高考生物真题分类汇编：24 基因工程（含解析）
文档属性
| 名称 | 高考生物真题分类汇编：24 基因工程（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 2.5MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-10-30 00:27:07 | ||
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文档简介
高考生物真题分类汇编
专题24 基因工程
考点 基因工程
1.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 ( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案 C 酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部,酶切后会破坏标记基因,D不符合题意;酶3切割后产生平末端,E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端,故E.coli DNA连接酶无法连接酶3切割产生的平末端,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4 DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,C符合题意。
2.(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 ( )
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案 D DNA的粗提取与鉴定实验中,通过研磨破碎细胞,使细胞裂解释放DNA等物质,A正确;粗提取的DNA中可能会含有蛋白质、多糖、RNA等杂质,通过分离可以去除混合物中的杂质,B正确;根据DNA和蛋白质等在95%的冷酒精中的溶解度不同,可反复多次沉淀来提高DNA的纯度,C正确;DNA鉴定时,DNA溶液加入二苯胺试剂后,需要沸水浴加热才会变蓝,D错误。
3.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 ( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D 用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。
4.(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
甲
乙
下列叙述正确的是 ( )
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
答案 B 从图甲可知GFP和Gata3基因使用同一个启动子,故Gata3基因的启动子同时控制GFP和Gata3基因的表达,A错误;由于启动子区在左侧,基因的编码区在右侧,因此转录的方向是从左到右,mRNA的5'端为Gata3基因,3'端为GFP基因,因此翻译时先合成Gata3蛋白,B正确;大片段为Gata3-GFP基因,小片段为Gata3基因,因此2号为Gata3-GFP基因纯合子,4号为野生型,C错误;若用引物1和引物3进行PCR,则Gata3基因无法扩增,不利于区分纯合子和杂合子,D错误。
5.(2023浙江1月选考,2,2分)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述正确的是 ( )
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.治疗性克隆不需要监控和审查
C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
答案 D 试管婴儿技术可以帮助不育夫妇解决生育问题,不应全面禁止,A错误;治疗性克隆也需要监控和审查,B错误;生殖性克隆存在伦理道德方面的风险,C错误;我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验,D正确。
6.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是 ( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B 94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
6.(2022浙江1月选考,21,2分)羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc,但不发病。当羊感染了PrPSc后,PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc,导致PrPSc积累,从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病。下列分析合理的是 ( )
A.动物体内的 PrPSc可全部被蛋白酶水解
B.患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C.产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D.给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc,小鼠不会发病
答案 D 感染性蛋白粒子PrPSc会将羊体内的PrPc不断转变为PrPSc,PrPSc在体内积累从而导致发病,可见动物体内的PrPSc并不会全部被蛋白酶水解,A错误;患病羊体内存在指导蛋白质PrPc合成的基因,而PrPSc并不是自身合成的,而是外界感染的,B错误;PrPSc在体内积累从而导致发病,说明产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用,C错误;把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病,原因是患瘙痒病的羊组织匀浆含有感染性蛋白粒子PrPSc,小鼠体内含有PrPc,PrPc基因敲除小鼠不含PrPc,接种PrPSc后也不会发生使PrPc转变为PrPSc并积累PrPSc而致病的现象,D正确。
8.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是 ( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B 由于在低温条件下DNA酶的活性较低,因此过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A正确;DNA存在于上清液中,离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,B错误;沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C正确;并非所有蛋白质都可溶于冷酒精,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质,D正确。
9.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
10.(2021北京,14,2分)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是( )
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案 A 高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
11.(2021浙江6月选考,20,2分)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是( )
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案 B 受精卵在体外培养时,由于不同发育阶段的胚胎细胞所需的环境有所不同,因此需要更换不同成分的培养液,A正确;进行胚胎移植的早期胚胎通常为发育到8细胞以上的胚胎,如早期囊胚,B错误;利用胚胎干细胞通过核移植等技术来获得转基因小鼠时,可在短时间内获得大量的转基因小鼠胚胎,再通过胚胎移植技术大量培养转基因小鼠,C正确;根据题干信息可知,EGFP基因被定点插入Y染色体上,而Y染色体只有雄性才具有,因而观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎,D正确。
12.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
13.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C 根据题干信息可知,限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点是由6个碱基对构成的,若用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,则理论上得到DNA的的平均长度(碱基对)约为46碱基对,即约为4 000碱基对。故选C。
14.(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案 D PCR反应中出现非特异性条带的主要原因是引物与模板DNA出现了非特异性结合,模板DNA不纯或过多易出现非特异性结合,A错误;延长热变性时间与非特异性条带无直接关系,B错误;延长延伸时间易出现非特异性结合,C错误;复性温度偏低易出现非特异性结合,故提高复性温度可减少反应中非特异条带的产生,D正确。
15.(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案 A 加入适量的木瓜蛋白酶能分解滤液中的主要杂质——蛋白质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,A符合题意;37~40 ℃达不到破坏蛋白质所需的温度,所选温度应该是60~75 ℃,此温度能够破坏滤液中主要杂质蛋白质的结构,进而去除这些杂质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,B不符合题意;与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精是题干中的“特定试剂”,C不符合题意;加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L,经过以上处理后DNA析出,过滤后DNA主要存在于纱布上的过滤物中,在滤液中含量极少,经过D项处理后应过滤去除溶液中的杂质,再用物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,D不符合题意。
16.(2020山东,15,2分)新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是( )
A.抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理
B.感染早期,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况
C.患者康复后,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况
D.感染该病毒但无症状者,因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测
答案 D 抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理,A正确;感染早期,新冠病毒的核酸已进入机体,但机体可能尚未进行体液免疫产生抗体,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况,B正确;患者康复后,体内留有记忆细胞和抗体,而新冠病毒已被机体清除,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况,C正确;感染该病毒但无症状者,其体内会发生体液免疫产生抗体,适用抗体检测法检测,D错误。
17.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制酶,该酶会破坏重组质粒的结构,不利于重组质粒在受体中保持结构稳定,A错误;抗除草剂基因转入某抗盐植物获得的2个稳定遗传品系中有抗除草剂不抗盐的品系,抗盐性的改变可能与抗除草剂基因的转入有关,B错误;在DNA检测均含目的基因的条件下,抗性鉴定为抗除草剂说明目的基因完成了表达,抗性鉴定为不抗除草剂说明目的基因可能完成了转录而没有翻译成蛋白质,还有可能是目的基因没有转录,C错误;因为质粒为环形,用某限制酶完全酶切后出现3条带,说明酶切后的产物中有3种不同分子量的DNA,可以推测出质粒上至少有3个位置被该酶切开,D正确。
18.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
图1 酶切位点图
图2 电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案 D 本题通过对酶切位点图和电泳结果示意图的分析,考查基因工程工具酶的相关知识,以及观察图示、分析推理的能力,试题通过两种图示的分析体现了对科学思维素养中的演绎与推理要素的考查。图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道①②电泳结果知,泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。
19.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A.用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞
D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案 C 本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。
20.(2014重庆理综,4,6分)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述,正确的是( )
A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状
D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
答案 D ②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与,A错误;③侵染植物细胞后,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到④的染色体上,B错误;④的染色体上含有目的基因(抗虫基因)但不一定表达,C错误;基因工程依据的原理是基因重组,基因重组属于可遗传变异,D正确。
21.(2014重庆理综,2,6分)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述,错误的是( )
A.应严格选择转基因植物的目的基因,避免产生对人类有害的物质
B.当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验,但不反对治疗性克隆
C.反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
答案 D 在获得转基因植物时,要严格选择目的基因,避免产生对人类有害的毒性蛋白或过敏蛋白等物质,A正确;当今社会的普遍观点是禁止有关人类的生殖性克隆,但不反对治疗性克隆,B正确;反对设计试管婴儿的原因之一是有人将此技术用于设计婴儿性别,C正确;生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等,干扰素不属于生物武器,D错误。
22.(2013大纲全国,5,6分)下列实践活动包含基因工程技术的是( )
A.水稻F1花药经培养和染色体加倍,获得基因型纯合新品种
B.抗虫小麦与矮秆小麦杂交,通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C.将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞,经组织培养获得抗病植株
D.用射线照射大豆使其基因结构发生改变,获得种子性状发生变异的大豆
答案 C 本题主要考查不同育种方式所用到的技术。A项为单倍体育种,用到植物组织培养技术;B项为传统的杂交育种;C项抗病植株的培育用到基因工程技术和植物组织培养技术;D项为诱变育种。
23.(2013安徽理综,6,6分)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是( )
A.根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目
B.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
