新人教生物一轮复习学案：第47讲 微生物的选择培养和计数、发酵工程及其应用（含答案解析）
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| 名称 | 新人教生物一轮复习学案：第47讲 微生物的选择培养和计数、发酵工程及其应用（含答案解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 968.2KB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-11-27 23:50:29 | ||
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文档简介
新人教生物一轮复习学案
第47讲 微生物的选择培养和计数、发酵工程及其应用
课标要求 1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 2.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。 3.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 4.阐明发酵工程利用微生物进行发酵来生产特定的产物。 5.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上的应用。
考点1 微生物的选择培养和计数
概 念 落 实
1.微生物选择培养的原理
实验室中对微生物的筛选，可以人为提供 的条件（包括营养、温度和pH等），同时 其他微生物的生长。可以利用 培养基。
归 纳 总 结
三种选择培养方法的比较
方法 特点 举例
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源时可以分离固氮微生物
利用某种化学物质进行的选择培养 在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
2.微生物的选择培养——稀释涂布平板法的操作步骤
（1）铲取土样，将样品装入纸袋中。
（2）将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（3）一系列稀释操作
（4）涂布平板操作
①取 mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有 的烧杯中（目的是消毒）。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用 将 均匀地涂布在 表面。涂布时可 培养皿，使涂布均匀。
⑤待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入28 ℃左右（培养温度因菌种种类的不同而有差异）的恒温培养箱中培养24～48 h。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的 菌落。
归 纳 总 结
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
接种用具 接种环 涂布器
分离结果
单细胞菌 落的获得 单细胞菌落从后划线的区域挑取 只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落
应用 都会在培养基表面形成单菌落，达到分离纯化微生物的目的；都可用于观察菌落特征
不能用于微生物的计数 可对微生物进行计数
其他共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作
3.微生物的数量测定
计数 方法 法 （间接计数法、活菌计数法） 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数
计数 原则 一般选择菌落数为 的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出平均值 实质是样方法，计数时要注意“计上不计下，计左不计右”
缺点 及结果 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，导致统计的结果往往比实际值偏 不能区分死菌和活菌，故结果会比实际值偏
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成 。利用 作为唯一 的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
（2）操作步骤
①土壤取样：从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤中取样。先铲去表层土，在距地表约 cm的土壤层取样。
②样品的稀释：第一次做实验时，可以将稀释的范围放宽一点。
③微生物的培养与观察
a. 培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。
b. 观察：每隔 统计一次 数目，选取菌落数目 时的记录作为结果。
诊断·加强
1.判断下列说法的正误：
（1）选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 （ ）
（2）对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。 （ ）
（3）在选择培养基上生长的微生物就都是所需的目的菌。 （ ）
（4）筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 （ ）
（5）分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。 （ ）
2.微生物培养中设置对照和重复
对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除 因素对实验结果的影响
实例 空白对照：确定培养基制作是否 同一稀释度涂布至少3个平板
典 题 固 法
（2022·江苏卷）下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
（2021·山东卷）解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是（ ）
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
（2022·广东卷）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146 m深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用 法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用 法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌物各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 。
审 答 指 导
第（2）小题需要审题，“置于各种培养基中培养”排除了因营养物质的缺乏而导致很多微生物不能被分离筛选出来，因此可考虑深海独特环境因素的影响。
第（3）小题考查分解者在生态系统碳循环中的作用，重点强调将有机物氧化分解为CO2等无机物，返回到无机环境，从而加快物质的循环。
（2020·全国Ⅰ卷）某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于 培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个·mL－1，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 （答出1点即可）。
