（2）微生物的培养与应用
【考点梳理】
典例1
下表所示为某微生物培养基的配方，有关叙述错误的是( )
成分 含量 成分 含量
NaNO3 3g FeSO4 0.01g
K2HPO4 1g 葡萄糖 30g
琼脂 15g H2O 1000mL
MgSO4·7H2O 0.5g 青霉素 0.1万单位
A.依物理性质划分，该培养基属于固体培养基；依用途划分，该培养基属于选择培养基
B.由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌或毛霉
C.本培养基中青霉素的添加满足了微生物生长对特殊营养物质的要求
D.若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素
答案：C
解析：从培养基成分看，配方中含有琼脂，应属于固体培养基；依用途划分，该培养基中加入了青霉素，因此属于选择培养基，A正确。由培养基成分可知，葡萄糖属于有机碳源，因此该培养基所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌或毛霉，B正确。本培养基中青霉素的添加是为了筛选能够抗青霉素的微生物，青霉素不属于微生物生长所需的特殊营养物质，C错误。若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并加入尿素，D正确。
考点链接
培养基及无菌技术
一、概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
二、种类：（按物理性质分）
三、营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
四、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1.培养基配制的原则
（1）目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。
（2）营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用。
（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH约为6.5～7.5、放线菌的适宜pH约为7.5～8.5、真菌的适宜pH约为5.0～6.0。为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸氢二钾—磷酸二氢钾。
2.步骤
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
五、无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。主要内容包括：
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
六、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
例题练习
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，关于倒平板的描述正确的是( )
①等培养基冷却至40℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞
③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰
④用左手的拇指和食指打开皿盖
⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上皿盖
⑥等待平板冷却5~10s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A.①②③④ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
答案：C
解析：①等培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，防止杂菌污染，①错误；
②不能将灭过菌的培养皿放在桌面上，因为桌面上可能有杂菌，②错误；
③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰，高温可防止杂菌污染，③正确；
④用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不能打开皿盖，④错误；
⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上皿盖，并通过酒精灯火焰，⑤正确；
⑥等待平板冷却5～10分钟，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，⑥错误。
故选：C。
2.下列有关培养基配制的描述，正确的是( )
A.液体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定
B.任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐等成分
C.在配制培养基时，应先灭菌再进行分装
D.微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、渗透压等影响
答案：D
解析：固体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定，A错误；培养基不一定含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基不需加碳源，分离自生固氮菌的培养基不需加氮源，B错误；配制培养基时应先分装再进行灭菌，避免分装过程中的污染，C错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、氧气、渗透压等的影响，D正确。
典例2
下列有关细菌纯化培养的说法，不正确的是( )
A.实验操作者接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒
B.每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌
C.培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆
D.菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数
答案：C
解析：在细菌的纯化培养过程中，可以使用稀释涂布平板法，也可以使用平板划线法，都可以得到单菌落，得到的单菌落通常是一个或者少数几个菌的克隆。故C选项错误。
考点链接
纯化大肠杆菌
一、纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。
二、纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
1.平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
2.释释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
①系列稀释操作：
a.将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
b.用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。
c.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
②涂布平板操作：
三、培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别记录观察。
四、菌种保存
临时保藏法 甘油管藏法
适用对象 频繁使用的菌种 长期保存的菌种
培养基类型 固体斜面培养基 液体培养基
温度 4℃ -20℃
方法 菌落长成后放入冰箱中保存，以后每3～6个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上 将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后放在冷冻箱内保存
例题练习
1.用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点是( )
A.都可以用固体培养基或液体培养基 B.接种时都需要在酒精灯的火焰旁进行
C.都需要使用接种环进行接种 D.都可以用来统计样品中的活菌数
答案：B
解析：平板划线法或稀释涂布平板法都是在固体培养基上进行的；不论是平板划线法还是稀释涂布平板法都需要进行无菌操作，需在酒精灯火焰旁进行；平板划线法使用接种环进行接种，稀释涂布平板法使用涂布器进行接种；稀释涂布平板法可以用来统计样品中的活菌数，而平板划线法不能用于统计样品中的活菌数。
2.下列关于大肠杆菌的培养中叙述不正确的是( )
A.在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑PH、温度和渗透压等条件
B.在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒
C.若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想所得估计值更接近实际值除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的稀释度
