(共35张PPT)
202届高考生物一轮复习课件
第九单元 生物技术实践
（5）DNA与蛋白质技术
核心考点
DNA的粗提取与鉴定
多聚酶链式反应扩增DNA片段
血红蛋白的提取和分离
典例1
粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L
答案：A
解析：本题考查DNA粗提取实验的相关知识。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A项正确；37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温10~15分钟，使蛋白质变性析出，B项错误；向滤液中加入等体积、体积分数为95%冷却的酒精，此时DNA会析出，不会进入滤液中，C项错误；DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度小，DNA会析出，不会进入滤液中，D项错误。
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DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.提取原理
（1）DNA的溶解性：
①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。
②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可溶于其中。
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（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：
①蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
②大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，发生变性，而DNA在80℃以上才会变性。
③洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3.DNA的鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
二、实验操作
1.实验材料的选取
选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
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2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
（1）动物细胞的破碎（以鸡血为例）：在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
（2）植物细胞的破碎（以洋葱为例）：先将洋葱切碎，然后加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3.去除滤液中的杂质
（1）方案一：通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
（2）方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
（3）方案三：将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15min，使蛋白质变性而与DNA分离。
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4.DNA的析出
在滤液中加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物。
5.DNA的鉴定
将呈白色丝状的DNA溶解于5mL物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min，冷却后观察溶液的颜色，注意要同时设置对照实验。
三、操作提示
1.以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3.鉴定DNA用的二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
例题练习
在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述错误的是( )
A.实验材料选择错误的组别是丙
B.沸水浴后试管中溶液颜色蓝色最深的是丁
C.甲组实验现象差的原因是50℃的酒精对DNA的凝集效果差
D.乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
组别 实验材料 提取核物质时加入的溶液 去除杂质时加入的溶液 DNA鉴定时加入的试剂
甲 鸡血 蒸馏水 95%的酒精（50℃） 二苯胺
乙 菜花 蒸馏水 95%的酒精（冷却） 双缩脲试剂
丙 猪血 蒸馏水 95%的酒精（冷却） 二苯胺
丁 鸡血 蒸馏水 95%的酒精（冷却） 二苯胺
例题练习
答案：D
解析：猪血中成熟红细胞不含细胞核，丙组选择猪血作为实验材料，导致提取的DNA过少，A正确；“DNA的粗提取与鉴定”实验中，所选材料一般为鸡血，去杂时一般使用冷却的95%的酒精溶液，用二苯胺试剂鉴定，综上所述丁组蓝色最深，B正确；50℃的酒精对DNA的凝集效果差，C正确；乙组材料为植物，将植物细胞放入蒸馏水中时，植物细胞不会吸水涨破，且DNA应该用二苯胺鉴定，而不能用双缩脲试剂鉴定，D错误。
典例2
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述，错误的是( )
A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B.为了便于将扩增的DNA片段与运载体连接，可在引物的3′端加上限制酶识别序列
C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化
D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
答案：B
解析：本题考查PCR相关知识。引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物和引物配对情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5′→3′，因此为了便于扩增的DNA片段与运载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶识别位点，B错误；设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自身环化的现象，为了便于扩增的DNA片段与运载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。
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多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、PCR原理
1.PCR的原理
（1）概念：PCR是多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
（2）扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。
（3）引物
①本质：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
