人教版高中生物选修1多聚酶链式反应pcr技术课件（45张）

课件45张PPT。课题2
多聚酶链式反应扩增DNA片段温故知新1组成DNA分子的基本单位是什么?
这些基本单位是如何连接成DNA分子的?
DNA分子结构有什么特点？
一、基础知识O12345A T G C磷酸酯键5'端3'端5'端3'端DNA的方向：通常将DNA的游离的羟基末端（-OH）称为3'端，而游离的磷酸基团的末端称为5'端。DNA分子的复制过程是怎样的？
DNA分子的复制需要哪些条件？温故知新2补充知识1、DNA聚合酶的特点：
不能从头合成DNA，只能从3'端延伸DNA，因此DNA复制需要引物，为DNA聚合酶提供3'端3'3'复制方向：沿模板，从子链的5'向3'端延伸引物：是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链一段碱基序列碱基互补配对，用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸补充知识2、DNA的半不连续复制二、PCR 技术
DNA模板
DNA聚合酶
两种引物
四种脱氧核糖核苷酸
1、原理：体外模拟细胞内DNA的复制
另外，PCR技术需要在一定的缓冲溶液中才能进行2、模拟细胞内DNA的复制面临的首要问题是：DNA双链如何解开，如何保持单链状态？细胞内复制DNA用的是解旋酶使得双链打开，然后DNA单链结合蛋白与解开的单链结合，使单链状态得以保持。PCR技术利用的是DNA的热变性和复性原理DNA双链单链变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合DNA 分子的热变性原理：3、PCR反应的过程……………………………………………………降低温度复性55℃……………………………………………………DNA聚合酶DNA聚合酶 高温能将将DNA的双螺旋打开，但同时也可能使DNA聚合酶失活，所以每循环一次就要向反应体系中重新加入一次DNA聚合酶，如何解决这个问题呢？
耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化3、PCR反应的过程…………………………………………………………………………………………………………DNA聚合酶DNA聚合酶……………………………………………………第二轮5'5'5'PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸30次循环后一个靶序列扩增的数量三、 PCR 的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪微量离心管微量移液器一次性吸液枪头1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n（二）实验中DNA含量的测定1 、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2 、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③测定④计算DNA含量（ ?g ）＝50 x (260nm的读数）
x 稀释倍数50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02比色杯六、 课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃谢谢！