C.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接
D.放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
答案 D 本题主要考查微生物的计数和DNA分子杂交等相关知识。根据培养皿中菌落数只能估算样品中含有的活菌数目;外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能够进行转录;重组质粒与探针因碱基互补配对能进行分子杂交;用放射性标记的DNA探针与特定DNA分子杂交后,洗去未结合的探针,放射自显影结果可以显示原培养皿中含特定DNA的细菌菌落位置。
24.(2013广东理综,3,4分)从某海洋动物中获得一基因,其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物,首先要做的是( )
A.合成编码目的肽的DNA片段
B.构建含目的肽DNA片段的表达载体
C.依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D.筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
答案 C 由题中信息“在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物”可推知本题考查蛋白质工程的相关知识。根据蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因),可推知答案为C。
25.(2013江苏单科,15,2分)下列关于转基因生物安全性的叙述中,错误的是( )
A.我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B.国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C.开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D.目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
答案 B 本题考查了转基因生物安全性的有关知识。目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性两个方面;因对转基因生物的安全性还处于争论阶段,故不可能在转基因食品标签上警示性注明可能的危害;但我国已对转基因食品和农产品强制实施了产品标识制度,以维护消费者对转基因产品的知情权和选择权;开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提。
26.(2012江苏单科,13,2分)下列关于转基因生物安全性的叙述,错误的是( )
A.种植转基因作物应与传统农业种植区隔离
B.转基因作物被动物食用后,目的基因会转入动物体细胞中
C.种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性
D.转基因植物的目的基因可能转入根际微生物
答案 B 本题主要考查转基因生物安全性的相关问题,种植转基因作物时为了避免基因污染,应与传统农业种植区隔离,故A对;转基因作物被动物食用后,目的基因会被动物消化,不会转入动物体细胞中,故B错;转基因植物有可能将基因扩散至野生植物中,从而影响野生植物的遗传多样性,故C对;转基因植物的目的基因可被微生物利用,故D对。
27.(2012江苏单科,18,2分)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述,正确的是( )
A.洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B.将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C.常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取
D.用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少
答案 C 本题考查DNA粗提取与鉴定实验的基本知识。洗涤剂能瓦解细胞膜,但对DNA在NaCl溶液中的溶解度无影响,故A错误;DNA丝状物需先溶解在适宜浓度的NaCl溶液中,然后加入二苯胺试剂,混合均匀后沸水浴,待冷却后溶液变蓝,故B错误;常温下菜花匀浆中有些水解酶可能会使DNA水解而影响DNA的提取,故C正确;用玻棒朝一个方向缓慢搅拌可减轻对DNA分子的破坏,有利于DNA分子的提取,故D错误。
28.(2012浙江理综,6,6分)天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰,下列操作正确的是( )
A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因B
B.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D.将基因B直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞
答案 A 此题考查基因工程及其应用的相关知识。要获取目的基因B,可先提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再经PCR技术扩增基因B,A正确;基因文库构建是将目的基因与载体连接起来,形成重组载体,再导入受体菌中储存和扩增,提取目的基因时不需使用限制酶,B错误;连接目的基因与质粒的酶是DNA连接酶,C错误;将目的基因导入植物细胞,常用农杆菌转化法,不使用大肠杆菌,D错误。
29.(2011四川理综,5,6分)北极比目鱼中有抗冻基因,其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列,该序列重复次数越多,抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图,有关叙述正确的是( )
A.过程①获取的目的基因,可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B.将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C.过程②构成的重组质粒缺乏标记基因,需要转入农杆菌才能进行筛选
D.应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
答案 B 将多个抗冻基因编码区相连成能表达的新基因,合成的蛋白质为新的蛋白质,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白,故选项B正确;过程①是利用反转录法合成目的基因,由于没有非编码区和编码区中的内含子,不能用于比目鱼基因组测序;用作运载体的质粒,必须具有标记基因才能便于检测和筛选;应用DNA探针技术,可检测转基因抗冻番茄中目的基因的存在和转录,但不能检测是否成功表达,故选项A、C、D错误。
30.(2011江苏单科,19,2分)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中,相关叙述正确的是( )
A.用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L,滤去析出物
B.调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶,都可以去除部分杂质
C.将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈蓝色
D.用菜花替代鸡血作为实验材料,其实验操作步骤相同
答案 B 用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L时,滤取析出物;利用二苯胺试剂鉴定DNA时,需沸水浴加热几分钟,才呈蓝色;用菜花替代鸡血为实验材料,需要对材料的细胞壁进行处理。调节NaCl溶液浓度改变不同物质在其中的溶解度,加入木瓜蛋白酶分解蛋白质都可以去除部分杂质,故B正确。
31.(2011江苏单科,14,2分)关于现代生物技术应用的叙述,错误的是( )
A.蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质
B.体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体
C.植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒
D.动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育
答案 B 克隆动物是核移植工程的应用;茎尖分生能力强,没有病毒侵染,以茎尖为外植体,通过植物组织培养可获得无病毒植株;导入目的基因的受体细胞,需通过动物细胞培养技术获得早期胚胎,才能进一步培育成转基因动物。
32.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
33.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载
体的农杆菌共培养幼苗→ 转化
植株A
图1
植株B植株上半部分
浸入含重组载
体的农杆菌液植株长出
毛状根阳性毛
状根段幼苗→ 转化
植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
答案 (1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用 (2)遗传特性 转基因种子 (3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上 (4)检测毛状根段是否有绿色荧光 植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增) 若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带) (5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便
解析 (1)外植体经过脱分化形成愈伤组织,愈伤组织经过再分化形成幼苗,再分化培养基需要有一定比例的生长素和细胞分裂素。叶绿素的形成需要光,故再分化过程中需要适宜的光照以诱导叶绿素的形成。(2)图1中,若不经过愈伤组织与含重组载体的农杆菌共培养环节,直接诱导培养植株,则获得的植株遗传物质全部来自植株A,这种无性繁殖的方式可以保持植株A的遗传特性。为遵守我国对农业转基因生物实行的标识制度,需对含有外源基因的转化植株A生产的种子的包装标注“转基因种子”。(3)见答案。(4)用含有重组载体的农杆菌液处理植株B后长出的毛状根中若含有基因编辑载体(阳性毛状根),则该基因编辑载体中的绿色荧光蛋白基因可以在毛状根中表达,故可通过观察其是否含有绿色荧光筛选阳性毛状根。若导入幼苗中的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶基因测序就会出现序列缺失,或用另一种方法,根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增,不会出现扩增条带。(5)对比图1与图2知,与常规转化法相比,用CDB法进行基因递送不需要进行植物组织培养,不需要无菌操作,操作简便。
34.(2023湖南,21,13分)某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题:
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌,培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H,其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好,若要确定其有抑菌效果的最低浓度,需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌 抗菌肽浓度(μg·mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黄色葡 萄球菌 - - - - - + +
枯草芽 孢杆菌 - - - - - + +
禾谷镰 孢菌 - + + + + + +
假丝酵母 - + + + + + +
注:“+”表示长菌,“-”表示未长菌
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体,转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中,传代多次后,生产条件未变,但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 (答出两点即可)。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官,可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体,如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 (答出两点)等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 (填“是”或“否”)。
(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种耐药菌,严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型,来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体
②MRSA感染的肺类装配体
③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽
④生理盐水
⑤青霉素(抗金黄色葡萄球菌的药物)
⑥万古霉素(抗MRSA的药物)
答案 (1)淀粉、无机盐 (2)金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45 (3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失 (4)适宜的气体和无菌、无毒的环境 否 (5)②③④⑥
解析 (1)培养基的成分一般包含水、碳源、氮源和无机盐等营养成分,筛选分解淀粉的固氮细菌所需要的选择培养基中,除含水、无机盐外,还应含有淀粉,而不能含有有机氮。(2)从表中数据可以看出,抗菌肽浓度为3.45~55.20 μg·mL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无法存活,禾谷镰孢菌和假丝酵母在抗菌肽浓度为55.20 μg·mL-1时无法存活,而在抗菌浓度低于27.6 μg·mL-1(含)时可存活,故抗菌肽对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制效果较好。抗菌肽浓度为1.73 μg·mL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均能存活,而在3.45 μg·mL-1时均不能存活,所以若要确定抗菌肽有抑菌效果的最低浓度,应在1.73~3.45 μg·mL-1浓度区间进一步实验。(3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失时,菌株不能再产生淀粉酶M。(4)动物细胞培养除需要满足适宜的营养、温度、渗透压和pH条件外,还需要适宜的气体环境(95%空气和5%CO2)以满足代谢需求和维持培养液pH,以及无菌、无毒的环境防止其他微生物的污染和细胞代谢物的危害。肺类装配体形成过程涉及两种或多种细胞的共培养,但并未运用动物细胞融合技术。(5)若要探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力,需至少取三组MRSA感染的肺类装配体进行培养,第一组加入解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽,第二组加入万古霉素(作为有抗菌效果的对照),第三组加入等量生理盐水(作为无抗菌效果的对照),观察并比较三组肺类装配体的生长情况,若第一组肺类装配体生长情况明显好于第三组,且与第二组类似或好于第二组,说明该抗菌肽对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。
35.(2023全国甲,38,15分)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是
。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。
答案 (1)该疫苗不含乙肝病毒DNA,不会在人体细胞内增殖产生乙肝病毒 (2)作为标记基因筛选出转化成功的酵母细胞 RNA聚合酶 (3)基因组DNA 放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段 (4)从酵母细胞中提取蛋白质,用乙肝病毒表面抗原的特异性抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,说明酵母细胞中表达出目的蛋白。