规范长难句——第（3）问属于因果分析，“因”是S超过一定浓度，“果”是细菌对S降解量反而降低，因与果之间需要作出合理的推测，例如S浓度过高会抑制该菌株的生长或抑制该菌株的代谢。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤： 。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。
考向1 分解尿素的细菌的分离和计数
1.某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列叙述不正确的是（ ）
A.在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B.梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C.振荡的目的是增加尿素分解菌的浓度
D.由图示菌落计数结果可知10 g土样中的菌株数约为1.6×107个
考向2 结合实例考查微生物的选择培养与计数
2.培养基可为微生物的生长、繁殖提供必需的营养物质。根据某些微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理设计培养基，可使其具有只允许特定的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。下列关于选择培养基的说法，错误的是（ ）
A.培养基中添加伊红—亚甲蓝，统计饮用水中大肠杆菌的数量
B.以尿素为唯一氮源的培养基，可将土壤中的尿素分解菌筛选出来
C.培养基中添加青霉素从而将真菌从混有细菌的培养基上选择出来
D.用以纤维素为唯一碳源的培养基分离出分解纤维素的微生物
3.（2022·广州二模）营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法合理的是（ ）
A.过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同
B.进行过程②培养时，必须先将丝绒布转印至基本培养基上，顺序不能颠倒
C.统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大
D.营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关
4.（2022·广东六校联考）为了检测牛奶中是否含有某种微生物，配制的培养基的配方如下（注：伊红—亚甲蓝是由两种染色剂组成的细胞染料），请分析并回答下列问题：
蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4
10 g 5 g 5 g 2 g
伊红 亚甲蓝 蒸馏水
0.4 g 0.065 g 1 000 mL
将培养基pH调至7.2
（1）根据配方，该培养基可用来培养 （选填“细菌”“霉菌”或“细菌与霉菌”），其所含氮源的功能是 。
（2）该微生物在同化作用上的代谢类型是 型，其在培养基上产生的单个菌落在生态学中被称为 。
（3）接种好的培养皿在恒温箱中培养时要倒置，目的是 。
（4）有同学为统计消毒后的牛奶中该微生物的含量，取5 mL牛奶样液进行了下图操作，每个平板中的统计结果为87、83、85，则经过消毒后的牛奶中该微生物的含量大约是 个·mL－1。用该方法统计样本菌落数时 （选填“需要”或“不需要”）设置空白对照组，目的是 。
考点2 发酵工程及其应用
概 念 落 实
1.发酵工程的基本环节
基本环节 主要方法及目的
选育菌种 选育方法：从自然界中筛选； ；
扩大培养 快速增加菌种数量
配制培养基 结合菌种的代谢特点配制培养基
灭菌 避免因杂菌污染而影响产品品质和产量
接种 将扩大培养后的菌种投放到 中
发酵罐 内发酵 ①监测并控制 等发酵条件，使发酵全过程处于最佳状态； ②随时检测培养液中微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程，还要及时添加必需的 等
分离、提 纯产物 ①若发酵产品是微生物细胞本身，采用 等方法将菌体分离、干燥； ②若发酵产品是代谢物，可根据 采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品
归 纳 总 结
与传统的容器相比，发酵罐最明显的优势
发酵罐能实现大规模连续生产，最大限度地利用原料和设备，获得高产量和高效率。
（1）进行严格灭菌能使空气按需要流通，从而提供良好的发酵环境。
（2）实施搅拌、振荡以促进微生物生长。
（3）对温度、压力、空气流量实行自动控制。
（4）通过各种生物传感器测定发酵罐内菌体浓度、营养成分、产品浓度等，并用电脑随时调节发酵进程。
2.发酵工程的应用
具体应用 成果
在食品工业上的应用 生产传统的 利用 发酵生产酱油、利用 生产各种酒类
生产各种各样的 利用黑曲霉发酵生产柠檬酸、利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸
生产 利用微生物发酵生产淀粉酶、果胶酶、脂肪酶和氨基肽酶等
在医药工业上的应用 通过 生产药物 利用工程菌发酵生产生长激素释放抑制激素
通过改造菌种生产药物 通过 的青霉菌发酵生产青霉素
在农牧业上的应用 生产微生物肥料 利用 和固氮菌生产的根瘤菌肥、固氮菌肥
生产 利用苏云金杆菌防治多种农林虫害、利用白僵菌防治玉米螟和松毛虫
生产微生物饲料 利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液通过发酵获得大量微生物菌体用于生产饲料
在其他方面的应用 解决资源短缺和环境污染问题 利用 发酵生产酒精、乙烯
对极端微生物的利用 利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂
诊断·加强
判断下列说法的正误：
（1）在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种。 （ ）
（2）分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤、沉淀等方法。 （ ）
（3）在连续培养过程中补充的同种培养液和空气必须先灭菌。 （ ）
（4）乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产。 （ ）
（5）发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关。 （ ）
（6）单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的。 （ ）
典 题 固 法
（2022·山东卷）青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是（ ）
A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B.可用深层通气液体发酵技术提高产量
C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需要严格灭菌
（2022·山东卷）啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法不正确的是（ ）
A.用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无需发芽就能产生α－淀粉酶
B.焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C.糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D.通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
（2022·湖北卷）废水、废料经加工可变废为宝。某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A.该生产过程中，一定有气体生成
B.微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料
C.该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质