②需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。
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（4）原理
双螺旋的打开：DNA的热变性原理，即：
（5）反应条件：①一定的缓冲溶液；②DNA模板；③分别与两条模板链相结合的两种引物；④四种脱氧核苷酸；⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能严格控制温度变化的温控设备。
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2.细胞内DNA复制的基本条件
二、PCR的反应过程
（1）过程
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
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（2）结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
三、PCR的实验操作
1.实验用具
（1）PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
（2）微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行PCR反应的场所。
（3）微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。
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2.实验步骤
3.注意事项
（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
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（2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。
（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
4.DNA含量的测定
DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：
例题练习
PCR一般要经过三十多次循环，从第二次循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，下列相关叙述正确的是( )
A.由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，无需与引物结合，直接在酶的作用下从头合成子链
C.若只有1个DNA片段作为模板，经过5次循环，会得到32个DNA分子
D.若只有1个DNA片段作为模板，经过2次循环，含引物Ⅰ的DNA单链占DNA总链数的1/4
答案：C
解析：当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5'端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链，A、B错误；若只有1个DNA片段作为模板，经过5次循环，DNA复制了5次，可以得到的DNA分子数是25=32(个)，C正确；若只有1个DNA片段作为模板，经过2次循环，会形成4个DNA片段，8条单链，其中含有原始模板链(不含引物)2条，另外6条单链中含有引物Ⅰ的有3条单链，含有引物Ⅱ的有3条单链，即含有引物Ⅰ的DNA单链占DNA总链数的3/8，D错误。
在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是( )
A.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B.洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C.洗涤过程选用0.1%的生理盐水
D.透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
典例3
答案：D
解析：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化；分离时要采用低速短时间离心，以达到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。
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血红蛋白的提取和分离
一、蛋白质分离的原理和方法
1.蛋白质的分离依据
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2.凝胶色谱法
（1）凝胶：实际上是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖、琼脂糖。
（2）原理：凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。
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（3）分离过程：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子蛋白质移动快、小分子蛋白质移动慢→收集大分子蛋白质→收集小分子蛋白质
3.缓冲溶液
（1）作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
（2）配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
4.电泳
（1）概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
（2）原理：
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①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、血红蛋白提取和分离的实验操作
1.样品处理
（1）红细胞的洗涤
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①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
②过程：
（2）血红蛋白的释放
①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
②过程：
a.将洗涤好的红细胞倒入烧杯中。
b.加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。
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c.加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。
d.置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。
e.红细胞破裂，释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液
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2.粗分离——透析
（1）目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
