新人教生物一轮复习学案：第50讲 基因工程的工具和操作（含答案解析）
文档属性
| 名称 | 新人教生物一轮复习学案：第50讲 基因工程的工具和操作（含答案解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 2.1MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-11-27 23:51:59 | ||
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文档简介
新人教生物一轮复习学案
第50讲 基因工程的工具和操作
课标要求 1.阐明重组DNA技术的实现需要利用三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序。
考点1 基因工程的原理和基本工具
概 念 落 实
1.基因工程概述
（1）又叫作 技术。是在分子水平上，通过转基因等技术创造出新的 和 。
（2）原理： 。
（3）优点：克服 的障碍，定向改造生物的 。
整 体 提 升
基因工程的理论基础
2.重组DNA技术的基本工具
（1）限制性内切核酸酶（限制酶）
说明：
①将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生 个黏性末端或平末端。
②限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的是 。
（2）DNA连接酶
归 纳 总 结
与DNA有关的几种酶的比较
（3）载体
特 别 提 醒
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
诊断·加强
判断下列说法的正误：
（1）DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来。 （ ）
（2）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 （ ）
（3）限制酶也可以识别和切割RNA。 （ ）
（4）质粒是细菌拟核之外的小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。 （ ）
（5）天然质粒或噬菌体等都可以直接用作运载基因进入受体细胞的载体。 （ ）
典 题 固 法
（2021·湖北卷，7）限制酶EcoR Ⅰ识别并切割双链DNA，用EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到的DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A.6
B.250
C.4 000
D.24 000
（2021·全国乙卷）用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
考向1 基因工程中的工具酶
1.下列有关DNA连接酶的说法，正确的是（ ）
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反，DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA连接酶可以连接有平末端的DNA片段，也能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段
考向2 基因工程的载体
2.构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5'－P变成5'－OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5'－OH与3'－OH不能连接而形成切口（nick）。下列说法错误的是（ ）
A.经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化
B.外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理
C.T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端
D.重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA
3.（2022·华师一附中）图1为生产转基因抗虫棉时使用的质粒，图2为生产转基因抗虫棉时所用目的基因侧翼涉及的限制酶的酶切位点。
图1
图2 目的基因侧翼涉及的限制酶酶切位点
（1）为了高效地构建基因表达载体，最好选用 （填限制酶名称）同时酶切质粒和目的基因。
（2）为了筛选出基因表达载体，需要将DNA连接酶处理后的溶液与大肠杆菌混合在一起进行培养，为了促使大肠杆菌吸收外源DNA，需要用 处理大肠杆菌，使其处于感受态。随后再将大肠杆菌涂布在含
的培养基中培养，一般情况下这样培养出来的大肠杆菌有两种类型：一种是结合了目的基因的质粒，一种是未结合目的基因的质粒。可以加入 分别去切割两种质粒，其中结合了目的基因的质粒在酶切后能产生目的基因。
（3）图示质粒在设计时插入了T－DNA序列，并且将启动子、多克隆位点和终止子序列插入T－DNA中（注：插入不会破坏T－DNA的作用），T－DNA的作用是 。
（4）有人担心基因工程中使用的抗性基因可转移至近缘生物中，本例中的质粒能否有助于降低氨苄青霉素抗性基因转移到近缘生物的风险？为什么？ 。
考点2 基因工程的基本操作程序
概 念 落 实
1.基因工程主要的四个步骤
（1）目的基因的筛选与获取
（2）基因表达载体的构建——基因工程的核心
①基因表达载体的组成
②基因表达载体的构建过程
用一定的 切割载体，使它出现一个切口；然后用 限制酶或能产生 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用 将 拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
特 别 提 醒
（1）基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。
（2）目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。
（3）启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
方 法 规 律
构建基因表达载体时限制酶的选择
甲
（1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。这样才能保证目的基因的完整性。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则这样的两个末端也可连接。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中的限制酶 SmaⅠ 会破坏标记基因。
乙
（3）将目的基因导入受体细胞
受体细胞 导入方法 内容
植物细胞 法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等
农杆菌转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的 可携带目的基因整合到受体细胞的 DNA上
动物细胞 技术 常用受体细胞：
原核细胞 Ca2＋处理法 用 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
（4）目的基因的检测与鉴定
检测水平 具体方法
分子水平 的检测 ①通过 等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA； ②从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 ，检测目的基因是否翻译成蛋白质
