【备考2024】一轮新人教版生物学学案：选择性必修3 第10单元 第4讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题（含解析）
文档属性
| 名称 | 【备考2024】一轮新人教版生物学学案：选择性必修3 第10单元 第4讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 5.1MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-12-13 17:38:32 | ||
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文档简介
【备考2024】一轮新人教版生物学学案
第十单元 生物技术与工程
第4讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
考点1 重组DNA技术的基本工具
一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
二、基本工具
1．限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)作用特点：具有专一性，表现在两个方面
①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)作用结果：产生黏性末端或平末端。
①
②
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将限制酶切割下来的DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)类型
常用类型 E．coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)作用：将外源基因送入受体细胞。
(2)常用载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。
(3)最常用载体：质粒。
①本质：裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②特点
1．用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？(选择性必修3 P71“文字信息”)
提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。(选择性必修3 P72“旁栏思考”)
提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
3．限制酶不切割细菌本身的DNA分子，其原因是什么？(选择性必修3 P74“拓展应用”)
提示：含有某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌含有某种限制酶，它本身的DNA也不会被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
1．基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的。 (√)
2．重组DNA技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 (×)
提示：重组DNA技术的基本工具有限制酶、DNA连接酶和载体。
3．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 (×)
提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 (√)
5．做载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (√)
6．DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在－4 ℃冰箱中放置几分钟。 (×)
提示：DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在4 ℃冰箱中放置几分钟。
1．实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是_____________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害
2．用T4 DNA连接酶构建基因表达载体时，研究人员常选用能产生黏性末端的限制酶，理由是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：T4 DNA连接酶连接黏性末端的效率高于连接平末端的效率
1．与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
2．限制酶的选择方法
图甲 图乙
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，与图乙所示质粒连接。
1．CRISPR—Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫SgRNA)和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，原理如图所示。
CRISPR－Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，试分析脱靶最可能原因。
提示：其他DNA序列也含有与向导RNA(SgRNA)互补配对序列 ，造成向导RNA(SgRNA)错误结合而脱靶，而且SgRNA的序列越短，脱靶率会越高。
2．限制性内切核酸酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
提示：
基因工程工具酶的应用
1．(2022·山东济南模拟)如表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断的以下说法中，正确的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ ↓ GGATCC KpnⅠ ↓ GGTACC
EcoRⅠ ↓ GAATTC Sau3AⅠ ↓ GATC
HindⅠ ↓ GTYRAC SmaⅠ ↓ CCCGGG
(注：Y＝C或T，R＝A或G。)
A．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B．限制酶切割后一定形成黏性末端
C．不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端
D．限制酶的切割位点在识别序列内部
C [由图可知，由于Y＝C或T，R＝A或G，因此HindⅠ可以识别多种核苷酸序列，A错误；限制酶切割后可能形成黏性末端或平末端，B错误；不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C正确；限制酶的切割位点在识别序列内部或外部，如Sau3AⅠ，D错误。]
基因工程载体的应用
2．(2022·北京朝阳区二模)农杆菌特有的T DNA能够提高其对宿主细胞的转化，进而使宿主长出冠瘿瘤。如图为T DNA上的部分结构，有关分析错误的是( )
A．T DNA是Ti质粒上特有的序列，在基因工程中广泛应用
B．T DNA整合到宿主细胞基因组DNA上可能会导致基因突变
C．T DNA结构的完整性是诱导宿主植株产生冠瘿瘤的重要条件
D．农杆菌通过改变植物激素的种类与比例诱导细胞的分化方向
