）VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子ⅠL—6；操作过程中对细胞的损伤（或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用），可以激活相应细胞分泌炎症因子ⅠL—6
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1） PCR的原理是DNA双链复制 ； 本题中，HindⅢ酶和BamH Ⅰ酶 是目的基因的“剪刀”， DNA连接 酶是基因工程的“缝合针”；
（2）GFP基因(4735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光 ， GFP基因在重组质粒中可作为标记基因 ；其重要作用是 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 ； 电泳鉴定时 ，分子质量增加，表面基因构建成功， VNN1基因已插入到含GFP基因的载体中；
（3）图2显示IL－6 在 GFP－VNN1重组质粒 组中浓度升高， IL－6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应由此说明VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子ⅠL—6 ； 细胞的损伤（或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用），可以激活相应细胞分泌炎症因子ⅠL—6 。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、质粒；
（1）限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
（2）DNA连接酶：缝合DNA片段的磷酸二酯键；
（3）载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入，具有启动子和终止子；
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
12．【答案】（1）hLF基因在人肌肉细胞中不表达；5’；SalⅠ和BamHⅠ
（2）使hLF基因在山羊乳腺细胞中表达（使目的基因表达）
（3）pEB质粒、pEBL质粒（普通质粒和重组质粒）；是否有绿色荧光
（4）不同已知长度的DNA片段混合物；①②③
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由于hLF基因在人肌肉细胞中不转录（表达），因此①过程中不能从人肌肉细胞中提取RNA用于RT-PCR，根据②过程构建的重组质粒中目的基因两侧限制酶的识别序列可知，在RT-PCR过程中，加入的引物需在5'端添加Sal I和BamH I两种限制酶的识别序列，以便于hLF基因插入pEB中。
（2）过程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是使人乳铁蛋白基因在山羊的乳腺细胞中表达。
（3）将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细胞应该是导入pEB质粒或pEBL质粒的细胞，再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中是否有绿色荧光，以筛选出转染成功的细胞。
（4）标准（Marker）的实质为不同已知长度的DNA片段混合物，3号泳道的杂带出现的原因可能是模板受到污染、引物的特异性不强、退火温度偏低，即①②③。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶：①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
13．【答案】（1）DNA双链复制；sGFP两端的核苷酸序列；AGCT
（2）DNA连接酶；保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
（3）潮霉素在高温灭菌时结构会被破坏
（4）3
（5）大丽轮枝菌细胞中绿色荧光的强度
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR扩增sGFP的原理是DNA双链复制，由于DNA的两条链反向平行，且DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5'→3'方向延伸，所以该过程需要根据sGFP两端（3'端）核苷酸（或碱基）序列设计特异性引物序列。为了保证sGFP正确插入质粒中，还需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，由于质粒大片段是利用HindⅢ和BamHI共同切割得到的质粒的长片段，所以b链5'端是利用HindⅢ切割形成的黏性末端，根据HindIⅢI识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为AGCT。
（2）过程②为构建重组DNA，需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的潮霉素溶液，以防止杂菌污染。由于潮霉素在高温灭菌时结构会被破坏，不能发挥选择作用，所以潮霉素不能与培养基一同灭菌。
（4）根据质粒中BamHI和HindⅢ的识别位点以及用BamHI和HindⅢ酶切后得到的质粒大片段为3500bp，可知质粒小片段应为3750-3500=250（bp）。sGFP的基因长度为720bp，质粒大片段为3500bp，二者连接后的长度为3500+720=4220（bp）。用BamHI和HindⅢ完全酶切后会形成4220bp，3500bp和720bp三种长度不同的DNA片段。
（5）转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。其中人工合成方法中包括反转录法，即可先提取人体细胞中的mRNA，以其作为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA（或DNA）．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术，方法是采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
14．【答案】（1）微量移（或取）液器；缓冲液；原料（（或dNTP混合物）；Taq酶（或热稳定的DNA聚合酶）；3；BamH I；GATC
（2）限制酶和DNA连接酶；0.95；培养基中添加潮霉素
（3）用Ca2+处理
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)在微量离心管中添加各种试剂时，需要用到微量移（或取）液器。PCR的条件是模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等，因此需要向微量离心管中加入缓冲液、原料（（或dNTP混合物）、Taq酶（或热稳定的DNA聚合酶）和水。DNA复制是半保留方式复制，据题意可知，该DNA复制三次后的DNA为：
，因此至少经过3次扩增获得8条长度为0.7Kb的脱氧核苷酸链。据图可知，质粒上启动子和终止子之间的限制酶切位点是Hid Ⅲ和BamH Ⅰ，因此目的基因也应该在引物1的5'端用BamH I切割才能连接起来，因此还需要在引物1的5'端添加限制酶BamH I的识别序列，从图中可以看出b链端是用Hid Ⅲ切割后形成的，根据图中Hid Ⅲ识别的碱基序列可以推知b链的碱基序列为 GATC。
(2)据图可知，过程③是基因表达载体的构建，需要将目的基因和质粒用相同的限制酶进行酶切，然后用DNA连接酶连接起来，因此此过程需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶。据图可知，质粒的长度为3.75kb，经双酶切后形成长度为0.25kb和3.5kb片段，与目的基因（0.7kb）l连接后，能形成0.25kb+0.7kb=0.95 kb和3.5kb+0.7kb=4.2kb的重组环状DNA。据图可知，该质粒中的标记基因是潮霉素抗性基因，因此检测是否导入符合要求的重组环状DNA的受体菌，需要通过培养基中添加潮霉素淘汰。
(3)将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，因此常用的方法是用Ca2+处理。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——感受态细胞法：适用于微生物。Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
15．【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物；延伸的时间和退火的温度
（2）B；C
（3）限制性核酸内切酶（限制酶）
（4）A；B；C
（5）P3、P4
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR反应体系中包括DNA模板，耐高温的DNA聚合酶、引物和四种脱氧核苷酸，引物是根据扩增的基因序列设计的，据此推测，分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物；扩增步骤包括变性、退火、延伸，扩增的DNA片段长度不同，则延伸设置的时间不同，所使用的引物不同，则退火的温度也可能不同，所以扩增程序中最主要的不同是延伸的时间和退火的温度。