水平的 鉴定 例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度
方 法 规 律
如何筛选出含有目的基因的受体细胞
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4， 则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2.PCR技术
（1）PCR概述
过程 说明 图解
①条件：温度上升到 ℃以上； ②实质：双链DNA解链为单链
①条件：温度下降到 ℃左右； ②实质：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
①条件： ℃左右； ②实质：Taq DNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由 端延伸
注：PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。（操作详见实验17）
归 纳 总 结
PCR技术和DNA复制的比较
（2）PCR反应体系中的条件分析
①PCR反应需要在一定的 中进行，加入复制需要的各组分，同时控制温度。
②因为反应循环中需要高温变性，使用的DNA聚合酶为 。
③引物是一段20～30个碱基的 ，通过碱基互补配对与模板片段结合，游离的脱氧核苷酸加到引物的 端。
④PCR反应不需要解旋酶，DNA在 下会打开双链。
⑤在PCR反应过程中加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的 ，又可为DNA的合成提供 。（dNTP加入到延伸链的3'端，与上一个核苷酸形成二酯键，同时释放一个焦磷酸PPi）
（3）PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8
含引物A（或B）的DNA分子数 1 3 7
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 －2
诊断·加强
1.判断下列说法的正误：
（1）用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。 （ ）
（2）用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 （ ）
（3）在PCR反应体系中未加入ATP，因为PCR反应过程不需要能量。 （ ）
（4）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 （ ）
（5）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。 （ ）
2.构建基因表达载体需要两种工具酶： 。
3.将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到 技术。
4.PCR不可以扩增mRNA的原因： ，必须把mRNA逆转录成 之后再做PCR。
典 题 固 法
（2022·海南卷）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5 d的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题：
（1）CEFs是从孵化9 d的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用
处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）体外获取OSNL的方法有 （答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和 等。启动子是
识别和结合的部位，有了它才能驱动 。
（3）iPS 细胞和 iPGCs 细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 。
（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是 。
（5）该实验流程中用到的生物技术有 （答出2点即可）。
（2022·河北卷节选）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
（2） 是实施基因工程的核心。
（3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上。
（4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
（写出两点即可）。
（5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步检测抗虫的 以鉴定其抗性程度。
（6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
（写出2点即可）。
（2022·全国乙卷）新冠病毒感染出现后，病毒核酸检测和疫苗接种发挥了重要作用。回答下列问题：
（1）新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT－PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
（2021·全国甲卷）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测患者是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从患者组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集患者组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是 ，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
考向1 PCR技术
1.（2022·广东测试）图1是我国自主设计的“本地＋移动”一站式新冠病毒核酸检测平台示意图，单平台混样日检测量可达13万人次。图2为RT－PCR（逆转录荧光PCR技术）的原理：PCR过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和淬灭基团（抑制荧光发出），当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。请回答下列问题：
图1 图2
（1）PCR技术的目的是 。RT－PCR过程中，需先将RNA逆转录成cDNA，故装置中需添加的酶有 。
（2）对新冠病毒进行检测时，探针的设计依据是 。探针与模板结合发生在PCR循环中的 （选填“变性”“复性”或“延伸”）阶段。
（3）若监测系统检测到荧光信号，则可判定该检测样本为阳性，其原理是 。
（4）为了在没有核酸检测的条件下及早发现新冠病毒，我国于2022年3月11日推出新冠病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是 。
考向2 基因表达载体的构建
2.（2022·深圳模拟）将编码四种不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR与叶绿体转运肽基因连接，搭载到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段中构建多基因表达载体，最终在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法错误的是（ ）
A.可用分子杂交技术检测四个基因是否成功导入水稻
