发酵工程
考点一：传统发酵技术
腐乳的制作
发酵：利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
腐乳制作的原理
菌种 青霉、毛霉、曲霉、酵母等，主要是毛霉
代谢类型 异养需氧型
繁殖方式 孢子生殖
前期发酵 主要是毛霉等微生物生长。需要满足微生物生长所需要的适宜的温度、充足的氧气、一定的湿度
后期发酵 是微生物生长产生的酶发挥作用的过程。需要抑制微生物的生长，主要是控制高盐、无氧等条件，同时加入酒和香辛料
腐乳的制作流程
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
制作泡菜
泡菜制作的原理
（1）菌种：乳酸菌。
分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道等处。
代谢类型：异养厌氧型。
常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
发酵原理：乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸。
泡菜制作的实验设计
（1）制作流程
（2）准备材料
选择泡菜坛：选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
选择原料：质地鲜嫩，肉丰富，无虫咬，无烂痕，无斑点。
制作过程
原料处理：将鲜菜修整、清洗、阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状。
配制盐水：按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水，并将盐水煮沸冷却。
装坛：将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛中，装至半坛时放入香辛料，继续装到八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
封坛发酵：向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。要注意经常补充水槽中的水。
成品：将封好的坛子，放在室温环境中约15天，便可制成清脆爽口的泡菜。
（4）腌制条件：在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
3. 果醋和果酒的制作
（1）果酒的制作原理
菌种：酵母菌。
代谢类型：兼性厌氧型。
最适生长温度：20℃左右。
（2）果酒发酵原理：
在有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖。反应式：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O。
在无氧条件下，进行酒精发酵，产生酒精。反应式：C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2。
（3）菌种来源：自然发酵过程中，来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
（4）果醋的制作原理
菌种：醋酸菌。
代谢类型：需氧型。
最适生长温度：30～35℃。
（5）果醋发酵原理：
当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。反应简式：C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。
果醋和果酒的制作流程
（1）实验流程
（2）实验装置
充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气；
排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；
出料口：用来取样。
（3）发酵条件
果酒制作 果醋制作
温度 18～25℃ 30～35℃
时间 10～12d 7～8d
通气 先通气后密封，或预留约1/3的空间 始终通气
（4）操作要求
器具的清洗、消毒：榨汁机要洗净晾干，发酵瓶要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒。
材料的选择和处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗1～2遍除去污物后，再去枝梗。
榨汁装瓶：将冲洗干净并除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁，然后将葡萄汁装入发酵瓶，要留大约1/3的空间，并封闭充气口。
发酵：
①制葡萄酒的过程中，将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12d，每天定时排出发酵产生的CO2，10d后开始从出料口抽样，监测酒精浓度或菌体数量。
②制葡萄醋的过程中，用充气泵不断从充气口泵入空气，温度严格控制在30～35℃，发酵7～8d，即可制成果醋。
酒精检测
①检测试剂：重铬酸钾。
②检测条件：酸性条件。
③实验现象：呈现灰绿色。
腐乳制作过程中防止杂菌污染的措施
前期发酵即让豆腐长出毛霉时不需严格灭菌，在后期发酵中要防止杂菌污染。
（1）用来腌制腐乳的玻璃瓶，在洗刷干净后要用沸水消毒。
（2）装瓶时，操作要迅速、小心。豆腐块分层放置，分层加盐，接近瓶口表面的盐铺厚一些，以防止杂菌从瓶口进入。
（3）加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
2. 泡菜发酵的过程
（1）发酵初期：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵，发酵产物为乳酸、乙醇、醋酸和CO2等。由于有较多的CO2产生，气泡会间歇性地从坛沿水槽中放出，使坛内逐渐形成无氧状态。此时泡菜液的含酸量约为0.3%～0.4%，是泡菜初熟阶段，其菜质咸而不酸、有生味。
（2）发酵中期：由于初期乳酸发酵使乳酸不断积累，pH下降，无氧状态形成，乳酸菌开始活跃，并进行同型乳酸发酵。这时乳酸的积累量可达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8。大肠杆菌、腐败菌、酵母菌、霉菌的活动受到抑制。这一期间为泡菜完全成熟阶段，泡菜有香味且清香。
（3）发酵后期：在此期间进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达1.0%以上。当乳酸含量达到1.2%以上时，乳酸菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。此阶段泡菜酸度过高，风味不协调。
果酒和果醋制作流程和发酵条件的控制
比较项目 果酒制作 果醋制作
发酵温度 18～25℃ 30～35℃
发酵时间 10～12d 7～8d
气体控制 先通气一段时间后再密封发酵容器或预留发酵容器1/3的空间 需不断通入氧气（无菌空气）
杂菌控制 实验材料的冲洗和实验用具的灭菌 酸性的发酵液具有抑菌的作用 发酵菌种迅速形成优势种
联系 制作果醋可在酒精发酵的基础上进行醋酸发酵
传统发酵技术中常用菌种的比较
微生物 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
代谢类型 异养兼性厌氧 异养需氧 异养需氧 异养厌氧
适宜温度 18～25 ℃ 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
发酵条件 前期需氧；后期不需氧 一直需氧 一直需氧 无氧
生殖方式 孢子生殖，适宜条件下进行出芽生殖 二分裂生殖 孢子生殖 二分裂生殖
生产应用 酿酒、发面 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
例题1：下列有关腐乳制作的叙述，不正确的是（ ）
A.腐乳的制作主要是利用了微生物发酵的原理，起主要作用的微生物是毛霉
B.腐乳的营养丰富，是因为大分子物质经过发酵分解成了易于消化的小分子物质
C.含水量为70%左右的豆腐适于制作腐乳，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形，且不利于毛霉的生长
D.卤汤中含酒量应该控制在21%左右，酒精含量过高，腐乳成熟的时间会延长；含量过低，不足以抑制微生物的生长
【答案】D
【解析】腐乳的制作主要是利用了微生物发酵的原理，起主要作用的微生物是毛霉，A正确。腐乳的营养丰富，是因为大分子物质经过发酵分解成了易于消化的小分子物质，蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，脂肪水解成脂肪酸和甘油，B正确。含水量为70%左右的豆腐适于制作腐乳，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形，且不利于毛霉的生长，C正确。卤汤中含酒量应该控制在12%左右，加酒可以抑制微生物的生长，同时使腐乳具有独特的香味，酒精含量过高，腐乳成熟的时间会延长；含量过低，不足以抑制微生物的生长，D错误。
例题2：泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌，而在发酵初期，水槽内经常有气泡产生，这些气泡产生的原因及成分分别是( )
A.乳酸菌初期进行有氧呼吸产生CO2；气体为CO2
B.因制过程中的盐进入蔬菜使蔬菜体积变小，气体被排出；气体为空气
C.发酵初期活动强烈的是酵母菌，其利用氧产生CO2；气体为CO2
D.乳酸菌在发酵过程中产生了热量，使坛内温度升高，空气受热膨胀排出；气体为空气
【答案】C
【解析】制作泡菜时要用到乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，只能进行无氧呼吸产生乳酸，不产生CO2，A错误；蔬菜体积变小是因为在高盐作用下脱水，B错误；泡菜发酵初期有气泡产生，是因为水中溶解有少量O2，酵母菌进行有氧呼吸产生了CO2，CO2从坛内排出，进入水槽形成气泡，C正确，D错误。
例题3：（多选题）将少量的酵母菌提取液加到足量的葡萄汁中进行果酒制作，16 ℃条件下密封保温一段时间之后，检测到反应体系中含有少量的酒精。如对上述实验的某个因子进行改动，则实验的结果也会发生相应的变化。下列有关叙述错误的是( )
A.增加葡萄汁量，初期产生酒精的速率不变
B.增加酵母菌提取液量，初期产生酒精的速率上升
C.间隔通入氧气，若消耗等量有机物，则产生的酒精量增多
D.将温度提高到23 ℃，初期酒精浓度不变
【答案】CD
【解析】题干所述实验中葡萄汁足量，增加葡萄汁量，初期产生酒精的速率不会改变，A正确；增加酵母菌提取液量，初期氧气消耗较快，酵母菌较早进入无氧呼吸阶段，初期产生酒精的速率会上升，B正确；间隔通入氧气，会抑制酵母菌的无氧呼吸，若消耗等量有机物，则产生的酒精量会减少，C错误；酵母菌发酵的适宜温度为18~30 ℃，将温度提高到23 ℃，酶活性增强，酵母菌代谢加快，初期酒精浓度会上升，D错误。
考点二：发酵工程
含义：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
发酵工程与传统发酵技术相比的特点
主要以可再生资源为原料；反应条件温和；环境污染较少；能生产目前不能生产或通过化学方法生产困难的性能优异的产品；投资较少。