D.使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃
答案：B
解析：培养过程中，除营养条件要满足需要外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件是否适宜；灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以，对培养基和培养皿进行灭菌而不是消毒；使用稀释涂布平板法时要保证样品稀释比例合适，这样才会有更科学的数据；有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状，所以使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
典例3
分离土壤中尿素分解菌的实验操作中，无法分离得到尿素分解菌的原因最可能是( )
A.制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B.涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌
C.牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D.接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
答案：C
解析：从土壤中分离微生物的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。回顾和梳理分离土壤中分解尿素菌的实验操作的相关知识，认真分析各个选项即可正确作答。A.制备浸出液的土壤取自土壤的表层与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，A错误；B.涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，B错误；C.该培养基必须以尿素为唯一的氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基或在其中添加尿素作为氮源，该操作对实验影响最大，C正确；D.接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒，可能会造成污染，但与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，D错误。
考点链接
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、研究思路
1.筛选菌株
（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
（2）选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2.统计菌落数目
（1）活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M。
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）。
M：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
（2）显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
3.设置对照
（1）对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
（2）主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计
1.土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。
2.样品的稀释
（1）稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。
（2）稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。
3.微生物的培养与观察
（1）培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
三、菌种鉴定
1.原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。
2.方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
例题练习
1.在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述，出现科学性错误的是( )
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B.可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以检测培养基是否受到污染
C.如果其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，结果与甲同学一致，则可以证明甲同学无误
D.B、C项的实验思路都遵循了实验的对照原则
答案：D
解析：甲同学获得的菌落数目远大于其他同学，原因可能是所取的土样不同，也可能是操作过程中培养基被污染，A正确；污染可能是培养基灭菌不彻底，或操作过程没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，可以检测培养基是否受到污染，B正确；若是土样不同造成的，让其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C正确；B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复性原则，D错误。
2.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，有关叙述错误的是( )
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH再灭菌
B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
答案：C
解析：在配制步骤②、③所用的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌，A错误；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单细胞菌落，B正确；要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，而牛肉膏和蛋白胨都能提供氮源，因此步骤③所用的培养基不能是牛肉膏蛋白胨培养基，C错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。
典例4
下列有关“分解纤维素的微生物的分离”实验的说法，正确的是( )
A.纤维素酶中C1酶和葡萄糖苷酶都能将纤维素分解成纤维二糖
B.在选择培养基中直接加入刚果红进行纤维素分解菌的鉴别
C.应先利用固体选择培养基增加纤维素分解菌的浓度，以保证筛选效果
D.菌落周围的透明圈不一定是能分解纤维素的微生物所形成的
答案：D
解析：纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和Cx酶能将纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖，A错误；在用刚果红染色法鉴别纤维素分解菌时，使用的是鉴别培养基，B错误；增加纤维素分解菌的浓度使用的是液体培养基，C错误；有些微生物能降解色素，因此刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈，D正确。
考点链接
分解纤维素的微生物的分离
一、纤维素与纤维素酶
1.纤维素
纤维素属于多糖类物质，可用于纺织工业，可造纸；食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄等。自然界中纤维素含量最高的天然产物是棉花，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的。
2.纤维素酶
（1）组分：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖，从而使纤维素能为微生物的生长提供营养。
（2）作用
二、纤维素分解菌的筛选
土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
1.土壤取样应选择富含纤维素的环境，或者将滤纸等埋在土壤中，一段时间后从腐烂的滤纸上取样。
2.选择培养的目的是增加目的菌的浓度。若所选土样纤维素分解菌丰富，此步骤可以省略；若所选士样中纤维素分解菌较少，此步骤也可重复，重复选择培养次数越多，最后的培养液中纤维素分解菌浓度越大。
选择培养应用的是液体培养基，理论上应是以纤维素为唯一碳源的选择培养基。事实上课本中给出的选择培养基配方中含有少量其他碳源，但并不影响通过选择培养增大目的菌浓度。
3.样品涂布到鉴别培养基上之前需要进行梯度稀释，鉴别培养基中需加刚果红溶液，筛选带有透明圈的菌落。加入刚果红溶液的时间可以是倒平板时，也可以是长出菌落后。
例题练习
1.科研人员在富含纤维素的培养基中加入刚果红（刚果红能与纤维素结合形成红色复合物，但不能与纤维素水解后产生的纤维二糖和葡萄糖发生反应），再接种土壤浸出液，准备从土壤中筛选出高效降解纤维素的细菌。如图表示恒温培养后平板中菌落周围出现透明圈的情况，下列有关说法错误的是( )