B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板
C.应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的水稻细胞
D.基因表达载体中的四个基因在水稻细胞核内进行转录
3.（2022·北京一模）下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是（ ）
pBR322质粒 人生长激素基因
注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。
A.应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B.所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C.用含氨苄青霉素的培养基筛选出含重组质粒的受体菌
D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
考向3 基因工程的基本操作程序
4.（2022·佛山一模）戊型肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV）引起的一种急性传染性肝炎，发病率和死亡率都很高。世界首支戊型肝炎疫苗是我国科研工作者通过基因工程技术研制成功的。如图为一种戊肝疫苗研制的技术流程图，其中ORF2蛋白是戊肝病毒的表面抗原，能引起人体特异性免疫反应。据图分析并回答下列问题：
注：引物P1（5'—CTAGCTAGCGCCACCATGCCTACCCCCTCTCCTGC—3'）含NheⅠ酶切位点；
引物F1（5'—CGCGATCCTTACTAAGGGTAATCAACTGTCCTCC—3'）含BamH Ⅰ酶切位点。
（1）过程①需要 酶的参与。过程②除引物和模板外，还需往缓冲液中加入 。
（2）实验中使用的pBV220载体上应该具有 。过程③需要的关键酶有 。
（3）过程④常用的方法是 。
过程⑤需要依据 原理对产物进行鉴定。
（4）与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗的主要优点是 。
构核心概念
练教材长句
链接选择性必修3教材 P72“资料卡”。
（1）限制酶主要来源于原核生物，但为什么不会切割自身DNA分子？
（2）
链接选择性必修3教材 P72正文。
（2）用作基因工程载体的质粒需要具有能 等特点。
链接选择性必修3教材 P81“资料卡”。
（3）农杆菌能作为基因工程的载体，是因为 ，当它侵染植物细胞后，能 ，并且将其 。
拎教材“冷”点
链接选择性必修3教材 P72旁栏思考题。
（1）DNA连接酶和DNA聚合酶的不同点体现在：DNA连接酶连接的是 ，而DNA聚合酶是把 连接到已有的DNA片段上。
链接选择性必修3教材P77“旁栏思考”
（2）PCR引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。
（3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活，因此，一般要添加到PCR反应缓冲溶液中。
第50讲 基因工程的工具和操作
考点1 基因工程的原理和基本工具
【概念落实】
1.（1）重组DNA 生物类型 生物产品 （2）基因重组 （3）远缘杂交不亲和 遗传性状
2.（1）原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 ①4 ②平末端 （2）磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端和平末端 （3）环状双链DNA分子 噬菌体 有一个至多个 自我复制 受体DNA 标记
【诊断·加强】
（1）× （2）× （3）× （4）√ （5）× 提示：一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们常根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
【典题固法】
【高考典例】
例1 C 解析：据题意可知，限制酶EcoR Ⅰ的识别序列为，则理论上，该序列出现的概率为1/（4×4×4×4×4×4）＝1/4 096，即4 096个碱基对序列中会出现一个限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，故用EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对个数）约为4 000，C符合题意。
例2 （1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ （2）磷酸二酯键 （3）自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 （4）RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析：（1）由题图可以看出，EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
【对点演练】
1.A 解析：DNA连接酶不能连接单链DNA片段，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，B错误；E.coli DNA连接酶只能连接有黏性末端的DNA片段，C错误；T4 DNA连接酶既可以连接有黏性末端的DNA片段，也可以连接有平末端的DNA片段，D错误。
2.B 解析：将经过碱性磷酸单酯酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5'－OH与3'－OH不能连接而形成切口（nick），因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA进行半保留复制，1个重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。
3.（1）Hind Ⅲ和BamHⅠ （2）CaCl2（或Ca2＋） 氨苄青霉素 Hind Ⅲ和BamHⅠ （3）将插入T－DNA中的DNA序列转移并整合到受体细胞染色体DNA上 （4）能，只有T－DNA之间的DNA序列可以转移至染色体DNA上，本例中氨苄青霉素抗性基因不能转移到染色体DNA上，个体发育过程中会随着细胞分裂而逐渐丢失，因而不会转移至近缘生物中
解析：（1）高效构建基因表达载体宜采用双酶切，即选用Hind Ⅲ和BamHⅠ同时切割质粒和目的基因。（2）筛选时需要用到抗性基因，在本质粒中抗性基因是氨苄青霉素抗性基因，因此在重组体筛选时需要用到含氨苄青霉素的培养基。使用DNA连接酶连接后的重组质粒中，原来切割质粒和目的基因的限制酶酶切位点在重组质粒中再次出现，可以使用同样的限制酶（HindⅢ和BamHⅠ）将重组质粒再次切开。（4）因为T－DNA中插入启动子、多克隆位点和终止子之后并不影响T－DNA的作用，所以T－DNA会把T－DNA中插入的DNA片段转移到染色体DNA上，这样氨苄青霉素抗性基因将无法转移到染色体DNA上而保留在细胞质中，细胞质中的DNA无法稳定的保存和复制，在个体发育过程中随细胞分裂次数的增加而丢失，从而降低了抗性基因转移的风险。
考点2 基因工程的基本操作程序
【概念落实】
1.（1）结构和功能清晰 序列数据库 目的基因 PCR 基因文库 （2）①上游 RNA聚合酶 下游 目的基因 ②限制酶 同种 相同末端 DNA连接酶 目的基因片段 （3）花粉管通道 T－DNA 染色体 显微注射 受精卵 Ca2＋ （4）PCR 抗原—抗体杂交 个体生物学
2.聚合酶链式反应 DNA复制 脱氧核苷酸 引物 2n 变性 90 复性 50 延伸 72 5'端向3' （2）①缓冲溶液 ②耐高温的DNA聚合酶 ③单链核酸 3' ④高温 ⑤原料 能量 （3）2n 2n－1 2n－2