发酵工程的基本环节
菌种的选育（诱变育种、基因工程和细胞工程）
扩大培养
培养基的配制
培养基和设备的灭菌
接种（注意防止杂菌的污染，发酵罐冷却后才可加入）
发酵罐内发酵——中心环节
需严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
（7）产品的分离和提纯
菌体可采用过滤、沉淀等方法分离。
代谢产物可采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。
发酵工程中菌种的选择
如果生产的是微生物直接合成的产物：可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
如果生产的是一般微生物不能合成的产品：可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传持性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的。
发酵工程的特点
（1）生产条件温和：温度、压力都不高。
（2）原料来源丰富且价格低廉：微生物种类多，易分离。
（3）产物专一：可直接生产某种物质。
（4）废弃物对环境的污染小且容易处理：废料是各种代谢产物，只要灭菌后，一般对环境不造成污染。
6. 发酵工程的应用
在食品工业上的应用
（1）生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。
（2）生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。
（3）生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶等。
在医药工业上的应用：基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。
在农牧业上的应用
（1）生产微生物肥料。微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
（2）生产微生物农药。微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。
（3）生产微生物饲料。微生物含有丰富的蛋白质。以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
在其他方面的应用
发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。
啤酒酿造的工艺流程及发酵过程
（1）工艺流程
（2）发酵过程
主发酵主要分为：起泡期、高泡期和落泡期三个阶段。
主发酵过程控制：
温度的控制控制不同的发酵温度有各自的优缺点采用低温发酵，酵母在发酵过程中生成的副产物较少，使啤酒的口味较好，泡沫状况良好，但发酵时间长；采用高温发酵，酵母的发酵速度较快，发酵时间短，设备的利用率高但生成副产物较多，啤酒口味较差。
浓度的控制：麦汁浓度的变化受发酵温度和发酵时间的影响。发酵旺盛，降糖速度快，则可适当降低发酵温度和缩短最高温度的保持时间；反之，则应适当提高发酵温度或延长最高温度的保持时间。
发酵时间的控制：发酵时间主要取决于发酵温度的变化，发酵温度高，则发酵时间短；发酵温度低，则发酵时间长。
发酵工程的应用
具体应用 成果
在食品工业上的应用 生产传统的发酵产品 利用霉菌发酵生产酱油、利用酿酒酵母生产各种酒类
生产各种各样的食品添加剂 利用黑曲霉发酵生产柠檬酸、利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸
生产酶制剂 利用微生物发酵生产淀粉酶、果胶酶、脂肪酶和氨基肽酶等
在医药工业上的应用 通过工程菌生产药物 利用工程菌发酵生产生长激素释放抑制激素
通过改造菌种生产药物 通过诱变的青霉菌发酵生产青霉素
在农牧业上的应用 生产微生物肥料 利用根瘤菌和固氮菌生产的根瘤菌肥、固氮菌肥
生产微生物农药 利用苏云金杆菌防治多种农林虫害、利用白僵菌防治玉米螟和松毛虫
在农牧业上的应用 生产微生物饲料 利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液通过发酵获得大量微生物菌体用于饲料生产
在其他方面的应用 解决资源短缺和环境污染问题 利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯
对极端微生物的利用 利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂
例题1：下列对发酵工程及其应用的叙述，正确的有几项( )
①用诱变育种或基因工程等方法选育出性状优良的菌种并进行扩大培养
②用单细胞蛋白制成的微生物饲料，可通过发酵工程从微生物细胞中提取
③发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身
④啤酒的工业化生产过程中，酒精的产生积累主要在后发酵阶段完成
⑤生产柠檬酸需要筛选产酸量高的黑曲霉
⑥生产谷氨酸需将pH调至中性或弱碱性
⑦利用发酵工程生产的根瘤菌肥作为微生物农药可以促进植物生长
A.2项 B.3项 C.4项 D.5项
【答案】C
【解析】①诱变育种和基因工程等方法都属于可遗传变异，能够改变微生物的遗传性状，进而可以从中选育出性状优良的菌种，并进行扩大培养，①正确；②单细胞蛋白即微生物菌体，不需要从微生物细胞中提取，②错误；③发酵工程的产品可以是微生物的代谢物、酶以及菌体本身，③正确；④啤酒发酵的过程分为主发酵和后发酵两个阶段，但酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，主发酵结束后在低温、密闭环境下储存一段时间属于后发酵，因此酒精主要在主发酵阶段的产生积累，④错误；⑤利用高产黑曲霉生产柠檬酸，⑤正确；⑥谷氨酸是由谷氨酸棒状杆菌生产的，而谷氨酸棒状杆菌属于细菌，通常要求在中性偏碱的环境中生长，⑥正确；⑦根瘤菌肥作为微生物肥料，可以通过根瘤菌的固氮作用，增加土壤中的氮肥量，促进植物生长，⑦错误。所以①③⑤⑥四项正确，②④⑦三项错误，ABD错误，C正确。故选C。
例题2：（多选题）发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵和产品的分离、提纯等。下列关于发酵工程的认识不科学的是( )
A.发酵工程具有生产条件温和、产物专一、污染小的特点
B.发酵工程的产品可以是微生物的代谢产物，也可以是微生物细胞本身
C.通常所指的发酵条件包括温度、溶氧、pH和加入酶的种类等
D.现代发酵工程与传统发酵技术最大的区别是前者可以用微生物进行发酵
【答案】CD
【解析】发酵工程具有生产条件温和、产物专一、污染小的特点，A正确；发酵工程的产品可以是微生物的代谢产物，也可以是微生物细胞本身，B正确；通常所指的发酵条件的控制包括温度控制、溶氧控制、pH控制等，酶由微生物细胞产生，对微生物细胞的代谢有催化作用，通常在发酵过程中不需要向发酵液中额外加入酶，C错误；传统发酵技术和现代发酵工程都是利用各种微生物的代谢来实现相关产品的生产，D错误。
考点三：微生物的培养
培养基的配制
培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
培养基的分类：按照物理性质不同分为两类。
液体培养基：呈液体状态的培养基，不加入凝固剂（如琼脂）。
固体培养基：呈固体状态的培养基，加入凝固剂（如琼脂）。
营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
培养基特殊需求：
培养乳酸杆菌时，在培养基中添加维生素。
培养霉菌时，将培养基调至酸性。
培养细菌时，将培养基调至中性或弱碱性。
培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
无菌技术
关键：防止杂菌污染。
目的：
（1）可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
（2）有效避免操作者自身被微生物感染。
无菌技术的选择原则：
（1）考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
（2）考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
消毒与灭菌：
（1）概念：
消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）。
（2）类型
消毒 灭菌
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
微生物的纯培养
概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
酵母菌的纯培养：
纯培养的原理：设法在培养基上得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物（单菌落）。
纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
纯培养过程
配制培养基：
灭菌：培养基转移至锥形瓶，加棉塞，包上牛皮纸，如图所示，然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。
倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程：
（4）平板划线法接种和分离酵母菌
平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
平板划线法结果：平板划线示意图（A）及培养后菌落分布示意图（B）如下图所示。
几次灼烧的目的：
灼烧时期 目的
第一次操作（取菌种前） 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物
每次划线之前 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
划线结束 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
（5）培养酵母菌：接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
培养基的成分及功能
营养物质 作用 功能 主要来源
碳源 能为微生物代谢提供碳元素 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 能为微生物的代谢提供氮元素 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子 是生长必不可少的 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 是生命活动所必需的 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 外界摄入
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机化合物
培养基的类型及应用
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产，连续培养