A.可用牛肉膏、蛋白胨配制该培养基 B.培养基的pH需调至中性或微碱性
C.所用接种方法为稀释涂布平板法 D.应选择图中菌落③作为目的菌种进行推广使用
答案：A
解析：该培养基用于筛选并鉴定能高效降解纤维素的细菌，应以纤维素作为唯一碳源，牛肉膏和蛋白胨可为微生物提供碳源，不能用于配制该培养基，A错误；在培养细菌时，需要将培养基的pH调至中性或微碱性，B正确；根据菌落分布情况可知，接种采用的是稀释涂布平板法，C正确；透明圈的直径与菌落直径的比值越大，说明菌种降解纤维素的效果越好，故应选择菌落③作为目的菌种进行推广使用，D正确。
2.为分离土壤中分解纤维素的微生物，某同学设计了以下两种培养基配方（用蒸馏水定容到1000mL）：
其中，酵母膏的主要作用是提供维生素等物质，水解酪蛋白可提供氮源，请判断下列说法，错误的是( )
A.上述两种培养基中，乙培养基是固体培养基
B.若采用甲培养基进行初步选择，则需要再添加一定量纤维素
C.经初步选择后，在甲培养基中能够分离出目的微生物菌落
D.可以采用稀释涂布平板法在添加了刚果红染料的乙培养基上分离目的微生物
答案：C
解析：根据培养基的成分中是否有琼脂来判断是否为固体培养基，有琼脂成分的为固体培养基，A正确；土壤中分解纤维素的微生物数量较少，为提高其浓度，可以初步选择培养，为确保能分离到纤维素分解菌，需要配制加入纤维素作为碳源的培养基，培养纤维素分解菌的同时抑制其他杂菌生长，B正确；甲培养基不是固体培养基，也缺乏纤维素作为碳源，在甲培养基中无法形成纤维素分解菌单菌落，即无法分离出目的微生物，C错误；鉴定纤维素分解菌的方法是刚果红染色法，利用稀释涂布平板法进行接种，能够获取由单个细胞形成的菌落，D正确。
【要点突破】
一、培养基的成分及功能
营养物质 作用 功能 主要来源
碳源 能为微生物代谢提供碳元素 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 能为微生物的代谢提供氮元素 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子 是生长必不可少的 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 是生命活动所必需的 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 外界摄入
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机化合物
二、倒平板操作的注意事项
1.培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
2.要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
4.平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
5.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
6.整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
三、几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱160～170℃加热1～2h 玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽灭菌 100kPa、121℃维持15～30min 培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 70～75℃煮30min或80℃煮15min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 30W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
四、平板划线法和稀释涂布平板法的比较
优点 缺点 适用范围
平板划线分离法 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 不能计数 适用于好氧菌
稀释涂布平板法 可以计数，可以观察菌落特征 吸收量较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
五、统计菌落数目的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：
项目 直接计数法 间接计数法
原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要用具 显微镜、细菌计数板 培养基
计数数据 菌体本身 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
六、选择培养基的选择作用
（1）原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
（2）方法：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。
③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
七、纤维素分解菌与尿素分解菌的分离与鉴定比较
纤维素分解菌的分离与鉴定 尿素分解菌的分离与鉴定
分离条件 纤维素为主要碳源 尿素作为唯一氮源
鉴定方法 在以纤维素为主要碳源的培养基上，利用刚果红染色法，出现透明圈 培养基中加入酚红指示剂，变红色
鉴定原理 分解纤维素的微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使纤维素—刚果红复合物降解而出现透明圈 分解尿素的微生物合成脲酶，将尿素分解产生NH3，使pH升高，加入酚红变红色
步骤 土壤取样→制备培养基→选择培养→富集培养→梯度稀释→涂布培养→刚果红染色法→挑取菌落→进一步鉴定 土壤取样→制备培养基→样品梯度稀释→涂布平板→培养观察→进一步鉴定
八、培养基的类型及应用
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产，连续培养
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、对微生物进行分类及鉴定
固体培养基 对微生物进行分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 对微生物进行分类、鉴别
用途 选择培养基 添加（或缺少）某种化学成分 培养、分离出特定微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物
易错辨析
关于纤维素分解菌筛选的三个易错警示
（1）纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
（2）在纤维素分解菌的选择培养基中生长的不只有纤维素分解菌。因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。
（3）出现透明圈的菌落也不一定是纤维素分解菌。
2(共43张PPT)
2024届高考生物一轮复习课件
第九单元 生物技术实践
（2）微生物的培养与应用
核心考点
培养基及无菌技术
纯化大肠杆菌
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
分解纤维素的微生物的分离
典例1
下表所示为某微生物培养基的配方，有关叙述错误的是( )
A.依物理性质划分，该培养基属于固体培养基；依用途划分，该培养基属于选择培养基
B.由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌或毛霉
C.本培养基中青霉素的添加满足了微生物生长对特殊营养物质的要求
D.若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素
成分 含量 成分 含量
NaNO3 3g FeSO4 0.01g
K2HPO4 1g 葡萄糖 30g
琼脂 15g H2O 1000mL
MgSO4·7H2O 0.5g 青霉素 0.1万单位
典例1
答案：C
解析：从培养基成分看，配方中含有琼脂，应属于固体培养基；依用途划分，该培养基中加入了青霉素，因此属于选择培养基，A正确。由培养基成分可知，葡萄糖属于有机碳源，因此该培养基所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌或毛霉，B正确。本培养基中青霉素的添加是为了筛选能够抗青霉素的微生物，青霉素不属于微生物生长所需的特殊营养物质，C错误。若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并加入尿素，D正确。
考点链接
培养基及无菌技术
一、概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
二、种类：（按物理性质分）
三、营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
四、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1.培养基配制的原则
（1）目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。