【诊断·加强】
1.（1）√ （2）√ （3）× （4）× （5）×
2.限制酶和DNA连接酶
3.植物组织培养
4.PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA进行PCR 单链cDNA
【典题固法】
【高考典例】
例1 （1）胰蛋白酶或胶原蛋白酶 血清 （2）利用PCR获取和扩增、通过构建基因文库来获取 终止子 RNA聚合酶 基因转录出mRNA （3）基因的选择性表达 （4）诱导iPS细胞的技术是指诱导已分化的细胞重编程为诱导多能干细胞，而体细胞核移植技术是指将一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成个体的技术 （5）基因工程、动物细胞培养
解析：（2）体外获取目的基因的方法有多种，如基因文库法、 PCR技术、人工合成法。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等结构，启动子是 RNA聚合酶识别和结合的部位，有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。（3）iPGCs细胞是由iPS细胞增殖、分化而来的，两者在形态、结构和功能方面不同的根本原因是基因的选择性表达。（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技 术存在明显的区别，主要表现在诱导iPS细胞的技术是 将已分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞 （iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs） 的技术；而体细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。（5）分析题意可知，该实验流程中用到的生物技术有基因工程、动物细胞培养等技术。
例2 （1）调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物 （2）基因表达载体的构建（或表达载体的构建） （3）T－DNA （4）基因—DNA分子杂交技术、mRNA—分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术 （5）效果 （6）定向改变 害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂
解析：农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。
例3 （1）逆转录酶（反转录酶） （2）特异性核苷酸序列 退火（复性） （3）曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 （4）获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
解析：（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。（2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90～95 ℃）、复性（55～60 ℃）、延伸（70～75 ℃），故其中温度最低的一步是复性。（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为隐性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白。
例4 （1）④②③① （2）耐高温的DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 （3）病原菌DNA （4）在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
【对点演练】
1.（1）短时间内大量扩增目的基因 逆转录酶和Taq酶 （2）新冠病毒的核苷酸序列 复性 （3）检测样本中存在新冠病毒RNA，其逆转录产物可与探针特异性结合，PCR过程中探针被水解而发出荧光 （4）抗原与抗体特异性结合
解析：（1）PCR技术的目的是大量扩增目的基因片段，用于基因工程或检测。以RNA为模板逆转录成cDNA，是逆转录过程，需要用到逆转录酶；PCR过程中需要用到Taq酶。（2）探针是可以与模板结合的一小段DNA序列，故设计的依据是一段已知目的基因的核苷酸序列，即新冠病毒的核苷酸序列。变性过程是DNA双链打开的过程，复性时，引物与探针结合到模板DNA上。（3）根据题意，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。因此，样本中有新冠病毒核酸时，能进行快速复制，导致其荧光信号加强。
2.B 解析：若基因成功导入，则加入以基因的某一个片段制成的探针，会形成DNA杂交带，该方法称为分子杂交技术，A正确；DNA的两条链反向平行，假设图中DNA分子上面一条链为5'→3'方向，RNA聚合酶启动转录时只能与模板链的3'端结合，结合图示启动子的方向可知，EcCAT的模板链为下链，OsGLO1的模板链为上链，EcGCL和TSR的模板链为下链，故4个基因转录时不是都以DNA的同一条单链为模板，B错误；结合图示可知，潮霉素抗性基因在T－DNA中，会整合到植物的染色体上，因此用含潮霉素的培养基可以筛选转化成功的水稻细胞，C正确；搭载到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段中的4个基因会随着T－DNA的转移而整合到植物的染色体上，因此基因表达载体中的四个基因在水稻细胞核内进行转录，D正确。
3.C 解析：为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据图可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
4.（1）逆转录（反转录） Taq酶、dNTP （2）Nhe Ⅰ 和 BamH Ⅰ 酶切位点、标记基因 限制酶、DNA 连接酶 （3）Ca2＋转化法 抗原、抗体特异性结合 （4）仅需注射病毒的部分蛋白进入人体，更安全
解析：（1）①表示逆转录，需要逆转录酶的参与；②表示PCR，需要耐高温的DNA聚合酶的催化，还需要原料dNTP。（2）根据引物上含有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点可知，pBV220载体上应该含有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，另外还需要有标记基因，便于筛选和鉴定目的基因。③表示构建基因表达载体，需要限制酶和DNA连接酶的参与。（3）④表示将目的基因导入受体细胞，常用钙离子处理法。⑤表示目的基因的检测和鉴定，常用抗原、抗体杂交法检测基因表达产物，原理是抗原、抗体的特异性结合。（4）与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗只需要注射病毒的部分蛋白进入人体即可，相对来说更安全。
课堂小结与延伸
【构核心概念】
限制性内切核酸酶 DNA连接酶 质粒、动植物病毒、噬菌体 PCR技术 基因表达载体 花粉管通道法、农杆菌转化法 显微注射法 感受态法 检测与鉴定
【练教材长句】
（1）提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点进行切割。
（2）自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害