D.沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理
（2021·广东卷）中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有 等（答出2种方法即可）。
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g·L－1，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是 （答出2点即可）。
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌 。
考向1 发酵工程的基本环节
1.（2018·江苏卷）某高校采用如图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是（ ）
A.夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理
B.乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大
C.正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压
D.可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
2.下图所示为发酵工程生产产品的流程图，据图回答问题：
（1）若能生产人生长激素的工程菌是通过①培育的，①应该是 ；若高产青霉素菌种是通过②培育的，②应该是 。
（2）根据培养基的用途，可以将它们分为 培养基和 培养基。各种培养基的具体配方不同，但一般都含有 等营养成分。培养基在使用之前要用 进行灭菌。
（3）整个过程的中心环节是 ，在该时期要随时取样检测培养基中的 等。同时，要严格控制 等发酵条件，因为环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物 的形成。
（4）在发酵过程中要不断搅拌的目的是① ；② 。
（5）发酵产品分离、提纯时要根据产品的类型不同选择合适的方法。如果发酵产品是菌体本身，常常采用
等方法分离、提纯；如果发酵产品是微生物的代谢物，还要根据 采取适当的方法分离、提纯。
考向2 发酵工程的应用
3.发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。下列关于发酵工程的认识，错误的是（ ）
A.发酵工程具有条件温和、产物单一、污染小的特点
B.发酵工程的产品包括微生物的代谢产物和菌体本身
C.通常所指的发酵条件包括温度、溶解氧和pH等
D.发酵工程与传统发酵技术最大的区别是前者可以用微生物进行发酵
4.（2022·东莞调研）从传统发酵技术到发酵工程，发酵技术的发展为人们提供了丰富多样的食品和药物等。下列叙述错误的是（ ）
A.醋酸菌能以酵母菌的某种代谢产物为原料合成醋酸
B.无氧条件下利用大肠杆菌发酵大规模生产青霉素
C.腐乳味道鲜美是因为毛霉等产生的蛋白酶将蛋白质分解为氨基酸和小分子的肽
D.甜面酱、酱油、豆豉等都是利用传统发酵技术制作的食品
构核心概念
练教材长句
链接选择性必修3教材P18正文。
（1）与直接计数法相比， 稀释涂布平板法计数测得的细菌数 。这是因为 。
链接选择性必修3教材P24“思考·讨论”。
（2）啤酒工业生产中，发酵分为 两个阶段。进行后发酵的原因是 。
（3）啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期如果密封不严，会使啤酒变酸。这是因为 。
拎教材“冷”点
链接选择性必修3教材P17“图1－7”。
（1）不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免 其中的酒精。
链接选择性必修3教材P20“拓展应用”。
（2）分解纤维素的微生物的分离与鉴定实验中，选择培养纤维素分解菌的原理是利用 为唯一碳源的培养基培养土壤微生物，只有 的微生物能够生存并繁殖。在纤维素培养基中添加刚果红，刚果红与纤维素结合形成 ，当纤维素分解菌生长时，会形成具有 的菌落。
链接选择性必修3教材P23“发酵罐示意图”。
（3）搅拌叶轮在发酵过程中的作用：①增加微生物在发酵罐中与 的接触面；②有利于发酵产生的 散发；③使发酵液中的固性物质保持悬浮状态。
（4）发酵罐中发酵条件的控制
①温度的控制：发酵过程中可以通过 进行检测和由冷却水进、出口水流来调整。
② 的控制：通过通气量和搅拌速度加以调节。
③pH的控制：可以通过 检测。
第47讲 微生物的选择培养和计数、发酵工程及其应用
考点1 微生物的选择培养和计数
【概念落实】
1.有利于目的菌生长 抑制或阻止 选择
2.（4）①0.1 ②酒精 ④涂布器 菌液 培养基 转动 ⑤倒置 单
3.稀释涂布平板 活菌 菌落数 30～300 3 小 大
4.（1）脲酶 尿素 氮源 （2）①3～8 ③温度 时间 24 h 菌落 稳定
【诊断·加强】
1.（1）× （2）√ （3）× 提示：原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢物进行生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。 （4）√ （5）×
2.合格 偶然
【典题固法】
【高考典例】
例1 D 解析：农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；产脲酶菌分解尿素，不分解酚红指示剂，该指示剂是用来鉴定尿素分解产物的，D错误。
例2 B 解析：根据题意，甲、乙两种菌分别接种在醇溶青琼脂平板上，二者都能生存，甲周围呈现深蓝色，说明培养基的脂肪被分解为脂肪酸和甘油，说明甲能够分泌脂肪酶，属于解脂菌，A正确；乙周围不变色，说明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，不能利用脂肪，但乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪外，还存在别的碳源，B错误；为了便于比较结果，可以将两种菌接种到同一平板的不同区域，C正确；菌落周围深蓝色的直径越大，说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。
例3 （1）高压蒸汽灭菌 平板划线 纤维素 （2）某些微生物只能在深海冷泉的特定环境中存活 （3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 （4）耐低温
解析： （1）培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在 固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。（3）拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。（4）深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性。
例4 （1）高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 琼脂 选择 （2）104 （3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长 （4）取淤泥加入无菌水中，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数平板上菌落数，并求平均值 （5）水、碳源、氮源和无机盐
解析：（1）乙培养基为固体培养基，因此培养基中加入的是凝固剂琼脂。甲、乙两种培养基都是为了分离出可降解S的细菌，因此都是选择培养基。（2）设稀释倍数为A，1 mL＝1 000 μL，套用计算式：A×＝2×107（个·mL－1），计算出A＝104。（3）在筛选降解S物质的细菌的过程中，如果培养基中的S浓度过高，会导致细菌培养基的渗透压增大，细菌失水而代谢活性降低，对S的降解量反而下降（或者S改变了培养基的pH，导致细菌代谢活性降低）。（4）测定淤泥中能降解S的细菌细胞数的主要步骤是：①淤泥取样，即取少量的淤泥加入无菌水中；②用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上；③微生物培养与观察计数。