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（2）营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用。
（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH约为6.5～7.5、放线菌的适宜pH约为7.5～8.5、真菌的适宜pH约为5.0～6.0。为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸氢二钾—磷酸二氢钾。
2.步骤
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
五、无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。主要内容包括：
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
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（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
六、消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
例题练习
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，关于倒平板的描述正确的是( )
①等培养基冷却至40℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞
③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰
④用左手的拇指和食指打开皿盖
⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上皿盖
⑥等待平板冷却5~10s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A.①②③④ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
答案：C
解析：①等培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，防止杂菌污染，①错误；②不能将灭过菌的培养皿放在桌面上，因为桌面上可能有杂菌，②错误；③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰，高温可防止杂菌污染，③正确；④用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不能打开皿盖，④错误；⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上皿盖，并通过酒精灯火焰，⑤正确；⑥等待平板冷却5～10分钟，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，⑥错误。故选：C。
例题练习
2.下列有关培养基配制的描述，正确的是( )
A.液体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定
B.任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐等成分
C.在配制培养基时，应先灭菌再进行分装
D.微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、渗透压等影响
答案：D
解析：固体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定，A错误；培养基不一定含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基不需加碳源，分离自生固氮菌的培养基不需加氮源，B错误；配制培养基时应先分装再进行灭菌，避免分装过程中的污染，C错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、氧气、渗透压等的影响，D正确。
典例2
下列有关细菌纯化培养的说法，不正确的是( )
A.实验操作者接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒
B.每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌
C.培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆
D.菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数
答案：C
解析：在细菌的纯化培养过程中，可以使用稀释涂布平板法，也可以使用平板划线法，都可以得到单菌落，得到的单菌落通常是一个或者少数几个菌的克隆。故C选项错误。
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纯化大肠杆菌
一、纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。
二、纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
1.平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
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2.释释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
①系列稀释操作：
a.将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
b.用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。
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c.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
②涂布平板操作：
三、培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别记录观察。
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四、菌种保存
临时保藏法 甘油管藏法
适用对象 频繁使用的菌种 长期保存的菌种
培养基类型 固体斜面培养基 液体培养基
温度 4℃ -20℃
方法 菌落长成后放入冰箱中保存，以后每3～6个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上 将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后放在冷冻箱内保存
例题练习
1.用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点是( )
A.都可以用固体培养基或液体培养基
B.接种时都需要在酒精灯的火焰旁进行
C.都需要使用接种环进行接种
D.都可以用来统计样品中的活菌数
答案：B
解析：平板划线法或稀释涂布平板法都是在固体培养基上进行的；不论是平板划线法还是稀释涂布平板法都需要进行无菌操作，需在酒精灯火焰旁进行；平板划线法使用接种环进行接种，稀释涂布平板法使用涂布器进行接种；稀释涂布平板法可以用来统计样品中的活菌数，而平板划线法不能用于统计样品中的活菌数。
例题练习
2.下列关于大肠杆菌的培养中叙述不正确的是( )
A.在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑PH、温度和渗透压等条件
B.在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒
C.若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想所得估计值更接近实际值除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的稀释度
D.使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃
答案：B
解析：培养过程中，除营养条件要满足需要外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件是否适宜；灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以，对培养基和培养皿进行灭菌而不是消毒；使用稀释涂布平板法时要保证样品稀释比例合适，这样才会有更科学的数据；有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状，所以使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
典例3
分离土壤中尿素分解菌的实验操作中，无法分离得到尿素分解菌的原因最可能是( )
A.制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B.涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌
C.牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D.接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
答案：C
解析：从土壤中分离微生物的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。回顾和梳理分离土壤中分解尿素菌的实验操作的相关知识，认真分析各个选项即可正确作答。A.制备浸出液的土壤取自土壤的表层与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，A错误；B.涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，B错误；C.该培养基必须以尿素为唯一的氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基或在其中添加尿素作为氮源，该操作对实验影响最大，C正确；D.接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒，可能会造成污染，但与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，D错误。
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、研究思路
1.筛选菌株
（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
（2）选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2.统计菌落数目
（1）活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
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①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M。
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）。
M：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
（2）显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
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3.设置对照
（1）对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
（2）主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计
1.土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。
2.样品的稀释
（1）稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。
（2）稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。
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3.微生物的培养与观察
（1）培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
三、菌种鉴定
1.原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。
2.方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
例题练习
1.在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述，出现科学性错误的是( )
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B.可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以检测培养基是否受到污染
C.如果其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，结果与甲同学一致，则可以证明甲同学无误
D.B、C项的实验思路都遵循了实验的对照原则
答案：D
解析：甲同学获得的菌落数目远大于其他同学，原因可能是所取的土样不同，也可能是操作过程中培养基被污染，A正确；污染可能是培养基灭菌不彻底，或操作过程没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，可以检测培养基是否受到污染，B正确；若是土样不同造成的，让其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C正确；B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复性原则，D错误。
例题练习
2.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，有关叙述错误的是( )
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH再灭菌
B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
例题练习
答案：C
解析：在配制步骤②、③所用的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌，A错误；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单细胞菌落，B正确；要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，而牛肉膏和蛋白胨都能提供氮源，因此步骤③所用的培养基不能是牛肉膏蛋白胨培养基，C错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。
典例4
下列有关“分解纤维素的微生物的分离”实验的说法，正确的是( )
A.纤维素酶中C1酶和葡萄糖苷酶都能将纤维素分解成纤维二糖
B.在选择培养基中直接加入刚果红进行纤维素分解菌的鉴别
C.应先利用固体选择培养基增加纤维素分解菌的浓度，以保证筛选效果
D.菌落周围的透明圈不一定是能分解纤维素的微生物所形成的
答案：D
解析：纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和Cx酶能将纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖，A错误；在用刚果红染色法鉴别纤维素分解菌时，使用的是鉴别培养基，B错误；增加纤维素分解菌的浓度使用的是液体培养基，C错误；有些微生物能降解色素，因此刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈，D正确。
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分解纤维素的微生物的分离
一、纤维素与纤维素酶
1.纤维素
纤维素属于多糖类物质，可用于纺织工业，可造纸；食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄等。自然界中纤维素含量最高的天然产物是棉花，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的。
2.纤维素酶
（1）组分：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖，从而使纤维素能为微生物的生长提供营养。
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（2）作用
二、纤维素分解菌的筛选
土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
1.土壤取样应选择富含纤维素的环境，或者将滤纸等埋在土壤中，一段时间后从腐烂的滤纸上取样。
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2.选择培养的目的是增加目的菌的浓度。若所选土样纤维素分解菌丰富，此步骤可以省略；若所选士样中纤维素分解菌较少，此步骤也可重复，重复选择培养次数越多，最后的培养液中纤维素分解菌浓度越大。
选择培养应用的是液体培养基，理论上应是以纤维素为唯一碳源的选择培养基。事实上课本中给出的选择培养基配方中含有少量其他碳源，但并不影响通过选择培养增大目的菌浓度。
3.样品涂布到鉴别培养基上之前需要进行梯度稀释，鉴别培养基中需加刚果红溶液，筛选带有透明圈的菌落。加入刚果红溶液的时间可以是倒平板时，也可以是长出菌落后。
例题练习
1.科研人员在富含纤维素的培养基中加入刚果红（刚果红能与纤维素结合形成红色复合物，但不能与纤维素水解后产生的纤维二糖和葡萄糖发生反应），再接种土壤浸出液，准备从土壤中筛选出高效降解纤维素的细菌。如图表示恒温培养后平板中菌落周围出现透明圈的情况，下列有关说法错误的是( )
A.可用牛肉膏、蛋白胨配制该培养基
B.培养基的pH需调至中性或微碱性
C.所用接种方法为稀释涂布平板法
D.应选择图中菌落③作为目的菌种进行
例题练习
答案：A