解析 (1)只有乙肝病毒的DNA分子进入人体细胞,才能以其为模板进行DNA复制和外壳蛋白的表达,然后装配形成子代乙肝病毒。重组乙肝疫苗只含有乙肝病毒表面抗原,不含乙肝病毒DNA分子,不会在人体细胞内产生乙肝病毒。(2)载体上的抗生素抗性基因常作为标记基因,用于将成功导入重组基因表达载体的细胞筛选出来。细胞中的RNA聚合酶可识别载体中的启动子,并以目的基因的一条链为模板进行转录。(3)由于不能确定目的基因是否插入染色体中,需提取酵母细胞的基因组DNA,加热变性,用基因探针进行检测。该探针中需要含有目的基因中的特异性片段,且带有放射性同位素等标记。若受体细胞的染色体中含有目的基因,该探针就会与目的基因通过碱基互补配对结合在一起,从而在放射性等检测中观察到杂交带。(4)抗乙肝病毒表面抗原的抗体可与乙肝病毒表面抗原特异性结合,故可用该抗体与酵母细胞中提取出来的蛋白质进行抗原—抗体杂交,若出现杂交带,则可证明酵母细胞中表达出目的蛋白。
36.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是 。
答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录 将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子的简并性 (4)获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光
解析 (1)见答案。(2)基因表达载体中,启动子和终止子分别位于目的基因的上游和下游,由图中GFP突变基因的转录方向可判断,位于目的基因上游的②为启动子,位于目的基因下游的①为终止子,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因的转录。氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,用于筛选含目的基因的受体细胞。(3)绝大多数氨基酸都有几个密码子,若突变后的基因转录出的mRNA中的密码子与原基因序列所对应的密码子编码的氨基酸相同,则性状不发生改变。(4)若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可用获得的YFP基因构建表达载体后导入真核细胞内,检验受体细胞能否发出黄色荧光。
37.(2023浙江6月选考,23,14分)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸,而人类主要食物中的赖氨酸含量很低,利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。
回答下列问题:
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时,能抑制合成过程中两种关键酶的活性,导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平,这种调节方式属于 。根据这种调节方式,在培养基中添加 ,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞,可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体,通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展,2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为:
①构建乳腺专一表达载体。 随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索 获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内,与BEF膜发生 ,表达载体最终进入细胞核,发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞,从牛卵巢获取卵母细胞,经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合,电融合的作用除了促进细胞融合,同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ,植入代孕母牛子宫角,直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测:利用PCR技术,以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照,以 为阳性对照,检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测:从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞,提取总RNA,对总RNA进行 处理,以去除DNA污染,再经逆转录形成cDNA,并以此为 ,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达,而不在牛耳组织细胞内表达,原因是什么 。
答案 (1)(负)反馈调节 一定浓度的赖氨酸类似物 (2)①基因(序列)数据库 ②融合 ③受体细胞 激活 ④桑葚胚或囊胚 ⑤含酪蛋白基因的牛耳组织细胞 DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子,只能在乳腺细胞中启动转录,而在牛耳组织细胞中不能表达
解析 (1)一个系统工作的效果反过来抑制该系统的工作称为负反馈调节,基于此原理,若在培养基中加入一定浓度的赖氨酸类似物作为选择培养基,就可筛选获得抗赖氨酸类似物的细胞突变体。(2)①用化学方法合成目的基因时,需要已知其全部序列,所以可以通过基因(序列)数据库检索查询该序列。②利用膜融合的方式可将脂质体包裹的表达载体转入特定受体细胞。③核移植时常用的受体细胞为去核卵母细胞,携带转基因的BEF(核供体细胞)与受体细胞通过电融合法诱导融合,使供体核进入卵母细胞,形成重组细胞,同时电刺激还可激活重组细胞,使其完成细胞分裂和发育进程。④当重组细胞发育至桑葚胚或囊胚时进行胚胎移植。⑤阳性对照是指含有目的基因的细胞,所以用含酪蛋白基因的牛耳组织细胞作为阳性对照,通过对比判断目的基因是否导入转基因牛组织细胞中。可从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞中提取总RNA,对总RNA进行DNA酶处理,以除去细胞中的DNA,只剩下RNA,再通过逆转录形成cDNA,并以此为模板利用PCR技术扩增DNA检验基因是否表达。不同种类细胞中遗传信息的表达情况不同,含乳腺特异性启动子的表达载体只在乳腺细胞中表达。
38.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
图1
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
图2
图3
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
解析 (1)野生型DA1基因为显性基因,若导入成功,转基因植株的种子大小应与野生型的一致。(2)用农杆菌转化法进行转基因需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,所以需将二者用同种限制酶切割再用DNA连接酶连接。如要目的基因正常表达,其上游要有启动子驱动转录开始,下游要有终止子终止转录。(3)①能在选择培养基上萌发并生长的阳性个体说明其基因组中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。②T0代植株自交后所得的T1代种子若能在选择培养基上存活,则为导入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的阳性种子,但导入的数量未知,故用T1代植株继续自交,若某T1代植株为基因组单一位点插入,则其产生的T2代种子在选择培养基上的存活率(阳性率)为75%。③目标转基因植株应为纯合阳性子代,T2代植株中存在杂合阳性和纯合阳性子代,应该用自交的方法筛选,若后代不再出现性状分离,即阳性率为100%,说明培养基中的幼苗为目标转基因植株。(4)野生型基因和突变型基因长度均为150 bp,野生型基因内部无限制酶X的酶切位点,突变型基因在50 bp处有一个限制酶X的酶切位点,所以酶切后野生型出现1个150 bp的条带,而突变型出现100 bp和50 bp两个条带。
39.(2022天津,15,10分)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因, 为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物 和 ,并在引物的 (5'/3')端引入XhoⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含 (EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ/Xho Ⅰ)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为 。
A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C.卡那霉素和链霉素都敏感
D.卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案 (1)1 4(以上两空可调换) 5' (2)Xho Ⅰ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR(聚合酶链式反应,答案合理即可)
解析 (1)结合题图中载体1分析,要去除SacB区域,应扩增SacB区域外的DNA片段,所选择的两种引物应方向相反,且位于扩增部位两端,故应选引物1和4。由于PCR扩增时,子链从引物的3'端开始延伸,因此应在引物的5'端引入合适的限制酶识别序列。(2)根据题图中构建载体4的过程可知,从载体3扩增出的RpsL片段插入了载体2的XhoⅠ位点,故以载体3为模板扩增RpsL时所需引物应包含XhoⅠ酶识别序列。(3)因受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感,载体5上具有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因),故成功导入载体5的菌株链霉素敏感、卡那霉素不敏感,所以,为获得成功导入载体5的菌株,应利用含有卡那霉素的平板进行初步筛选,选择平板上出现的菌落即可。(4)P1基因整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失,所以该菌的表型依然是受体菌的表型,即链霉素不敏感、卡那霉素敏感,故B正确。(5)以受体菌拟核DNA为模板,采用P1基因特异性引物进行PCR扩增,若获得相应大小片段,即可表明该菌株成功整合了P1基因。
40.(2022重庆,26,15分)改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因,并开展了相关探索。
步骤Ⅰ:
步骤Ⅱ:
(1)花药培养能缩短育种年限,原因是 。在步骤Ⅰ的花药培养过程中,可产生单倍体愈伤组织,将其培养于含 的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。Ⅰ中能用于制造人工种子的材料是 。
(2)步骤Ⅱ中,eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库,原因是 ;在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株,需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后,应侵染Ⅰ中的 ,以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ,移栽后若发育为更高且丰产的稻株,则可望“禾下乘凉”。
答案 (1)花药培养获得的单倍体经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体 (2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌群而获得的,在cDNA文库中容易筛选获得目的基因 限制酶和DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术
解析 (1)花药离体培养可获得单倍体,再经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离,所以可以明显缩短育种年限。秋水仙素能抑制纺锤体的形成,从而引起细胞内染色体数目加倍,故将单倍体愈伤组织培养于含秋水仙素的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可分化形成根、芽,常用于制造人工种子。(2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌群获得的,而基因组文库包含了本物种的全部基因,在cDNA文库中容易筛选获得目的基因。在构建重组Ti质粒时,需使用一定的限制酶切割质粒,再使用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段,之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。重组Ti质粒中含有抗生素抗性基因,在培养基中添加抗生素可以筛选获得含重组Ti质粒的菌株。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,用含eui基因的农杆菌侵染愈伤组织,可将eui基因导入愈伤组织,获得转基因再生植株。可采取DNA分子杂交技术检测再生植株是否含有eui基因。
cDNA文库与基因组文库
cDNA是用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,这个受体菌群体称为cDNA文库。基因组文库是将某种生物的DNA全部提取出来,选用适当的限制酶切成一定范围大小的DNA片段,再将这些DNA片段分别与载体连接后导入受体菌群获得的。
41.(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 ,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是 ,终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是 ,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了 ,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于 ,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案 (1)引物 (2)便于筛选含有目的基因的受体细胞 使转录在所需要的地方停下来 (3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量 (4)废弃物的资源化 减少了碳排放
解析 (1)利用PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因两端的核苷酸序列,根据这一序列设计并合成一对引物。(2)抗生素抗性基因作为标记基因,作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯,位于基因的下游,可使转录在所需要的地方停下来。(3)酶蛋白的大量合成消耗大量的物质和能量,导致重组梭菌用于自身生长、繁殖的物质和能量减少,菌体生长迟缓。(4)该技术使一个系统产出的污染物,能够成为本系统或另一个系统的生产原料,从而实现了废弃物的资源化。从“碳中和”的角度看,该技术减少了碳排放。
42.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
解析 (1)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。(3)由图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大。