【对点演练】
1.C 解析：酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取过程中土样被污染，A正确；只用移液管，分度太低，而只用微量移液器，容量又太小，所以梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作，B正确；振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的利用率，C错误；由分析可知，每克土壤中的菌株数为1.6×106，即10 g土样中的菌株数约为1.6×107个，D正确。
2.A 解析：该培养基为鉴定培养基，不能统计大肠杆菌数目，只能鉴别大肠杆菌的有无，A错误。
3.B 解析：过程①得到的菌落均匀分布，接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分不同，基本培养基中缺乏某种氨基酸，A错误；进行过程②培养时，若先将丝绒布转印至完全培养基上，可能会携带某种氨基酸进入基本培养基，因此必须先将丝绒布转印至基本培养基上，B正确；统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏小，C错误；若该菌株为原核细胞，则不存在核孔复合体，营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，应是控制该酶合成的基因发生突变所致，D错误。
4.（1）细菌 主要用于合成蛋白质、核酸 （2）异养 种群 （3）防止冷凝水滴落在培养基上；避免水分过快蒸发 （4）85 000（8.5×104） 需要 用于判断培养基是否被污染
解析：（4）由图可知，牛奶样液稀释了103倍，则消毒后牛奶中每毫升含细菌数为（87＋83＋85）÷3÷1×103＝8.5×104（个）。统计样本菌落数的该方法叫稀释涂布平板法，统计样本菌落时，需要设置空白对照，目的是用于判断培养基是否被污染。
考点2 发酵工程及其应用
【概念落实】
1.诱变育种 基因工程育种 发酵罐 温度、pH、溶解氧 营养组分 过滤、沉淀 产物的性质
2.发酵产品 霉菌 酿酒酵母 食品添加剂 酶制剂 工程菌 诱变 根瘤菌 微生物农药 纤维废料
【诊断·加强】
（1）√ （2）√ （3）√ （4）× （5）√ （6）×
【典题固法】
【高考典例】
例1 D 解析：提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，渗透压高，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；发酵之前，需要对选育出的菌种进行扩大培养，C正确；某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉，使产量大大降低，因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌，D错误。
例2 B 解析：用赤霉素处理大麦，可诱导α－淀粉酶相关基因的表达，促进α－淀粉酶的合成，进而使大麦种子无需发芽就能产生α－淀粉酶，A正确；焙烤可以杀死大麦种子的胚，但没有进行灭菌，B错误；糖浆经蒸煮可产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌，冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C正确；转基因技术被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期属于转基因技术在微生物领域的应用，D正确。
例3 A 解析：据图可知，该生产过程中有酿酒酵母的参与，酵母菌呼吸作用会产生二氧化碳，故该生产过程中，一定有气体生成，A正确；糖类是主要的能源物质，微生物生长所需的碳源主要来源于果糖生产废水，B错误；分析图示可知，该技术过程中有连续搅拌反应器，该操作可以增加微生物与营养物质的接触面积，此外也可增大溶解氧含量，故据此推测，该生产工艺利用微生物的有氧发酵技术生产蛋白质，C错误；沼气生产利用的是厌氧微生物，在连续搅拌反应器中厌氧微生物会被抑制，因此沼气池废料无需灭菌，D错误。
例4 （1）唯一碳源 稀释涂布平板法（或涂布平板计数法、活菌计数法） 从自然界筛选新菌株；人工诱变；基因工程改造已有菌株 （2）高盐培养条件形成高的渗透压环境抑制杂菌；强碱性环境抑制杂菌；高盐条件有利于菌株H生长，形成优势，杂菌不能生长，菌株H能生长 （3）氧气（或溶解氧） （4）相应的水解酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等）
解析：（1）根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源。（2）已知，菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60 g·L－1，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60 d以上，而盐浓度为60 g·L－1的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。（3）分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气（O2或溶解氧）是限制高密度培养的重要因素。（4）根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
【对点演练】
1.B 解析：果酒发酵的适宜温度为18～30 ℃，因此夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理，A正确；乙醇是酵母菌无氧呼吸的产物，因此发酵过程中不需要通入空气，B错误；无氧呼吸产生了二氧化碳，但是没有消耗氧气，因此发酵罐中的气压不会低于大气压，C正确；葡萄酒发酵的原料是糖类，因此可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵，D正确。
2.（1）基因工程 诱变育种 （2）选择 鉴别 碳源、氮源、水、无机盐 高压蒸汽灭菌法 （3）发酵过程 微生物数量、产物浓度 溶氧量、pH和温度 代谢物 （4）增加溶氧量 使菌种与培养液充分接触，提高原料的利用率 （5）过滤、沉淀 产物的性质
3.D 解析：传统发酵技术和发酵工程都是利用各种微生物的代谢来实现相关产品的生产。
4.B 解析：醋酸菌在缺乏糖源时，能以酒精为原料合成醋酸，A正确；青霉素由青霉菌合成，青霉菌为需氧型生物，需在有氧条件下发酵，另外，青霉素对许多细菌具有较强的杀伤性，不宜用大肠杆菌生产青霉素，B错误；毛霉等产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质分解为氨基酸和小分子的肽，使腐乳味道鲜美、易于消化吸收，C正确；除泡菜、果酒、果醋、腐乳外，甜面酱、酱油、豆豉等也是利用传统发酵技术制作的食品，D正确。
课堂小结与延伸
【构核心概念】
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 以尿素为唯一氮源 培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌 30～300 可能存在两个或多个细菌形成单个菌落 小 接种 发酵
【练教材长句】
（1）较少 当两个或多个细菌连接在一起时，稀释涂布平板法往往统计的只是一个菌落；而直接计数法统计的是显微镜下活菌数与死菌数的总和
（2）主发酵和后发酵 主发酵后的发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间（进行后发酵），才能形成澄清、成熟的啤酒