（2）由图分析可知，引物F2-F与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧相同，所以引物F2-F对应的序列是C选项；同理，引物F1-R与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧互补，所以引物F1-R对应的序列是D选项。
故答案为：CD。
（3）传统重组质粒构建过程需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶，而题干中的过程使用的是重组酶，所以这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶。
（4）当通过稀释涂布平板法接种后，对微生物进行计数时，需要控制每个平板30~300个菌落，但本实验的目的是筛选出转化成功的大肠杆菌，所以不用控制每个平板的菌落数，A符合题意；一般是先将培养基冷却后，再进行接种，所以抗性平板上未长出菌落的原因不可能是培养基温度太高所致，B符合题意；转化后的大肠杆菌采用含有抗生素的培养基筛选，只有转化成功的大肠杆菌才能在该培养基上生长，而未转化成功的大肠杆菌和其它杂菌无法生长，所以抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C符合题意；单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物，所以抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D不符合题意。
故答案为：ABC。
（5）由图可知，EGFP和AnB1的长度总和是720＋390＝1110bp，电泳结果显示，P1和P2片段长度接近该值，而P3没有条带，P4片段长度显著小于该值，所以可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，所以对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
【分析】一、PCR技术
1、PCR技术是体外扩增目的基因的技术，是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
2、条件
DNA母链：提供DNA复制的模板； 酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）； 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸； 原料：四种脱氧核糖核苷酸。
二、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
三、 微生物的分离纯化一般可用平板划线法或稀释涂布平板法，其中平板划线法使用接种环等进行接种，不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法使用涂布器等进行接种，可用于微生物的计数，在样品稀释时，要保证计数用的平板中的菌落数落在30-300之间。
16．【答案】（1）②
（2）限制酶和DNA连接；显微注射；受精卵；红色；无色
（3）红色或黄色或蓝色
（4）设法使小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色随机出现决定
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据图中loxP1的碱基序列可以看出，其中①③序列的碱基序列是相同的，即根据这两个片段无法看出loxP1的方向性，因此，loxP1序列的方向性由序列②决定。
（2）基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理。将目的基因导入动物细胞，常用显微注射法，且为了培育转基因动物，通常用小鼠的受精卵细胞作为受体细胞。图2中信息提示为表达载体T中仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因，且表达载体T中不含Cre酶，因此含图二的表达载体T的小鼠a 的脑组织细胞色彩为红色，而其他组织细胞因为该基因不表达，而表现为无色。
（3）小鼠A有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，loxP1、loxP2位置如图二黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色；也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色；有可能敲除两个loxP2之间的红色 和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色。因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，即小鼠A的一个脑细胞的色彩为红色或黄色或蓝色。
（4）当小鼠脑细胞内有一个表达载体T时，注入含Cre酶的病毒后，会使小鼠的一个脑细胞中出现红色或黄色或蓝色，为了达到在一个细胞内随机出现两种或两种以上颜色叠加的目的，可设计思路为设法使小鼠脑组织细胞内有多个相同的图2所示DNA片段，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内多个荧光蛋白的颜色叠加而成。
【分析】1、基因表达载体的构建：（1）过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。（2）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。（3）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
17．【答案】（1）限制性核酸内切（或限制）
（2）引物1和引物4；有
（3）重组病毒；B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性
（4）Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）构建重组病毒时用的Hind Ⅲ和BamH I都是限制性内切核酸（或限制）酶，可以识别并切割特定的DNA序列。
（2）为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，据图分析，选用引物组合引物1和引物4进行PCR扩增可获得完整的Gluc基因和EGFP基因序列；扩增结果有1、2两种类型，如图2所示，该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因有插入病毒ASFV的K基因，因K基因大小约790bp（类型1），而插入成功的应大于790bp（类型2，约1758）。
（3）为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，根据对照原则，其中A组接种病毒ASFV，B组接种重组病毒。若B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性，则说明“重组病毒成功表达”。
（4）同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
【分析】1、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）：
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
3、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
1 / 12023年高考生物全国乙卷真题变式·分层精准练：第12题
一、原题
1．（2023·全国乙卷）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】（1）含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
（2）终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【知识点】遗传信息的翻译；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因文库是指含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
故答案为：含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
（2）图中结构是基因表达载体，GFP突变基因是目的基因，目的基因位于启动子和终止子之间，所以初步确定①、②是启动子或者终止子。由于箭头指的是目的基因转录的方向，②位于目的基因的上游，①位于目的基因的下游，所以可判断①是终止子，②是启动子。启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
故答案为：终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