A [T DNA是农杆菌特有的序列，该序列可存在于农杆菌所有DNA中，不是Ti质粒所特有的，A错误；基因突变是指DNA分子中碱基对的增添、替换和缺失而引起基因结构的改变，故T DNA整合到宿主细胞基因组DNA上可能会导致基因突变，B正确；基因的结构决定功能，基因要表达功能应保证其具有完整性，故T DNA结构的完整性是诱导宿主植株产生冠瘿瘤的重要条件，C正确；据图可知，重组质粒上有生长素合成基因和细胞分裂素合成基因，两者比例不同可决定植物根或茎的分化，D正确。]
考点2 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效地方法之一。
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
(3)PCR反应过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
1．PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是什么？(选择性必修3 P78“图3－5”)
提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
2．研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。(选择性必修3 P83“拓展应用”)
提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入或者同一染色体多位点插入或者不同染色体多位点插入。外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (√)
2．Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (√)
3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (×)
提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
4．PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 (√)
5．随着转化方法的研究，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 (√)
6．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (√)
1．为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，其作用在于_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：当诱导物存在时，激活或抑制目的基因的表达
2．如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是__________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因，相当于杂合子
1．目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2．筛选出含有目的基因的受体细胞的方法——载体表型选择法
(1)方法1(如图)
①原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
②被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
③筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，图中能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
(2)方法2：β 半乳糖苷酶显色反应选择法
β 半乳糖苷酶显色反应选择法，即我们常说的蓝白斑筛选法，也是一种常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。这种检测方法用到的载体上有LacZ基因，其表达产物为无活性的α肽段。受体细胞可以合成无活性的ω肽段。α肽段与ω肽段结合后可以产生有活性的β 半乳糖苷酶，该酶能将无色的5 溴 4 氯 3 吲哚 β D 半乳糖苷(X gal)水解成蓝色产物。如果目的基因插入LacZ基因的多克隆位点，重组载体转入受体细胞后就不能产生β 半乳糖苷酶，X gal也就无法水解成蓝色产物，因此在筛选平板上含有重组载体的菌落呈白色。
3．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过逆转录或人工方法合成的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，构建基因表达载体时，需要与质粒结合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
1．设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
(1)第1组：__________________________________；
(2)第2组：________________________________。
提示：(1)引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 (2)引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2．研究人员利用基因工程技术将油料作物紫苏DGAT1基因导入四尾栅藻，获得转基因的产油微藻，利用地热废水培养，不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。为检测转基因四尾栅藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如表。
指标 总氮(mg/L) 总磷(mg/L) 氟化物(mg/L)
废水培养基 23.2 4.32 4.56
培养转基因四尾栅藻11天后 1.9 0.45 0.84
该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，请进一步完善实验设计。
实验设计：
提示：应添加对照组：废水培养非转基因四尾栅藻11天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。
考查目的基因的获取
1．(2022·江苏苏州模拟)递减PCR是常规PCR技术的发展，如图表示递减PCR各阶段温度及时间控制。相关叙述错误的是( )
A．PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物、缓冲液等物质
B．第1阶段的目的是使模板DNA充分解旋，减少DNA复杂结构对扩增的影响
C．第2阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板
D．第4阶段72 ℃下维持10 min ，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋
D [结合题意分析可知，PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶(催化DNA子链的形成)、模板DNA、dNTP(原料)、引物、缓冲液等物质，A正确；据图可知，第1阶段是在96 ℃条件下处理4 min，该阶段的目的是使模板DNA在高温下充分解旋，得到单链DNA，以减少DNA复杂结构对扩增的影响，B正确；引物的碱基数量越少变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，故第2阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板，C正确；72 ℃下维持10 min，主要目的是使引物链延伸，以形成新的脱氧核苷酸链，D错误。]