（3）农杆菌细胞内含有Ti质粒 将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞 整合到该细胞的染色体DNA上
【拎教材“冷”点】
（1）两个DNA片段 单个的脱氧核苷酸
（2）RNA单链 引物 （3）M
第50讲 基因工程的工具和操作
课标要求 1.阐明重组DNA技术的实现需要利用三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序。
考点1 基因工程的原理和基本工具
概 念 落 实
1.基因工程概述
（1）又叫作 技术。是在分子水平上，通过转基因等技术创造出新的 和 。
（2）原理： 。
（3）优点：克服 的障碍，定向改造生物的 。
整 体 提 升
基因工程的理论基础
2.重组DNA技术的基本工具
（1）限制性内切核酸酶（限制酶）
说明：
①将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生 个黏性末端或平末端。
②限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的是 。
（2）DNA连接酶
归 纳 总 结
与DNA有关的几种酶的比较
（3）载体
特 别 提 醒
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
诊断·加强
判断下列说法的正误：
（1）DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来。 （ ）
（2）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 （ ）
（3）限制酶也可以识别和切割RNA。 （ ）
（4）质粒是细菌拟核之外的小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。 （ ）
（5）天然质粒或噬菌体等都可以直接用作运载基因进入受体细胞的载体。 （ ）
典 题 固 法
（2021·湖北卷，7）限制酶EcoR Ⅰ识别并切割双链DNA，用EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到的DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A.6
B.250
C.4 000
D.24 000
（2021·全国乙卷）用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
考向1 基因工程中的工具酶
1.下列有关DNA连接酶的说法，正确的是（ ）
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反，DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA连接酶可以连接有平末端的DNA片段，也能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段
考向2 基因工程的载体
2.构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5'－P变成5'－OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5'－OH与3'－OH不能连接而形成切口（nick）。下列说法错误的是（ ）
A.经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化
B.外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理
C.T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端
D.重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA
3.（2022·华师一附中）图1为生产转基因抗虫棉时使用的质粒，图2为生产转基因抗虫棉时所用目的基因侧翼涉及的限制酶的酶切位点。
图1
图2 目的基因侧翼涉及的限制酶酶切位点
（1）为了高效地构建基因表达载体，最好选用 （填限制酶名称）同时酶切质粒和目的基因。
（2）为了筛选出基因表达载体，需要将DNA连接酶处理后的溶液与大肠杆菌混合在一起进行培养，为了促使大肠杆菌吸收外源DNA，需要用 处理大肠杆菌，使其处于感受态。随后再将大肠杆菌涂布在含
的培养基中培养，一般情况下这样培养出来的大肠杆菌有两种类型：一种是结合了目的基因的质粒，一种是未结合目的基因的质粒。可以加入 分别去切割两种质粒，其中结合了目的基因的质粒在酶切后能产生目的基因。
（3）图示质粒在设计时插入了T－DNA序列，并且将启动子、多克隆位点和终止子序列插入T－DNA中（注：插入不会破坏T－DNA的作用），T－DNA的作用是 。
（4）有人担心基因工程中使用的抗性基因可转移至近缘生物中，本例中的质粒能否有助于降低氨苄青霉素抗性基因转移到近缘生物的风险？为什么？ 。
考点2 基因工程的基本操作程序
概 念 落 实
1.基因工程主要的四个步骤
（1）目的基因的筛选与获取
（2）基因表达载体的构建——基因工程的核心
①基因表达载体的组成
②基因表达载体的构建过程
用一定的 切割载体，使它出现一个切口；然后用 限制酶或能产生 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用 将 拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
特 别 提 醒
（1）基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。
（2）目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。
（3）启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
方 法 规 律
构建基因表达载体时限制酶的选择
甲
（1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。这样才能保证目的基因的完整性。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则这样的两个末端也可连接。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中的限制酶 SmaⅠ 会破坏标记基因。
乙
（3）将目的基因导入受体细胞
受体细胞 导入方法 内容
植物细胞 法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等
农杆菌转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的 可携带目的基因整合到受体细胞的 DNA上
动物细胞 技术 常用受体细胞：
原核细胞 Ca2＋处理法 用 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
（4）目的基因的检测与鉴定
检测水平 具体方法
分子水平 的检测 ①通过 等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA； ②从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 ，检测目的基因是否翻译成蛋白质
水平的 鉴定 例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度
方 法 规 律
如何筛选出含有目的基因的受体细胞