（3）由于密码子具有简并性，不同的密码子可能决定相同的氨基酸，所以GFP突变的基因转录出的mRNA与原来正常基因转录出的mRNA翻译出的蛋白质仍然可能是相同的。因此从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性。
故答案为：密码子具有简并性。
（4）题干信息指出要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，那么就需要将目的基因YFP插入到运载体上构建基因表达载体，再将其导入基因工程中常用的真核生物（如酵母菌）体内从而让目的基因在真核生物体内表达，因此实验思路是：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
故答案为：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
【分析】1、将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包含一种生物所有基因的文库，叫做基因组文库。包含一种生物的一部分基因的文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。
2、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。
3、简并性：绝大多数氨基酸都有几个密码子的现象。意义：（1）当密码子中有一个碱基发生改变时，由于密码子的简并，可能并不会改变其对应的氨基酸。（2）当某种氨基酸使用频率高时，几种不同的密码子都编码一种氨基酸可保证翻译的效率。
二、基础
2．（备考2021年新高考生物二轮复习专题15 基因工程和细胞工程）荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体(P1)的筛选和鉴定。部分过程如下图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题。
（1）过程①中用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有 末端，过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，前提是要根据 ，设计出引物，此外还需在引物的一端加上 序列，以便于P1的构建和筛选。
（2）过程③中，质粒P0需用限制酶 切割，才能与扩增出的目的基因在 酶作用下形成P1。
（3）为了筛选出含有质粒P1的菌落，需采用添加 的培养基平板进行培养，在紫外光激发下 的菌落，即为含有P1的菌落。
（4）提取经上述筛选所得菌落的RNA，通过 获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是 。
【答案】（1）平；一段已知目的基因的核苷酸序列；GGATCC
（2）BamHⅠ；DNA连接
（3）四环素；不发出绿色荧光
（4）反转录或逆转录；目的基因未在受体菌转录或未表达
【知识点】基因工程的应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)从表格中看出用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有平末端；PCR扩增目的基因，需要根据一段已知目的基因的核苷酸序列设计出引物；构建P1时，EcoRⅤ会破坏复制原点，Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，所以只能选择BamHⅠ，还需要在引物的一端加上GGATCC序列。(2)限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，而EcoRⅤ酶破坏复制原点，所以需要用BamHⅠ酶进行切割，切割后的目的基因在连接酶的作用下形成P1。(3)为了筛选含有质粒P1的菌落，由于标记基因是四环素抗性基因，所以需采用添加了四环素的培养基平板进行培养，在紫外光激发下，由于使用BamHⅠ酶破坏了GFP基因，故答案为：不发绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。(4)所得菌落的RNA通过逆转录(反转录)获得DNA，再进行PCR扩增；若最终未能检测出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受体菌中转录。
【分析】基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、质粒。
1、基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、质粒；
2、限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
3、DNA连接酶：缝合DNA片段的磷酸二酯键。
3．（2017高二下·无锡期中）如图为绿色荧光小鼠制备流程图，Gfp是绿色荧光蛋白基因，请分析回答：
（1）构建表达载体需要的酶是： ，表达载体包含绿色荧光蛋白基因Gfp、 、 、终止子和复制原点等。
（2）图中载体上的Neo基因是一种抗生素抗性基因，图中步骤③所用的G418是一种抗生素(对细胞有毒害作用)，添加G418的目的是 。
（3）图中所用的胚胎干细胞来自 。
（4）图中步骤⑤要将细胞注射入图中囊胚的 位置，图中步骤⑥胚胎移植前要对代孕母鼠用激素处理，目的是 。
（5）可以使用 方法在蛋白质水平上鉴定小鼠是否存在绿色荧光蛋白。
【答案】（1）限制性核酸内切酶、DNA连接酶；标记基因；启动子
（2）筛选出导入目的基因的胚胎干细胞
（3）早期胚胎或原始性腺
（4）内细胞团；同期发情处理
（5）抗原—抗体杂交
【知识点】基因工程的应用；胚胎干细胞及其应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)构建表达载体需要的酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，需要用限制性核酸内切酶将目的基因和运载体切开，然后用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来。表达载体包含目的基因绿色荧光蛋白基因Gfp、终止子和复制原点外还需要有启动子和标记基因。（2）因为重组质粒中含有抗生素的抗性基因，所以在步骤③添加G418的目的是筛选出导入目的基因的胚胎干细胞。（3）胚胎干细胞的来源有两个，早期胚胎或原始性腺。（4）步骤⑤导入受体细胞使要将细胞注射入图中囊胚的内细胞团，因为它具有发育的全能性。图中步骤⑥胚胎移植前要对代孕母鼠用激素处理，目的是进行同期发情处理，使生理状况相同。（5）在蛋白质水平上检测目的基因是否表达利用抗原-抗体杂交技术，如果出现杂交带说明表达成功。
【分析】分析题图，①表示基因表达载体的构建过程，②表示将表达载体导入胚胎干细胞，③表示胚胎干细胞的体外培养过程，④表示虫卵，⑤表示将胚胎干细胞团注入囊胚，⑥表示胚胎移植过程。
干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞就是胚胎干细胞。胚胎干细胞具有很强的分化能力，可以无限增加，并且可以分化成全身200多种细胞类型，也就是说它能长成动物的任何组织和器官。
目的基因的鉴定：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其中的遗传特性，只有通过检测和鉴定得知。
①分子检测：检测DNA：DNA分子杂交；检测RNA：分子杂交；检测蛋白质：抗原——抗体
②个体检测：例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
4．（2022高三上·山东月考）绿色荧光蛋白是科学家在水母细胞中发现的由238个氨基酸组成的蛋白质，被广泛应用于分子示踪和生物标记。科研人员利用基因工程获得转基因大肠杆菌，再通过发酵技术生产绿色荧光蛋白。请回答下列问题：
（1）利用PCR从水母基因组中扩增绿色荧光蛋白基因时，需要加入水母基因组DNA、引物、4种脱氧核苷酸、 缓冲液等物质，其中引物的作用是 。
（2）获得转基因大肠杆菌的核心步骤是 ，该过程所需要的酶有 。
（3）为提高转化效率，转化前需用 对大肠杆菌进行处理。
（4）利用转基因大肠杆菌生产绿色荧光蛋白时，培养基应选用 （填“液体培养基”或“固体培养基”），pH应调至 。
【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶；使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
（2）基因表达载体的构建；限制酶、DNA连接酶
（3）Ca2+
（4）液体培养基；中性或弱碱性
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR体系中需要加入DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等物质，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，该过程需要限制酶、DNA连接酶的参与。
（3）受体细胞是细菌时，转化前应用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，提高转化效率。