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、对微生物进行分类及鉴定
固体培养基 对微生物进行分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 对微生物进行分类、鉴别
用途 选择培养基 添加（或缺少）某种化学成分 培养、分离出特定微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物
几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱160～170℃加热1～2h 玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽灭菌 100kPa、121℃维持15～30min 培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 70～75℃煮30min或80℃煮15min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 30W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
例题1：某研究小组将紫外线照射后酵母菌接种到培养基甲上，一段时间后将培养皿甲的菌落影印接种（不改变菌落位置）到乙、丙两个培养基中，进一步培养得到如图所示结果。下列分析错误的是（ ）
A.实验中甲宜使用马铃薯琼脂培养基，实验中接种工具需消毒和灭菌
B.乙为选择培养基，丙为完全培养基，二者形成对照
C.整个实验过程中用到了湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
D.从乙中挑取菌种进行纯化培养，可得到某种营养缺陷型的突变酵母菌
【答案】D
【解析】酵母菌以糖类为主要营养物质，所以实验中宜使用马铃薯琼脂培养基，天然培养基营养全面，接种到甲时，涂布器在涂布前放在酒精中消毒并在酒精灯火焰中灼烧，涂布后灼烧灭菌，所以接种工具需消毒和灭菌，A正确；乙中某种营养缺陷型的突变酵母菌不能生长，为选择培养基，丙培养基满足营养缺陷型的突变酵母菌生长，应为完全培养基，二者形成对照，B正确；整个实验过程中，培养基、影印接种工具等采用湿热灭菌，培养皿等用干热灭菌，涂布器用灼烧灭菌，C正确；应从丙中对应乙中无菌落生长的相同位置的菌落上挑取菌种进行纯化培养，得到某种营养缺陷型的突变酵母菌，D错误。
例题2：如图是某实验室从葡萄果实上获取酵母菌菌种的简要操作步骤。下列相关叙述中不正确的是（ ）
A.图中接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法
B.图中①②③步骤都必须确保是无菌操作
C.图中选择培养基培养时，应在培养皿的皿盖上做好标记避免混淆
D.图中选择培养基为固体培养基，而扩大培养的培养基为液体培养基
【答案】C
【解析】微生物培养中常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；微生物培养的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯净，因此培养过程必须保证无菌操作，以防止杂菌污染，B正确；题图中选择培养基培养时，因为使用的平板较多，且平板是倒置的，为避免混淆，应在培养皿的皿底做好标记，C错误；在进行酵母菌筛选时用的是固体培养基，而进行扩大培养时用的是液体培养基，D正确。
考点四：微生物的选择培养与计数
选择培养基
实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
选择培养基概念：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
选择培养基配方的设计：
（1）原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
（2）培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
微生物的选择培养
方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
稀释涂布平板法的操作过程：
（1）系列梯度稀释操作：
（2）涂布平板操作。
取菌液：取0.1mL菌液，添加到培养基表面。
涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上燃烧，酒精燃尽后，冷却涂布器。
涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养，观察。
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
（1）统计依据。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）操作。
一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
选用一定稀释范围的样品液进行培养，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
（3）注意问题：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
显微镜直接计数
（1）原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
（2）方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
（3）计算公式：
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
（4）缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
4. 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）实验流程示意图：
（2）实验操作过程：
流程 具体操作 操作提示
土壤取样 先铲去表层土，取距地表 3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中 ①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样 ②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布 ①火焰旁称取土壤样本 ②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组 ①注意无菌操作 ②对所用的平板、试管做好标记 ③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液
培养、观察和计数 ①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养 ②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录 ③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300 的平板进行计数 ①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格 ②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等 ③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
※选择培养基和鉴别培养基
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件（如唯一氮源）或加入某种物质（如青霉素） 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽）
例题：新冠肺炎疫情防控期间，戴口罩、勤洗手是预防病毒感染的有效措施。研究人员用稀释涂布平板法对所戴口罩内外两侧的细菌进行培养、计数，下列相关操作正确的是（ ）
A.对操作的空间、操作者的衣着和双手等必须进行严格的灭菌处理
B.培养皿上应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等
C.完成接种后，应将平板放入18~20℃的恒温培养箱中培养1~2d
D.某稀释倍数下的三个平板中菌落数分别是27、169和176，应取平均值124
【答案】B
【解析】对操作的空间、操作者的衣着和双手等进行清洁和消毒，将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行严格灭菌，A错误；该实验使用的平板和试管较多，为了避免混乱，最好在使用前做好标记，B正确；不同种类的微生物适宜生存的温度不同，细菌一般在30~37℃的条件下培养1~2d，C错误；一个平板的计数结果与另两个相差悬殊，需舍去，应取平均值（169+176）/2=172.5，或者重新实验，D错误。
2(共44张PPT)
十三 发酵工程
2024届高考生物解锁大单元一轮复习
思维导图
考点一：传统发酵技术
1. 腐乳的制作
ü 发酵：利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
ü 腐乳制作的原理
菌种 青霉、毛霉、曲霉、酵母等，主要是毛霉
代谢类型 异养需氧型
繁殖方式 孢子生殖
前期发酵 主要是毛霉等微生物生长。需要满足微生物生长所需要的适宜的温度、充足的氧气、一定的湿度
后期发酵 是微生物生长产生的酶发挥作用的过程。需要抑制微生物的生长，主要是控制高盐、无氧等条件，同时加入酒和香辛料
ü 腐乳的制作流程
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
2. 制作泡菜
ü 泡菜制作的原理
（1）菌种：乳酸菌。
分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道等处。
代谢类型：异养厌氧型。
常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
（2）发酵原理：乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸。
ü 泡菜制作的实验设计
（1）制作流程
（2）准备材料
选择泡菜坛：选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
选择原料：质地鲜嫩，肉丰富，无虫咬，无烂痕，无斑点。
（2）制作过程
原料处理：将鲜菜修整、清洗、阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状。
配制盐水：按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水，并将盐水煮沸冷却。
装坛：将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛中，装至半坛时放入香辛料，继续装到八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