解析：该培养基用于筛选并鉴定能高效降解纤维素的细菌，应以纤维素作为唯一碳源，牛肉膏和蛋白胨可为微生物提供碳源，不能用于配制该培养基，A错误；在培养细菌时，需要将培养基的pH调至中性或微碱性，B正确；根据菌落分布情况可知，接种采用的是稀释涂布平板法，C正确；透明圈的直径与菌落直径的比值越大，说明菌种降解纤维素的效果越好，故应选择菌落③作为目的菌种进行推广使用，D正确。
例题练习
2.为分离土壤中分解纤维素的微生物，某同学设计了以下两种培养基配方（用蒸馏水定容到1000mL）：
其中，酵母膏的主要作用是提供维生素等物质，水解酪蛋白可提供氮源，请判断下列说法，错误的是( )
A.上述两种培养基中，乙培养基是固体培养基
B.若采用甲培养基进行初步选择，则需要再添加一定量纤维素
C.经初步选择后，在甲培养基中能够分离出目的微生物菌落
D.可以采用稀释涂布平板法在添加了刚果红染料的乙培养基上分离目的微生物
例题练习
答案：C
解析：根据培养基的成分中是否有琼脂来判断是否为固体培养基，有琼脂成分的为固体培养基，A正确；土壤中分解纤维素的微生物数量较少，为提高其浓度，可以初步选择培养，为确保能分离到纤维素分解菌，需要配制加入纤维素作为碳源的培养基，培养纤维素分解菌的同时抑制其他杂菌生长，B正确；甲培养基不是固体培养基，也缺乏纤维素作为碳源，在甲培养基中无法形成纤维素分解菌单菌落，即无法分离出目的微生物，C错误；鉴定纤维素分解菌的方法是刚果红染色法，利用稀释涂布平板法进行接种，能够获取由单个细胞形成的菌落，D正确。
要点突破
一、培养基的成分及功能
营养物质 作用 功能 主要来源
碳源 能为微生物代谢提供碳元素 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 能为微生物的代谢提供氮元素 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子 是生长必不可少的 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 是生命活动所必需的 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 外界摄入
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机化合物
要点突破
二、倒平板操作的注意事项
1.培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
2.要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
4.平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
5.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
6.整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
要点突破
三、几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱160～170℃加热1～2h 玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽灭菌 100kPa、121℃维持15～30min 培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 70～75℃煮30min或80℃煮15min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 30W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
要点突破
四、平板划线法和稀释涂布平板法的比较
优点 缺点 适用范围
平板划线分离法 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 不能计数 适用于好氧菌
稀释涂布平板法 可以计数，可以观察菌落特征 吸收量较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
要点突破
五、统计菌落数目的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：
项目 直接计数法 间接计数法
原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要用具 显微镜、细菌计数板 培养基
计数数据 菌体本身 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
要点突破
六、选择培养基的选择作用
（1）原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
（2）方法：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。
③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
要点突破
七、纤维素分解菌与尿素分解菌的分离与鉴定比较
纤维素分解菌的分离与鉴定 尿素分解菌的分离与鉴定
分离条件 纤维素为主要碳源 尿素作为唯一氮源
鉴定方法 在以纤维素为主要碳源的培养基上，利用刚果红染色法，出现透明圈 培养基中加入酚红指示剂，变红色
鉴定原理 分解纤维素的微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使纤维素—刚果红复合物降解而出现透明圈 分解尿素的微生物合成脲酶，将尿素分解产生NH3，使pH升高，加入酚红变红色
步骤 土壤取样→制备培养基→选择培养→富集培养→梯度稀释→涂布培养→刚果红染色法→挑取菌落→进一步鉴定 土壤取样→制备培养基→样品梯度稀释→涂布平板→培养观察→进一步鉴定
要点突破
八、培养基的类型及应用
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产，连续培养
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、对微生物进行分类及鉴定
固体培养基 对微生物进行分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 对微生物进行分类、鉴别
用途 选择培养基 添加（或缺少）某种化学成分 培养、分离出特定微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物
易错辨析
关于纤维素分解菌筛选的三个易错警示
（1）纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
（2）在纤维素分解菌的选择培养基中生长的不只有纤维素分解菌。因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。
（3）出现透明圈的菌落也不一定是纤维素分解菌。
谢谢观看（2）微生物的培养与应用
1.下列关于微生物培养的特殊培养基的叙述中错误的是( )
A.分离出分解纤维素的微生物，应以纤维素作唯一碳源
B.利用缺乏氮源的培养基，可分离出固氮微生物
C.分离出分解尿素菌，培养基中加入尿素作唯一氮源和能源
D.在培养基中添加一定量的NaCl，可筛选出耐盐微生物
2.下列有关培养基和菌种鉴定的叙述，错误的是( )
A.配制培养大肠杆菌的培养基时要将pH调至中性或弱酸性
B.菌落的形状、大小、颜色等特征都可以作为菌种鉴定的依据
C.在微生物的实验室培养中，培养皿可以采用干热灭菌法进行灭菌
D.微生物的生长除受营养因素的影响外，还受pH、渗透压等的影响
3.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述错误的是( )
A.在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具放入干热灭菌箱中进行干热灭菌
B.水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的
C.巴氏消毒法可以杀死牛奶中的所有微生物，且基本不会破坏牛奶的营养成分
D.培养基灭菌常采用湿热灭菌法，未接种的培养基表面也可能会有菌落生长
4.苹果树腐烂病由真菌感染引起，为了开发生物防治该病的途径，研究者拟从土壤中分离筛选出能抑制苹果树腐烂病菌生长的芽孢杆菌，实验流程如下图；其中左图为筛选能抑制腐烂病菌的芽孢杆菌，图为检验抑菌效果，A处接种等量的腐烂病菌，B处接种芽孢杆菌。下列判断不正确的是( )
A.配制上述培养基时，应先调PH为中性偏碱然后进行高压蒸汽灭菌
B.制平板培养基时应先灭菌再在酒精灯火焰旁边倒平板
C.若稀释10-2的每个平板平均单菌落为20个，则每克土壤为20000个
D.可通过比较右图两平板上腐烂病菌的大小来确定抑菌效果
5.实验室培养微生物时，接种前、后均需要进行平板倒置。下列有关平板倒置原因的叙述错误的是( )
A.可将营养成分富集在培养基表面，有利于乳酸菌等微生物的生长
B.可防止冷凝水落入培养基造成培养基与皿底黏附不牢，易脱离
C.可减慢培养基中水分的蒸发，避免培养基干裂，缩短培养时间
D.可防止冷凝水落入培养基造成污染，且拿取时不易误打开皿盖
6.熔喷布的主要成分是聚丙烯，会对环境造成污染。某科研小组从土壤中分离到一种能分解聚丙烯的细菌。下列说法正确的是( )
A.配制固体培养基时，需要在无菌的环境中进行
B.稀释涂布平板法所用的菌浓度应控制在300-3000个/mL
C.从土壤中分离能分解聚丙烯的细菌，可采用平板划线法进行分离与计数
D.纯化培养时，在培养皿皿盖做标记后倒置在恒温培养箱中静置培养