43.[2022浙江1月选考,29(二),7分]我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩,但全球疫情形势仍然非常严峻,尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎,更是威胁着全人类的生命健康。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是:以新冠病毒的单链 RNA 为模板,利用 酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的 ,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是:将腺病毒的复制基因敲除;以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发特异性免疫反应。在此过程中,腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是:取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养,使其融合,最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比,杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分,如胰岛素和 。
答案 (二)(1)逆转录 核酸探针 (2)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (3)脾(B淋巴) 动物血清
解析 (二)(1)以新冠病毒的单链RNA为模板,在逆转录酶催化下可合成相应的DNA。经PCR扩增后的DNA,可利用特定的核酸探针进行检测。(2)制备腺病毒载体疫苗时需将以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发人体的特异性免疫反应。因此,腺病毒相当于基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除,可使腺病毒失去复制能力,防止其在人体内增殖。(3)制备单克隆抗体时,要取免疫阳性小鼠的脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合,筛选获得特定的杂交瘤细胞。相比植物组织培养,动物细胞的培养需要动物血清等特殊成分。
44.(2022全国乙,38,15分) 新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是 ,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明 (答出1种情况即可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
答案 (1)逆转录酶 (2)特异核苷酸序列 复性 (3)被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒 被检测者感染了病毒并产生了抗体 (4)获得目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA需要逆转录酶。(2)用PCR技术扩增新冠病毒RNA片段时,所需要的引物必须依据新冠病毒RNA中的特定核苷酸序列来进行设计。PCR过程每次循环分为变性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)和延伸(72 ℃左右)三个阶段,复性阶段温度最低。(3)同时进行核酸检测和抗体检测,若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒;若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明被检测者感染了病毒并产生了抗体。(4)基因工程技术获得大量蛋白S的基本操作流程:目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
45.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ
图Ⅲ
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:
用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
知识拓展 在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。
46.(2022河北,24,15分)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPin1A)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。
回答下列问题:
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的 上,此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有 (写出两点即可)。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析 (填“NaPI”或“StPin1A”或“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生 ,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是 (写出两点即可)。
答案 (1)抑制害虫胰蛋白酶活性,从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)基因表达载体的构建 (3)T-DNA 该方法一般不适用于单子叶植物 (4)PCR技术、抗原—抗体杂交技术 (5)接种试验 NaPI+StPin1A NaPI+StPin1A的转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多 (6)定向改变 昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;昆虫的胰蛋白酶基因发生突变,原有的胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用
解析 (1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道内的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性,使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质,从而达到抗虫的目的。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,可将Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞,并将其整合到受体细胞的染色体DNA上。故利用农杆菌转化法时,需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上。但农杆菌一般只感染双子叶植物和裸子植物,故其不足之处是该方法一般不适用于单子叶植物。(4)在分子水平上可通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上或检测目的基因是否转录出了mRNA;是否翻译出相应的蛋白质则需要使用抗原—抗体杂交技术。(5)抗虫基因导入植物细胞后,要鉴定其是否赋予植物抗虫特性,需要做抗虫接种试验。题图中,NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低,每株棉铃数最多,故其抗虫效果最佳。(6)昆虫种群本来就存在抗虫性强或弱的变异,在抗虫剂(蛋白酶抑制剂)的选择作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,使昆虫朝着一定的方向不断进化。蛋白酶抑制剂通过与害虫消化道内的蛋白酶结合使害虫不能消化蛋白质而死亡。昆虫具有抗胰蛋白酶抑制剂的能力可能是因为昆虫的胰蛋白酶发生突变,产生一种新胰蛋白酶,其不能与原有的胰蛋白酶抑制剂结合,使原有胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用;也可能是昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力。
47.(2021全国乙,38,15分)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能 ;质粒DNA分子上有 ,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是 。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指 。
答案 (1)EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 限制酶切割位点 将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
解析 (1)E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。
48.(2021全国甲,38,15分)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 (用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是 。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步, 其中复性的结果是
。
(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案 (1)④②③① (2)DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
解析 (1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①。(2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到55~60 ℃,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
49.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是 。
答案 (1)SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析 (1)观察图示可知,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切割位点,分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位点,但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,切割后载体的部分序列如图所示:
扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的片段连接起来。由题图中终止子及基因的位置可知,F1~F7末端添加序列后应与XhoⅠ切割的末端相连,R末端添加序列后应与MunⅠ切割的末端相连。由于调控序列及启动子中有XhoⅠ限制酶切割位点,所以需寻找切割后的末端能与XhoⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,SalⅠ符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;由于调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点,所以需寻找切割后的末端能与MunⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,EcoRⅠ符合这一要求,所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:
本实验中,用EcoRⅠ和SalⅠ切割扩增产物,用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,故从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导P发挥作用,使BCL11A基因表达。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白的结合位点(荧光蛋白基因能表达),由此可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
50.(2021广东,22,12分)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(图13),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。
图13
回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有 。
(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有 。
(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有 。
(4)依图13所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是 。在分子水平上,可以通过改变 ,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
答案 (1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成 (2)蛋白酶水解法、盐析法、60~75 ℃恒温水浴法 (3)感受态 抗原—抗体杂交 (4)部分酶失活,无法获得肌醇 基因结构
解析 (1)目前获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。(2)制备高质量DNA模板时,可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质,而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,当盐浓度较高时,蛋白质的溶解度下降并析出,这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性,严格控制温度范围,使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性,可将DNA与蛋白质分离。(3)将表达载体导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法是首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。然后将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白,可以从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已表达出蛋白质产品。(4)酶的作用条件较温和,在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活,不同酶的最适温度、最适pH一般不同,将4种酶放在同一体系中,控制温度、pH等条件一致,则部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活,不能达到实验目的,即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成,可以通过改造酶基因的结构,从而改变蛋白质的结构,进而实现对酶特性的改造和优化。
51.(2021河北,24,15分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为 。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是 。
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是 。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的 (填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
图1
图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 (写出两点即可)。
答案 (1)基因文库 (2)限制酶和DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)农杆菌转化法 防止YCF1基因随花粉扩散,给生态系统带来风险 (4)耐性 叶 (5)转基因杨树液泡膜上的Cd转运蛋白可将细胞质基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响 乔木比草本生物量大,与外界物质交换能力强
解析 (1)将含有某种生物细胞不同基因的许多DNA片段与载体连接起来,导入受体菌的群体中并储存,每个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,这个群体称为基因文库。(2)构建基因表达载体时需要用限制酶切割DNA分子和质粒,然后用DNA连接酶使获取的目的基因与质粒连接起来。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,以便筛选出含有目的基因的细胞。(3)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等,其中农杆菌转化法是将目的基因导入双子