（4）利用转基因大肠杆菌生产绿色荧光蛋白时，培养基应选用液体培养基，pH应调至中性或弱碱性。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——感受态细胞法：适用于微生物。Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
5．（2023高二下·哈尔滨期末）“细菌画”是借助微生物培养技术，用表达不同荧光蛋白的转基因细菌在固体培养基上制作图案，从而绘制出精美画作的活动。请分析回答下列问题：
（1）这些细菌能够发光的原因是其细胞内导入了 基因，获取该基因的方法有人工合成、 等。
（2）研究人员获得了足够量的该基因后，下一步需要构建 ，这是培育出转基因细菌的核心工作，该过程用到的工具酶有 。
（3）获得纯净的微生物培养物是绘制精美画作的前提。纯培养物是指由 繁殖所获得的的微生物群体，培养过程中关键是 ，常采用 法对培养基进行灭菌。
（4）最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造现有的绿色荧光蛋白获得黄色荧光蛋白。对荧光蛋白分子的设计和改造过程属于 工程。
【答案】（1）荧光蛋白；PCR
（2）基因表达载体；限制酶和DNA连接酶
（3）单一个体；防止杂菌污染；湿热灭菌
（4）蛋白质
【知识点】微生物的分离和培养；蛋白质工程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）“细菌画”是用表达不同荧光蛋白的转基因细菌在固体培养基上制作图案，说明这些细菌能够发光的原因是其细胞内导入了荧光蛋白基因，获取该基因的方法有人工合成、PCR扩增等。
故填：荧光蛋白；PCR。
（2）研究人员获得了足够量的该基因后，下一步需要构建基因表达载体，这是培育出转基因细菌的核心工作，该过程需要利用同种限制酶切割载体和目的基因，并用DNA连接酶将二者相连，因此该过程用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。
故填：基因表达载体；限制酶和DNA连接酶。
（3）纯培养物是指由单一个体繁殖所获得的微生物群体，培养过程中关键是防止杂菌污染，常采用湿热灭菌法对培养基进行灭菌。
故填：单一个体；防止杂菌污染；湿热灭菌。
（4） 最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造现有的绿色荧光蛋白获得黄色荧光蛋白。对荧光蛋白分子的设计和改造过程属于蛋白质工程。
故填：蛋白质。
【分析】1、基因工程技术的基本操作流程：
①目的基因的筛选与获取：从已知结构的基因中进行筛选，然后可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
②基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
③将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；导入植物细胞一般选用农杆菌转化法，导入动物细胞采用显微注射技术，导入微生物细胞用钙离子处理使其处于感受态。
④目的基因的检测与鉴定。
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构与功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
三、提高
6．（高中生物人教版（2019）选择性必修三3.2 基因工程的基本操作程序 同步练习）荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体(P1)的筛选和鉴定。部分过程如下图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。请回答下列问题。
（1）过程①中，用EcoRⅤ切割目的基因获得 末端。
（2）过程②是利用 技术，多次循环扩增DNA片段；根据P0上的限制酶切割位点，需要在目的基因两端重设限制酶切割位点，则在扩增目的基因时，设计的引物5'端序列必须是 ，以获得相应的黏性末端，便于P1的构建和筛选。
（3）过程③中，P0需用限制酶 切割，才能与目的基因在 酶的作用下形成P1。
（4）为了筛选出含有P1的菌落，需采用添加 的培养基进行培养，在紫外光激发下 (选填“发出”或“不发出”)绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。
【答案】（1）平
（2）PCR；GATC
（3）BamHⅠ；DNA连接
（4）四环素；不发出
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)根据表中EcoRⅤ的识别序列及切割位点可知，该酶切割目的基因获得平末端。(2)体外扩增目的基因可采用PCR技术；由P0上的限制酶切割位点分析可知，若用限制酶Sau3AⅠ切割会同时破坏GFP基因和四环素抗性基因，而用限制酶BamHⅠ切割只会破坏GFP基因，因此过程③中，P0需用限制酶BamHⅠ切割，由于Sau3AⅠ和BamHⅠ切割形成的黏性末端相同，都是5'-GATC-3'，由此可知，该过程设计的引物5'端序列必须是GATC，以获得相应的黏性末端，便于P1的构建和筛选。(3)P0用BamHⅠ切割与目的基因在DNA连接酶的作用下形成 P1。(4)用限制酶BamHⅠ切割P0会破坏GFP基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此为了筛选出含有P1的菌落，需采用添加四环素的培养基进行培养，在紫外光激发下不发出绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。
【分析】 1、两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
2、PCR扩增技术中文名称为聚合酶链式反应，关于PCR技术扩增目的基因简介：
（1）原理：DNA双链可以进行半保留复制；
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成；
（3）条件：模板，引物（进行PCR操作的前提），热稳定DNA聚合酶（taqDNA聚合酶）；
（4）特点：使微量的DNA大幅增多。
3、限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
7．（2021高三上·靖远开学考）RGA是一种具有抑制植物生长作用的蛋白质，生长素能通过赤霉素使RGA降解，无赤霉素时，生长素不能引起RGA降解。研究者向拟南芥赤霉素合成缺陷型突变体中转入绿色荧光蛋白（GFP）基因与RGA基因的融合基因，获得转基因拟南芥植株，借助荧光显微镜可以观察转基因拟南芥幼苗根尖细胞中GFP—RGA融合蛋白的表达情况。回答下列问题：
（1）融合基因是将两个或多个基因首尾相连，置于同一套调控序列控制之下而构建的。调控序列包括能驱动基因转录出mRNA的 和能使转录在所需要的地方停下来的 。在GFP—RGA融合基因中，GFP基因的作用是作为 基因。
（2）构建融合基因需要 等工具酶，将融合基因导入拟南芥细胞时常用 法。
（3）转融合基因拟南芥细胞具有 性，因而通过 技术能使其发育成转基因植株。根据题意，写出从细胞或个体水平检测融合基因是否导入成功的方法 。
（4）将成功导入融合基因的拟南芥赤霉素合成缺陷型幼苗均分成甲、乙、丙三组，对其进行下
表所示处理，已知GFP—RGA融合蛋白中，GFP随RGA的分解而分解，预期能观察到绿色荧光的是 组。
组别 甲组 乙组 丙组
处理 保持完整 去幼芽、幼叶 去幼芽、幼叶+生长素
用适宜浓度的赤霉素溶液处理4 h后，用荧光显微镜观察幼苗根尖是否出现绿色荧光
【答案】（1）启动子；终止子；标记
（2）限制酶、DNA连接酶；农杆菌转化
（3）全能；植物组织培养；在荧光显微镜下观察幼苗根尖细胞，若观察到绿色荧光，则说明融 合基因导入成功
（4）乙
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）
能驱动基因转录出mRNA的是启动子，能使转录在所需要的地方停下来的是终止子。在GFP—RGA融合基因中，GFP基因是绿色荧光蛋白基因，其作用是作为标记基因。
（2）
根据题意，融合基因是将两个或多个基因首尾相连，故构建融合基因时需要限制酶、DNA连接酶等工具酶，将基因表达载体导入植物细胞用农杆菌转化法，所以将融合基因导入拟南芥细胞时常用农杆菌转化法。
（3）
转融合基 因拟南芥细胞具有全能性，因而通过植物组织培养技术能使其发育成转基因植株。从个体水平检测融合基 因是否导入成功的实验思路：在荧光显微镜下观察幼苗根尖细胞，若观察到绿色荧光，则说明融合基因导入成功。
（4）
分析题干可知，植物中的生长素能通过赤霉素使RGA降解，在导入了绿色荧光蛋白（GFP）基因的转基因拟南芥植株中，GFP随RGA的分解而分解，则不能在荧光显微镜下观察到绿色。幼芽和幼叶是生长素的主要产生部位，甲组和丙组都有生长素，故能使被赤霉素处理过的植株中的RGA降解，GFP也随之分解，不能出现绿色荧光；而乙组去幼芽、幼叶，不能合成生长素，故不能使被赤霉素处理过的植株中的RGA降解；预期能观察到绿色荧光的是乙组。
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测及个体水平上的鉴定如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