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4， 则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2.PCR技术
（1）PCR概述
过程 说明 图解
①条件：温度上升到 ℃以上； ②实质：双链DNA解链为单链
①条件：温度下降到 ℃左右； ②实质：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
①条件： ℃左右； ②实质：Taq DNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由 端延伸
注：PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。（操作详见实验17）
归 纳 总 结
PCR技术和DNA复制的比较
（2）PCR反应体系中的条件分析
①PCR反应需要在一定的 中进行，加入复制需要的各组分，同时控制温度。
②因为反应循环中需要高温变性，使用的DNA聚合酶为 。
③引物是一段20～30个碱基的 ，通过碱基互补配对与模板片段结合，游离的脱氧核苷酸加到引物的 端。
④PCR反应不需要解旋酶，DNA在 下会打开双链。
⑤在PCR反应过程中加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的 ，又可为DNA的合成提供 。（dNTP加入到延伸链的3'端，与上一个核苷酸形成二酯键，同时释放一个焦磷酸PPi）
（3）PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8
含引物A（或B）的DNA分子数 1 3 7
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 －2
诊断·加强
1.判断下列说法的正误：
（1）用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。 （ ）
（2）用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 （ ）
（3）在PCR反应体系中未加入ATP，因为PCR反应过程不需要能量。 （ ）
（4）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 （ ）
（5）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。 （ ）
2.构建基因表达载体需要两种工具酶： 。
3.将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到 技术。
4.PCR不可以扩增mRNA的原因： ，必须把mRNA逆转录成 之后再做PCR。
典 题 固 法
（2022·海南卷）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5 d的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题：
（1）CEFs是从孵化9 d的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用
处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）体外获取OSNL的方法有 （答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和 等。启动子是
识别和结合的部位，有了它才能驱动 。
（3）iPS 细胞和 iPGCs 细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 。
（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是 。
（5）该实验流程中用到的生物技术有 （答出2点即可）。
（2022·河北卷节选）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
（2） 是实施基因工程的核心。
（3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上。
（4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
（写出两点即可）。
（5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步检测抗虫的 以鉴定其抗性程度。
（6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
（写出2点即可）。
（2022·全国乙卷）新冠病毒感染出现后，病毒核酸检测和疫苗接种发挥了重要作用。回答下列问题：
（1）新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT－PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
（2021·全国甲卷）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测患者是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从患者组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集患者组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是 ，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
考向1 PCR技术
1.（2022·广东测试）图1是我国自主设计的“本地＋移动”一站式新冠病毒核酸检测平台示意图，单平台混样日检测量可达13万人次。图2为RT－PCR（逆转录荧光PCR技术）的原理：PCR过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和淬灭基团（抑制荧光发出），当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。请回答下列问题：
图1 图2
（1）PCR技术的目的是 。RT－PCR过程中，需先将RNA逆转录成cDNA，故装置中需添加的酶有 。
（2）对新冠病毒进行检测时，探针的设计依据是 。探针与模板结合发生在PCR循环中的 （选填“变性”“复性”或“延伸”）阶段。
（3）若监测系统检测到荧光信号，则可判定该检测样本为阳性，其原理是 。
（4）为了在没有核酸检测的条件下及早发现新冠病毒，我国于2022年3月11日推出新冠病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是 。
考向2 基因表达载体的构建
2.（2022·深圳模拟）将编码四种不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR与叶绿体转运肽基因连接，搭载到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段中构建多基因表达载体，最终在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法错误的是（ ）
A.可用分子杂交技术检测四个基因是否成功导入水稻
B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板
C.应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的水稻细胞
D.基因表达载体中的四个基因在水稻细胞核内进行转录