考查基因工程的基本操作程序
2．(2022·湖北华中师大一附中模拟)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列叙述错误的是( )
A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因
B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C．在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞
D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
C [由图可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，A正确；图中质粒与ACA－GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞为成功转入目的基因的细胞或含有普通质粒的细胞，C错误；PCR技术，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，即用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，D正确。]
3．(2023·广东广州六校联考)图1表示新型冠状病毒的结构示意图，其中蛋白S(刺突糖蛋白)通过与人体黏膜细胞表面的ACE2受体结合而进入细胞，蛋白M能刺激机体产生免疫反应；图2表示科研人员研制新冠疫苗的一条技术路线。请据图回答下列问题。
图1
图2
(1)蛋白S和ACE2受体的化学本质________(填“相同”或“不同”)，蛋白M在免疫过程中属于________。
(2)图2中，过程①需要的一种特殊酶是________。过程②是基因工程的核心，形成的重组DNA中含有的组件包括______________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
(3)过程③需要用________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种____________________的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
(4)疫苗Ⅱ导入实验动物体内，________(填“一定”或“不一定”)能引起免疫反应，理由是__________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)新型冠状病毒的蛋白S是糖蛋白，细胞膜上的受体也是糖蛋白，所以两者的化学本质相同。新型冠状病毒的蛋白M可以引起人体发生免疫反应，所以在免疫过程中蛋白M属于抗原。(2)过程①指的是通过逆转录获得目的基因的过程，该过程需要逆转录酶。重组DNA中包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点等组件。(3)将目的基因导入微生物时，需要先用Ca2+处理微生物，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(4)疫苗Ⅱ中的有效成分是DNA，而DNA不能充当抗原，只有表达出蛋白M才能引起免疫反应。目的基因导入动物体内后还需要进行检测，确定目的基因是否表达。
[答案] (1)相同 抗原 (2)逆转录酶 目的基因、标记基因，启动子，终止子、复制原点(答出任意2点即可) (3)Ca2+(或CaCl2) 能吸收周围环境中DNA分子 (4)不一定 疫苗Ⅱ含有能表达出蛋白M的基因，该基因在动物体内只有表达出蛋白M才能引起免疫反应，目的基因导入动物体内不一定能够表达，需要进行进一步的检测(答案合理即可)
考点3 基因工程的应用及蛋白质工程
一、基因工程的应用
二、蛋白质工程
1．概念
(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
(2)手段：改造或合成基因。
(3)结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
2．流程图
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B．翻译，C．分子设计，D．多肽链，E．预期功能。
3．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
(2)其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食的产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
1．利用大肠杆菌可生产出重组人胰岛素，联系前面细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的胰岛素，可用大肠杆菌吗？(选择性必修3 P87“从社会中来”)
提示：不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。
2．野外种植转基因抗A害虫植物的同时，还种植一定量的同种不抗虫植物，可降低抗性害虫在整个害虫种群中所占比例的增加速率。试分析其中的原因。(选择性必修3 P88“文字信息”)
提示：种植一定量的同种不抗虫植物，对抗性害虫的选择作用减弱。
3．对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？ 原因是什么？(选择性必修3 P93“文字信息”)
提示：通过对基因的操作来实现基因控制蛋白质的合成。基因能遗传给下一代。
1．转基因抗病农作物不需要使用农药。 (×)
提示：转基因抗病农作物减少了农药的使用。
2．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物。 (√)
3．利用基因工程技术，将人胰岛素的基因转入大肠杆菌后，大肠杆菌内表达出的胰岛素与人的胰岛素结构相同。 (×)
提示：大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体对核糖体产生的肽链进行加工，故表达出的胰岛素与人的胰岛素结构不同。
4．蛋白质工程常借助计算机建立蛋白质的三维结构模型。 (√)
5．对蛋白质的结构设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 (√)
6．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 (√)
1．用膀胱生物反应器也能生产干扰素，与乳腺生物反应器相比，其优势是____
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
提示：不受年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效
2．利用转基因技术培育的抗虫、耐除草剂转基因玉米成为农业害虫控制和杂草防除的有效手段，其优点有
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：能够有效减少化学药剂的施用，降低人工成本，提高玉米产量和品质，有利于保护生态环境和生物多样性
1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
2．蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目 蛋白质工程 基因工程
基本思路或过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