（3）醋酸菌是一种好氧菌，若发酵罐密封不严，酒精就会在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为醋酸
【拎教材“冷”点】
（1）引燃
（2）纤维素 能够分解纤维素 红色复合物 透明圈
（3）氧气和营养物质 热量
（4）①温度传感器和控制装置 ②溶解氧 ③pH计
第47讲 微生物的选择培养和计数、发酵工程及其应用
课标要求 1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 2.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。 3.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 4.阐明发酵工程利用微生物进行发酵来生产特定的产物。 5.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上的应用。
考点1 微生物的选择培养和计数
概 念 落 实
1.微生物选择培养的原理
实验室中对微生物的筛选，可以人为提供 的条件（包括营养、温度和pH等），同时 其他微生物的生长。可以利用 培养基。
归 纳 总 结
三种选择培养方法的比较
方法 特点 举例
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源时可以分离固氮微生物
利用某种化学物质进行的选择培养 在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
2.微生物的选择培养——稀释涂布平板法的操作步骤
（1）铲取土样，将样品装入纸袋中。
（2）将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（3）一系列稀释操作
（4）涂布平板操作
①取 mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有 的烧杯中（目的是消毒）。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用 将 均匀地涂布在 表面。涂布时可 培养皿，使涂布均匀。
⑤待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入28 ℃左右（培养温度因菌种种类的不同而有差异）的恒温培养箱中培养24～48 h。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的 菌落。
归 纳 总 结
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
接种用具 接种环 涂布器
分离结果
单细胞菌 落的获得 单细胞菌落从后划线的区域挑取 只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落
应用 都会在培养基表面形成单菌落，达到分离纯化微生物的目的；都可用于观察菌落特征
不能用于微生物的计数 可对微生物进行计数
其他共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作
3.微生物的数量测定
计数 方法 法 （间接计数法、活菌计数法） 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数
计数 原则 一般选择菌落数为 的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出平均值 实质是样方法，计数时要注意“计上不计下，计左不计右”
缺点 及结果 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，导致统计的结果往往比实际值偏 不能区分死菌和活菌，故结果会比实际值偏
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成 。利用 作为唯一 的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
（2）操作步骤
①土壤取样：从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤中取样。先铲去表层土，在距地表约 cm的土壤层取样。
②样品的稀释：第一次做实验时，可以将稀释的范围放宽一点。
③微生物的培养与观察
a. 培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。
b. 观察：每隔 统计一次 数目，选取菌落数目 时的记录作为结果。
诊断·加强
1.判断下列说法的正误：
（1）选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 （ ）
（2）对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。 （ ）
（3）在选择培养基上生长的微生物就都是所需的目的菌。 （ ）
（4）筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 （ ）
（5）分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。 （ ）
2.微生物培养中设置对照和重复
对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除 因素对实验结果的影响
实例 空白对照：确定培养基制作是否 同一稀释度涂布至少3个平板
典 题 固 法
（2022·江苏卷）下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
（2021·山东卷）解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是（ ）
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
（2022·广东卷）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146 m深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用 法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用 法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌物各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 。
审 答 指 导
第（2）小题需要审题，“置于各种培养基中培养”排除了因营养物质的缺乏而导致很多微生物不能被分离筛选出来，因此可考虑深海独特环境因素的影响。
第（3）小题考查分解者在生态系统碳循环中的作用，重点强调将有机物氧化分解为CO2等无机物，返回到无机环境，从而加快物质的循环。
（2020·全国Ⅰ卷）某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于 培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个·mL－1，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 （答出1点即可）。
规范长难句——第（3）问属于因果分析，“因”是S超过一定浓度，“果”是细菌对S降解量反而降低，因与果之间需要作出合理的推测，例如S浓度过高会抑制该菌株的生长或抑制该菌株的代谢。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤： 。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。
考向1 分解尿素的细菌的分离和计数
1.某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列叙述不正确的是（ ）