3.（2022·北京一模）下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是（ ）
pBR322质粒 人生长激素基因
注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。
A.应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B.所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C.用含氨苄青霉素的培养基筛选出含重组质粒的受体菌
D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
考向3 基因工程的基本操作程序
4.（2022·佛山一模）戊型肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV）引起的一种急性传染性肝炎，发病率和死亡率都很高。世界首支戊型肝炎疫苗是我国科研工作者通过基因工程技术研制成功的。如图为一种戊肝疫苗研制的技术流程图，其中ORF2蛋白是戊肝病毒的表面抗原，能引起人体特异性免疫反应。据图分析并回答下列问题：
注：引物P1（5'—CTAGCTAGCGCCACCATGCCTACCCCCTCTCCTGC—3'）含NheⅠ酶切位点；
引物F1（5'—CGCGATCCTTACTAAGGGTAATCAACTGTCCTCC—3'）含BamH Ⅰ酶切位点。
（1）过程①需要 酶的参与。过程②除引物和模板外，还需往缓冲液中加入 。
（2）实验中使用的pBV220载体上应该具有 。过程③需要的关键酶有 。
（3）过程④常用的方法是 。
过程⑤需要依据 原理对产物进行鉴定。
（4）与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗的主要优点是 。
构核心概念
练教材长句
链接选择性必修3教材 P72“资料卡”。
（1）限制酶主要来源于原核生物，但为什么不会切割自身DNA分子？
（2）
链接选择性必修3教材 P72正文。
（2）用作基因工程载体的质粒需要具有能 等特点。
链接选择性必修3教材 P81“资料卡”。
（3）农杆菌能作为基因工程的载体，是因为 ，当它侵染植物细胞后，能 ，并且将其 。
拎教材“冷”点
链接选择性必修3教材 P72旁栏思考题。
（1）DNA连接酶和DNA聚合酶的不同点体现在：DNA连接酶连接的是 ，而DNA聚合酶是把 连接到已有的DNA片段上。
链接选择性必修3教材P77“旁栏思考”
（2）PCR引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。
（3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活，因此，一般要添加到PCR反应缓冲溶液中。
第50讲 基因工程的工具和操作
考点1 基因工程的原理和基本工具
【概念落实】
1.（1）重组DNA 生物类型 生物产品 （2）基因重组 （3）远缘杂交不亲和 遗传性状
2.（1）原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 ①4 ②平末端 （2）磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端和平末端 （3）环状双链DNA分子 噬菌体 有一个至多个 自我复制 受体DNA 标记
【诊断·加强】
（1）× （2）× （3）× （4）√ （5）× 提示：一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们常根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
【典题固法】
【高考典例】
例1 C 解析：据题意可知，限制酶EcoR Ⅰ的识别序列为，则理论上，该序列出现的概率为1/（4×4×4×4×4×4）＝1/4 096，即4 096个碱基对序列中会出现一个限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，故用EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对个数）约为4 000，C符合题意。
例2 （1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ （2）磷酸二酯键 （3）自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 （4）RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析：（1）由题图可以看出，EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
【对点演练】
1.A 解析：DNA连接酶不能连接单链DNA片段，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，B错误；E.coli DNA连接酶只能连接有黏性末端的DNA片段，C错误；T4 DNA连接酶既可以连接有黏性末端的DNA片段，也可以连接有平末端的DNA片段，D错误。
2.B 解析：将经过碱性磷酸单酯酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5'－OH与3'－OH不能连接而形成切口（nick），因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA进行半保留复制，1个重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。
3.（1）Hind Ⅲ和BamHⅠ （2）CaCl2（或Ca2＋） 氨苄青霉素 Hind Ⅲ和BamHⅠ （3）将插入T－DNA中的DNA序列转移并整合到受体细胞染色体DNA上 （4）能，只有T－DNA之间的DNA序列可以转移至染色体DNA上，本例中氨苄青霉素抗性基因不能转移到染色体DNA上，个体发育过程中会随着细胞分裂而逐渐丢失，因而不会转移至近缘生物中
解析：（1）高效构建基因表达载体宜采用双酶切，即选用Hind Ⅲ和BamHⅠ同时切割质粒和目的基因。（2）筛选时需要用到抗性基因，在本质粒中抗性基因是氨苄青霉素抗性基因，因此在重组体筛选时需要用到含氨苄青霉素的培养基。使用DNA连接酶连接后的重组质粒中，原来切割质粒和目的基因的限制酶酶切位点在重组质粒中再次出现，可以使用同样的限制酶（HindⅢ和BamHⅠ）将重组质粒再次切开。（4）因为T－DNA中插入启动子、多克隆位点和终止子之后并不影响T－DNA的作用，所以T－DNA会把T－DNA中插入的DNA片段转移到染色体DNA上，这样氨苄青霉素抗性基因将无法转移到染色体DNA上而保留在细胞质中，细胞质中的DNA无法稳定的保存和复制，在个体发育过程中随细胞分裂次数的增加而丢失，从而降低了抗性基因转移的风险。
考点2 基因工程的基本操作程序
【概念落实】
1.（1）结构和功能清晰 序列数据库 目的基因 PCR 基因文库 （2）①上游 RNA聚合酶 下游 目的基因 ②限制酶 同种 相同末端 DNA连接酶 目的基因片段 （3）花粉管通道 T－DNA 染色体 显微注射 受精卵 Ca2＋ （4）PCR 抗原—抗体杂交 个体生物学
2.聚合酶链式反应 DNA复制 脱氧核苷酸 引物 2n 变性 90 复性 50 延伸 72 5'端向3' （2）①缓冲溶液 ②耐高温的DNA聚合酶 ③单链核酸 3' ④高温 ⑤原料 能量 （3）2n 2n－1 2n－2
【诊断·加强】
1.（1）√ （2）√ （3）× （4）× （5）×
2.限制酶和DNA连接酶
3.植物组织培养
4.PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA进行PCR 单链cDNA