1．结核病是由结核分枝杆菌(简称结核菌)引起的致死性疾病，接种卡介苗是预防结核病的有效手段。近年来，耐药结核病不断出现。我国科研者研制出了一种重组耐药卡介苗(RdrBCG)，即在原有卡介苗的基础上引入Ag85B和Rv2628两个新的基因，用于辅助治疗耐药结核病。
在重组质粒建构过程中，使用到了限制酶PstⅠ。结合图示所给酶切位点(灰色底色)等信息，写出重组质粒的制备过程。
提示：将Rv2628与质粒混合，加入限制酶PstⅠ和NdeⅠ后，再加入DNA连接酶形成重组质粒1，再将重组质粒1与Ag85B混合，加入限制酶BamHⅠ和HindⅢ，再加入DNA连接酶形成如图所示的重组质粒。
2．通过对Bt蛋白质三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，写出其实验设计思路。
实验设计思路：
提示：参照密码子表，找到合成该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。
考查基因工程的应用
1．(2023·广东广州联考)肿瘤坏死因子(TNF)在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖作用。科研人员利用乳腺生物反应器大量生产肿瘤坏死因子。已知限制酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ的识别序列及切点分别是、、、。回答下列问题：
图1
图2
(1)在构建基因表达载体时，________(填“能”或“不能”)选用PstⅠ切割质粒和含肿瘤坏死因子基因的DNA片段，其原因是____________________；若用HindⅢ和BglⅡ切割含肿瘤坏死因子基因的DNA片段，除选用HindⅢ和BglⅡ组合外还可以选用____________________组合切割质粒。
(2)利用PCR技术扩增TNF基因时，扩增过程可以在________中自动完成。已知DNA复制时，只能从子链的5′端向3′端开始延伸，据此可知应选择下图甲、乙、丙、丁四种引物中的________作为引物，若扩增4次，共需要引物________个。
科学家需将TNF基因与______________重组在一起，通过____________等方法，导入哺乳动物的____________中，由其发育成的转基因动物进入泌乳期后，可以在其分泌的乳汁中获取所需要的TNF。
[答案] (1)不能 用PstⅠ切割质粒会破坏四环素抗性基因 HindⅢ、BamHⅠ (2)PCR仪 乙、丙 30 乳腺细胞中特异表达的基因的启动子等调控元件 显微注射 受精卵
(教师用书独具)
(2022·山东临沂二模)甜柿鲜果肉中含丰富的可溶性糖、微量元素、维生素和β 胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者喜爱。甜柿自然脱涩的涩味程度与乙醛代谢关键酶基因(PDC)的表达情况有关。为筛选PDC基因调控蛋白，科研人员利用质粒A和质粒G(如图1、图2所示)，进行了相关研究。
图2
图3
(1)启动子位于基因首端，存在RNA聚合酶和多种调控蛋白的结合位点，共同影响基因的表达。PDC基因的启动子序列未知，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在__________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据__________和PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增。再将扩增所得PDC基因启动子与质粒A连接并导入代谢缺陷型酵母菌，可用__________的培养基筛选出成功转化的酵母菌Y1。
(2)已知质粒G上的AD基因表达出的AD蛋白与待测蛋白结合形成的融合蛋白足够靠近启动子时，才能够激活后续基因的转录。现从甜柿中提取的总mRNA经________过程合成不同片段的cDNA，然后分别插入质粒G中的________(填序号1～5)位点以获得不同的重组质粒(G1、G2……)，理由是______________
_____________________________________________________________________。
(3)已知插入的不同cDNA片段指导合成不同的待测蛋白，只有待测蛋白为PDC基因调控蛋白时，与AD蛋白形成的融合蛋白才能激活PDC基因启动子。请结合上述实验过程和图3，完善筛选PDC基因调控蛋白的实验思路及预期结果。
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
筛选得到PDC基因调控蛋白在农业生产中的应用前景是___________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)该操作为目的基因和载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接，即在DNA连接酶的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游；体外扩增基因常用的方法是PCR技术，DNA复制常需要引物，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物；由质粒A的图谱可知，带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则用不含尿嘧啶的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1。(2)科研人员从甜柿中提取mRNA，逆转录形成的各种cDNA；将cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，cDNA片段要插入启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因，故选择2作为cDNA的插入位点。(3)要筛选PDC基因调控蛋白，可将携带不同 cDNA 片段的重组质粒 G1 、G2……分别导入酵母菌 Y1 中，然后分别置于含金担子素的培养基上培养。若能在培养基上生长，则该酵母菌含有的cDNA 所表达的蛋白质即为 PDC 基因调控蛋白；甜柿自然脱涩的涩味程度与乙醛代谢关键酶基因(PDC)的表达情况有关，可通过改变调控蛋白的表达量进而调控 PDC 基因的表达，达到控制甜柿的自然脱涩进程的目的。
[答案] (1)DNA连接酶 接头片段 不含尿嘧啶 (2)逆转录(或反转录) 2 插入位点需要在AD基因的启动子和终止子之间，且不能破坏AD基因 (3)实验思路：将携带不同cDNA片段的重组质粒G1 、G2……分别导入酵母菌 Y1 中，然后分别置于含金担子素的培养基上培养。预期结果：若能在培养基上生长，则该酵母菌含有的cDNA 所表达的蛋白质即为 PDC 基因调控蛋白 可通过改变调控蛋白的表达量进而调控 PDC 基因的表达，达到控制甜柿的自然脱涩进程的目的
考查蛋白质工程及应用
2．(2021·辽宁选择性考试)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
D [在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其与底物分别置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。]
考点4 (探究·实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．实验步骤
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