专题24 基因工程
考点 基因工程
1.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 ( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案 C 酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部,酶切后会破坏标记基因,D不符合题意;酶3切割后产生平末端,E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端,故E.coli DNA连接酶无法连接酶3切割产生的平末端,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4 DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,C符合题意。
2.(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 ( )
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案 D DNA的粗提取与鉴定实验中,通过研磨破碎细胞,使细胞裂解释放DNA等物质,A正确;粗提取的DNA中可能会含有蛋白质、多糖、RNA等杂质,通过分离可以去除混合物中的杂质,B正确;根据DNA和蛋白质等在95%的冷酒精中的溶解度不同,可反复多次沉淀来提高DNA的纯度,C正确;DNA鉴定时,DNA溶液加入二苯胺试剂后,需要沸水浴加热才会变蓝,D错误。
3.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 ( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D 用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。
4.(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
甲
乙
下列叙述正确的是 ( )
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
答案 B 从图甲可知GFP和Gata3基因使用同一个启动子,故Gata3基因的启动子同时控制GFP和Gata3基因的表达,A错误;由于启动子区在左侧,基因的编码区在右侧,因此转录的方向是从左到右,mRNA的5'端为Gata3基因,3'端为GFP基因,因此翻译时先合成Gata3蛋白,B正确;大片段为Gata3-GFP基因,小片段为Gata3基因,因此2号为Gata3-GFP基因纯合子,4号为野生型,C错误;若用引物1和引物3进行PCR,则Gata3基因无法扩增,不利于区分纯合子和杂合子,D错误。
5.(2023浙江1月选考,2,2分)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述正确的是 ( )
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.治疗性克隆不需要监控和审查
C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
答案 D 试管婴儿技术可以帮助不育夫妇解决生育问题,不应全面禁止,A错误;治疗性克隆也需要监控和审查,B错误;生殖性克隆存在伦理道德方面的风险,C错误;我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验,D正确。
6.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是 ( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B 94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
6.(2022浙江1月选考,21,2分)羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc,但不发病。当羊感染了PrPSc后,PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc,导致PrPSc积累,从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病。下列分析合理的是 ( )
A.动物体内的 PrPSc可全部被蛋白酶水解
B.患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C.产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D.给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc,小鼠不会发病
答案 D 感染性蛋白粒子PrPSc会将羊体内的PrPc不断转变为PrPSc,PrPSc在体内积累从而导致发病,可见动物体内的PrPSc并不会全部被蛋白酶水解,A错误;患病羊体内存在指导蛋白质PrPc合成的基因,而PrPSc并不是自身合成的,而是外界感染的,B错误;PrPSc在体内积累从而导致发病,说明产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用,C错误;把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病,原因是患瘙痒病的羊组织匀浆含有感染性蛋白粒子PrPSc,小鼠体内含有PrPc,PrPc基因敲除小鼠不含PrPc,接种PrPSc后也不会发生使PrPc转变为PrPSc并积累PrPSc而致病的现象,D正确。
8.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是 ( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B 由于在低温条件下DNA酶的活性较低,因此过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A正确;DNA存在于上清液中,离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,B错误;沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C正确;并非所有蛋白质都可溶于冷酒精,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质,D正确。
9.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
10.(2021北京,14,2分)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是( )
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案 A 高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
11.(2021浙江6月选考,20,2分)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是( )
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案 B 受精卵在体外培养时,由于不同发育阶段的胚胎细胞所需的环境有所不同,因此需要更换不同成分的培养液,A正确;进行胚胎移植的早期胚胎通常为发育到8细胞以上的胚胎,如早期囊胚,B错误;利用胚胎干细胞通过核移植等技术来获得转基因小鼠时,可在短时间内获得大量的转基因小鼠胚胎,再通过胚胎移植技术大量培养转基因小鼠,C正确;根据题干信息可知,EGFP基因被定点插入Y染色体上,而Y染色体只有雄性才具有,因而观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎,D正确。
12.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
13.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C 根据题干信息可知,限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点是由6个碱基对构成的,若用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,则理论上得到DNA的的平均长度(碱基对)约为46碱基对,即约为4 000碱基对。故选C。
14.(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案 D PCR反应中出现非特异性条带的主要原因是引物与模板DNA出现了非特异性结合,模板DNA不纯或过多易出现非特异性结合,A错误;延长热变性时间与非特异性条带无直接关系,B错误;延长延伸时间易出现非特异性结合,C错误;复性温度偏低易出现非特异性结合,故提高复性温度可减少反应中非特异条带的产生,D正确。
15.(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案 A 加入适量的木瓜蛋白酶能分解滤液中的主要杂质——蛋白质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,A符合题意;37~40 ℃达不到破坏蛋白质所需的温度,所选温度应该是60~75 ℃,此温度能够破坏滤液中主要杂质蛋白质的结构,进而去除这些杂质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,B不符合题意;与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精是题干中的“特定试剂”,C不符合题意;加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L,经过以上处理后DNA析出,过滤后DNA主要存在于纱布上的过滤物中,在滤液中含量极少,经过D项处理后应过滤去除溶液中的杂质,再用物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,D不符合题意。
16.(2020山东,15,2分)新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是( )
A.抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理
B.感染早期,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况
C.患者康复后,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况
D.感染该病毒但无症状者,因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测
答案 D 抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理,A正确;感染早期,新冠病毒的核酸已进入机体,但机体可能尚未进行体液免疫产生抗体,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况,B正确;患者康复后,体内留有记忆细胞和抗体,而新冠病毒已被机体清除,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况,C正确;感染该病毒但无症状者,其体内会发生体液免疫产生抗体,适用抗体检测法检测,D错误。
17.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制酶,该酶会破坏重组质粒的结构,不利于重组质粒在受体中保持结构稳定,A错误;抗除草剂基因转入某抗盐植物获得的2个稳定遗传品系中有抗除草剂不抗盐的品系,抗盐性的改变可能与抗除草剂基因的转入有关,B错误;在DNA检测均含目的基因的条件下,抗性鉴定为抗除草剂说明目的基因完成了表达,抗性鉴定为不抗除草剂说明目的基因可能完成了转录而没有翻译成蛋白质,还有可能是目的基因没有转录,C错误;因为质粒为环形,用某限制酶完全酶切后出现3条带,说明酶切后的产物中有3种不同分子量的DNA,可以推测出质粒上至少有3个位置被该酶切开,D正确。
18.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
图1 酶切位点图
图2 电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案 D 本题通过对酶切位点图和电泳结果示意图的分析,考查基因工程工具酶的相关知识,以及观察图示、分析推理的能力,试题通过两种图示的分析体现了对科学思维素养中的演绎与推理要素的考查。图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道①②电泳结果知,泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。
19.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A.用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞
D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案 C 本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。
20.(2014重庆理综,4,6分)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述,正确的是( )
A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状
D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
答案 D ②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与,A错误;③侵染植物细胞后,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到④的染色体上,B错误;④的染色体上含有目的基因(抗虫基因)但不一定表达,C错误;基因工程依据的原理是基因重组,基因重组属于可遗传变异,D正确。
21.(2014重庆理综,2,6分)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述,错误的是( )
A.应严格选择转基因植物的目的基因,避免产生对人类有害的物质
B.当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验,但不反对治疗性克隆
C.反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
答案 D 在获得转基因植物时,要严格选择目的基因,避免产生对人类有害的毒性蛋白或过敏蛋白等物质,A正确;当今社会的普遍观点是禁止有关人类的生殖性克隆,但不反对治疗性克隆,B正确;反对设计试管婴儿的原因之一是有人将此技术用于设计婴儿性别,C正确;生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等,干扰素不属于生物武器,D错误。
22.(2013大纲全国,5,6分)下列实践活动包含基因工程技术的是( )
A.水稻F1花药经培养和染色体加倍,获得基因型纯合新品种
B.抗虫小麦与矮秆小麦杂交,通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C.将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞,经组织培养获得抗病植株
D.用射线照射大豆使其基因结构发生改变,获得种子性状发生变异的大豆
答案 C 本题主要考查不同育种方式所用到的技术。A项为单倍体育种,用到植物组织培养技术;B项为传统的杂交育种;C项抗病植株的培育用到基因工程技术和植物组织培养技术;D项为诱变育种。
23.(2013安徽理综,6,6分)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是( )
A.根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目
B.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
C.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接
D.放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