8．（2023·乌鲁木齐模拟）表面展示技术是通过DNA重组技术，将某种蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而将目的基因的表达产物展示在细胞表面。如下图是含有芽孢表面蛋白基因（cotB）与绿色荧光蛋白基因（gfp）的基因表达载体，Ampr是氨苄青霉素抗性基因。回答下列问题。
（1）由图可知，基因表达载体中cotB基因与基因共用的结构是 。
（2）将导入基因表达载体的芽孢杆菌培养在含 的固体培养基上以获得含有 的受体细胞。
（3）将cotB基因与gfp基因重组的目的是 。
（4）表面展示技术还能应用在酿酒过程中，将酸性蛋白酶基因（pepA）整合到酿酒酵母的特定基因位点，以期在发酵的过程中将发酵液中的蛋白质水解成小分子肽和氨基酸，进而降低酒的浑浊度。
①可通过 技术大量扩增pepA基因，该技术是利用 的原理。
②从酵母细胞中获得质粒以构建基因表达载体，质粒应具备的条件之一是 ，以便外源基因的插入。
③完成重组后，在对目的基因的检测与鉴定中，需在个体水平进行的鉴定是 。
【答案】（1）启动子和终止子
（2）氨苄青霉素；基因表达载体（目的基因表达载体和不含目的基因的载体）
（3）通过绿色荧光确定融合蛋白成功表达
（4）PCR；DNA复制；含有一个至多个限制酶酶切位点；检测使用转基因酿酒酵母进行发酵比传统酵母发酵是否可以降低酒的浑浊度
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，则需要将cotB和gfp一起表达，因此共用的结构是一个启动子和终止子，才能通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达。
（2）由于表达载体中含有Ampr基因，则若转基因成功，能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以可以将芽孢杆菌接种在含有氨苄青霉素的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的选择培养；培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含空载体（不含目的基因的载体、不含外源基因的载体）的单菌落，故该固体培养基上以获得含有基因表达载体（或目的基因表达载体）不含目的基因的载体的受体细胞。
（3）绿色荧光蛋白基因（gfp）能合成绿色荧光蛋白，将cotB基因与gfp基因重组的目的是通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达。
（4）①可通过PCR技术大量扩增pepA基因，该技术是利用DNA复制的原理。
②从酵母细胞中获得质粒以构建基因表达载体，质粒应具备的条件之一是含有一个至多个限制酶酶切位点，以便外源基因的插入。
③完成重组后，在对目的基因的检测与鉴定中，需在个体水平进行的鉴定是检测使用转基因酿酒酵母进行发酵比传统酵母发酵是否可以降低酒的浑浊度。
【分析】1、基因表达载体的构建：（1）过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。（2）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。（3）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
9．（2023·高州模拟）下图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对（bp），质粒有5369个碱基对（bp）。请据图回答问题：
（1）质粒中“氨苄青霉素抗性基因”的作用是 。研究发现复制原点处的A和T特别多，有利于DNA复制时 过程的发生。
（2）限制酶BamHⅠ的识别序列和切割位点是G↓GATCC，该酶切形成的黏性末端是 。过程③所需的工具酶是 。
（3）已知图中质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后进行电泳，出现了一条长度为5300bp的DNA条带，则重组质粒的长度为 的DNA片段条带。
（4）过程①用两种限制酶切割质粒，与单一酶切相比，其优势有 。过程②通过PCR技术实现，进行PCR时，需要在两种引物的 端分别添加BamHⅠ和HindⅢ的识别序列。
（5）将重组质粒导入大肠杆菌前，要用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 ；进行筛选时，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、C源、N源、琼脂等物质外，还要分别添加 。
【答案】（1）便于筛选目的基因是否导入受体细胞；解旋
（2）—CTAG；DNA连接酶
（3）6020bp
（4）可以避免目的基因自身环化；可使目的基因定向插入到运载体中；5'
（5）使大肠杆菌处于感受态（或处于容易吸收DNA的状态）；四环素、氨苄青霉素
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）氨苄青霉素抗性基因属于标记基因，质粒中标记基因的作用都是，便于筛选目的基因是否导入受体细胞；AT碱基对之间形成两个氢键，C和G之间形成三个氢键，AT对多便于解旋。
（2）限制酶BamH的识别序列和切割位点是G↓GATCC，则该酶切割DNA后形成的黏性末端是—CTAG，过程③表示切割后的目的基因和质粒发生重组，该过程需要DNA连接酶。
（3） 根据题意可知，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对 (bp），质粒有5369个碱基对 (bp)，质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后进行电泳，出现了一条长度为5300bp的DNA条带，说明5300bp的DNA条带是原质粒中切去部分片段的质粒；重组质粒的长度=5300+720=6020kb。
（4）用同一种酶切割目的基因和质粒，可形成相同的黏性末端，在质粒和目的基因连接的时候可能出现反向连接，目的基因和质粒也能出现自身环化的可能性；故用两种限制酶切割质粒，与单一酶切相比，可以避免目的基因自身环化；可使目的基因定向插入到运载体中。
（5）CaCl2处理大肠杆菌后，大肠杆菌会处于容易吸收DNA的状态，也即是处于感受态。图中的标记基因有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因已经被破坏，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、C源、N源、琼脂等物质外，分别添加四环素、氨苄青霉素，选择抗氨苄青霉素而不抗四环素的即为需要的目的菌株。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3、“分子缝合针”-DNA连接酶
两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。②区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
10．（2021高二下·渭滨期末）转基因技术的应用大大提高了动植物的品质，下图是绿色荧光蛋白转基因克隆猪培育示意图，据图和材料回答下列问题：
（1）过程①需要的工具酶有 。绿色荧光蛋白基因需要导入到成纤维细胞的 上才有可能培育出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
（2）猪胎儿成纤维细胞培养过程中，为了防止培养过程中的污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的 。
（3）通过过程⑤将早期胚胎移植到受体母猪体内能存活的原因是 。
（4）若是想在短期内获得更多的相同的绿色荧光蛋白转基因克隆猪该如何做？
（5）科学家将反义F3H序列导入到康乃馨中，降低了植株中F3H基因的表达量和酶活性，封锁了花青素合成途径，获得花香物质苯甲酸的释放量大大增加的转基因康乃馨。以上说明目的基因除了编码蛋白质的基因外，还可以是 。将目的基因导入植物细胞常用的方法是 。
【答案】（1）限制酶和DNA连接酶；染色体DNA
（2）抗生素
（3）受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应
（4）对早期胚胎进行分割移植
（5）调控作用因子；农杆菌转化法
【知识点】动物细胞培养技术；胚胎移植；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）过程①表示基因表达载体的构建，需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。绿色荧光蛋白基因需要导入到成纤维细胞的染色体DNA上才有可能培育出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
（2）猪胎儿成纤维细胞培养过程中，培养液中通常加入抗生素的目的是防止培养液被污染，培养液含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。
（3）早期胚胎移植时，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体母猪体内的存活提供了可能。