2．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1_mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．DNA粗提取中的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。
1．如图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是( )
① ② ③ ④
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌的目的相同
C．若图③操作后接图②操作，则DNA留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA留在纱布上
B [图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻璃棒搅拌的目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒搅拌的目的是溶解细胞核内的DNA，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。]
2．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B [低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。]
3．(2022·山东济南三模)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因(Wx)编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5′－GCTTCACTTCTCTGCTTGTG－3′，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列叙述正确的是( )
高直链淀粉含量(GG)和中等直链淀粉含量(TT)水稻品种中蜡质基因部分DNA顺序
A．该实验中需设计的引物2为5′－TTCAACTCT CGTTAAATCAT－3′
B．若酶切产物只能观察到450 bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型
C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带
D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
C [由引物1的碱基序列及图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5′－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3′，A错误。若酶切产物只能观察到450 bp的DNA条带，则表明第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，该水稻品种为GG型，B错误。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，C正确。组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同，D错误。]
考点5 生物技术的安全性与伦理问题
一、转基因成果
1．基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域是对微生物的基因改造。
2．转基因动物方面，科学家将生长激素基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内，培育了一批生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜。
3．转基因植物方面，目前已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物。种植转基因植物面积较大的国家有美国、巴西、阿根廷、加拿大等；种植的转基因作物中大豆和玉米最多，其次是棉花和油菜。
二、对转基因产品安全性的争论
三、理性看待转基因技术
1．需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
2．应看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
3．要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
四、关注生殖性克隆人
1．生殖性克隆：指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
2．治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
3．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
五、禁止生物武器
1．种类：致病菌类、病毒类、生化毒剂类等。
2．中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．将来自玉米的α 淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以防止转基因花粉传播的原因是什么？(选择性必修3 P102“相关信息”)
提示：由于α 淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。
2．我国科学家用4种小分子化合物诱导小鼠的成纤维细胞转变成了iPS细胞，这种诱导方法与转入转录因子诱导产生iPS细胞相比，其优点是什么？(选择性必修3 P108“文字信息”)
提示：避免了转入转录因子诱导iPS细胞可能带来的致癌风险。
3．有一种神秘的“X疾病(Disease X)”，它是由未知病原体造成的大规模流行性疾病，一旦暴发可能导致数百万人死亡。你认为这种未知病原体的来源可能有哪些？(选择性必修3 P113“拓展应用”)
提示：这种未知病原体可能来自其他动物或者高科技实验室、由某些科学家制造出来，还有可能是在自然界中经过突变产生的。
1．转基因技术已被用于减少啤酒酵母双乙酰的生成。 (√)
2．理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 (√)
3．可以运用重组DNA技术进行生殖性克隆人研究。 (×)
提示：不允许任何人进行生殖性克隆人研究。
4．生物武器仅包括病毒类。 (×)
提示：生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
5．提供骨髓中的造血干细胞并不会对婴儿的健康造成损伤。 (√)
6．克隆动物实验存在流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。 (√)
1．转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是什么？
_____________________________________________________________________。
提示：叶绿体基因不会通过花粉传给下一代
2．治疗性克隆获得的组织器官在移植时一般不会出现排异反应，其根本原因是什么？_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：治疗性克隆获得的组织和器官的绝大多数遗传物质和患者相同
1．关注转基因生物的优缺点
优点 缺点
(1)解决粮食短缺问题 (2)减少农药使用，从而减少环境污染 (3)节省生产成本，降低粮食售价 (4)增加食物营养，提高附加价值 (5)增加食物种类，提升食物品质 (6)提高生产效率，带动相关产业发展 (1)可能产生新病毒和新的过敏原 (2)可能产生抗除草剂的杂草 (3)可能使疾病的传播跨越物种障碍 (4)可能会损害生物多样性 (5)可能干扰生态系统的稳定性