7.为验证青霉素对青霉素敏感菌株的抑制作用，某研究性小组做了如下实验：(1)将0．1mL青霉素敏感菌株的稀释液分别涂布到A、B、C3个牛肉膏蛋白胨培养基平板上；(2)将吸附无菌水、5mg/mL青霉素溶液、10mg/mL青霉素溶液的滤纸片分别放入甲、乙、丙3个平板中，用封口膜密封，并倒置培养；(3)观察并记录培养基上菌落的生长情况。下列相关分析错误的是( )
A.甲中滤纸片周围细菌生长正常，起对照作用
B.乙、丙中滤纸片周围出现了抑菌圈，且丙中的抑菌圈可能更大
C.青霉素敏感菌株的扩大培养用液体培养基
D.牛肉膏蛋白胨培养基只允许青霉素敏感菌株生长
8.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )
A.某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少
B.3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
D.该实验需设置未接种的培养基直接培养作对照，用以判断培养基是否被杂菌污染
9.某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是______。甲、乙培养基均属于______培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释______倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是______（答出1点即可）。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：______。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即______。
10.下列关于斜面培养基的叙述，错误的是( )
A. 灭菌过的固体培养基注入试管，将试管斜放在台面上凝固后制成
B. 常用于菌种的筛选
C. 可以用接种环进行划线接种
D. 优点是能增大接种面积、厚度增大、营养丰富等
11.肠道病原菌可生产次级代谢产物绿脓菌素，绿脓菌素的产量与肠道病原菌培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和绿脓菌素产量的影响，结果见表。下列叙述错误的是( )
碳源 细胞干重/（g·L-1） 绿浓菌素产量/（g·L-1）
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
A.肠道病原菌纯培养，可用平板法划线进行接种
B.肠道病原菌生长的最适碳源是葡萄糖
C.用肠道病原菌生产绿脓菌素的最适碳源是制糖废液
D.碳源是淀粉时，肠道病原菌不能生长的原因是肠道病原菌细胞中缺少果胶酶
12.一般情况下，一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性。为探究某种抗生素对细菌的选择作用，实验人员在接种了金黄色葡萄球菌的培养基中放置了含某种抗生素的圆形滤纸片和不含抗生素的圆形滤纸片，一段时间后测量滤纸片周围抑菌圈的直径。从抑菌圈边缘的菌落上挑取细菌富集培养，然后重复上述步骤培养三代，结果如下表所示。下列有关叙述错误的是( )
培养代数 平板各区域滤纸片周围抑菌圈的直径/cm
①号区域 ②号区域 ③号区域 ④号区域
第一代 0 2.27 2.13 2.27
第二代 0 1.95 2.02 1.87
第三代 0 1.80 1.87 1.78
A.一定浓度的抗生素会诱导细菌产生耐药性的变异
B.采用稀释涂布平板法将金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上
C.平板中①号区域的滤纸片不含抗生素，起空白对照的作用
D.随培养代数增多，抑菌圈的直径越小，说明细菌的耐药性越强
13.尿素分解菌体内的脲酶能够把尿素（CH4N2O）分解为氨（NH3）和CO2，进而利用氨合成一些所需的物质。尿素分解菌的分离与纯化的培养基通常只需要将细菌的完全培养基中的氮源作一些调整。下列有关叙述正确的是( )
A. 尿素分解菌为自养生物，属于生产者
B. 尿素能为尿素分解菌提供碳源和氮源
C. 尿素分解菌的分离纯化需以尿素为唯一氮源
D. 其他杂菌无法在分离纯化残留的培养基上生长
14.如图所示，科研人员利用诱变方式选育可高产β-胡萝卜素的三孢布拉霉负菌。未突变菌不能在含有β-紫罗酮的培养基上生长。随β-胡萝卜素含量增加，菌体颜色从黄色加深至橙红色。图甲为选育菌种及获得β-胡萝卜素的流程，以下相关叙述不正确的是( )
A.要得到图乙所示的菌落，可用稀释涂布平板法进行②操作，然后培养
B.经过程①紫外线照射的三孢布拉霉负菌都能在含β-紫罗酮培养基上生长
C.进行③操作时，应选择较大的橙红色菌落中的菌株继续接种培养
D.能在添加了β-紫罗酮的乙上长成菌落的细菌，其遗传物质都发生了改变
15.三糖铁（TS）培养基含有牛肉膏、蛋白陈、蔗糖、乳糖、微量葡萄糖、硫酸亚铁、氯化钠、酚红、琼脂等成分，可根据观察单一细菌对三种糖的分解能力及是否产生硫化氢来鉴别细菌的种类。三糖铁（TS）琼脂试验方法是：使用笔直的接种针挑取待测菌落，将接种针平稳刺入三糖铁固体斜面培养基内，然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针，最后在斜面上进行之字划线，36℃下培养18～24h观察实验结果。酚红在酸性条件下显黄色，在碱性条件下显红色。细菌产生的硫化氢与铁盐反应生成黑色沉淀。下列叙述正确的是( )
A.穿刺或划线的目的是将纯培养物进行二次传代培养，须严格控制交叉污染
B.若培养基出现黑色沉淀，可推测该细菌不能分解牛肉膏、蛋白
C.若细菌能分解乳糖和葡萄糖而产酸、产，推测斜面为黄色、底层为红色且有气泡
D.三糖铁（TSI）培养基属于选择培养基
16.2023年春节过后，新冠病毒感染的第一波高峰期已过，但正确佩戴口罩仍是预防二次感染的有效手段。某研究小组对非灭菌的一次性口罩中的微生物进行检测，通过分析微生物的种类和数量来确定口罩的合格性。部分操作如下：从口罩上剪取总量9cm2样品(体积近似1ml)，剪碎后加入已灭菌的生理盐水中，定容至10mL，充分混匀，得到样液。下列说法正确的是( )
A.取4个经灭菌处理的培养皿，将冷却到40℃的培养基倒入培养皿，待培养基凝固后，将平板倒置
B.向前3个平板中分别加入1mL样液，用涂布器将样液涂布均匀
C.第4个平板不接种样液并与前3个平板共同培养，可用于检测是否有杂菌污染
D.若一段时间后，4个平板上长出的菌落数依次为31、42、35和0个，可计算出1cm2口罩样品中菌体数量为36个
17.甜瓣子是豆瓣酱的重要成分之一，其生产工艺如下图所示：
回答下面相关问题：
(1)制曲过程中，加入的蚕豆主要为米曲霉的生长提供______________（填“碳源”“氮源”或“碳源和氮源”）。加入的蚕豆需经沸水漂烫约4min，过滤、冷却后使用，这样操作的目的是______________。
(2)制曲时将米曲霉与蚕豆瓣混合相当于微生物培养的 ______________技术（操作步骤），主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，并大量产生和积蓄所需要的酶。在统计米曲霉的数量以了解制曲进程时，可在显微镜下用______________直接计数。在制曲容器内，上层的米曲霉数量比底层的多，说明米曲霉的代谢类型是______________。
(3)待米曲霉达到一定数量后，向豆瓣曲中加入一定量盐水，开始制作酱醅，盐水的作用主要是______________。
(4)将酱醅转入发酵池进行发酵，该过程米曲霉可将蚕豆中的葡萄糖代谢为丙酮酸，在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供能量和______________；同时产生的肽和氨基酸等物质都影响着甜瓣子的品质，从而形成独特的色香味和风味。
答案以及解析
1.答案：C
解析：A、在以纤维素为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长，故分离出分解纤维素的微生物，应以纤维素作唯一碳源，A正确；
B、在缺乏氮源的培养基上，固氮微生物能够很好地生长，其他微生物则不能生长，故利用缺乏氮源的培养基，可分离出固氮微生物，B正确；
C、利用尿素作为唯一氮源的选择培养基可筛选分解尿素的细菌，尿素一般不能作为能源物质，糖类可以提供能量，C错误；
D、在培养基中添加一定量的NaCl，耐盐微生物能够很好地生长，其他微生物的生长受到抑制，D正确。
故选C。
2.答案：A
解析：培养细菌（比如大肠杆菌）时需将培养基的pH调至中性至弱碱性（一般控制在pH为7~7.5），A错误；每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征，包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等，不同种或同种在不同的培养条件下，菌落特征是不同的，所以，菌落特征可作为微生物分类鉴定的重要依据之一，B正确；常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等，吸管和培养皿等玻璃器皿可以采用干热灭菌法进行灭菌，C正确；微生物的营养物质主要有碳源、氮源、水和无机盐等，有的微生物还需要特殊的营养物质，微生物的培养过程中除受营养因素影响外，还受到pH、氧、渗透压的影响，D正确。
3.答案：C
解析：C、巴氏消毒法大约是70℃，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，基本不破坏牛奶的营养成分，C错误。
4.答案：C