（2）过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的烧杯中，透析12 h。
3.纯化——凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作
①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。
②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。
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④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。
（2）凝胶色谱柱的装填
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（3）样品的加入和洗脱
4.纯度鉴定
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
例题练习
蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是( )
A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可通过透析将样品中各种不同的蛋白质分离
B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小的不同等，可通过电泳分离蛋白质
C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
答案：A
解析：蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质可以透过半透膜，因此透析可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，故A错误。
要点突破
一、DNA提取与鉴定的原理和方法
基本原理 方法 目的
DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同 溶于NaCl溶液中并稀释 ①NaCl溶液为2mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质；②当NaCl溶液稀释至0.14mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白质和其他杂质
DNA不被蛋白酶所水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，分解蛋白质
DNA不溶于酒精溶液 加入冷却酒精（95%） DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质
DNA可被二苯胺染成蓝色 加入二苯胺，并沸水浴加热 鉴定DNA
要点突破
二、DNA粗提取与鉴定实验中四个关键操作的目的
1.两次加入蒸馏水
2.三次加NaCl溶液
次数 目的
第一次 使鸡血细胞吸水涨破
第二次 稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出
次数 目的
第一次 溶解DNA，析出蛋白质等杂质
第二次 使DNA再溶解，为了获得含杂质较少的DNA
第三次 溶解DNA，以便DNA与二苯胺反应
要点突破
二、DNA粗提取与鉴定实验中四个关键操作的目的
3.三次过滤
次数 目的
第一次 单层 除去细胞破碎后的细胞膜、核膜、糖类、蛋白质等，获得含核物质的滤液
第二次 两层 除去不溶于2mol/LNaCl溶液中的蛋白质等杂质，获得含DNA的滤液
第三次 多层 除去溶于0.14mol/LNaCl溶液中的杂质，获得含DNA的丝状物
要点突破
二、DNA粗提取与鉴定实验中四个关键操作的目的
4.六次搅拌
次数 实验操作 目的
第一次 搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液 加速细胞破裂
第二次 搅拌含DNA的高浓度盐溶液 加速DNA的溶解
第三次 搅拌加蒸馏水的NaCl溶液 析出DNA
第四次 搅拌含DNA的高浓度盐溶液 加速DNA的溶解
第五次 搅拌含DNA的酒精溶液 提取含杂质较少的DNA
第六次 搅拌含DNA的白色丝状物的盐溶液 加速DNA的溶解
要点突破
三、直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
比较项目 直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
酶的种类 一种或几种 一种 一系列酶
制作方法 － 化学结合固定化、物理吸附固定化 包埋法固定化
是否需要营养物质 否 否 是
催化反应 单一或多种 单一 一系列
反应底物 各种物质（大分子、小分子） 各种物质（大分子、小分子） 小分子物质
优点 催化效率高，低耗能、低污染等 ①既能与反应物接触，又能与产物分离，提高了产品质量；②可重复使用，降低了成本 成本更低，操作更容易
缺点 ①对环境条件非常敏感，易失活；②酶难回收，成本高，影响产品质量 不利于催化一系列的酶促反应 反应物不易与酶接触，尤其是大分子物质，可能导致反应效率下降
实例 果胶酶 固定化葡萄糖异构酶 固定化酵母细胞
要点突破
三、PCR扩增与DNA复制的异同
项目 DNA复制 PCR扩增
不同点 时期 有丝分裂间期或减Ⅰ前的间期 任何时期
场所 活细胞内 细胞外
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的TaqDNA聚合酶
引物 有转录，产生RNA作引物，无需人工加入 无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物
特点 边解旋边复制 先全部解旋后开始复制
缓冲液 不需缓冲液 配制缓冲液代替细胞核液
设备 无 控制温度变化的温控设备
相同点 原理 严格遵循碱基互补配对原则
引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
模板 DNA的两条链为模板
特点 半保留复制
原料 游离的四种脱氧核苷酸
易错辨析
与PCR原理有关的三个易错点
（1）酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
（2）DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
（3）PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。
谢谢观看（5）DNA与蛋白质技术
1.下面关于多聚酶链式反应(PCR)的叙述，错误的是( )
A.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
B.PCR的循环过程分为变性、复性和延伸三步
C.PCR技术利用DNA半保留复制的原理，可在短时间内大量扩增目的基因
D.一个目的基因用PCR扩增生成2个目的基因的过程中要消耗2n+1个引物
2.PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切割位点等序列。下列叙述正确的是( )
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.PCR第四次循环要消耗15对引物
C.Taq酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶切割位点的产物