封坛发酵：向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。要注意经常补充水槽中的水。
成品：将封好的坛子，放在室温环境中约15天，便可制成清脆爽口的泡菜。
（4）腌制条件：在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
3. 果醋和果酒的制作
（1）果酒的制作原理
菌种：酵母菌。
代谢类型：兼性厌氧型。
最适生长温度：20℃左右。
（2）果酒发酵原理：
在有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖。反应式：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O。
在无氧条件下，进行酒精发酵，产生酒精。反应式：C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2。
（3）菌种来源：自然发酵过程中，来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
（4）果醋的制作原理
菌种：醋酸菌。
代谢类型：需氧型。
最适生长温度：30～35℃。
（5）果醋发酵原理：
当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。反应简式：C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。
果醋和果酒的制作流程
（1）实验流程
（2）实验装置
充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气；
排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；
出料口：用来取样。
（3）发酵条件
（4）操作要求
器具的清洗、消毒：榨汁机要洗净晾干，发酵瓶要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒。
材料的选择和处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗1～2遍除去污物后，再去枝梗。
榨汁装瓶：将冲洗干净并除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁，然后将葡萄汁装入发酵瓶，要留大约1/3的空间，并封闭充气口。
果酒制作 果醋制作
温度 18～25℃ 30～35℃
时间 10～12d 7～8d
通气 先通气后密封，或预留约1/3的空间 始终通气
发酵：
①制葡萄酒的过程中，将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12d，每天定时排出发酵产生的CO2，10d后开始从出料口抽样，监测酒精浓度或菌体数量。
②制葡萄醋的过程中，用充气泵不断从充气口泵入空气，温度严格控制在30～35℃，发酵7～8d，即可制成果醋。
酒精检测
①检测试剂：重铬酸钾。
②检测条件：酸性条件。
③实验现象：呈现灰绿色。
1. 腐乳制作过程中防止杂菌污染的措施
前期发酵即让豆腐长出毛霉时不需严格灭菌，在后期发酵中要防止杂菌污染。
（1）用来腌制腐乳的玻璃瓶，在洗刷干净后要用沸水消毒。
（2）装瓶时，操作要迅速、小心。豆腐块分层放置，分层加盐，接近瓶口表面的盐铺厚一些，以防止杂菌从瓶口进入。
（3）加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
2. 泡菜发酵的过程
（1）发酵初期：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵，发酵产物为乳酸、乙醇、醋酸和CO2等。由于有较多的CO2产生，气泡会间歇性地从坛沿水槽中放出，使坛内逐渐形成无氧状态。此时泡菜液的含酸量约为0.3%～0.4%，是泡菜初熟阶段，其菜质咸而不酸、有生味。
（2）发酵中期：由于初期乳酸发酵使乳酸不断积累，pH下降，无氧状态形成，乳酸菌开始活跃，并进行同型乳酸发酵。这时乳酸的积累量可达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8。大肠杆菌、腐败菌、酵母菌、霉菌的活动受到抑制。这一期间为泡菜完全成熟阶段，泡菜有香味且清香。
（3）发酵后期：在此期间进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达1.0%以上。当乳酸含量达到1.2%以上时，乳酸菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。此阶段泡菜酸度过高，风味不协调。
3. 果酒和果醋制作流程和发酵条件的控制
比较项目 果酒制作 果醋制作
发酵温度 18～25℃ 30～35℃
发酵时间 10～12d 7～8d
气体控制 先通气一段时间后再密封发酵容器或预留发酵容器1/3的空间 需不断通入氧气（无菌空气）
杂菌控制 实验材料的冲洗和实验用具的灭菌酸性的发酵液具有抑菌的作用发酵菌种迅速形成优势种
联系 制作果醋可在酒精发酵的基础上进行醋酸发酵
4. 传统发酵技术中常用菌种的比较
微生物 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
代谢类型 异养兼性厌氧 异养需氧 异养需氧 异养厌氧
适宜温度 18～25 ℃ 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
发酵条件 前期需氧；后期不需氧 一直需氧 一直需氧 无氧
生殖方式 孢子生殖，适宜条件下进行出芽生殖 二分裂生殖 孢子生殖 二分裂生殖
生产应用 酿酒、发面 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
例题1：下列有关腐乳制作的叙述，不正确的是（ ）
A.腐乳的制作主要是利用了微生物发酵的原理，起主要作用的微生物是毛霉
B.腐乳的营养丰富，是因为大分子物质经过发酵分解成了易于消化的小分子物质
C.含水量为70%左右的豆腐适于制作腐乳，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形，且不利于毛霉的生长
D.卤汤中含酒量应该控制在21%左右，酒精含量过高，腐乳成熟的时间会延长；含量过低，不足以抑制微生物的生长
【答案】D
【解析】腐乳的制作主要是利用了微生物发酵的原理，起主要作用的微生物是毛霉，A正确。腐乳的营养丰富，是因为大分子物质经过发酵分解成了易于消化的小分子物质，蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，脂肪水解成脂肪酸和甘油，B正确。含水量为70%左右的豆腐适于制作腐乳，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形，且不利于毛霉的生长，C正确。卤汤中含酒量应该控制在12%左右，加酒可以抑制微生物的生长，同时使腐乳具有独特的香味，酒精含量过高，腐乳成熟的时间会延长；含量过低，不足以抑制微生物的生长，D错误。
例题2：泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌，而在发酵初期，水槽内经常有气泡产生，这些气泡产生的原因及成分分别是( )
A.乳酸菌初期进行有氧呼吸产生CO2；气体为CO2
B.因制过程中的盐进入蔬菜使蔬菜体积变小，气体被排出；气体为空气
C.发酵初期活动强烈的是酵母菌，其利用氧产生CO2；气体为CO2
D.乳酸菌在发酵过程中产生了热量，使坛内温度升高，空气受热膨胀排出；气体为空气
【答案】C
【解析】制作泡菜时要用到乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，只能进行无氧呼吸产生乳酸，不产生CO2，A错误；蔬菜体积变小是因为在高盐作用下脱水，B错误；泡菜发酵初期有气泡产生，是因为水中溶解有少量O2，酵母菌进行有氧呼吸产生了CO2，CO2从坛内排出，进入水槽形成气泡，C正确，D错误。
例题3：（多选题）将少量的酵母菌提取液加到足量的葡萄汁中进行果酒制作，16 ℃条件下密封保温一段时间之后，检测到反应体系中含有少量的酒精。如对上述实验的某个因子进行改动，则实验的结果也会发生相应的变化。下列有关叙述错误的是( )
A.增加葡萄汁量，初期产生酒精的速率不变
B.增加酵母菌提取液量，初期产生酒精的速率上升
C.间隔通入氧气，若消耗等量有机物，则产生的酒精量增多
D.将温度提高到23 ℃，初期酒精浓度不变
【答案】CD
【解析】题干所述实验中葡萄汁足量，增加葡萄汁量，初期产生酒精的速率不会改变，A正确；增加酵母菌提取液量，初期氧气消耗较快，酵母菌较早进入无氧呼吸阶段，初期产生酒精的速率会上升，B正确；间隔通入氧气，会抑制酵母菌的无氧呼吸，若消耗等量有机物，则产生的酒精量会减少，C错误；酵母菌发酵的适宜温度为18~30 ℃，将温度提高到23 ℃，酶活性增强，酵母菌代谢加快，初期酒精浓度会上升，D错误。
1. 含义：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
2. 发酵工程与传统发酵技术相比的特点
主要以可再生资源为原料；反应条件温和；环境污染较少；能生产目前不能生产或通过化学方法生产困难的性能优异的产品；投资较少。
3. 发酵工程的基本环节
（1）菌种的选育（诱变育种、基因工程和细胞工程）
（2）扩大培养
（3）培养基的配制
（4）培养基和设备的灭菌
（5）接种（注意防止杂菌的污染，发酵罐冷却后才可加入）
（6）发酵罐内发酵——中心环节
需严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
考点二：发酵工程
（7）产品的分离和提纯
菌体可采用过滤、沉淀等方法分离。
代谢产物可采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。
4.发酵工程中菌种的选择
如果生产的是微生物直接合成的产物：可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
如果生产的是一般微生物不能合成的产品：可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传持性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的。
5.发酵工程的特点
（1）生产条件温和：温度、压力都不高。
（2）原料来源丰富且价格低廉：微生物种类多，易分离。
（3）产物专一：可直接生产某种物质。
（4）废弃物对环境的污染小且容易处理：废料是各种代谢产物，只要灭菌后，一般对环境不造成污染。
6. 发酵工程的应用
ü 在食品工业上的应用
（1）生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。
（2）生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。
（3）生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶等。
ü 在医药工业上的应用：基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。