【典题固法】
【高考典例】
例1 （1）胰蛋白酶或胶原蛋白酶 血清 （2）利用PCR获取和扩增、通过构建基因文库来获取 终止子 RNA聚合酶 基因转录出mRNA （3）基因的选择性表达 （4）诱导iPS细胞的技术是指诱导已分化的细胞重编程为诱导多能干细胞，而体细胞核移植技术是指将一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成个体的技术 （5）基因工程、动物细胞培养
解析：（2）体外获取目的基因的方法有多种，如基因文库法、 PCR技术、人工合成法。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等结构，启动子是 RNA聚合酶识别和结合的部位，有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。（3）iPGCs细胞是由iPS细胞增殖、分化而来的，两者在形态、结构和功能方面不同的根本原因是基因的选择性表达。（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技 术存在明显的区别，主要表现在诱导iPS细胞的技术是 将已分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞 （iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs） 的技术；而体细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。（5）分析题意可知，该实验流程中用到的生物技术有基因工程、动物细胞培养等技术。
例2 （1）调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物 （2）基因表达载体的构建（或表达载体的构建） （3）T－DNA （4）基因—DNA分子杂交技术、mRNA—分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术 （5）效果 （6）定向改变 害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂
解析：农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。
例3 （1）逆转录酶（反转录酶） （2）特异性核苷酸序列 退火（复性） （3）曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 （4）获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
解析：（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。（2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90～95 ℃）、复性（55～60 ℃）、延伸（70～75 ℃），故其中温度最低的一步是复性。（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为隐性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白。
例4 （1）④②③① （2）耐高温的DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 （3）病原菌DNA （4）在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
【对点演练】
1.（1）短时间内大量扩增目的基因 逆转录酶和Taq酶 （2）新冠病毒的核苷酸序列 复性 （3）检测样本中存在新冠病毒RNA，其逆转录产物可与探针特异性结合，PCR过程中探针被水解而发出荧光 （4）抗原与抗体特异性结合
解析：（1）PCR技术的目的是大量扩增目的基因片段，用于基因工程或检测。以RNA为模板逆转录成cDNA，是逆转录过程，需要用到逆转录酶；PCR过程中需要用到Taq酶。（2）探针是可以与模板结合的一小段DNA序列，故设计的依据是一段已知目的基因的核苷酸序列，即新冠病毒的核苷酸序列。变性过程是DNA双链打开的过程，复性时，引物与探针结合到模板DNA上。（3）根据题意，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。因此，样本中有新冠病毒核酸时，能进行快速复制，导致其荧光信号加强。
2.B 解析：若基因成功导入，则加入以基因的某一个片段制成的探针，会形成DNA杂交带，该方法称为分子杂交技术，A正确；DNA的两条链反向平行，假设图中DNA分子上面一条链为5'→3'方向，RNA聚合酶启动转录时只能与模板链的3'端结合，结合图示启动子的方向可知，EcCAT的模板链为下链，OsGLO1的模板链为上链，EcGCL和TSR的模板链为下链，故4个基因转录时不是都以DNA的同一条单链为模板，B错误；结合图示可知，潮霉素抗性基因在T－DNA中，会整合到植物的染色体上，因此用含潮霉素的培养基可以筛选转化成功的水稻细胞，C正确；搭载到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段中的4个基因会随着T－DNA的转移而整合到植物的染色体上，因此基因表达载体中的四个基因在水稻细胞核内进行转录，D正确。
3.C 解析：为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据图可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
4.（1）逆转录（反转录） Taq酶、dNTP （2）Nhe Ⅰ 和 BamH Ⅰ 酶切位点、标记基因 限制酶、DNA 连接酶 （3）Ca2＋转化法 抗原、抗体特异性结合 （4）仅需注射病毒的部分蛋白进入人体，更安全
解析：（1）①表示逆转录，需要逆转录酶的参与；②表示PCR，需要耐高温的DNA聚合酶的催化，还需要原料dNTP。（2）根据引物上含有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点可知，pBV220载体上应该含有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，另外还需要有标记基因，便于筛选和鉴定目的基因。③表示构建基因表达载体，需要限制酶和DNA连接酶的参与。（3）④表示将目的基因导入受体细胞，常用钙离子处理法。⑤表示目的基因的检测和鉴定，常用抗原、抗体杂交法检测基因表达产物，原理是抗原、抗体的特异性结合。（4）与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗只需要注射病毒的部分蛋白进入人体即可，相对来说更安全。
课堂小结与延伸
【构核心概念】
限制性内切核酸酶 DNA连接酶 质粒、动植物病毒、噬菌体 PCR技术 基因表达载体 花粉管通道法、农杆菌转化法 显微注射法 感受态法 检测与鉴定
【练教材长句】
（1）提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点进行切割。
（2）自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害
（3）农杆菌细胞内含有Ti质粒 将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞 整合到该细胞的染色体DNA上
【拎教材“冷”点】
（1）两个DNA片段 单个的脱氧核苷酸
（2）RNA单链 引物 （3）M
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