（4）来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，所以将早期胚胎进行胚胎分割移植可以获得更多相同的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
（5）科学家将反义F3H序列导入到康乃馨中，降低了植株中F3H基因的表达量和酶活性，封锁了花青素合成途径，获得花香物质苯甲酸的释放量大大增加的转基因康乃馨。以上说明目的基因除了编码蛋白质的基因外，还可以是调控作用因子。因为导入的对象是植物细胞，而土壤农杆菌易侵染植物细胞，故一般用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。
【分析】1、基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
2、动物细胞培养条件：
（1）营养：培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，通常需要加入血清等天然成分。
（2）无菌、无毒的环境。
（3）温度、pH和渗透压。
（4）气体环境：氧气是细胞代谢所必需的，二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH。动物细胞培养需要将培养瓶置于含95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养。
四、培优
11．（2020高三下·安徽月考）[生物——选修3：现代生物科技专题]
VNN1基因(1542bp)与炎症相关性疾病有关，GFP基因(4735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光。某研究小组进行鼠源GFP－VNN1重组质粒的构建及其功能研究，回答下列问题：
（1）为构建重组质粒，研究小组从数据库查找到VNN1的DNA序列，并设计引物。上游引物：5'－AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC－3'(下划线为Hind III酶切位点)，下游引物：5'－GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA－3'(下划线为BamH I酶切位点)，之后进行PCR扩增，PCR的原理是 。扩增后的VNN1基因要与含GFP基因的载体连接，需用 (填具体酶)切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用 酶处理，构建重组质粒。
（2）GFP基因在重组质粒中可作为 ，其作用是 。用之前相同的限制酶对GFP－VNN1重组质粒切割后，进行电泳鉴定时得到如图1所示的部分条带，结果表明 。
（3）IL－6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应。图2为GFP－VNN1重组质粒对细胞分泌IL－6的影响，由此说明 ；同时发现与正常组比较，空质粒转染组IL－6的表达有轻微升高，造成这种现象的可能原因是 。
【答案】（1）DNA双链复制；HindⅢ酶和BamH Ⅰ酶；DNA连接
（2）标记基因；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来；VNN1基因已插入到含GFP基因的载体中
（3）VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子ⅠL—6；操作过程中对细胞的损伤（或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用），可以激活相应细胞分泌炎症因子ⅠL—6
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1） PCR的原理是DNA双链复制 ； 本题中，HindⅢ酶和BamH Ⅰ酶 是目的基因的“剪刀”， DNA连接 酶是基因工程的“缝合针”；
（2）GFP基因(4735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光 ， GFP基因在重组质粒中可作为标记基因 ；其重要作用是 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 ； 电泳鉴定时 ，分子质量增加，表面基因构建成功， VNN1基因已插入到含GFP基因的载体中；
（3）图2显示IL－6 在 GFP－VNN1重组质粒 组中浓度升高， IL－6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应由此说明VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子ⅠL—6 ； 细胞的损伤（或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用），可以激活相应细胞分泌炎症因子ⅠL—6 。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、质粒；
（1）限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
（2）DNA连接酶：缝合DNA片段的磷酸二酯键；
（3）载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入，具有启动子和终止子；
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
12．（2020高三上·如皋开学考）人乳铁蛋白（hLF）对细菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人员开展人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体构建及转染研究，主要流程如下图。RT-PCR过程需先进行逆转录合成DNA，然后再进行PCR。图中Ase I、Nhe I、Sal I、BamH I代表相关限制酶切点，neor为新霉素抗性基因，BLG基因为B乳球蛋白基因，GFP基因为绿色荧光蛋白基因。请回答：
（1）过程①中，不能从人肌肉细胞中提取RNA用于RT-PCR，是因为 。在RT-PCR过程中，加入的引物需在 端添加 两种限制酶的识别序列，以便于hLF基因插入pEB中。
（2）过程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是 。
（3）将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细胞应该是导入 的细胞，再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中 ，以筛选出转染成功的细胞。
（4）科研过程中，也可以用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转染后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增后进行DNA电泳，结果如图所示：1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照（提纯的目的基因片段），3号泳道为实验组。请问，标准（Marker）的实质为 ，3号泳道的杂带出现的原因一般有 （在下列选项中选择）。
①模板受到污染 ②引物的特异性不强 ③退火温度偏低 温度偏高
【答案】（1）hLF基因在人肌肉细胞中不表达；5’；SalⅠ和BamHⅠ
（2）使hLF基因在山羊乳腺细胞中表达（使目的基因表达）
（3）pEB质粒、pEBL质粒（普通质粒和重组质粒）；是否有绿色荧光
（4）不同已知长度的DNA片段混合物；①②③
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）由于hLF基因在人肌肉细胞中不转录（表达），因此①过程中不能从人肌肉细胞中提取RNA用于RT-PCR，根据②过程构建的重组质粒中目的基因两侧限制酶的识别序列可知，在RT-PCR过程中，加入的引物需在5'端添加Sal I和BamH I两种限制酶的识别序列，以便于hLF基因插入pEB中。
（2）过程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是使人乳铁蛋白基因在山羊的乳腺细胞中表达。
（3）将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细胞应该是导入pEB质粒或pEBL质粒的细胞，再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中是否有绿色荧光，以筛选出转染成功的细胞。
（4）标准（Marker）的实质为不同已知长度的DNA片段混合物，3号泳道的杂带出现的原因可能是模板受到污染、引物的特异性不强、退火温度偏低，即①②③。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶：①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）“分子运输车”-载体①载体具备的条件：a、能在受体细胞中复制并稳定保存。b、具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