ü 在农牧业上的应用
（1）生产微生物肥料。微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
（2）生产微生物农药。微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。
（3）生产微生物饲料。微生物含有丰富的蛋白质。以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
ü 在其他方面的应用
发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。
1. 啤酒酿造的工艺流程及发酵过程
（1）工艺流程
（2）发酵过程
主发酵主要分为：起泡期、高泡期和落泡期三个阶段。
主发酵过程控制：
ü 温度的控制控制不同的发酵温度有各自的优缺点采用低温发酵，酵母在发酵过程中生成的副产物较少，使啤酒的口味较好，泡沫状况良好，但发酵时间长；采用高温发酵，酵母的发酵速度较快，发酵时间短，设备的利用率高但生成副产物较多，啤酒口味较差。
ü 浓度的控制：麦汁浓度的变化受发酵温度和发酵时间的影响。发酵旺盛，降糖速度快，则可适当降低发酵温度和缩短最高温度的保持时间；反之，则应适当提高发酵温度或延长最高温度的保持时间。
ü 发酵时间的控制：发酵时间主要取决于发酵温度的变化，发酵温度高，则发酵时间短；发酵温度低，则发酵时间长。
2. 发酵工程的应用
具体应用 成果
在食品工业上的应用 生产传统的发酵产品 利用霉菌发酵生产酱油、利用酿酒酵母生产各种酒类
生产各种各样的食品添加剂 利用黑曲霉发酵生产柠檬酸、利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸
生产酶制剂 利用微生物发酵生产淀粉酶、果胶酶、脂肪酶和氨基肽酶等
在医药工业上的应用 通过工程菌生产药物 利用工程菌发酵生产生长激素释放抑制激素
通过改造菌种生产药物 通过诱变的青霉菌发酵生产青霉素
在农牧业上的应用 生产微生物肥料 利用根瘤菌和固氮菌生产的根瘤菌肥、固氮菌肥
生产微生物农药 利用苏云金杆菌防治多种农林虫害、利用白僵菌防治玉米螟和松毛虫
在农牧业上的应用 生产微生物饲料 利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液通过发酵获得大量微生物菌体用于饲料生产
在其他方面的应用 解决资源短缺和环境污染问题 利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯
对极端微生物的利用 利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂
例题1：下列对发酵工程及其应用的叙述，正确的有几项( )①用诱变育种或基因工程等方法选育出性状优良的菌种并进行扩大培养②用单细胞蛋白制成的微生物饲料，可通过发酵工程从微生物细胞中提取③发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身④啤酒的工业化生产过程中，酒精的产生积累主要在后发酵阶段完成⑤生产柠檬酸需要筛选产酸量高的黑曲霉⑥生产谷氨酸需将pH调至中性或弱碱性⑦利用发酵工程生产的根瘤菌肥作为微生物农药可以促进植物生长
A.2项 B.3项 C.4项 D.5项
【答案】C
【解析】①诱变育种和基因工程等方法都属于可遗传变异，能够改变微生物的遗传性状，进而可以从中选育出性状优良的菌种，并进行扩大培养，①正确；②单细胞蛋白即微生物菌体，不需要从微生物细胞中提取，②错误；③发酵工程的产品可以是微生物的代谢物、酶以及菌体本身，③正确；④啤酒发酵的过程分为主发酵和后发酵两个阶段，但酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，主发酵结束后在低温、密闭环境下储存一段时间属于后发酵，因此酒精主要在主发酵阶段的产生积累，④错误；⑤利用高产黑曲霉生产柠檬酸，⑤正确；⑥谷氨酸是由谷氨酸棒状杆菌生产的，而谷氨酸棒状杆菌属于细菌，通常要求在中性偏碱的环境中生长，⑥正确；⑦根瘤菌肥作为微生物肥料，可以通过根瘤菌的固氮作用，增加土壤中的氮肥量，促进植物生长，⑦错误。所以①③⑤⑥四项正确，②④⑦三项错误，ABD错误，C正确。故选C。
例题2：（多选题）发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵和产品的分离、提纯等。下列关于发酵工程的认识不科学的是( )
A.发酵工程具有生产条件温和、产物专一、污染小的特点
B.发酵工程的产品可以是微生物的代谢产物，也可以是微生物细胞本身
C.通常所指的发酵条件包括温度、溶氧、pH和加入酶的种类等
D.现代发酵工程与传统发酵技术最大的区别是前者可以用微生物进行发酵
【答案】CD
【解析】发酵工程具有生产条件温和、产物专一、污染小的特点，A正确；发酵工程的产品可以是微生物的代谢产物，也可以是微生物细胞本身，B正确；通常所指的发酵条件的控制包括温度控制、溶氧控制、pH控制等，酶由微生物细胞产生，对微生物细胞的代谢有催化作用，通常在发酵过程中不需要向发酵液中额外加入酶，C错误；传统发酵技术和现代发酵工程都是利用各种微生物的代谢来实现相关产品的生产，D错误。
考点三：微生物的培养
1. 培养基的配制
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
（2）培养基的分类：按照物理性质不同分为两类。
液体培养基：呈液体状态的培养基，不加入凝固剂（如琼脂）。
固体培养基：呈固体状态的培养基，加入凝固剂（如琼脂）。
（3）营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
（4）培养基特殊需求：
培养乳酸杆菌时，在培养基中添加维生素。
培养霉菌时，将培养基调至酸性。
培养细菌时，将培养基调至中性或弱碱性。
培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
2. 无菌技术
ü 关键：防止杂菌污染。
ü 目的：
（1）可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
（2）有效避免操作者自身被微生物感染。
ü 无菌技术的选择原则：
（1）考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
（2）考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
ü 消毒与灭菌：
（1）概念：
消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）。
（2）类型
消毒 灭菌
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
3. 微生物的纯培养
ü 概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
ü 酵母菌的纯培养：
（1）纯培养的原理：设法在培养基上得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物（单菌落）。
（2）纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
（3）纯培养过程
配制培养基：
灭菌：培养基转移至锥形瓶，加棉塞，包上牛皮纸，如图所示，然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。
倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程：
（4）平板划线法接种和分离酵母菌
平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
平板划线法结果：平板划线示意图（A）及培养后菌落分布示意图（B）如下图所示。
几次灼烧的目的：
（5）培养酵母菌：接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
灼烧时期 目的
第一次操作（取菌种前） 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物
每次划线之前 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
划线结束 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
1. 培养基的成分及功能
营养物质 作用 功能 主要来源
碳源 能为微生物代谢提供碳元素 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 能为微生物的代谢提供氮元素 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子 是生长必不可少的 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 是生命活动所必需的 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 外界摄入
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机化合物
2. 培养基的类型及应用
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产，连续培养
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、对微生物进行分类及鉴定
固体培养基 对微生物进行分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 对微生物进行分类、鉴别
用途 选择培养基 添加（或缺少）某种化学成分 培养、分离出特定微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物
3. 几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱160～170℃加热1～2h 玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽灭菌 100kPa、121℃维持15～30min 培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 70～75℃煮30min或80℃煮15min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 30W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
4. 两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
例题1：某研究小组将紫外线照射后酵母菌接种到培养基甲上，一段时间后将培养皿甲的菌落影印接种（不改变菌落位置）到乙、丙两个培养基中，进一步培养得到如图所示结果。下列分析错误的是（ ）
A.实验中甲宜使用马铃薯琼脂培养基，实验中接种工具需消毒和灭菌
B.乙为选择培养基，丙为完全培养基，二者形成对照
C.整个实验过程中用到了湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