A.在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B.梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C.振荡的目的是增加尿素分解菌的浓度
D.由图示菌落计数结果可知10 g土样中的菌株数约为1.6×107个
考向2 结合实例考查微生物的选择培养与计数
2.培养基可为微生物的生长、繁殖提供必需的营养物质。根据某些微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理设计培养基，可使其具有只允许特定的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。下列关于选择培养基的说法，错误的是（ ）
A.培养基中添加伊红—亚甲蓝，统计饮用水中大肠杆菌的数量
B.以尿素为唯一氮源的培养基，可将土壤中的尿素分解菌筛选出来
C.培养基中添加青霉素从而将真菌从混有细菌的培养基上选择出来
D.用以纤维素为唯一碳源的培养基分离出分解纤维素的微生物
3.（2022·广州二模）营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法合理的是（ ）
A.过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同
B.进行过程②培养时，必须先将丝绒布转印至基本培养基上，顺序不能颠倒
C.统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大
D.营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关
4.（2022·广东六校联考）为了检测牛奶中是否含有某种微生物，配制的培养基的配方如下（注：伊红—亚甲蓝是由两种染色剂组成的细胞染料），请分析并回答下列问题：
蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4
10 g 5 g 5 g 2 g
伊红 亚甲蓝 蒸馏水
0.4 g 0.065 g 1 000 mL
将培养基pH调至7.2
（1）根据配方，该培养基可用来培养 （选填“细菌”“霉菌”或“细菌与霉菌”），其所含氮源的功能是 。
（2）该微生物在同化作用上的代谢类型是 型，其在培养基上产生的单个菌落在生态学中被称为 。
（3）接种好的培养皿在恒温箱中培养时要倒置，目的是 。
（4）有同学为统计消毒后的牛奶中该微生物的含量，取5 mL牛奶样液进行了下图操作，每个平板中的统计结果为87、83、85，则经过消毒后的牛奶中该微生物的含量大约是 个·mL－1。用该方法统计样本菌落数时 （选填“需要”或“不需要”）设置空白对照组，目的是 。
考点2 发酵工程及其应用
概 念 落 实
1.发酵工程的基本环节
基本环节 主要方法及目的
选育菌种 选育方法：从自然界中筛选； ；
扩大培养 快速增加菌种数量
配制培养基 结合菌种的代谢特点配制培养基
灭菌 避免因杂菌污染而影响产品品质和产量
接种 将扩大培养后的菌种投放到 中
发酵罐 内发酵 ①监测并控制 等发酵条件，使发酵全过程处于最佳状态； ②随时检测培养液中微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程，还要及时添加必需的 等
分离、提 纯产物 ①若发酵产品是微生物细胞本身，采用 等方法将菌体分离、干燥； ②若发酵产品是代谢物，可根据 采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品
归 纳 总 结
与传统的容器相比，发酵罐最明显的优势
发酵罐能实现大规模连续生产，最大限度地利用原料和设备，获得高产量和高效率。
（1）进行严格灭菌能使空气按需要流通，从而提供良好的发酵环境。
（2）实施搅拌、振荡以促进微生物生长。
（3）对温度、压力、空气流量实行自动控制。
（4）通过各种生物传感器测定发酵罐内菌体浓度、营养成分、产品浓度等，并用电脑随时调节发酵进程。
2.发酵工程的应用
具体应用 成果
在食品工业上的应用 生产传统的 利用 发酵生产酱油、利用 生产各种酒类
生产各种各样的 利用黑曲霉发酵生产柠檬酸、利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸
生产 利用微生物发酵生产淀粉酶、果胶酶、脂肪酶和氨基肽酶等
在医药工业上的应用 通过 生产药物 利用工程菌发酵生产生长激素释放抑制激素
通过改造菌种生产药物 通过 的青霉菌发酵生产青霉素
在农牧业上的应用 生产微生物肥料 利用 和固氮菌生产的根瘤菌肥、固氮菌肥
生产 利用苏云金杆菌防治多种农林虫害、利用白僵菌防治玉米螟和松毛虫
生产微生物饲料 利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液通过发酵获得大量微生物菌体用于生产饲料
在其他方面的应用 解决资源短缺和环境污染问题 利用 发酵生产酒精、乙烯
对极端微生物的利用 利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂
诊断·加强
判断下列说法的正误：
（1）在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种。 （ ）
（2）分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤、沉淀等方法。 （ ）
（3）在连续培养过程中补充的同种培养液和空气必须先灭菌。 （ ）
（4）乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产。 （ ）
（5）发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关。 （ ）
（6）单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的。 （ ）
典 题 固 法
（2022·山东卷）青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是（ ）
A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B.可用深层通气液体发酵技术提高产量
C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需要严格灭菌
（2022·山东卷）啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法不正确的是（ ）
A.用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无需发芽就能产生α－淀粉酶
B.焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C.糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D.通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
（2022·湖北卷）废水、废料经加工可变废为宝。某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A.该生产过程中，一定有气体生成
B.微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料
C.该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质
D.沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理
（2021·广东卷）中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有 等（答出2种方法即可）。