3.用PCR方法检测转基因植株是否成功导人目的基因时，得到的电泳图谱如图所示，其中1号为DNA标准样液，10号为蒸馏水。以下分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250bp至500bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应的植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
4.研究员利用PCR技术扩增X基因。两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子,如图乙所示。下列叙述正确的是( )
A.利用DNA连接酶才能完成PCR过程
B.一次加入30轮所需的引物1和引物2会干扰PCR进行
C.第⑤种DNA分子最早出现在第三轮复制后，只有一个⑤
D.经四轮复制产生的第⑤种DNA分子共有8个
5.下图甲和乙表示凝胶色谱法的有关实验操作，图丙为某同学的分离结果，下列叙述正确的是( )
A.甲装置中的B一般是用羧甲基纤维素钠制成的
B.甲装置中的A通常使用的是柠檬酸钠溶液
C.图乙装置上端洗脱瓶C中是待分离的蛋白质样液
D.图丙中的甲蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电冰中迁移速率最慢
6.下列有关“血红蛋白的提取和分离”实验中缓冲溶液的说法，错误的是( )
A.在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C.通过调节缓冲剂的种类，就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液
D.凝胶色谱法、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳都要用到缓冲溶液
7.PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。右图是PCR定点突变技术流程图，据图分析错误的是( )
A.该技术需要使用四条引物
B.引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点
C.利用引物1和2需要进行三次PCR才可得到DNA片段A
D.该技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变的优点
8.某兴趣小组以洋葱为实验材料进行DNA的粗提取和鉴定，图1和图2表示其中的部分过程。下列叙述正确的是( )
A.将洋葱研磨后的滤液置于4℃冰箱中放置几分钟，取沉淀物离心后进行图1操作
B.图1中应选择体积分数为75%的预冷酒精溶液进行DNA的粗提取
C.图2中应将试管置于沸水浴中加热，待试管冷却后，可观察到试管2呈现蓝色
D.图2中试管1含有1mol·L-1的NaCl溶液，以便和试管2作对照
9.融合PCR技术（fusionPCR）采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。图1表示融合PCR技术的过程示意图（P1-P4表示引物），图2表示融合后产物的电泳图。
（1）从化学本质上来说，引物是____________________作用是________________________________________________________。
（2）图1过程设计的P2与P3引物的添加序列必须能够发生________________。融合PCR步骤1中，至少进行________循环才能获得基因A的PCR产物。
（3）融合PCR步骤2中基因A、B融合形成一个基因的机制是________________________________________________________________________________________________________。
若要对A、B融合基因继续进行PCR扩增，则图1中的M、N处位置所需要的引物分别是________。
（4）图2中电泳图中________号条带最可能表示融合后片段，若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是________________________________________________（至少两点）。
10.下列关于DNA粗提取和PCR、电泳技术，叙述错误的是( )
A.可利用DNA不溶于酒精的特点来提取DNA
B.可利用洋葱研磨液离心后的沉淀物来提取DNA
C.PCR中通过调节温度来控制DNA双链的解聚
D.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时，需将核酸染料加入琼脂糖溶液中
11.如下表示“DNA粗提取与鉴定”实验的基本流程，下列叙述错误的是( )
A.本实验使用的酒精的浓度与“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中的相同
B.步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料
C.步骤①中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液
D.步骤⑥向试管中加入二苯胺试剂后静置5min后即可呈现蓝色
12.PCR是体外快速大量扩增DNA的一种技术，下列关于PCR技术叙述错误的是( )
A.增加模板DNA的量可以提高反应速度
B.复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加
C.延伸时，DNA聚合酶从引物的5'端连接脱氧核苷酸
D.PCR反应体系中一般需加Mg2+以激活DNA聚合酶
13.我国科研人员在实验室中通过构建多种酶催化体系的方法,首次实现了在细胞外从CO2固定到合成淀粉的过程。下列有关叙述错误的是( )
A. 可采用PCR技术从不同物种的基因组中扩增得到多酶催化体系中的目标酶基因
B. 在多酶催化体系中,可能会因为酶的最适反应条件不同而使反应中断
C. 该方法可在分子水平上直接改变氨基酸的序列,实现对酶特性的改造和优化
D. 若该科研成果成熟后推广应用,有助于摆脱耕地和自然环境限制,解决粮食危机
14.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述错误的是( )
A.PCR技术可用于固氮基因的获取和检测
B.实验中需将转基因水稻种子在缺氮培养液中进行筛选
C.为了提高PCR扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度
D.PCR实验中使用的微量离心管和枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
15.DNA分子杂交技术的原理是当两种生物的 DNA单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，如下图所示。关于DNA 分子杂交技术的应用，下列相关叙述正确的是( )
A.杂合双链区的一条链的序列是5'-GATACC-3'，那么另一条链的序列是5'-CTATGG-3'
B.该技术可用来比较不同物种DNA分子的差异，以分析生物亲缘关系的远近
C.通过设计一种DNA引物与DNA的其中一条链结合，经PCR技术可大量扩增目的基因
D.通过设计含有目的基因片段的DNA探针，可检测特定细胞中是否合成了目的蛋白
16.下列有关“血红蛋白的提取和分离”技术的说法，正确的是（ ）
A.鸡血是血红蛋白提取和分离实验的理想材料
B.需用蒸馏水对红细胞进行洗涤以去除杂蛋白
C.为了使凝胶装填紧密，应使用缓冲液充分洗涤平衡凝胶12小时
D.凝胶色谱法是根据带电离子在电场的作用下发生迁移来分离蛋白质