13．（2022高三上·张掖模拟）大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下（图中a链和b链分别是相应基因转录模板链）。分析回答下列问题：
（1）过程①中，PCR扩增sGFP的原理是 ，该过程除需要根据 设计特异性引物序列外，为保证sCFP正确插入质粒中，还需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为 。
（2）过程②需要的工具酶是 。研究中将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是 。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，再加入潮霉素溶液，潮霉素不能与培养基一同灭菌的原因是 。
（4）选择过程③筛选培养得到的不同农杆菌菌落，分别提取细菌质粒DNA，并用BamHI和HindⅢ完全酶切，可以得到 种长度不同的DNA片段。
（5）将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测 筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【答案】（1）DNA双链复制；sGFP两端的核苷酸序列；AGCT
（2）DNA连接酶；保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
（3）潮霉素在高温灭菌时结构会被破坏
（4）3
（5）大丽轮枝菌细胞中绿色荧光的强度
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR扩增sGFP的原理是DNA双链复制，由于DNA的两条链反向平行，且DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5'→3'方向延伸，所以该过程需要根据sGFP两端（3'端）核苷酸（或碱基）序列设计特异性引物序列。为了保证sGFP正确插入质粒中，还需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，由于质粒大片段是利用HindⅢ和BamHI共同切割得到的质粒的长片段，所以b链5'端是利用HindⅢ切割形成的黏性末端，根据HindIⅢI识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为AGCT。
（2）过程②为构建重组DNA，需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的潮霉素溶液，以防止杂菌污染。由于潮霉素在高温灭菌时结构会被破坏，不能发挥选择作用，所以潮霉素不能与培养基一同灭菌。
（4）根据质粒中BamHI和HindⅢ的识别位点以及用BamHI和HindⅢ酶切后得到的质粒大片段为3500bp，可知质粒小片段应为3750-3500=250（bp）。sGFP的基因长度为720bp，质粒大片段为3500bp，二者连接后的长度为3500+720=4220（bp）。用BamHI和HindⅢ完全酶切后会形成4220bp，3500bp和720bp三种长度不同的DNA片段。
（5）转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。其中人工合成方法中包括反转录法，即可先提取人体细胞中的mRNA，以其作为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA（或DNA）．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术，方法是采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
14．（2022高二下·盐城期末）为探究某病菌对棉花的侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转化该种病菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，并让其感染棉花植株，主要过程如下图。其中a链和b链分别是相应基因转录的模板链。相关限制酶识别序列和切割位点为：Hid Ⅲ——5 'G↓GATCC3'；BamH Ⅰ——5'A↓AGCTT3'。请回答下列问题：
（1）过程②操作时，除图中标注物质外，还需要用 向微量离心管中加入 、 、 和水。至少需经过 次扩增可获得8条长度为0.7Kb的脱氧核苷酸链。为保证sGFP正确插入到质粒中，还需要在引物1的5'端添加限制酶 的识别序列，图中b链的黏性末端碱基序列（5'→3'）为 。
（2）过程③需要的工具酶是 。经过过程①③可获得长度为 Kb和4.2Kb的两种重组环状DNA．过程⑤中通过 淘汰只导入不符合要求的重组环状DNA的受体菌。
（3）过程④常采用的方法是 。
【答案】（1）微量移（或取）液器；缓冲液；原料（（或dNTP混合物）；Taq酶（或热稳定的DNA聚合酶）；3；BamH I；GATC
（2）限制酶和DNA连接酶；0.95；培养基中添加潮霉素
（3）用Ca2+处理
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)在微量离心管中添加各种试剂时，需要用到微量移（或取）液器。PCR的条件是模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等，因此需要向微量离心管中加入缓冲液、原料（（或dNTP混合物）、Taq酶（或热稳定的DNA聚合酶）和水。DNA复制是半保留方式复制，据题意可知，该DNA复制三次后的DNA为：
，因此至少经过3次扩增获得8条长度为0.7Kb的脱氧核苷酸链。据图可知，质粒上启动子和终止子之间的限制酶切位点是Hid Ⅲ和BamH Ⅰ，因此目的基因也应该在引物1的5'端用BamH I切割才能连接起来，因此还需要在引物1的5'端添加限制酶BamH I的识别序列，从图中可以看出b链端是用Hid Ⅲ切割后形成的，根据图中Hid Ⅲ识别的碱基序列可以推知b链的碱基序列为 GATC。
(2)据图可知，过程③是基因表达载体的构建，需要将目的基因和质粒用相同的限制酶进行酶切，然后用DNA连接酶连接起来，因此此过程需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶。据图可知，质粒的长度为3.75kb，经双酶切后形成长度为0.25kb和3.5kb片段，与目的基因（0.7kb）l连接后，能形成0.25kb+0.7kb=0.95 kb和3.5kb+0.7kb=4.2kb的重组环状DNA。据图可知，该质粒中的标记基因是潮霉素抗性基因，因此检测是否导入符合要求的重组环状DNA的受体菌，需要通过培养基中添加潮霉素淘汰。
(3)将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，因此常用的方法是用Ca2+处理。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——感受态细胞法：适用于微生物。Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
15．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用____。
A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’
（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有____。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物；延伸的时间和退火的温度
（2）B；C
（3）限制性核酸内切酶（限制酶）
（4）A；B；C
（5）P3、P4
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR反应体系中包括DNA模板，耐高温的DNA聚合酶、引物和四种脱氧核苷酸，引物是根据扩增的基因序列设计的，据此推测，分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物；扩增步骤包括变性、退火、延伸，扩增的DNA片段长度不同，则延伸设置的时间不同，所使用的引物不同，则退火的温度也可能不同，所以扩增程序中最主要的不同是延伸的时间和退火的温度。
（2）由图分析可知，引物F2-F与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧相同，所以引物F2-F对应的序列是C选项；同理，引物F1-R与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧互补，所以引物F1-R对应的序列是D选项。
故答案为：CD。
（3）传统重组质粒构建过程需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶，而题干中的过程使用的是重组酶，所以这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶。