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g·L－1，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是 （答出2点即可）。
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌 。
考向1 发酵工程的基本环节
1.（2018·江苏卷）某高校采用如图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是（ ）
A.夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理
B.乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大
C.正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压
D.可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
2.下图所示为发酵工程生产产品的流程图，据图回答问题：
（1）若能生产人生长激素的工程菌是通过①培育的，①应该是 ；若高产青霉素菌种是通过②培育的，②应该是 。
（2）根据培养基的用途，可以将它们分为 培养基和 培养基。各种培养基的具体配方不同，但一般都含有 等营养成分。培养基在使用之前要用 进行灭菌。
（3）整个过程的中心环节是 ，在该时期要随时取样检测培养基中的 等。同时，要严格控制 等发酵条件，因为环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物 的形成。
（4）在发酵过程中要不断搅拌的目的是① ；② 。
（5）发酵产品分离、提纯时要根据产品的类型不同选择合适的方法。如果发酵产品是菌体本身，常常采用
等方法分离、提纯；如果发酵产品是微生物的代谢物，还要根据 采取适当的方法分离、提纯。
考向2 发酵工程的应用
3.发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。下列关于发酵工程的认识，错误的是（ ）
A.发酵工程具有条件温和、产物单一、污染小的特点
B.发酵工程的产品包括微生物的代谢产物和菌体本身
C.通常所指的发酵条件包括温度、溶解氧和pH等
D.发酵工程与传统发酵技术最大的区别是前者可以用微生物进行发酵
4.（2022·东莞调研）从传统发酵技术到发酵工程，发酵技术的发展为人们提供了丰富多样的食品和药物等。下列叙述错误的是（ ）
A.醋酸菌能以酵母菌的某种代谢产物为原料合成醋酸
B.无氧条件下利用大肠杆菌发酵大规模生产青霉素
C.腐乳味道鲜美是因为毛霉等产生的蛋白酶将蛋白质分解为氨基酸和小分子的肽
D.甜面酱、酱油、豆豉等都是利用传统发酵技术制作的食品
构核心概念
练教材长句
链接选择性必修3教材P18正文。
（1）与直接计数法相比， 稀释涂布平板法计数测得的细菌数 。这是因为 。
链接选择性必修3教材P24“思考·讨论”。
（2）啤酒工业生产中，发酵分为 两个阶段。进行后发酵的原因是 。
（3）啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期如果密封不严，会使啤酒变酸。这是因为 。
拎教材“冷”点
链接选择性必修3教材P17“图1－7”。
（1）不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免 其中的酒精。
链接选择性必修3教材P20“拓展应用”。
（2）分解纤维素的微生物的分离与鉴定实验中，选择培养纤维素分解菌的原理是利用 为唯一碳源的培养基培养土壤微生物，只有 的微生物能够生存并繁殖。在纤维素培养基中添加刚果红，刚果红与纤维素结合形成 ，当纤维素分解菌生长时，会形成具有 的菌落。
链接选择性必修3教材P23“发酵罐示意图”。
（3）搅拌叶轮在发酵过程中的作用：①增加微生物在发酵罐中与 的接触面；②有利于发酵产生的 散发；③使发酵液中的固性物质保持悬浮状态。
（4）发酵罐中发酵条件的控制
①温度的控制：发酵过程中可以通过 进行检测和由冷却水进、出口水流来调整。
② 的控制：通过通气量和搅拌速度加以调节。
③pH的控制：可以通过 检测。
第47讲 微生物的选择培养和计数、发酵工程及其应用
考点1 微生物的选择培养和计数
【概念落实】
1.有利于目的菌生长 抑制或阻止 选择
2.（4）①0.1 ②酒精 ④涂布器 菌液 培养基 转动 ⑤倒置 单
3.稀释涂布平板 活菌 菌落数 30～300 3 小 大
4.（1）脲酶 尿素 氮源 （2）①3～8 ③温度 时间 24 h 菌落 稳定
【诊断·加强】
1.（1）× （2）√ （3）× 提示：原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢物进行生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。 （4）√ （5）×
2.合格 偶然
【典题固法】
【高考典例】
例1 D 解析：农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；产脲酶菌分解尿素，不分解酚红指示剂，该指示剂是用来鉴定尿素分解产物的，D错误。
例2 B 解析：根据题意，甲、乙两种菌分别接种在醇溶青琼脂平板上，二者都能生存，甲周围呈现深蓝色，说明培养基的脂肪被分解为脂肪酸和甘油，说明甲能够分泌脂肪酶，属于解脂菌，A正确；乙周围不变色，说明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，不能利用脂肪，但乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪外，还存在别的碳源，B错误；为了便于比较结果，可以将两种菌接种到同一平板的不同区域，C正确；菌落周围深蓝色的直径越大，说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。
例3 （1）高压蒸汽灭菌 平板划线 纤维素 （2）某些微生物只能在深海冷泉的特定环境中存活 （3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 （4）耐低温
解析： （1）培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在 固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。（3）拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。（4）深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性。
例4 （1）高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 琼脂 选择 （2）104 （3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长 （4）取淤泥加入无菌水中，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数平板上菌落数，并求平均值 （5）水、碳源、氮源和无机盐
解析：（1）乙培养基为固体培养基，因此培养基中加入的是凝固剂琼脂。甲、乙两种培养基都是为了分离出可降解S的细菌，因此都是选择培养基。（2）设稀释倍数为A，1 mL＝1 000 μL，套用计算式：A×＝2×107（个·mL－1），计算出A＝104。（3）在筛选降解S物质的细菌的过程中，如果培养基中的S浓度过高，会导致细菌培养基的渗透压增大，细菌失水而代谢活性降低，对S的降解量反而下降（或者S改变了培养基的pH，导致细菌代谢活性降低）。（4）测定淤泥中能降解S的细菌细胞数的主要步骤是：①淤泥取样，即取少量的淤泥加入无菌水中；②用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上；③微生物培养与观察计数。
【对点演练】