17.为了研究蛋白质的结构与功能，常需要从生物材料中分离纯化蛋白质。某同学用凝胶色谱法从某种生物材料中分离纯化得到了甲、乙、丙3种蛋白质，并对纯化得到的3种蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知甲的相对分子质量是乙的2倍，且甲、乙均由一条肽链组成。回答下列问题。
（1）图中甲、乙、丙在进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移的方向是_________（填“从上向下”或“从下向上”）。
（2）图中丙在凝胶电泳时出现2个条带，其原因是_________。
（3）凝胶色谱法可以根据蛋白质_________的差异来分离蛋白质。据图判断，甲、乙、丙3种蛋白质中最先从凝胶色谱柱中洗脱出来的蛋白质是_________，最后从凝胶色谱柱中洗脱出来的蛋白质是_________。
（4）假设甲、乙、丙为3种酶，为了减少保存过程中酶活性的损失，应在_________（答出1点即可）条件下保存。
答案以及解析
1.答案：D
解析：一个DNA分子扩增n次要消耗引物的数量为2n-2，D错误。
2.答案：D
解析：图中引物与模板链碱基互补配对，该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；PCR三次循环共消耗7（23-1）对引物，PCR四次循环共消耗15（24-1）对引物，第四次循环要消耗8对引物，B错误；dNMP只有一个磷酸基团，为脱氧核苷酸，dNTP有三个磷酸基团，延伸时，在Taq酶催化下，dNMP作为扩增的原料会依次连接到3'端，相邻的dNMP间形成磷酸二酯键，C错误；若在引物的5'端添加限制酶切割位点序列，则第一轮循环后，得到的2个DNA片段中各自的两条脱氧核苷酸链都不等长，通过绘图可推知，再经过一次循环，产物中开始出现脱氧核苷酸链等长的含有上述添加限制酶切割位点的DNA片段，所以扩增两个循环后即可获得添加限制酶切割位点的产物，D正确。
3.答案：B
解析：本题考查PGR和电泳技术的相关知识。
PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。据题意知PCR产物是含目的基因的某特定片段，4~9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合1号DNA标准样液的电泳图谱，推测包含自的基因的片段大小应在250~500bp之间，A正确；据题意可知，2号样品（野生型植株DNA）的PCR结果中不包含250~500bp片段，而4号样品（转基因植株DNA）的PCR结果中包含250~500bp片段，3号样品的PCR结果也包含250~500bp片段，故其应为包含目的基因的载体DNA,B错误；9号样品的PCR结果不包含250~500bp片段，所以其对应的植株不是所需的转基因植株，C正确;10号样品为蒸馏水，无任何DNA分子片段，故10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。
4.答案：D
解析： PCR过程不需要DNA连接酶，A错误；一次加入30轮所需的引物不会干扰正常过程，B错误；第⑤种DNA分子最早出现在第三轮复制后，有两个⑤，C错误；X基因第四次复制得到16个、五种DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2个③复制得2个③和2个⑤，2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤复制得4个⑤，故经四轮复制可产生8个第⑤种DNA分子，D正确。
5.答案：D
解析：A、甲图是透析过程，甲装置中的B是透析袋，是一种半透膜，可以用植物膜、玻璃纸等材料制得，用的最多的是纤维素制成的透析膜，A错误；
B、甲装置中的A通常使用的是磷酸缓冲液，抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定，B错误；
C、图乙是用凝胶色谱法对蛋白质进行纯化操作的示意图，图乙装置上端洗脱瓶中是缓冲液，C错误；
D、图丙为蛋白质的洗脱顺序，由于分子质量大的蛋白质先洗脱出来，因此蛋白质分子量依次为甲＞乙＞丙。加入SDS可以使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移速率完全取决于分子的大小，甲的蛋白质分子量最大，因此图丙中的甲蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电冰中迁移速率最慢，D正确。
故选D。
6.答案：C
解析：A、在纯化洗脱血红蛋白时为保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致，维持蛋白质正常结构和功能，需要加入磷酸缓冲液，A正确；
B、缓冲溶液通常是由一或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液，B正确；
C、缓冲物质指能调节溶液的pH值，使溶液的pH值在加入一定量的酸性物质或碱性物质时保持恒定或小范围变化的一种物质，调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液，C错误；
D、凝胶色谱法是加缓冲溶液是为了洗涤平衡，使凝胶装填均匀紧密，缓冲液在电泳过程中一个作用是维持合适的pH，D正确。
故选C。
7.答案：A
解析：A、据图可知，该技术需要使用四种引物，即引物1﹣引物4，而非四条引物（引物的数量随PCR扩增次数增加而增加）,A错误。
8.答案：C
解析：A、将洋葱研磨后的滤液置于4℃冰箱中放置几分钟，再取上清液进行图1操作，A错误；B、图1中应选择体积分数为95%的预冷酒精溶液进行DNA的粗提取，B错误；C、在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂发生反应呈蓝色，故图2中应将试管置于沸水浴中加热，待试管冷却后，可观察到试管2呈现蓝色，C正确；D、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解故图2中试管1含有2mol·L-1的NaCl溶液，以便和试管2作对照，D错误。
9.答案：（1）一小段单链DNA或RNA；使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（2）碱基互补配对；2
（3）引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在TaqDNA聚合酶的作用下向两边延伸，基因A、B完成融合；P1、P4
（4）4；复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合
解析：（1）引物是一小段单链DNA或RNA,能与目的基因碱基互补配对,其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
（2）由于A、B基因需要融合,融合依据的原理是碱基互补配对,因此在引物设计是P2与P3引物对应的序列就要求能碱基互补配对。PCR经过两次循环才能获得纯的目的基因片段。
（3）由图可知,引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对,然后在TaqDNA聚合酶的作用下向两边延伸,使基因A、B完成融合。根据引物延伸的方向,N出添加的引物是P4,M处添加的引物是P1。
（4）融合后的片段长度更长,很有可能是4号条带。PCR技术没有扩增出目的基因的原因包括:复性温度太高;引物设计不合理无法与目的基因结合。
10.答案：B