答案 D 本题主要考查微生物的计数和DNA分子杂交等相关知识。根据培养皿中菌落数只能估算样品中含有的活菌数目;外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能够进行转录;重组质粒与探针因碱基互补配对能进行分子杂交;用放射性标记的DNA探针与特定DNA分子杂交后,洗去未结合的探针,放射自显影结果可以显示原培养皿中含特定DNA的细菌菌落位置。
24.(2013广东理综,3,4分)从某海洋动物中获得一基因,其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物,首先要做的是( )
A.合成编码目的肽的DNA片段
B.构建含目的肽DNA片段的表达载体
C.依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D.筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
答案 C 由题中信息“在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物”可推知本题考查蛋白质工程的相关知识。根据蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因),可推知答案为C。
25.(2013江苏单科,15,2分)下列关于转基因生物安全性的叙述中,错误的是( )
A.我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B.国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C.开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D.目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
答案 B 本题考查了转基因生物安全性的有关知识。目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性两个方面;因对转基因生物的安全性还处于争论阶段,故不可能在转基因食品标签上警示性注明可能的危害;但我国已对转基因食品和农产品强制实施了产品标识制度,以维护消费者对转基因产品的知情权和选择权;开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提。
26.(2012江苏单科,13,2分)下列关于转基因生物安全性的叙述,错误的是( )
A.种植转基因作物应与传统农业种植区隔离
B.转基因作物被动物食用后,目的基因会转入动物体细胞中
C.种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性
D.转基因植物的目的基因可能转入根际微生物
答案 B 本题主要考查转基因生物安全性的相关问题,种植转基因作物时为了避免基因污染,应与传统农业种植区隔离,故A对;转基因作物被动物食用后,目的基因会被动物消化,不会转入动物体细胞中,故B错;转基因植物有可能将基因扩散至野生植物中,从而影响野生植物的遗传多样性,故C对;转基因植物的目的基因可被微生物利用,故D对。
27.(2012江苏单科,18,2分)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述,正确的是( )
A.洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B.将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C.常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取
D.用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少
答案 C 本题考查DNA粗提取与鉴定实验的基本知识。洗涤剂能瓦解细胞膜,但对DNA在NaCl溶液中的溶解度无影响,故A错误;DNA丝状物需先溶解在适宜浓度的NaCl溶液中,然后加入二苯胺试剂,混合均匀后沸水浴,待冷却后溶液变蓝,故B错误;常温下菜花匀浆中有些水解酶可能会使DNA水解而影响DNA的提取,故C正确;用玻棒朝一个方向缓慢搅拌可减轻对DNA分子的破坏,有利于DNA分子的提取,故D错误。
28.(2012浙江理综,6,6分)天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰,下列操作正确的是( )
A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因B
B.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D.将基因B直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞
答案 A 此题考查基因工程及其应用的相关知识。要获取目的基因B,可先提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再经PCR技术扩增基因B,A正确;基因文库构建是将目的基因与载体连接起来,形成重组载体,再导入受体菌中储存和扩增,提取目的基因时不需使用限制酶,B错误;连接目的基因与质粒的酶是DNA连接酶,C错误;将目的基因导入植物细胞,常用农杆菌转化法,不使用大肠杆菌,D错误。
29.(2011四川理综,5,6分)北极比目鱼中有抗冻基因,其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列,该序列重复次数越多,抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图,有关叙述正确的是( )
A.过程①获取的目的基因,可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B.将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C.过程②构成的重组质粒缺乏标记基因,需要转入农杆菌才能进行筛选
D.应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
答案 B 将多个抗冻基因编码区相连成能表达的新基因,合成的蛋白质为新的蛋白质,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白,故选项B正确;过程①是利用反转录法合成目的基因,由于没有非编码区和编码区中的内含子,不能用于比目鱼基因组测序;用作运载体的质粒,必须具有标记基因才能便于检测和筛选;应用DNA探针技术,可检测转基因抗冻番茄中目的基因的存在和转录,但不能检测是否成功表达,故选项A、C、D错误。
30.(2011江苏单科,19,2分)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中,相关叙述正确的是( )
A.用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L,滤去析出物
B.调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶,都可以去除部分杂质
C.将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈蓝色
D.用菜花替代鸡血作为实验材料,其实验操作步骤相同
答案 B 用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L时,滤取析出物;利用二苯胺试剂鉴定DNA时,需沸水浴加热几分钟,才呈蓝色;用菜花替代鸡血为实验材料,需要对材料的细胞壁进行处理。调节NaCl溶液浓度改变不同物质在其中的溶解度,加入木瓜蛋白酶分解蛋白质都可以去除部分杂质,故B正确。
31.(2011江苏单科,14,2分)关于现代生物技术应用的叙述,错误的是( )
A.蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质
B.体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体
C.植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒
D.动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育
答案 B 克隆动物是核移植工程的应用;茎尖分生能力强,没有病毒侵染,以茎尖为外植体,通过植物组织培养可获得无病毒植株;导入目的基因的受体细胞,需通过动物细胞培养技术获得早期胚胎,才能进一步培育成转基因动物。
32.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
33.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载
体的农杆菌共培养幼苗→ 转化
植株A
图1
植株B植株上半部分
浸入含重组载
体的农杆菌液植株长出
毛状根阳性毛
状根段幼苗→ 转化
植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
答案 (1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用 (2)遗传特性 转基因种子 (3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上 (4)检测毛状根段是否有绿色荧光 植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增) 若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带) (5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便
解析 (1)外植体经过脱分化形成愈伤组织,愈伤组织经过再分化形成幼苗,再分化培养基需要有一定比例的生长素和细胞分裂素。叶绿素的形成需要光,故再分化过程中需要适宜的光照以诱导叶绿素的形成。(2)图1中,若不经过愈伤组织与含重组载体的农杆菌共培养环节,直接诱导培养植株,则获得的植株遗传物质全部来自植株A,这种无性繁殖的方式可以保持植株A的遗传特性。为遵守我国对农业转基因生物实行的标识制度,需对含有外源基因的转化植株A生产的种子的包装标注“转基因种子”。(3)见答案。(4)用含有重组载体的农杆菌液处理植株B后长出的毛状根中若含有基因编辑载体(阳性毛状根),则该基因编辑载体中的绿色荧光蛋白基因可以在毛状根中表达,故可通过观察其是否含有绿色荧光筛选阳性毛状根。若导入幼苗中的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶基因测序就会出现序列缺失,或用另一种方法,根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增,不会出现扩增条带。(5)对比图1与图2知,与常规转化法相比,用CDB法进行基因递送不需要进行植物组织培养,不需要无菌操作,操作简便。
34.(2023湖南,21,13分)某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题:
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌,培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H,其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好,若要确定其有抑菌效果的最低浓度,需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌 抗菌肽浓度(μg·mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黄色葡 萄球菌 - - - - - + +
枯草芽 孢杆菌 - - - - - + +
禾谷镰 孢菌 - + + + + + +
假丝酵母 - + + + + + +
注:“+”表示长菌,“-”表示未长菌
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体,转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中,传代多次后,生产条件未变,但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 (答出两点即可)。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官,可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体,如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 (答出两点)等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 (填“是”或“否”)。
(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种耐药菌,严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型,来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体
②MRSA感染的肺类装配体
③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽
④生理盐水
⑤青霉素(抗金黄色葡萄球菌的药物)
⑥万古霉素(抗MRSA的药物)
答案 (1)淀粉、无机盐 (2)金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45 (3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失 (4)适宜的气体和无菌、无毒的环境 否 (5)②③④⑥
解析 (1)培养基的成分一般包含水、碳源、氮源和无机盐等营养成分,筛选分解淀粉的固氮细菌所需要的选择培养基中,除含水、无机盐外,还应含有淀粉,而不能含有有机氮。(2)从表中数据可以看出,抗菌肽浓度为3.45~55.20 μg·mL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无法存活,禾谷镰孢菌和假丝酵母在抗菌肽浓度为55.20 μg·mL-1时无法存活,而在抗菌浓度低于27.6 μg·mL-1(含)时可存活,故抗菌肽对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制效果较好。抗菌肽浓度为1.73 μg·mL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均能存活,而在3.45 μg·mL-1时均不能存活,所以若要确定抗菌肽有抑菌效果的最低浓度,应在1.73~3.45 μg·mL-1浓度区间进一步实验。(3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失时,菌株不能再产生淀粉酶M。(4)动物细胞培养除需要满足适宜的营养、温度、渗透压和pH条件外,还需要适宜的气体环境(95%空气和5%CO2)以满足代谢需求和维持培养液pH,以及无菌、无毒的环境防止其他微生物的污染和细胞代谢物的危害。肺类装配体形成过程涉及两种或多种细胞的共培养,但并未运用动物细胞融合技术。(5)若要探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力,需至少取三组MRSA感染的肺类装配体进行培养,第一组加入解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽,第二组加入万古霉素(作为有抗菌效果的对照),第三组加入等量生理盐水(作为无抗菌效果的对照),观察并比较三组肺类装配体的生长情况,若第一组肺类装配体生长情况明显好于第三组,且与第二组类似或好于第二组,说明该抗菌肽对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。
35.(2023全国甲,38,15分)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是
。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。
答案 (1)该疫苗不含乙肝病毒DNA,不会在人体细胞内增殖产生乙肝病毒 (2)作为标记基因筛选出转化成功的酵母细胞 RNA聚合酶 (3)基因组DNA 放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段 (4)从酵母细胞中提取蛋白质,用乙肝病毒表面抗原的特异性抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,说明酵母细胞中表达出目的蛋白。