1.C 解析：酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取过程中土样被污染，A正确；只用移液管，分度太低，而只用微量移液器，容量又太小，所以梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作，B正确；振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的利用率，C错误；由分析可知，每克土壤中的菌株数为1.6×106，即10 g土样中的菌株数约为1.6×107个，D正确。
2.A 解析：该培养基为鉴定培养基，不能统计大肠杆菌数目，只能鉴别大肠杆菌的有无，A错误。
3.B 解析：过程①得到的菌落均匀分布，接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分不同，基本培养基中缺乏某种氨基酸，A错误；进行过程②培养时，若先将丝绒布转印至完全培养基上，可能会携带某种氨基酸进入基本培养基，因此必须先将丝绒布转印至基本培养基上，B正确；统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏小，C错误；若该菌株为原核细胞，则不存在核孔复合体，营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，应是控制该酶合成的基因发生突变所致，D错误。
4.（1）细菌 主要用于合成蛋白质、核酸 （2）异养 种群 （3）防止冷凝水滴落在培养基上；避免水分过快蒸发 （4）85 000（8.5×104） 需要 用于判断培养基是否被污染
解析：（4）由图可知，牛奶样液稀释了103倍，则消毒后牛奶中每毫升含细菌数为（87＋83＋85）÷3÷1×103＝8.5×104（个）。统计样本菌落数的该方法叫稀释涂布平板法，统计样本菌落时，需要设置空白对照，目的是用于判断培养基是否被污染。
考点2 发酵工程及其应用
【概念落实】
1.诱变育种 基因工程育种 发酵罐 温度、pH、溶解氧 营养组分 过滤、沉淀 产物的性质
2.发酵产品 霉菌 酿酒酵母 食品添加剂 酶制剂 工程菌 诱变 根瘤菌 微生物农药 纤维废料
【诊断·加强】
（1）√ （2）√ （3）√ （4）× （5）√ （6）×
【典题固法】
【高考典例】
例1 D 解析：提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，渗透压高，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；发酵之前，需要对选育出的菌种进行扩大培养，C正确；某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉，使产量大大降低，因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌，D错误。
例2 B 解析：用赤霉素处理大麦，可诱导α－淀粉酶相关基因的表达，促进α－淀粉酶的合成，进而使大麦种子无需发芽就能产生α－淀粉酶，A正确；焙烤可以杀死大麦种子的胚，但没有进行灭菌，B错误；糖浆经蒸煮可产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌，冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C正确；转基因技术被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期属于转基因技术在微生物领域的应用，D正确。
例3 A 解析：据图可知，该生产过程中有酿酒酵母的参与，酵母菌呼吸作用会产生二氧化碳，故该生产过程中，一定有气体生成，A正确；糖类是主要的能源物质，微生物生长所需的碳源主要来源于果糖生产废水，B错误；分析图示可知，该技术过程中有连续搅拌反应器，该操作可以增加微生物与营养物质的接触面积，此外也可增大溶解氧含量，故据此推测，该生产工艺利用微生物的有氧发酵技术生产蛋白质，C错误；沼气生产利用的是厌氧微生物，在连续搅拌反应器中厌氧微生物会被抑制，因此沼气池废料无需灭菌，D错误。
例4 （1）唯一碳源 稀释涂布平板法（或涂布平板计数法、活菌计数法） 从自然界筛选新菌株；人工诱变；基因工程改造已有菌株 （2）高盐培养条件形成高的渗透压环境抑制杂菌；强碱性环境抑制杂菌；高盐条件有利于菌株H生长，形成优势，杂菌不能生长，菌株H能生长 （3）氧气（或溶解氧） （4）相应的水解酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等）
解析：（1）根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源。（2）已知，菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60 g·L－1，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60 d以上，而盐浓度为60 g·L－1的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。（3）分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气（O2或溶解氧）是限制高密度培养的重要因素。（4）根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
【对点演练】
1.B 解析：果酒发酵的适宜温度为18～30 ℃，因此夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理，A正确；乙醇是酵母菌无氧呼吸的产物，因此发酵过程中不需要通入空气，B错误；无氧呼吸产生了二氧化碳，但是没有消耗氧气，因此发酵罐中的气压不会低于大气压，C正确；葡萄酒发酵的原料是糖类，因此可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵，D正确。
2.（1）基因工程 诱变育种 （2）选择 鉴别 碳源、氮源、水、无机盐 高压蒸汽灭菌法 （3）发酵过程 微生物数量、产物浓度 溶氧量、pH和温度 代谢物 （4）增加溶氧量 使菌种与培养液充分接触，提高原料的利用率 （5）过滤、沉淀 产物的性质
3.D 解析：传统发酵技术和发酵工程都是利用各种微生物的代谢来实现相关产品的生产。
4.B 解析：醋酸菌在缺乏糖源时，能以酒精为原料合成醋酸，A正确；青霉素由青霉菌合成，青霉菌为需氧型生物，需在有氧条件下发酵，另外，青霉素对许多细菌具有较强的杀伤性，不宜用大肠杆菌生产青霉素，B错误；毛霉等产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质分解为氨基酸和小分子的肽，使腐乳味道鲜美、易于消化吸收，C正确；除泡菜、果酒、果醋、腐乳外，甜面酱、酱油、豆豉等也是利用传统发酵技术制作的食品，D正确。
课堂小结与延伸
【构核心概念】
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 以尿素为唯一氮源 培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌 30～300 可能存在两个或多个细菌形成单个菌落 小 接种 发酵
【练教材长句】
（1）较少 当两个或多个细菌连接在一起时，稀释涂布平板法往往统计的只是一个菌落；而直接计数法统计的是显微镜下活菌数与死菌数的总和
（2）主发酵和后发酵 主发酵后的发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间（进行后发酵），才能形成澄清、成熟的啤酒
（3）醋酸菌是一种好氧菌，若发酵罐密封不严，酒精就会在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为醋酸
【拎教材“冷”点】
（1）引燃
（2）纤维素 能够分解纤维素 红色复合物 透明圈
（3）氧气和营养物质 热量
（4）①温度传感器和控制装置 ②溶解氧 ③pH计
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