解析：A中DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可以根据该特性来提纯DNA,A正确；B中洋葱加入研磨液后离心后，DNA存在于上清液中，用上清液提取DNA，B错误；C中PCR技术包括高温变性(解链)—低温复性(引物和模板链结合)—中温延伸三个步骤，解旋过程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA在高温下变性的原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，C正确；D中凝胶中的DNA需要与核酸染料结合，在波长为300nm的紫外灯下才被观察到，核酸染料加入琼脂糖溶液中，混合均匀，然后将温热的琼脂糖溶液倒入模具，D正确。故选：B。
11.答案：D
解析：本题主要考查DNA粗提取和鉴定实验，考查学生的实验探究能力。本实验和“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验所用的酒精浓度相同，都是体积分数为95%的酒精，A项正确。步骤⑥中DNA鉴定时向试管中加入二苯胺试剂后，应将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后可观察到蓝色，D项错误。
12.答案：C
解析：C.延伸时，DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，C错误。
13.答案： C
解析：对酶进行改造,一般在基因水平上进行。
14.答案：C
解析：通过设计相应引物，利用PCR技术可获得固氮基因，A项正确；若要检测转基因水稻是否成功，可将该水稻种于缺氮的培养液，若无缺乏症，则可证明转基因成功，B正确；若要提高PCR扩增固氮基因的特异性，因引物延长，与模板特异性结合能力更强，可耐受较高的复性温度，所以应可适当增加引物长度并提高复性温度，C项错误；为避免杂菌的DNA污染，所用装置应该严格灭菌，D项正确。
15.答案：B
解析：A、由于是DNA分子杂交，所以发生的碱基互补配对方式是A-T、T-A、G-C、C-G，A错误；B、DNA分子中的碱基序列代表遗传信息，如果两个DNA分子形成的杂合双链区越多，则说明两个DNA分子中的遗传信息越相似，B正确；C、双链区是通过碱基对中的氢键形成的，C错误；D、由于人和大猩猩的亲缘关系更近，所以人和大猩猩的DNA杂交形成的杂合双链区要多于人与羊的DNA杂合双链区，D错误。故选：B。
16.答案：C
解析：A、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和众多细胞器，含有大量的血红蛋白，是血红蛋白提取和分离实验的理想材料，A错误;B、洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，加入五倍体积的生理盐水，B错误;C、为了使凝胶装填紧密，应使用缓冲液充分洗涤平衡凝胶12小时，C正确;D、凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，D错误。故选:C。
17.答案：（1）从上向下
（2）该蛋白质由2条肽链组成，在SDS的作用下解聚成2条肽链
（3）相对分子质量；丙；乙
（4）低温
解析：（1）在测定蛋白质相对分子质量时，通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。已知甲的相对分子质量是乙的2倍，推测甲的移动距离小于乙，因此甲、乙、丙在进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移的方向是从上向下。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果只是单条肽链的相对分子质量，图中丙经凝胶电泳后出现2个条带，原因是该蛋白质由2条肽链组成，在SDS的作用下解聚成单条肽链。
（3）凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果可知，这3种蛋白质相对分子质量的大小依次为丙>甲>乙，因此最先从凝胶色谱柱中洗脱出来的蛋白质是丙，最后从凝胶色谱柱中洗脱出来的蛋白质是乙。
（4）在低温条件下，酶的活性很低，但酶的空间结构稳定，在适宜的温度下，酶的活性较高，不易保存。因此，酶制剂适合在低温条件下保存。
2（5）DNA与蛋白质技术
【考点梳理】
典例1
粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L
答案：A
解析：本题考查DNA粗提取实验的相关知识。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A项正确；37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温10~15分钟，使蛋白质变性析出，B项错误；向滤液中加入等体积、体积分数为95%冷却的酒精，此时DNA会析出，不会进入滤液中，C项错误；DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度小，DNA会析出，不会进入滤液中，D项错误。
考点链接
DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.提取原理
（1）DNA的溶解性：
①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。
②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可溶于其中。
（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：
①蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
②大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，发生变性，而DNA在80℃以上才会变性。
③洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3.DNA的鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
二、实验操作
1.实验材料的选取
选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
（1）动物细胞的破碎（以鸡血为例）：在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
（2）植物细胞的破碎（以洋葱为例）：先将洋葱切碎，然后加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3.去除滤液中的杂质
（1）方案一：通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
（2）方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
（3）方案三：将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15min，使蛋白质变性而与DNA分离。
4.DNA的析出
在滤液中加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物。
5.DNA的鉴定
将呈白色丝状的DNA溶解于5mL物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min，冷却后观察溶液的颜色，注意要同时设置对照实验。
三、操作提示