解析 (1)只有乙肝病毒的DNA分子进入人体细胞,才能以其为模板进行DNA复制和外壳蛋白的表达,然后装配形成子代乙肝病毒。重组乙肝疫苗只含有乙肝病毒表面抗原,不含乙肝病毒DNA分子,不会在人体细胞内产生乙肝病毒。(2)载体上的抗生素抗性基因常作为标记基因,用于将成功导入重组基因表达载体的细胞筛选出来。细胞中的RNA聚合酶可识别载体中的启动子,并以目的基因的一条链为模板进行转录。(3)由于不能确定目的基因是否插入染色体中,需提取酵母细胞的基因组DNA,加热变性,用基因探针进行检测。该探针中需要含有目的基因中的特异性片段,且带有放射性同位素等标记。若受体细胞的染色体中含有目的基因,该探针就会与目的基因通过碱基互补配对结合在一起,从而在放射性等检测中观察到杂交带。(4)抗乙肝病毒表面抗原的抗体可与乙肝病毒表面抗原特异性结合,故可用该抗体与酵母细胞中提取出来的蛋白质进行抗原—抗体杂交,若出现杂交带,则可证明酵母细胞中表达出目的蛋白。
36.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是 。
答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录 将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子的简并性 (4)获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光
解析 (1)见答案。(2)基因表达载体中,启动子和终止子分别位于目的基因的上游和下游,由图中GFP突变基因的转录方向可判断,位于目的基因上游的②为启动子,位于目的基因下游的①为终止子,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因的转录。氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,用于筛选含目的基因的受体细胞。(3)绝大多数氨基酸都有几个密码子,若突变后的基因转录出的mRNA中的密码子与原基因序列所对应的密码子编码的氨基酸相同,则性状不发生改变。(4)若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可用获得的YFP基因构建表达载体后导入真核细胞内,检验受体细胞能否发出黄色荧光。
37.(2023浙江6月选考,23,14分)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸,而人类主要食物中的赖氨酸含量很低,利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。
回答下列问题:
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时,能抑制合成过程中两种关键酶的活性,导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平,这种调节方式属于 。根据这种调节方式,在培养基中添加 ,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞,可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体,通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展,2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为:
①构建乳腺专一表达载体。 随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索 获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内,与BEF膜发生 ,表达载体最终进入细胞核,发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞,从牛卵巢获取卵母细胞,经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合,电融合的作用除了促进细胞融合,同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ,植入代孕母牛子宫角,直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测:利用PCR技术,以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照,以 为阳性对照,检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测:从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞,提取总RNA,对总RNA进行 处理,以去除DNA污染,再经逆转录形成cDNA,并以此为 ,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达,而不在牛耳组织细胞内表达,原因是什么 。
答案 (1)(负)反馈调节 一定浓度的赖氨酸类似物 (2)①基因(序列)数据库 ②融合 ③受体细胞 激活 ④桑葚胚或囊胚 ⑤含酪蛋白基因的牛耳组织细胞 DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子,只能在乳腺细胞中启动转录,而在牛耳组织细胞中不能表达
解析 (1)一个系统工作的效果反过来抑制该系统的工作称为负反馈调节,基于此原理,若在培养基中加入一定浓度的赖氨酸类似物作为选择培养基,就可筛选获得抗赖氨酸类似物的细胞突变体。(2)①用化学方法合成目的基因时,需要已知其全部序列,所以可以通过基因(序列)数据库检索查询该序列。②利用膜融合的方式可将脂质体包裹的表达载体转入特定受体细胞。③核移植时常用的受体细胞为去核卵母细胞,携带转基因的BEF(核供体细胞)与受体细胞通过电融合法诱导融合,使供体核进入卵母细胞,形成重组细胞,同时电刺激还可激活重组细胞,使其完成细胞分裂和发育进程。④当重组细胞发育至桑葚胚或囊胚时进行胚胎移植。⑤阳性对照是指含有目的基因的细胞,所以用含酪蛋白基因的牛耳组织细胞作为阳性对照,通过对比判断目的基因是否导入转基因牛组织细胞中。可从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞中提取总RNA,对总RNA进行DNA酶处理,以除去细胞中的DNA,只剩下RNA,再通过逆转录形成cDNA,并以此为模板利用PCR技术扩增DNA检验基因是否表达。不同种类细胞中遗传信息的表达情况不同,含乳腺特异性启动子的表达载体只在乳腺细胞中表达。
38.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
图1
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
图2
图3
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
解析 (1)野生型DA1基因为显性基因,若导入成功,转基因植株的种子大小应与野生型的一致。(2)用农杆菌转化法进行转基因需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,所以需将二者用同种限制酶切割再用DNA连接酶连接。如要目的基因正常表达,其上游要有启动子驱动转录开始,下游要有终止子终止转录。(3)①能在选择培养基上萌发并生长的阳性个体说明其基因组中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。②T0代植株自交后所得的T1代种子若能在选择培养基上存活,则为导入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的阳性种子,但导入的数量未知,故用T1代植株继续自交,若某T1代植株为基因组单一位点插入,则其产生的T2代种子在选择培养基上的存活率(阳性率)为75%。③目标转基因植株应为纯合阳性子代,T2代植株中存在杂合阳性和纯合阳性子代,应该用自交的方法筛选,若后代不再出现性状分离,即阳性率为100%,说明培养基中的幼苗为目标转基因植株。(4)野生型基因和突变型基因长度均为150 bp,野生型基因内部无限制酶X的酶切位点,突变型基因在50 bp处有一个限制酶X的酶切位点,所以酶切后野生型出现1个150 bp的条带,而突变型出现100 bp和50 bp两个条带。
39.(2022天津,15,10分)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因, 为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物 和 ,并在引物的 (5'/3')端引入XhoⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含 (EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ/Xho Ⅰ)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为 。
A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C.卡那霉素和链霉素都敏感
D.卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案 (1)1 4(以上两空可调换) 5' (2)Xho Ⅰ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR(聚合酶链式反应,答案合理即可)
解析 (1)结合题图中载体1分析,要去除SacB区域,应扩增SacB区域外的DNA片段,所选择的两种引物应方向相反,且位于扩增部位两端,故应选引物1和4。由于PCR扩增时,子链从引物的3'端开始延伸,因此应在引物的5'端引入合适的限制酶识别序列。(2)根据题图中构建载体4的过程可知,从载体3扩增出的RpsL片段插入了载体2的XhoⅠ位点,故以载体3为模板扩增RpsL时所需引物应包含XhoⅠ酶识别序列。(3)因受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感,载体5上具有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因),故成功导入载体5的菌株链霉素敏感、卡那霉素不敏感,所以,为获得成功导入载体5的菌株,应利用含有卡那霉素的平板进行初步筛选,选择平板上出现的菌落即可。(4)P1基因整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失,所以该菌的表型依然是受体菌的表型,即链霉素不敏感、卡那霉素敏感,故B正确。(5)以受体菌拟核DNA为模板,采用P1基因特异性引物进行PCR扩增,若获得相应大小片段,即可表明该菌株成功整合了P1基因。
40.(2022重庆,26,15分)改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因,并开展了相关探索。
步骤Ⅰ:
步骤Ⅱ:
(1)花药培养能缩短育种年限,原因是 。在步骤Ⅰ的花药培养过程中,可产生单倍体愈伤组织,将其培养于含 的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。Ⅰ中能用于制造人工种子的材料是 。
(2)步骤Ⅱ中,eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库,原因是 ;在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株,需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后,应侵染Ⅰ中的 ,以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ,移栽后若发育为更高且丰产的稻株,则可望“禾下乘凉”。
答案 (1)花药培养获得的单倍体经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体 (2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌群而获得的,在cDNA文库中容易筛选获得目的基因 限制酶和DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术
解析 (1)花药离体培养可获得单倍体,再经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离,所以可以明显缩短育种年限。秋水仙素能抑制纺锤体的形成,从而引起细胞内染色体数目加倍,故将单倍体愈伤组织培养于含秋水仙素的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可分化形成根、芽,常用于制造人工种子。(2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌群获得的,而基因组文库包含了本物种的全部基因,在cDNA文库中容易筛选获得目的基因。在构建重组Ti质粒时,需使用一定的限制酶切割质粒,再使用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段,之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。重组Ti质粒中含有抗生素抗性基因,在培养基中添加抗生素可以筛选获得含重组Ti质粒的菌株。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,用含eui基因的农杆菌侵染愈伤组织,可将eui基因导入愈伤组织,获得转基因再生植株。可采取DNA分子杂交技术检测再生植株是否含有eui基因。
cDNA文库与基因组文库
cDNA是用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,这个受体菌群体称为cDNA文库。基因组文库是将某种生物的DNA全部提取出来,选用适当的限制酶切成一定范围大小的DNA片段,再将这些DNA片段分别与载体连接后导入受体菌群获得的。
41.(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 ,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是 ,终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是 ,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了 ,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于 ,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案 (1)引物 (2)便于筛选含有目的基因的受体细胞 使转录在所需要的地方停下来 (3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量 (4)废弃物的资源化 减少了碳排放
解析 (1)利用PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因两端的核苷酸序列,根据这一序列设计并合成一对引物。(2)抗生素抗性基因作为标记基因,作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯,位于基因的下游,可使转录在所需要的地方停下来。(3)酶蛋白的大量合成消耗大量的物质和能量,导致重组梭菌用于自身生长、繁殖的物质和能量减少,菌体生长迟缓。(4)该技术使一个系统产出的污染物,能够成为本系统或另一个系统的生产原料,从而实现了废弃物的资源化。从“碳中和”的角度看,该技术减少了碳排放。
42.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
解析 (1)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。(3)由图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大。
43.[2022浙江1月选考,29(二),7分]我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩,但全球疫情形势仍然非常严峻,尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎,更是威胁着全人类的生命健康。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是:以新冠病毒的单链 RNA 为模板,利用 酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的 ,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是:将腺病毒的复制基因敲除;以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发特异性免疫反应。在此过程中,腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是:取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养,使其融合,最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比,杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分,如胰岛素和 。