2．比较试管婴儿和设计试管婴儿
(1)试管婴儿和设计试管婴儿过程(如图所示)
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
项目 试管婴儿 设计试管婴儿
不同点 技术手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断
应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、贫血症等遗传疾病的预防及治疗
相同点 二者都是体外受精、体外进行早期胚胎培养，再经过胚胎移植，从生殖方式上都为有性生殖
2017年8月，科学家运用基因组编辑技术在人类的早期胚胎中修正了与肥厚型心肌病发生相关的基因MYBPC3的突变，使胚胎携带正常MYBPC3基因的概率提高了20%左右。你认为该不该允许对人类胚胎进行基因组编辑的相关研究？请说出你的理由。
提示：不允许。由于目前该技术存在一系列安全风险和伦理问题，如可能会出现“设计婴儿”，“基因脱靶”问题，导入基因与细胞内原有基因相互作用的问题，病毒基因植入问题，因此应禁止将对胚胎细胞进行基因编辑的技术应用于临床。
考查生物技术的安全性问题
1．下面关于生物武器的叙述，错误的是( )
A．世界各国都应当禁止在任何情况下生产、储存和发展生物武器
B．生物武器利用致病菌、病毒、生化毒剂、干扰素及重组致病菌等形成杀伤力
C．生物武器传染性强、作用范围广，应严格禁止
D．消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面
B [干扰素为细胞因子，非生物武器，B错误。]
(教师用书独具)
(2022·山东泰安三模)植物生物反应器主要以整株植物、植物组织或植物悬浮细胞为加工场所，生产药物蛋白。叶绿体遗传转化体系是近几年发展起来的一种新的植物生物反应器。叶绿体转化是以同源重组原理将外源目的基因整合到目标叶绿体基因组中的一种方式，是一种高表达、安全性极高的遗传转化方法。下列相关叙述不正确的是( )
A．植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程
B．构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达
C．植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散
D．把目的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子一定含有此目的基因
D [植物生物反应器首先需要用基因工程技术将目的基因导入植物细胞，其次需要采用植物细胞工程技术将转基因植物细胞培育成转基因植株或转基因植物组织或转基因植物悬浮细胞，因此涉及基因工程和植物细胞工程技术，A正确；要使得目的基因只能在叶绿体中表达，则构建的基因表达载体中要含有叶绿体特异性启动子，B正确；由于受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，因此植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散，C正确；把该基因导入叶绿体DNA中，叶绿体DNA存在于细胞质中，在配子产生过程中并不遵循遗传定律，所以将来产生的配子中不一定含有抗病基因，D错误。]
考查生物技术的伦理问题
2．(2022·湖北华中师大一附中模拟预测)当前生物技术发展非常迅猛，很多生物技术的应用已经与我们的日常生活密切相关。下列有关生物技术的说法或做法正确的是( )
A．设计试管婴儿是指通过遗传咨询有选择地生育优良性状的小孩
B．在我国，通过生殖性克隆有可能解决一些夫妇不孕不育的问题
C．胚胎工程繁育良种时，供体和受体母畜都要进行同期发情处理
D．对囊胚进行胚胎分割时，必须对整个胚胎进行均等分割
C [设计试管婴儿是指通过胚胎移植前对胚胎进行遗传学诊断有选择地生育符合特殊要求的小孩，通过遗传咨询有选择地生育优良性状的小孩能降低遗传病的发生概率，A错误；在我国，通过试管婴儿技术有可能解决一些夫妇不孕不育的问题，B错误；胚胎工程繁育良种时，供体和受体母畜都要进行同期发情处理，保证胚胎移植前后生理环境的相同，C正确；对囊胚进行胚胎分割时，必须对内细胞团进行均等分割，D错误。]
3．(2022·辽宁沈阳模拟预测)下列关于生物技术安全性和伦理问题的叙述，正确的是( )
A．基因身份证含有致病基因和易感基因等涉及个人敏感基因的信息
B．生物武器种类包括致病菌、干扰素、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌
C．抗除草剂基因通过花粉传播到杂草形成“超级杂草”会造成食物安全问题
D．国际上大多数国家在转基因食品标签上都有警示性标记，并注明可能的危害
A [基因身份证是指把个人的致病基因和易感基因检测出来，记录在磁卡上，做成个人基因身份证，A正确；生物武器种类包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等，干扰素不属于生物武器，B错误；抗除草剂基因通过花粉传播到杂草形成“超级杂草”会影响生物多样性，会造成生物安全问题，C错误；转基因食品上只标明原料来自转基因生物，并未标明其危害，D错误。]
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P72)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(3)(选择性必修3 P76)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(4)(选择性必修3 P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(5)(选择性必修3 P84)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 (6)(选择性必修3 P106)生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
2．结论语句
(1)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(2)(选择性必修3 P72)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(3)(选择性必修3 P74)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须含有启动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P84)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(7)(选择性必修3 P93)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
(8)(选择性必修3 P94)对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(9)(选择性必修3 P103)理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(10)(选择性必修3 P107)我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