解析：A、如果先进行高压蒸汽灭菌再调pH，那么在调pH时，培养基就有可能被污染，所以在制培养基时，都是要先调pH后高压蒸汽灭菌，A正确；
B、培养基经高压蒸汽灭菌后，需冷却至50℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。倒平板时须在酒精灯火焰附近，防止杂菌进入，B正确；
C、每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，C代表某稀释梯度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数，所以每克土壤样品中的菌株数=(20÷0.2)×100=10000个,C错误；
D、由题意分析可知，A处接种等量的腐烂病菌，B处接种芽孢杆菌，可通过观察对比右图两平板上腐烂病菌的大小来确定抑菌效果，D正确。
故选C。
5.答案：A
解析：A、平板倒置可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，A错误；B、平板倒置可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，B正确；C、平板倒置可以使培养基表面的水分更好地挥发，C正确；D、平板倒置可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，且拿取时不易误打开皿盖，D正确。
故选A。
6.答案：B
解析：A、配制固体培养基时，不需要在无菌的环境中进行，因为培养基配制好之后要进行灭菌，A错误；B、在涂布时吸取的菌液不超过0.1mL，平板上的菌落数应介于30～300个，因此，涂布用的菌浓度应控制在300-3000个/mL，B正确；C、平板划线法只能对微生物进行分离，不能计数，从土壤中分离能分解聚丙烯的细菌，可采用稀释涂布平板法进行分离与计数，C错误；D、纯化培养时，在培养皿皿底做标记后倒置在恒温培养箱中静置培养，这样方便观察，D错误。故选B。
7.答案：D
解析：A、培养基A中的滤纸片吸附的是无菌水，滤纸片周围细菌生长正常，起对照作用，A正确；
B、培养基B、C的滤纸片吸附的是青霉素溶液，滤纸片周围均出现抑菌圈，因为培养基C中的滤纸片吸附的青霉素溶液浓度比B高，因此培养基C中的滤纸片周围的抑菌圈更大，B正确；
C、菌种的扩大培养用液体培养基，液体培养基能够增加营养物质和菌体的接触，从而达到增加菌种数量的目的，因此，青霉素敏感菌株的扩大培养用液体培养基，C正确；
D、牛肉膏蛋白胨含有丰富的碳源、氮源、无机盐等，有利于多种微生物的快速生长，D错误。
故选D。
8.答案：C
解析：A、设置重复组，增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂3个平板。稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要少，A正确；
B、据图可知，将10g土样加入到90mL无菌水中定容至100mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中样品的稀释倍数是104倍，B正确；
C、5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3×106÷0.1=1.7×109个，C错误；
D、为了判断培养基是否被杂菌污染，需要设置的对照组是未接种的培养基，即将未接种的培养基与接种的培养基同时培养，若未接种的培养基上出现菌落，说明其被污染，否则没有被污染，D正确。
故选C。
9.答案：（1）高压蒸汽灭菌；琼脂；选择
（2）
（3）细菌细胞由于渗透作用失水过多，丧失活性（S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长）
（4）淤泥中取样，然后进行梯度稀释，微生物的培养与观察，计数
（5）水、无机盐、碳源、氮源
解析：（1）培养基一般使用高压蒸汽灭菌，微生物的分离和筛选一般使用选择培养基，该物质Y是琼脂，甲、乙培养基均以S为唯一碳源和氮源的选择培养基。
（2）利用稀释涂布平板法对细菌进行计数，要保证每个平板上长出的菌落数不超过200，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布100 μL（0.1ml）稀释后的菌液，则有200×a÷0.1=2×，则稀释倍数a=。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，可能会导致细菌细胞由于渗透作用失水过多，导致活性丧失。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，主要实验步骤有淤泥中取样，然后进行梯度稀释，微生物的培养与观察，计数。
（5）培养基的主要成分包括水、无机盐、碳源、氮源。
10.答案：B
解析：A、斜面培养基的制作应将灭菌过的固体培养基定量分装于试管内，将试管斜放在台面上凝固后制成，A正确；
B、斜面培养基可用于菌种的保存，B错误；
C、斜面培养基是固体培养基的一种形式，可以用接种环进行划线接种，C正确；
D、斜面培养基的优点是能增大接种面积、厚度增大、营养丰富等，D正确。
故选B。
11.答案：D
解析：本题主要考查微生物的培养，考查学生的实验探究能力。分解淀粉需要淀粉水解酶的催化，D项符合题意。
12.答案：A
解析：A、细菌产生耐药性的变异是基因突变产生的，抗生素起到了选择作用，A错误；B、将金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上可以采用稀释涂布平板法，B正确；C、平板中①号区域起空白对照的作用，故滤纸片上不含有抗生素，C正确；D、随培养代数增多，抑菌圈的直径越小，说明细菌对抗生素的耐药性越强，D正确。
13.答案：C
解析：A、尿素分解菌体内的脲酶能够把尿素（CH4N2O）分解为氨（NH3）和CO2，进而利用氨合成一些所需的物质，尿素是有机物，即尿素分解菌利用有机物合成其他物质，而不是利用无机物合成有机物，其为异养生物，不属于生产者，A错误；
B、尿素（CH4N2O）被分解为氨（NH3）和CO2，尿素分解菌利用氨合成一些所需的物质，说明尿素能为尿素分解菌提供氮源，而不能提供碳源，B错误；
C、尿素分解菌的分离纯化需以尿素为唯一氮源，对应的培养基为选择培养基，C正确；
D、在分离纯化残留的培养基上有尿素分解菌的代谢产物，可能有些杂菌能在分离残留的培养基上生长，D错误。故选C。
14.答案：B
解析：A、图乙中的菌落均匀分布于平板，说明接种方法是用稀释涂布平板法，A正确； B、过程①紫外线照射的作用是利用物理因素诱导发生基因突变，由于突变的不定项性，被照射的三孢布拉霉负菌不可能都能在含β-紫罗酮培养基上生长，B错误； C、橙红色的菌体为高产菌，素进行③操作时，应选择较大的橙红色菌落中的菌株继续接种培养，C正确； D、能在添加了β-紫罗酮的乙上长成菌落的细菌是经过通过紫外线照射后的高产菌，其遗传物质都发生了改变，D正确。
15.答案：A
解析：分析题干信息及培养基成分可知，三糖铁(TSI)培养基属于鉴别培养基，可根据观察单一细菌对三种糖的分解能力及是否产生硫化氢，来鉴别细菌的种类。划线和穿刺操作一定针对纯培养物，否则实验操作是无意义的。划线或穿刺的目的是将纯培养物二次传代培养，这种操作也见于标准菌株复壮或传代，整个操作过程中要严格规范操作，严格控制交叉污染，A正确；细菌产生的硫化氢与铁盐反应生成黑色沉淀，若培养基出现黑色沉淀，可推测该细菌能够分解牛肉膏、蛋白胨，B错误；细菌分解葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，C错误；三糖铁(TSI)培养基属于鉴别培养基，D错误。
16.答案：C
解析：A、40℃时琼脂已经凝固，应在培养基冷却至50℃左右时倒平板，A错误；
B、用稀释涂布平板法统计细菌数量时，为避免培养基表面的菌液出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果，滴加到培养基表面的菌悬液的量一般不超过0．1mL，B错误；
C、不接种样液的空白平板可用于检验试验前的灭菌是否彻底，也可检测是否有杂菌污染，C正确；
D、第4个平板没有菌落形成，说明没有杂菌污染，且前三个平板长出的菌落数均在30~300之间，说明操作中的稀释倍数(10倍)是合适的。若接种的样液是0．1ml，则9cm2口罩样品中菌体数量为(31+42+35)÷3÷0．1×10=3600个，则lcm2口罩样品中菌体数量为400个，D错误。
故选C。
17.答案：(1)氮源和碳源；沸水漂烫的目的是消灭杂菌，冷却的目的是防止蚕豆温度过高导致微生物死亡
(2)接种；血细胞计数板；需氧型（或好氧型）
(3)抑制微生物的生长
(4)合成其他物质的原料
解析：(1)蚕豆中含有大量蛋白质,主要为微生物的生长提供碳源和氮源类营养物质。加入的蚕豆经沸水漂烫约4min冷却后使用,这样既可以对蚕豆进行消毒,消灭蚕豆表面的杂菌,又能防止蚕豆温度过高导致接种的微生物死亡。
(2)制曲时向蚕豆瓣中加入米曲霉的过程,相当于接种过程。在统计米曲霉的数量时,可通过显微镜借助血细胞计数板对米曲霉直接计数。因为米曲霉是需氧型微生物,所以在氧气丰富的容器上层繁殖较快,数量较多。
(3)待米曲霉的数量达到一定值后,需向豆瓣曲中加入一定量盐水以抑制微生物的生长,进行酱醅并发酵得到甜瓣子。
(4)有氧呼吸第一阶段产生的丙酮酸在有氧呼吸第二、三阶段被分解释放出的能量可用于微生物的生长,产生的中间产物可为其他化合物的合成提供原材料。在酱醅发酵的过程中,米曲霉产生的蛋白酶可将蚕豆中的蛋白质分解为肽和氨基酸,淀粉酶将淀粉分解为还原糖,这些物质都影响着甜瓣子的口味和风味,
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