答案 (二)(1)逆转录 核酸探针 (2)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (3)脾(B淋巴) 动物血清
解析 (二)(1)以新冠病毒的单链RNA为模板,在逆转录酶催化下可合成相应的DNA。经PCR扩增后的DNA,可利用特定的核酸探针进行检测。(2)制备腺病毒载体疫苗时需将以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发人体的特异性免疫反应。因此,腺病毒相当于基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除,可使腺病毒失去复制能力,防止其在人体内增殖。(3)制备单克隆抗体时,要取免疫阳性小鼠的脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合,筛选获得特定的杂交瘤细胞。相比植物组织培养,动物细胞的培养需要动物血清等特殊成分。
44.(2022全国乙,38,15分) 新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是 ,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明 (答出1种情况即可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
答案 (1)逆转录酶 (2)特异核苷酸序列 复性 (3)被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒 被检测者感染了病毒并产生了抗体 (4)获得目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA需要逆转录酶。(2)用PCR技术扩增新冠病毒RNA片段时,所需要的引物必须依据新冠病毒RNA中的特定核苷酸序列来进行设计。PCR过程每次循环分为变性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)和延伸(72 ℃左右)三个阶段,复性阶段温度最低。(3)同时进行核酸检测和抗体检测,若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒;若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明被检测者感染了病毒并产生了抗体。(4)基因工程技术获得大量蛋白S的基本操作流程:目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
45.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ
图Ⅲ
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:
用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
知识拓展 在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。
46.(2022河北,24,15分)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPin1A)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。
回答下列问题:
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的 上,此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有 (写出两点即可)。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析 (填“NaPI”或“StPin1A”或“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生 ,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是 (写出两点即可)。
答案 (1)抑制害虫胰蛋白酶活性,从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)基因表达载体的构建 (3)T-DNA 该方法一般不适用于单子叶植物 (4)PCR技术、抗原—抗体杂交技术 (5)接种试验 NaPI+StPin1A NaPI+StPin1A的转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多 (6)定向改变 昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;昆虫的胰蛋白酶基因发生突变,原有的胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用
解析 (1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道内的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性,使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质,从而达到抗虫的目的。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,可将Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞,并将其整合到受体细胞的染色体DNA上。故利用农杆菌转化法时,需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上。但农杆菌一般只感染双子叶植物和裸子植物,故其不足之处是该方法一般不适用于单子叶植物。(4)在分子水平上可通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上或检测目的基因是否转录出了mRNA;是否翻译出相应的蛋白质则需要使用抗原—抗体杂交技术。(5)抗虫基因导入植物细胞后,要鉴定其是否赋予植物抗虫特性,需要做抗虫接种试验。题图中,NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低,每株棉铃数最多,故其抗虫效果最佳。(6)昆虫种群本来就存在抗虫性强或弱的变异,在抗虫剂(蛋白酶抑制剂)的选择作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,使昆虫朝着一定的方向不断进化。蛋白酶抑制剂通过与害虫消化道内的蛋白酶结合使害虫不能消化蛋白质而死亡。昆虫具有抗胰蛋白酶抑制剂的能力可能是因为昆虫的胰蛋白酶发生突变,产生一种新胰蛋白酶,其不能与原有的胰蛋白酶抑制剂结合,使原有胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用;也可能是昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力。
47.(2021全国乙,38,15分)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能 ;质粒DNA分子上有 ,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是 。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指 。
答案 (1)EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 限制酶切割位点 将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
解析 (1)E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。
48.(2021全国甲,38,15分)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 (用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是 。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步, 其中复性的结果是
。
(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案 (1)④②③① (2)DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
解析 (1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①。(2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到55~60 ℃,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
49.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是 。
答案 (1)SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析 (1)观察图示可知,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切割位点,分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位点,但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,切割后载体的部分序列如图所示:
扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的片段连接起来。由题图中终止子及基因的位置可知,F1~F7末端添加序列后应与XhoⅠ切割的末端相连,R末端添加序列后应与MunⅠ切割的末端相连。由于调控序列及启动子中有XhoⅠ限制酶切割位点,所以需寻找切割后的末端能与XhoⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,SalⅠ符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;由于调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点,所以需寻找切割后的末端能与MunⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,EcoRⅠ符合这一要求,所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:
本实验中,用EcoRⅠ和SalⅠ切割扩增产物,用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,故从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导P发挥作用,使BCL11A基因表达。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白的结合位点(荧光蛋白基因能表达),由此可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
50.(2021广东,22,12分)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(图13),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。
图13
回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有 。
(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有 。
(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有 。
(4)依图13所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是 。在分子水平上,可以通过改变 ,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
答案 (1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成 (2)蛋白酶水解法、盐析法、60~75 ℃恒温水浴法 (3)感受态 抗原—抗体杂交 (4)部分酶失活,无法获得肌醇 基因结构
解析 (1)目前获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。(2)制备高质量DNA模板时,可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质,而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,当盐浓度较高时,蛋白质的溶解度下降并析出,这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性,严格控制温度范围,使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性,可将DNA与蛋白质分离。(3)将表达载体导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法是首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。然后将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白,可以从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已表达出蛋白质产品。(4)酶的作用条件较温和,在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活,不同酶的最适温度、最适pH一般不同,将4种酶放在同一体系中,控制温度、pH等条件一致,则部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活,不能达到实验目的,即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成,可以通过改造酶基因的结构,从而改变蛋白质的结构,进而实现对酶特性的改造和优化。
51.(2021河北,24,15分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为 。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是 。
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是 。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的 (填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
图1
图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 (写出两点即可)。
答案 (1)基因文库 (2)限制酶和DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)农杆菌转化法 防止YCF1基因随花粉扩散,给生态系统带来风险 (4)耐性 叶 (5)转基因杨树液泡膜上的Cd转运蛋白可将细胞质基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响 乔木比草本生物量大,与外界物质交换能力强
解析 (1)将含有某种生物细胞不同基因的许多DNA片段与载体连接起来,导入受体菌的群体中并储存,每个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,这个群体称为基因文库。(2)构建基因表达载体时需要用限制酶切割DNA分子和质粒,然后用DNA连接酶使获取的目的基因与质粒连接起来。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,以便筛选出含有目的基因的细胞。(3)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等,其中农杆菌转化法是将目的基因导入双子
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