1．(2022·全国乙卷改编)新冠病毒感染出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疾病防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是____________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明_____________(答出一种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是___________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(超过90 ℃)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒(或注射过新冠疫苗)，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体结合的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)。
[答案] (1)逆转录酶(或反转录酶) (2)特异性核苷酸序列 复性 (3)曾感染新冠病毒，已康复(或注射过新冠疫苗) 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体结合的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
2．(2021·福建选择性考试)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为________。
图1
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用________酶将载体P切开，再用________(填“T4 DNA”或“E．coli DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的________和________。选用________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_______________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
图2
[解析] (1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ酶将载体P切开；由于E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
[答案] (1)引物1和引物4 (2)EcoRⅤ T4 DNA 启动子 终止子 XhoⅠ和PstⅠ 钙 (3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
3．(2021·广东选择性考试)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高生产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有________________(答出两种即可)。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有______________(答出两种即可)。
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备____________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是_________________。在分子水平上，可以通过改变____________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[解析] (1)获得目的基因的方法除PCR技术外，还有从基因文库中获取、人工合成等方法。(2)蛋白酶可分解蛋白质，但不会分解DNA；蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性，因此在制备高质量的DNA模板时，去除蛋白可采用酶解法或高温处理。(3)将大肠杆菌作为基因工程的受体细胞时，首先应用Ca2+处理，使其成为能吸收外界DNA的感受态细胞。检测目的基因是否成功表达出酶蛋白可采用抗原—抗体杂交技术。(4)酶的作用条件有适宜的温度、pH等，温度过低，酶的活性会降低，温度过高、强酸或强碱的情况下，酶的活性会降低甚至失活，依据题图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系，这4种酶的最适反应条件不同，会导致可溶性淀粉的分解效率降低。可通过蛋白质工程实现对酶特性的改造和优化，在分子水平上，改变酶相应基因的碱基序列，从而改变酶蛋白的结构，最终实现优化酶特性的目的。
[答案] (1)从基因文库中获取、人工合成 (2)酶解法(使用蛋白酶进行水解)、高温处理 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)可溶性淀粉的分解效率降低 酶相应基因的碱基序列
(教师用书独具)
(2020·江苏高考改编)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种___________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；耐高温的DNA聚合酶的作用是催化________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是____________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′ AACTATGCGCTCATGA 3′ ②5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′ ③5′ AGAGGCTACGCATTGC 3′ ④5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′ AACTATGCG┈┈AGCCCTT 3′
B．5′ AATTCCATG┈┈CTGAATT 3′
C．5′ GCAATGCGT┈┈TCGGGAA 3′
D．5′ TTGATACGC┈┈CGAGTAC 3′
[解析] (1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，耐高温的DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′(引物④)和5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
[答案] (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
课时分层作业(三十八) 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题(1)
1．(2022·广东广州一模)下列有关DNA聚合酶和DNA连接酶的叙述错误的是( )
A．二者的合成需要核糖体的参与
B．二者在酵母菌的细胞核和细胞质中均发挥作用
C．二者在大肠杆菌的拟核和线粒体均有分布
D．二者所催化的反应要消耗细胞代谢产生的能量
C [DNA聚合酶和DNA连接酶的本质都是蛋白质，合成场所都是核糖体，A正确；DNA聚合酶和DNA连接酶可参与DNA复制，DNA复制的场所主要是细胞核，在细胞质的线粒体内也能进行，因此二者在酵母菌的细胞核和细胞质中均发挥作用，B正确；大肠杆菌为原核生物，不含线粒体，C错误；二者所催化的反应为DNA复制，要消耗细胞代谢产生的能量，D正确。]
2．(2022·北京房山区二模)大肠杆菌的质粒—环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是( )