D.从乙中挑取菌种进行纯化培养，可得到某种营养缺陷型的突变酵母菌
【答案】D
【解析】酵母菌以糖类为主要营养物质，所以实验中宜使用马铃薯琼脂培养基，天然培养基营养全面，接种到甲时，涂布器在涂布前放在酒精中消毒并在酒精灯火焰中灼烧，涂布后灼烧灭菌，所以接种工具需消毒和灭菌，A正确；乙中某种营养缺陷型的突变酵母菌不能生长，为选择培养基，丙培养基满足营养缺陷型的突变酵母菌生长，应为完全培养基，二者形成对照，B正确；整个实验过程中，培养基、影印接种工具等采用湿热灭菌，培养皿等用干热灭菌，涂布器用灼烧灭菌，C正确；应从丙中对应乙中无菌落生长的相同位置的菌落上挑取菌种进行纯化培养，得到某种营养缺陷型的突变酵母菌，D错误。
例题2：如图是某实验室从葡萄果实上获取酵母菌菌种的简要操作步骤。下列相关叙述中不正确的是（ ）
A.图中接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法
B.图中①②③步骤都必须确保是无菌操作
C.图中选择培养基培养时，应在培养皿的皿盖上做好标记避免混淆
D.图中选择培养基为固体培养基，而扩大培养的培养基为液体培养基
【答案】C
【解析】微生物培养中常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；微生物培养的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯净，因此培养过程必须保证无菌操作，以防止杂菌污染，B正确；题图中选择培养基培养时，因为使用的平板较多，且平板是倒置的，为避免混淆，应在培养皿的皿底做好标记，C错误；在进行酵母菌筛选时用的是固体培养基，而进行扩大培养时用的是液体培养基，D正确。
考点四：微生物的选择培养与计数
1. 选择培养基
ü 实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
ü 选择培养基概念：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
ü 选择培养基配方的设计：
（1）原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
（2）培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
2. 微生物的选择培养
ü 方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
ü 稀释涂布平板法的操作过程：
（1）系列梯度稀释操作：
（2）涂布平板操作。
取菌液：取0.1mL菌液，添加到培养基表面。
涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上燃烧，酒精燃尽后，冷却涂布器。
涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
ü 培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养，观察。
3. 微生物的数量测定
ü 稀释涂布平板法
（1）统计依据。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）操作。
一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
选用一定稀释范围的样品液进行培养，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
（3）注意问题：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
ü 显微镜直接计数
（1）原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
（2）方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
（3）计算公式：每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
（4）缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
4. 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）实验流程示意图：
（2）实验操作过程：
流程 具体操作 操作提示
土壤取样 先铲去表层土，取距地表 3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中 ①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布 ①火焰旁称取土壤样本②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组 ①注意无菌操作 ②对所用的平板、试管做好标记③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液
培养、观察和计数 ①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300 的平板进行计数 ①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
选择培养基和鉴别培养基
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件（如唯一氮源）或加入某种物质（如青霉素） 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽）
例题：新冠肺炎疫情防控期间，戴口罩、勤洗手是预防病毒感染的有效措施。研究人员用稀释涂布平板法对所戴口罩内外两侧的细菌进行培养、计数，下列相关操作正确的是（ ）
A.对操作的空间、操作者的衣着和双手等必须进行严格的灭菌处理
B.培养皿上应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等
C.完成接种后，应将平板放入18~20℃的恒温培养箱中培养1~2d
D.某稀释倍数下的三个平板中菌落数分别是27、169和176，应取平均值124
【答案】B
【解析】对操作的空间、操作者的衣着和双手等进行清洁和消毒，将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行严格灭菌，A错误；该实验使用的平板和试管较多，为了避免混乱，最好在使用前做好标记，B正确；不同种类的微生物适宜生存的温度不同，细菌一般在30~37℃的条件下培养1~2d，C错误；一个平板的计数结果与另两个相差悬殊，需舍去，应取平均值（169+176）/2=172.5，或者重新实验，D错误。发酵工程
1.下列关于微生物培养的特殊培养基的叙述中错误的是( )
A.分离出分解纤维素的微生物，应以纤维素作唯一碳源
B.利用缺乏氮源的培养基，可分离出固氮微生物
C.分离出分解尿素菌，培养基中加入尿素作唯一氮源和能源
D.在培养基中添加一定量的NaCl，可筛选出耐盐微生物
2.下列有关培养基和菌种鉴定的叙述，错误的是( )
A.配制培养大肠杆菌的培养基时要将pH调至中性或弱酸性
B.菌落的形状、大小、颜色等特征都可以作为菌种鉴定的依据
C.在微生物的实验室培养中，培养皿可以采用干热灭菌法进行灭菌
D.微生物的生长除受营养因素的影响外，还受pH、渗透压等的影响
3.下列关于无菌技术的说法正确的是( )
A.培养皿、培养基可用干热灭菌法灭菌
B.牛奶、熟啤酒、葡萄酒都可用巴氏消毒法消毒
C.100℃煮沸10分钟可以杀死微生物细胞和全部芽孢
D.为了防止污染，接种环经灼烧灭菌后应趁热快速挑取菌落
4.关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是( )
A.在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气
B.白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程
C.葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体
D.生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌
5.苹果树腐烂病由真菌感染引起，为了开发生物防治该病的途径，研究者拟从土壤中分离筛选出能抑制苹果树腐烂病菌生长的芽孢杆菌，实验流程如下图；其中左图为筛选能抑制腐烂病菌的芽孢杆菌，图为检验抑菌效果，A处接种等量的腐烂病菌，B处接种芽孢杆菌。下列判断不正确的是( )
A.配制上述培养基时，应先调PH为中性偏碱然后进行高压蒸汽灭菌
B.制平板培养基时应先灭菌再在酒精灯火焰旁边倒平板
C.若稀释10-2的每个平板平均单菌落为20个，则每克土壤为20000个
D.可通过比较右图两平板上腐烂病菌的大小来确定抑菌效果
6.下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验操作的叙述，错误的是( )
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C.该实验每隔24h统计一次菌落数目，并以菌落数目稳定时的记录作为结果
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
7.发酵食品是中国传统食品中一个重要的类别，承载了中华民族悠久的历史和丰富的文化内涵。早在《齐民要术》中就有泡菜制作技术的相关记载：“作盐水，令极咸，于盐水中洗菜，即内雍中。”下列关于泡菜制作的叙述，错误的是( )
A.发酵初期，水槽内有气泡产生是因为微生物有氧呼吸产生了CO2
B.盐水注入泡菜坛前，煮沸所用盐水的目的是杀灭细菌和除去部分溶解氧
C.发酵过程中的无氧环境、发酵液的pH上升可抑制其他杂菌生长
D.若罐口密闭不严会导致需氧腐生菌生长繁殖，使泡菜腐烂变质
8.油炸臭豆腐是一种风味小吃，制作时需要将豆腐浸入含有乳酸菌和芽孢杆菌等微生物的卤汁中发酵，相关叙述错误的是( )
A.卤汁中的乳酸菌和芽孢杆菌存在竞争关系
B.乳酸菌发酵产生了乳酸和二氧化碳，需定期排气
C.微生物发酵产生不同的代谢物使得臭豆腐具有独特的味道
D.制作臭豆腐时，豆腐相当于微生物生长的培养基
9.研究者从温泉中筛选出高效产生耐高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接到同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，结果如图2所示。下列说法正确的是( )
A.①过程为用蒸馏水稀释，②过程为涂布接种
B.图2培养皿要放在高温条件下培养，周围显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌
C.透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明该微生物分解淀粉的能力越强
D.甲、乙试管为液体培养基，液体培养基能分离获得水生嗜热菌单菌落