（4）当通过稀释涂布平板法接种后，对微生物进行计数时，需要控制每个平板30~300个菌落，但本实验的目的是筛选出转化成功的大肠杆菌，所以不用控制每个平板的菌落数，A符合题意；一般是先将培养基冷却后，再进行接种，所以抗性平板上未长出菌落的原因不可能是培养基温度太高所致，B符合题意；转化后的大肠杆菌采用含有抗生素的培养基筛选，只有转化成功的大肠杆菌才能在该培养基上生长，而未转化成功的大肠杆菌和其它杂菌无法生长，所以抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C符合题意；单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物，所以抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D不符合题意。
故答案为：ABC。
（5）由图可知，EGFP和AnB1的长度总和是720＋390＝1110bp，电泳结果显示，P1和P2片段长度接近该值，而P3没有条带，P4片段长度显著小于该值，所以可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，所以对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
【分析】一、PCR技术
1、PCR技术是体外扩增目的基因的技术，是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
2、条件
DNA母链：提供DNA复制的模板； 酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）； 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸； 原料：四种脱氧核糖核苷酸。
二、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
三、 微生物的分离纯化一般可用平板划线法或稀释涂布平板法，其中平板划线法使用接种环等进行接种，不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法使用涂布器等进行接种，可用于微生物的计数，在样品稀释时，要保证计数用的平板中的菌落数落在30-300之间。
16．（2022高三上·广东月考）Cre - loxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。科学家把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建如图2所示的表达载体T，在Cre酶的作用下，一部分荧光蛋白基因会被随机地“剪掉”，而剩下的部分得以表达，这样就可以随机呈现不同的颜色。这种利用荧光蛋白“点亮”神经元的大脑成像技术被称为“脑彩虹”，能帮助科学家了解大脑。
（1）loxP序列具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是 （填序号）。
（2）构建表达载体T需要用到 酶，用 法将表达载体T导入小鼠的 细胞中，经筛选后获得细胞中含一个表达载体T的转基因小鼠a（不含Cre酶）。小鼠a的脑组织细胞和其他组织细胞的色彩分别是 和 。
（3）已知两个loxrP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次。研究者将Cre酶基因与病毒基因重组构建Cre病毒，然后将Cre病毒注入细胞中含一个表达载体T的转基因小鼠A体内，出现“脑彩虹”现象，小鼠A的一个脑细胞的色彩为 。
（4）利用上述技术可以培育能够在一个细胞内随机出现两种颜色的“脑彩虹”小鼠，请依据题目信息，简要写出设计思路。
【答案】（1）②
（2）限制酶和DNA连接；显微注射；受精卵；红色；无色
（3）红色或黄色或蓝色
（4）设法使小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色随机出现决定
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据图中loxP1的碱基序列可以看出，其中①③序列的碱基序列是相同的，即根据这两个片段无法看出loxP1的方向性，因此，loxP1序列的方向性由序列②决定。
（2）基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理。将目的基因导入动物细胞，常用显微注射法，且为了培育转基因动物，通常用小鼠的受精卵细胞作为受体细胞。图2中信息提示为表达载体T中仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因，且表达载体T中不含Cre酶，因此含图二的表达载体T的小鼠a 的脑组织细胞色彩为红色，而其他组织细胞因为该基因不表达，而表现为无色。
（3）小鼠A有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，loxP1、loxP2位置如图二黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色；也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色；有可能敲除两个loxP2之间的红色 和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色。因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，即小鼠A的一个脑细胞的色彩为红色或黄色或蓝色。
（4）当小鼠脑细胞内有一个表达载体T时，注入含Cre酶的病毒后，会使小鼠的一个脑细胞中出现红色或黄色或蓝色，为了达到在一个细胞内随机出现两种或两种以上颜色叠加的目的，可设计思路为设法使小鼠脑组织细胞内有多个相同的图2所示DNA片段，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内多个荧光蛋白的颜色叠加而成。
【分析】1、基因表达载体的构建：（1）过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。（2）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。（3）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
17．（2022高三上·莆田月考）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如图1所示。回答下列问题：
（1）构建重组病毒时用的 Hind Ⅲ 和BamH I都是 酶。
（2）为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，选用引物组合 进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因 (填“有”或“没有”)插入病毒ASFV的K基因。
（3）为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种 。支持“重组病毒成功表达”的实验结果为： 。
（4）同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明 。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
【答案】（1）限制性核酸内切（或限制）
（2）引物1和引物4；有
（3）重组病毒；B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性
（4）Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）构建重组病毒时用的Hind Ⅲ和BamH I都是限制性内切核酸（或限制）酶，可以识别并切割特定的DNA序列。
（2）为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，据图分析，选用引物组合引物1和引物4进行PCR扩增可获得完整的Gluc基因和EGFP基因序列；扩增结果有1、2两种类型，如图2所示，该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因有插入病毒ASFV的K基因，因K基因大小约790bp（类型1），而插入成功的应大于790bp（类型2，约1758）。
（3）为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，根据对照原则，其中A组接种病毒ASFV，B组接种重组病毒。若B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性，则说明“重组病毒成功表达”。
（4）同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
【分析】1、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）：
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
3、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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