1.以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3.鉴定DNA用的二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
例题练习
在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述错误的是( )
组别 实验材料 提取核物质时加入的溶液 去除杂质时加入的溶液 DNA鉴定时加入的试剂
甲 鸡血 蒸馏水 95%的酒精（50℃） 二苯胺
乙 菜花 蒸馏水 95%的酒精（冷却） 双缩脲试剂
丙 猪血 蒸馏水 95%的酒精（冷却） 二苯胺
丁 鸡血 蒸馏水 95%的酒精（冷却） 二苯胺
A.实验材料选择错误的组别是丙
B.沸水浴后试管中溶液颜色蓝色最深的是丁
C.甲组实验现象差的原因是50℃的酒精对DNA的凝集效果差
D.乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
答案：D
解析：猪血中成熟红细胞不含细胞核，丙组选择猪血作为实验材料，导致提取的DNA过少，A正确；“DNA的粗提取与鉴定”实验中，所选材料一般为鸡血，去杂时一般使用冷却的95%的酒精溶液，用二苯胺试剂鉴定，综上所述丁组蓝色最深，B正确；50℃的酒精对DNA的凝集效果差，C正确；乙组材料为植物，将植物细胞放入蒸馏水中时，植物细胞不会吸水涨破，且DNA应该用二苯胺鉴定，而不能用双缩脲试剂鉴定，D错误。
典例2
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述，错误的是( )
A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B.为了便于将扩增的DNA片段与运载体连接，可在引物的3′端加上限制酶识别序列
C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化
D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
答案：B
解析：本题考查PCR相关知识。引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物和引物配对情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5′→3′，因此为了便于扩增的DNA片段与运载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶识别位点，B错误；设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自身环化的现象，为了便于扩增的DNA片段与运载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。
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多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、PCR原理
1.PCR的原理
（1）概念：PCR是多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
（2）扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。
（3）引物
①本质：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
②需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。
（4）原理
双螺旋的打开：DNA的热变性原理，即：
（5）反应条件：①一定的缓冲溶液；②DNA模板；③分别与两条模板链相结合的两种引物；④四种脱氧核苷酸；⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能严格控制温度变化的温控设备。
2.细胞内DNA复制的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
二、PCR的反应过程
（1）过程
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
（2）结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
三、PCR的实验操作
1.实验用具
（1）PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
（2）微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行PCR反应的场所。
（3）微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。
2.实验步骤
3.注意事项
（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
（2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。
（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
4.DNA含量的测定
DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：
例题练习
PCR一般要经过三十多次循环，从第二次循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，下列相关叙述正确的是( )
A.由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，无需与引物结合，直接在酶的作用下从头合成子链
C.若只有1个DNA片段作为模板，经过5次循环，会得到32个DNA分子
D.若只有1个DNA片段作为模板，经过2次循环，含引物Ⅰ的DNA单链占DNA总链数的1/4
答案：C
解析：当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5'端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链，A、B错误；若只有1个DNA片段作为模板，经过5次循环，DNA复制了5次，可以得到的DNA分子数是25=32(个)，C正确；若只有1个DNA片段作为模板，经过2次循环，会形成4个DNA片段，8条单链，其中含有原始模板链(不含引物)2条，另外6条单链中含有引物Ⅰ的有3条单链，含有引物Ⅱ的有3条单链，即含有引物Ⅰ的DNA单链占DNA总链数的3/8，D错误。
典例3
在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是( )
A.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B.洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C.洗涤过程选用0.1%的生理盐水
D.透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
答案：D
解析：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化；分离时要采用低速短时间离心，以达到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。
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血红蛋白的提取和分离