10.某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是______。甲、乙培养基均属于______培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释______倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是______（答出1点即可）。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：______。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即______。
11.检验某水体中大肠杆菌数目是否符合生活饮用水卫生标准，常用滤膜法测定，其操作流程如下图所示。EMB培养基上形成的不同菌落中，大肠杆菌菌落呈深紫色。下列对该实验操作的分析，错误的是( )
A.测定前，滤杯、滤膜、滤瓶、镊子和水样均需进行灭菌处理
B.若培养后的平板没有长出菌落，则可能是滤膜孔径过大所致
C.配制EMB培养基时，应满足大肠杆菌所需营养物质及调节pH为弱酸性
D.制备培养基时，需要将培养基冷却到室温再倒平板，避免高温杀死菌种
12.厨房中的厨余垃圾多为湿垃圾，湿垃圾处理的有效方法之一是用微生物对其进行降解。如图表示筛选高效降解淀粉菌种的过程。下列有关叙述错误的是( )
A.配制培养基后需进行灭菌处理，常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法
B.菌落①与菌落②周围产生了透明圈，说明菌落①与菌落②产淀粉酶
C.培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个甚至几个活菌
D.初步判断培养基上菌种的类型，需要用显微镜观察菌体的形态特征
13.一般情况下，一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性。为探究某种抗生素对细菌的选择作用，实验人员在接种了金黄色葡萄球菌的培养基中放置了含某种抗生素的圆形滤纸片和不含抗生素的圆形滤纸片，一段时间后测量滤纸片周围抑菌圈的直径。从抑菌圈边缘的菌落上挑取细菌富集培养，然后重复上述步骤培养三代，结果如下表所示。下列有关叙述错误的是( )
培养代数 平板各区域滤纸片周围抑菌圈的直径/cm
①号区域 ②号区域 ③号区域 ④号区域
第一代 0 2.27 2.13 2.27
第二代 0 1.95 2.02 1.87
第三代 0 1.80 1.87 1.78
A.一定浓度的抗生素会诱导细菌产生耐药性的变异
B.采用稀释涂布平板法将金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上
C.平板中①号区域的滤纸片不含抗生素，起空白对照的作用
D.随培养代数增多，抑菌圈的直径越小，说明细菌的耐药性越强
14.如图所示，科研人员利用诱变方式选育可高产β-胡萝卜素的三孢布拉霉负菌。未突变菌不能在含有β-紫罗酮的培养基上生长。随β-胡萝卜素含量增加，菌体颜色从黄色加深至橙红色。图甲为选育菌种及获得β-胡萝卜素的流程，以下相关叙述不正确的是( )
A.要得到图乙所示的菌落，可用稀释涂布平板法进行②操作，然后培养
B.经过程①紫外线照射的三孢布拉霉负菌都能在含β-紫罗酮培养基上生长
C.进行③操作时，应选择较大的橙红色菌落中的菌株继续接种培养
D.能在添加了β-紫罗酮的乙上长成菌落的细菌，其遗传物质都发生了改变
15.三糖铁（TS）培养基含有牛肉膏、蛋白陈、蔗糖、乳糖、微量葡萄糖、硫酸亚铁、氯化钠、酚红、琼脂等成分，可根据观察单一细菌对三种糖的分解能力及是否产生硫化氢来鉴别细菌的种类。三糖铁（TS）琼脂试验方法是：使用笔直的接种针挑取待测菌落，将接种针平稳刺入三糖铁固体斜面培养基内，然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针，最后在斜面上进行之字划线，36℃下培养18～24h观察实验结果。酚红在酸性条件下显黄色，在碱性条件下显红色。细菌产生的硫化氢与铁盐反应生成黑色沉淀。下列叙述正确的是( )
A.穿刺或划线的目的是将纯培养物进行二次传代培养，须严格控制交叉污染
B.若培养基出现黑色沉淀，可推测该细菌不能分解牛肉膏、蛋白
C.若细菌能分解乳糖和葡萄糖而产酸、产，推测斜面为黄色、底层为红色且有气泡
D.三糖铁（TSI）培养基属于选择培养基
16.培养基是指由不同营养物质组合配制而成的，供微生物、植物细胞或动物细胞生长繁殖的营养基质。下列关于培养基的叙述，正确的是( )
A.利用植物细胞培养技术获得初生代谢物时，需要在培养基中添加琼脂
B.体外培养杂交瘤细胞时，培养基加入血清后需湿热灭菌以确保无菌
C.探究酵母菌种群数量变化时，通过振荡培养增加溶氧促进其增殖
D.分离并纯化硝化细菌时，培养基中无需添加碳源和氮源
17.某同学选用新鲜成熟的葡萄制作果酒和果醋,下列相关叙述正确的是( )
A. 果酒发酵,每日放气需迅速,避免空气回流
B. 发酵过程中pH持续降低,有机物的种类和含量持续增加
C. 果醋发酵时,发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时
D. 果酒发酵后,提高发酵环境温度即可进行旺盛的果醋发酵
18.成熟的紫皮百香果果皮中富含花色苷，果汁色泽金黄、香气馥郁、酸甜可口，富含多酚、类胡萝卜素等活性成分，有“果汁之王”的美称。以紫皮百香果全果和果汁为原料发酵，所得百香果酒的香气深受消费者的喜爱。以下说法正确的是( )
A.百香果酒制作过程中酵母菌始终进行无氧呼吸
B.从酿酒残渣中筛选培养醋酸菌时，在缺少糖的液体培养基中可加入乙醇作为碳源
C.可利用酸性的重铬酸钾遇酒精变黄的特点，检测发酵液是否开始进行酒精发酵
D.家庭制作百香果酒时，要每隔12小时打开瓶盖使多余的二氧化碳排出
19.刺梨是云贵川的特有水果，富含超氧化物歧化酶和大量的维生素C、花青素等，是制作果酒和果醋的优质原料。刺梨酒和刺梨醋的主要生产流程如图所示。下列叙述正确的是( )
A.发酵过程Ⅱ需要氧并产生大量
B.图示发酵过程中发酵液pH先升高后降低
C.发酵过程的温度比发酵过程Ⅱ高
D.发酵I、Ⅱ是此生产过程的中心环节
20.下列有关微生物培养过程的叙述，正确的是( )
A.湿热灭菌后的培养基需冷却至室温再倒平板，避免高温杀死菌种
B.筛选可分解尿素的菌种时，培养基中还需加入适量的碳源
C.实验室分离纯化菌种一般使用液体培养基或半固体培养基
D.可以利用添加适量伊红美蓝的培养基鉴定金黄色葡萄球菌
21.科研人员采用富集培养方法从土壤中分离出能降解对羟基苯甲酸的微生物的实验过程，如图所示。下列说法正确的是( )
A.富集培养基以对羟基苯甲酸为唯一碳源，不能进行高压蒸汽灭菌
B.取少量样品重复培养的目的是使能降解对羟基苯甲酸的微生物比例增高
C.在图中1、2试管中都有微生物生长，说明该富集培养得到了欲分离的微生物
D.富集培养后通过平板划线法得到纯培养物
22.我国科学家利用如下图所示的液态厌氧发酵工艺，实现了高效产出乙醇和乙醇梭菌蛋白。下列叙述错误的是( )
A.乙醇梭菌以CO、CO2为主要的碳源和能源，具有较强的固碳潜力
B.乙醇梭菌是自养厌氧型细菌，其厌氧发酵的过程需要进行搅拌
C.通过该工艺高效生产清洁能源乙醇，可降低生态足迹
D.乙醇羧菌单细胞蛋白是通过发酵工程而生产的微生物菌体
23.玉米芯残渣含有大量的木质纤维素(由纤维素、半纤维素和木质素组成)，通常被焚烧处理，不但造成严重的环境污染，还导致大量能量浪费。某科研团队从树林土壤中筛选得到野生的季也蒙毕赤酵母，并进行多次筛选以期获得优良菌株。优良菌株以玉米芯残渣为原料可发酵生产洁净燃料——乙醇。下图l为筛选过程，请分析回答：
图1 图2
(1)图1中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是____________。稀释后将菌液接种到
以________________作为唯一碳源的培养基中进行培养。待长出菌落后，提取其基因组DNA进行扩增并测序，鉴定为季也蒙毕赤酵母。
(2)发酵生产时需先将玉米芯残渣进行预处理，该过程会产生许多抑制物。因此，研究人员在②的液体培养基中加入抑制物，并在③多次筛选时不断提高抑制物的浓度，目的是____________。培养过程中从②的液体培养基中定期取样并用___________法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的育种方法还有___________(多选)。
A.杂交育种 B.诱变育种 C.多倍体育种 D.基因工程育种
(3)刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的葡萄糖等发生这种反应，从而在纤维素分解菌周围出现透明的水解圈。将经过多次实验后所获得的4种优良菌株接种到含纤维素、刚果红、高浓度抑制物的固体培养基中，结果如图2。可选择菌株____________作为目标菌株进行发酵生产，原因是_______________。
答案以及解析
1.答案：C
解析：A、在以纤维素为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长，故分离出分解纤维素的微生物，应以纤维素作唯一碳源，A正确；
B、在缺乏氮源的培养基上，固氮微生物能够很好地生长，其他微生物则不能生长，故利用缺乏氮源的培养基，可分离出固氮微生物，B正确；
C、利用尿素作为唯一氮源的选择培养基可筛选分解尿素的细菌，尿素一般不能作为能源物质，糖类可以提供能量，C错误；
D、在培养基中添加一定量的NaCl，耐盐微生物能够很好地生长，其他微生物的生长受到抑制，D正确。
故选C。
2.答案：A
解析：培养细菌（比如大肠杆菌）时需将培养基的pH调至中性至弱碱性（一般控制在pH为7~7.5），A错误；每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征，包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等，不同种或同种在不同的培养条件下，菌落特征是不同的，所以，菌落特征可作为微生物分类鉴定的重要依据之一，B正确；常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等，吸管和培养皿等玻璃器皿可以采用干热灭菌法进行灭菌，C正确；微生物的营养物质主要有碳源、氮源、水和无机盐等，有的微生物还需要特殊的营养物质，微生物的培养过程中除受营养因素影响外，还受到pH、氧、渗透压的影响，D正确。
3.答案：B
解析：A、培养皿可用干热灭菌法灭菌，培养基一般用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A错误；B、牛奶、熟啤酒、葡萄酒都可用巴氏消毒法消毒，该方法可以减少牛奶和酒类中的营养流失，B正确；C、煮沸消毒法中100℃煮10分钟可以杀死部分微生物细胞，不包括所有芽孢、孢子，C错误；D、为了防止污染，接种环经灼烧灭菌后需冷却后挑取菌落，否则会烫死菌种，D错误。
故选：B。
4.答案：C
解析：在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气，让酵母菌大量繁殖，再进行酒精发酵，A正确；白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程，如发酵初期酵母菌大量繁殖，B正确；酒精发酵利用的菌种是酵母菌，葡萄糖转化为乙醇为无氧呼吸，所需的酶存在于细胞质基质，不存在线粒体中，C错误，D正确。
5.答案：C
解析：A、如果先进行高压蒸汽灭菌再调pH，那么在调pH时，培养基就有可能被污染，所以在制培养基时，都是要先调pH后高压蒸汽灭菌，A正确；
B、培养基经高压蒸汽灭菌后，需冷却至50℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。倒平板时须在酒精灯火焰附近，防止杂菌进入，B正确；
C、每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，C代表某稀释梯度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数，所以每克土壤样品中的菌株数=(20÷0.2)×100=10000个,C错误；
D、由题意分析可知，A处接种等量的腐烂病菌，B处接种芽孢杆菌，可通过观察对比右图两平板上腐烂病菌的大小来确定抑菌效果，D正确。
故选C。
6.答案：B
解析：A、利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度，稀释倍数太低，菌落太多会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不易进行计数，A正确；
B、若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，B错误；
C、该实验每隔24h统计一次菌落数目，并以菌落数目稳定时的记录作为结果，C正确；
D、以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后，培养基的pH相对稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。故选B。
7.答案：B
解析：B、草盛豆苗稀，描述的是两种物种，体现了种间竞争关系，B正确
8.答案：B
解析：B、乳酸菌是厌氧菌，能够进行无氧呼吸，发酵产生了乳酸，不会产生二氧化碳，B错误。
9.答案：C
解析：A、图中①是用无菌水进行梯度稀释，②是涂布接种，二者合称为稀释涂布平板法，A错误；
B、图2中周围不显蓝色的菌落，说明其产生的淀粉酶可以在高温下分解淀粉，即周围不显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌，B错误；
C、题意显示，淀粉遇碘液会变蓝，产生耐高温淀粉酶的嗜热菌能够分泌淀粉酶将淀粉分解掉，在培养基上会形成透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明该微生物分解淀粉的能力越强，C正确；
D、微生物需要在固体培养基上才能形成单菌落，液体培养基可以用于扩大培养，D错误。
故选C
10.答案：（1）高压蒸汽灭菌；琼脂；选择
（2）
（3）细菌细胞由于渗透作用失水过多，丧失活性（S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长）
（4）淤泥中取样，然后进行梯度稀释，微生物的培养与观察，计数
（5）水、无机盐、碳源、氮源
解析：（1）培养基一般使用高压蒸汽灭菌，微生物的分离和筛选一般使用选择培养基，该物质Y是琼脂，甲、乙培养基均以S为唯一碳源和氮源的选择培养基。
（2）利用稀释涂布平板法对细菌进行计数，要保证每个平板上长出的菌落数不超过200，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布100 μL（0.1ml）稀释后的菌液，则有200×a÷0.1=2×，则稀释倍数a=。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，可能会导致细菌细胞由于渗透作用失水过多，导致活性丧失。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，主要实验步骤有淤泥中取样，然后进行梯度稀释，微生物的培养与观察，计数。
（5）培养基的主要成分包括水、无机盐、碳源、氮源。
11.答案：B
解析：B、滤膜法需要将微生物留在滤膜上，则滤膜孔径应该比大肠杆菌小，因此若培养后的平板没有长出菌落，则可能是滤膜孔径过大所致，B正确。
12.答案：D
解析：培养基灭菌常用高压蒸汽灭菌法，A正确；淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，因此会形成透明圈，图中菌落①与菌落②周围产生了透明圈，说明菌落①与菌落②能产生淀粉酶，B正确；由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上显示的只是一个菌落，故培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个，甚至几个活菌，C正确；由于菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌体的形态特征，D错误。
13.答案：A
解析：A、细菌产生耐药性的变异是基因突变产生的，抗生素起到了选择作用，A错误；B、将金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上可以采用稀释涂布平板法，B正确；C、平板中①号区域起空白对照的作用，故滤纸片上不含有抗生素，C正确；D、随培养代数增多，抑菌圈的直径越小，说明细菌对抗生素的耐药性越强，D正确。
14.答案：B
解析：A、图乙中的菌落均匀分布于平板，说明接种方法是用稀释涂布平板法，A正确； B、过程①紫外线照射的作用是利用物理因素诱导发生基因突变，由于突变的不定项性，被照射的三孢布拉霉负菌不可能都能在含β-紫罗酮培养基上生长，B错误； C、橙红色的菌体为高产菌，素进行③操作时，应选择较大的橙红色菌落中的菌株继续接种培养，C正确； D、能在添加了β-紫罗酮的乙上长成菌落的细菌是经过通过紫外线照射后的高产菌，其遗传物质都发生了改变，D正确。
15.答案：A
解析：分析题干信息及培养基成分可知，三糖铁(TSI)培养基属于鉴别培养基，可根据观察单一细菌对三种糖的分解能力及是否产生硫化氢，来鉴别细菌的种类。划线和穿刺操作一定针对纯培养物，否则实验操作是无意义的。划线或穿刺的目的是将纯培养物二次传代培养，这种操作也见于标准菌株复壮或传代，整个操作过程中要严格规范操作，严格控制交叉污染，A正确；细菌产生的硫化氢与铁盐反应生成黑色沉淀，若培养基出现黑色沉淀，可推测该细菌能够分解牛肉膏、蛋白胨，B错误；细菌分解葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，C错误；三糖铁(TSI)培养基属于鉴别培养基，D错误。
16.答案：C
解析：利用植物细胞培养技术获得初生代谢物时需悬浮培养愈伤组织，因此培养基中不能添加琼脂；血清经过湿热灭菌后活性成分失活，血清可进行射线除菌或过滤除菌；探究酵母菌种群数量变化时，使其先进行有氧呼吸增殖，应振荡培养；硝化细菌为化能自养型微生物，分离并纯化硝化细菌时无需添加碳源，但应添加作为氮源和能源。
17.答案： C
解析：果酒发酵时,装置内压强总是大于外界的,需缓慢放气,防止发酵液喷出,A错误;发酵过程中有机物种类增加,有机物含量因为代谢消耗而减少,B错误。
18.答案：B
解析：A、在制作酒时，开始先通入一段时间的空气，目的是让酵母菌先进行有氧呼吸，快速增加酵母菌的数量，此时不产生酒精，因为在有氧呼吸的情况下酵母菌将有机物分解为二氧化碳和水；只有氧气耗完后，进行无氧呼吸，才将有机物分解为酒精和水，A错误；
B、从酿酒残渣中筛选培养醋酸菌时，醋酸菌可以将乙醇直接转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸，故可以加入乙醇作为碳源，B正确；
C、在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色，检测发酵液是否开始进行酒精发酵，C错误；
D、家庭制作百香果酒时，要每隔12小时拧松瓶盖使多余的二氧化碳排出，不是打开，D错误。故选B。
19.答案：D
解析：果酒制作所用菌种是酵母菌，代谢类型是异养兼性厌氧型真菌，属于真核细胞，果酒制作的前期需氧，后期不需氧。果醋制作所用菌种是醋酸菌，属于原核细胞，适宜温度为30~35℃，需要持续通入氧气。发酵过程Ⅱ是醋酸菌利用酒精生产醋酸的过程，醋酸菌为需氧菌，可将酒精分解为乙醛，乙醛再变为醋酸，该过程需要氧但不产生，A错误；酒精生产过程中酵母菌无氧呼吸会产生，使发酵液pH降低，醋酸发酵过程中产生的醋酸会使发酵液的pH再度降低，B错误；酒精发酵的适宜温度为28℃左右，醋酸发酵的适宜温度为30~35℃，因此发酵过程I(酒精发酵)的温度比发酵过程Ⅱ(醋酸发酵)低，C错误；酒精发酵是酵母菌在无氧条件下产生酒精，上述醋酸发酵是醋酸菌利用酒精生产醋酸，因此发酵I、Ⅱ是此生产过程的中心环节，D正确。
20.答案：B
解析：对培养基灭菌可用高压蒸汽灭菌法，后冷却至50℃左右时，进行倒平板，A错误；尿素可作为唯一氮源，还需要添加碳源，B正确；分离菌种一般使用固体培养基，C错误；伊红美蓝用于鉴定大肠杆菌，D错误。
21.答案：B
解析：A.为防止培养基中杂菌或孢子对实验结果的影响，要对以对羟基苯甲酸为唯一碳源的富集培养基进行高压蒸汽灭菌处理，故A错误;B取少量样品重复培养的目的是使能降解对羟基苯甲酸的微生物大量繁殖，使能降解对羟基苯甲酸的微生物所占比例增高，故B正确;C.若在图中1号试管中也有微生物的生长，则说明该富集培养得到的微生物中既有能降解对羟基苯甲酸的微生物，也有能分解其他碳源的微生物，即存在杂菌，故C错误;D.富集培养后，通过单菌落挑取法得到纯培养物故D错误。
22.答案：A
解析：A、图中显示，乙醇梭菌以CO2为主要的碳源，以CO为主要能源，实现了将无机物转变成有机物的过程，因为自养微生物，A错误；B、乙醇梭菌是自养厌氧型细菌，其厌氧发酵的过程需要进行搅拌，通过搅拌可使细菌和营养物质充分混合，提高培养基的使用效率，B正确；C、通过该工艺高效生产清洁能源乙醇，可减少化石燃料的燃烧，进而降低生态足迹，C正确；D、乙醇羧菌单细胞蛋白是通过发酵工程而生产的微生物菌体，即单细胞蛋白是微生物菌体本身，D正确。故选A。
23.答案：(1)(便于涂布平板后)得到单菌落；木质纤维素
(2)筛选对抑制物不敏感的优良菌株；稀释涂布平板法；BD
(3)B；菌落直径与透明圈直径比值最小
解析：(1)稀释的目的是保证每个菌落都是由一个细胞发育而来，以保证计数的准确性。季也蒙毕赤酵母以玉米芯残渣为原料可发酵生产洁净燃料，说明季也蒙毕赤酵母可以分解木质纤维素，因此需将季也蒙毕赤酵母接种到以木质纤维素为唯一碳源的培养基中进行培养。待长出菌落后，提取其基因组DNA进行扩增并测序，鉴定为季也蒙毕赤酵母。
(2)发酵生产时需先将玉米芯残渣进行预处理，该过程会产生许多抑制物，为了筛选出对抑制物不敏感的优良菌株，可在②的液体培养基中加入抑制物，并在③多次筛选时不断提高制物的浓度。
对菌落进行计数，常用稀释涂布平板法。诱变育种的原理是基因突变，基因工程能按照人们意愿获得人们所需要的新的生物类型，所以还可以通过B诱变育种和D基因工程育种获得优良菌株。
(3)由图可知，B的菌落最小，透明圈最大，说明其分解纤维素的能力最强，所以可选择菌株B作为标菌株进行发酵生产，原因是菌落直径与透明圈直径比值最小。
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