一、蛋白质分离的原理和方法
1.蛋白质的分离依据
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2.凝胶色谱法
（1）凝胶：实际上是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖、琼脂糖。
（2）原理：凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。
（3）分离过程：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子蛋白质移动快、小分子蛋白质移动慢→收集大分子蛋白质→收集小分子蛋白质
3.缓冲溶液
（1）作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
（2）配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
4.电泳
（1）概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
（2）原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、血红蛋白提取和分离的实验操作
1.样品处理
（1）红细胞的洗涤
①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
②过程：
（2）血红蛋白的释放
①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
②过程：
a.将洗涤好的红细胞倒入烧杯中。
b.加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。
c.加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。
d.置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。
e.红细胞破裂，释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液
2.粗分离——透析
（1）目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
（2）过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的烧杯中，透析12 h。
3.纯化——凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作
①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。
②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。
（2）凝胶色谱柱的装填
（3）样品的加入和洗脱
4.纯度鉴定
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
例题练习
蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是( )
A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可通过透析将样品中各种不同的蛋白质分离
B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小的不同等，可通过电泳分离蛋白质
C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
答案：A
解析：蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质可以透过半透膜，因此透析可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，故A错误。
【要点突破】
一、DNA提取与鉴定的原理和方法
基本原理 方法 目的
DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同 溶于NaCl溶液中并稀释 ①NaCl溶液为2mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质；②当NaCl溶液稀释至0.14mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白质和其他杂质
DNA不被蛋白酶所水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，分解蛋白质
DNA不溶于酒精溶液 加入冷却酒精（95%） DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质
DNA可被二苯胺染成蓝色 加入二苯胺，并沸水浴加热 鉴定DNA
二、DNA粗提取与鉴定实验中四个关键操作的目的
1.两次加入蒸馏水
次数 目的
第一次 使鸡血细胞吸水涨破
第二次 稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出
2.三次加NaCl溶液
次数 目的
第一次 溶解DNA，析出蛋白质等杂质
第二次 使DNA再溶解，为了获得含杂质较少的DNA
第三次 溶解DNA，以便DNA与二苯胺反应
3.三次过滤
次数 目的
第一次 单层 除去细胞破碎后的细胞膜、核膜、糖类、蛋白质等，获得含核物质的滤液
第二次 两层 除去不溶于2mol/LNaCl溶液中的蛋白质等杂质，获得含DNA的滤液
第三次 多层 除去溶于0.14mol/LNaCl溶液中的杂质，获得含DNA的丝状物
4.六次搅拌
次数 实验操作 目的
第一次 搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液 加速细胞破裂
第二次 搅拌含DNA的高浓度盐溶液 加速DNA的溶解
第三次 搅拌加蒸馏水的NaCl溶液 析出DNA
第四次 搅拌含DNA的高浓度盐溶液 加速DNA的溶解
第五次 搅拌含DNA的酒精溶液 提取含杂质较少的DNA
第六次 搅拌含DNA的白色丝状物的盐溶液 加速DNA的溶解
三、PCR扩增与DNA复制的异同
项目 DNA复制 PCR扩增
不同点 时期 有丝分裂间期或减Ⅰ前的间期 任何时期
场所 活细胞内 细胞外
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的TaqDNA聚合酶
引物 有转录，产生RNA作引物，无需人工加入 无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物
特点 边解旋边复制 先全部解旋后开始复制
缓冲液 不需缓冲液 配制缓冲液代替细胞核液
设备 无 控制温度变化的温控设备
相同点 原理 严格遵循碱基互补配对原则
引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
模板 DNA的两条链为模板
特点 半保留复制
原料 游离的四种脱氧核苷酸
易错辨析
与PCR原理有关的三个易错点
（1）酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
（2）DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
（3）PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。
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