A．①②③共同组成核糖核苷酸
B．质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C．DNA连接酶会使化学键④重新连接
D．若某种限制酶在质粒上只有一个酶切位点，则质粒被切为两个片段
B [①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；DNA连接酶使DNA片段重新连接，这过程形成磷酸二酯键，且磷酸二酯键是由磷酸基团与3号碳原子相连，C错误；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。]
3．(2022·湖北武汉高三模拟)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
注：PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同限制酶。
下列相关叙述错误的是( )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
D．农杆菌可将Ti质粒上的T DNA整合到白玫瑰染色体DNA上
B [靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时使用限制酶PmeⅠ，会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B错误；sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。]
4．(2022·江苏盐城三模)酵母菌报告基因的转录需要激活因子GAL4参与，它由结构功能相互独立的DNA结合域(AD)和转录激活域(BD)构成。AD、BD只有通过特定途径在空间上结合时，才能激活转录。为研究蛋白质X、Y能否特异性结合，科学家通过基因工程将蛋白质X、Y分别与酵母菌中报告基因表达所需AD、BD制成融合蛋白，通过报告基因表达情况进行分析，如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．GAL4的化学本质是蛋白质
B．该技术操作的前提是阻断酵母菌原有的AD、BD结合途径
C．若报告基因成功表达，则表明蛋白质X、Y能特异性结合
D．AD与BD结合后，发挥类似于DNA聚合酶的作用
D [蛋白质X、Y分别结合在AD、BD上形成融合蛋白，说明AD、BD都是蛋白质，即GAL4的化学本质是蛋白质，A正确；要研究蛋白质X、Y能否特异性结合，应该先阻止AD与BD的特异性结合，B正确；若报告基因成功表达了，说明AD与BD结合了，进而说明蛋白质X、Y能特异性结合，C正确；AD与BD结合后，激活的是转录过程，因此发挥的是类似于RNA聚合酶的作用，D错误。]
5．(2022·福建莆田高三质检)非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因(大小为790 bp)中间插入荧光素酶基因(Gluc基因)和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP基因)，从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒(ASFV－Gluc－EGFP)体系，如图1所示。回答下列问题：
图1
(1)构建重组病毒时用的HindⅢ和BamHⅠ都是________酶。
(2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，选用__________(引物组合)进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因__________(填“有”或“没有”)插入病毒ASFV的K基因。
M：指示分子大小的标准参照物。
1：病毒ASFV的PCR产物。
2：重组病毒的PCR产物。
图2
(3)为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞(PAMS)培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种________。支持“重组病毒成功表达”的实验结果为：____________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明______________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
[解析] (1)构建重组病毒时用的HindⅢ和BamHⅠ都是限制性内切核酸(或限制)酶，可以识别并切割特定的DNA序列。(2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，据图1分析，选用引物组合引物1和引物4进行PCR扩增可获得完整的Gluc基因和EGFP基因序列；扩增结果有1、2两种类型，如图2所示，该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因有插入病毒ASFV的K基因，因K基因大小约790 bp(类型1)，而插入成功的应大于790 bp(类型2，约1 758 bp)。(3)为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞(PAMS)培养一段时间后，平均分成A、B两组，根据对照原则，其中A组接种病毒ASFV，B组接种重组病毒。若B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性，则说明“重组病毒成功表达”。(4)科研人员分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
[答案] (1)限制性内切核酸(或限制) (2)引物1和引物4(或引物4和引物1) 有 (3)重组病毒 B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性 (4)Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制
6．(2023·广东佛山检测)农杆菌Ti质粒上的T DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是( )
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置
C [PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置，D正确。]
7．(2022·山东潍坊高三二模)修复DNA双链断裂的细胞通路在细胞生长、发育和癌变中具有关键作用，近年科学家在哺乳动物真核细胞内发现参与此通路的一种独特的 DNA聚合酶(Polθ)。当DNA 双链发生断裂时，某些酶会在断裂处将5′端链切割(原双链DNA两端的5′端因连有特殊物质“”而避免被切割)，形成局部单链 DNA(ssDNA 悬臂)。其上某些区域的碱基可互补配对，称为微同源区。DNA 发生双链断裂后，Polθ主要承担检测和修复 DNA 双链断裂的工作，如图1表示绿色荧光蛋白基因(GFP)在受体细胞中断裂后的修复过程。GFP含有6个碱基对的微同源区段。
图1
(1)DNA双链因________键断裂而断开，两ssDNA悬臂微同源区结合依赖________。
(2)在 GFP的修复过程中，Polθ的作用具体体现在________，此时微同源区的单链片段相当于该过程中的________，科研人员发现 Polθ基因在肿瘤细胞中高表达，主要用于发挥此项作用。
(3)核糖核苷酸替换是基因组中最常见的 DNA 核苷酸损伤，即 DNA 某条链的部分脱氧核苷酸被核糖核苷酸取代。科学家将 10 个核糖核苷酸序列替换到原 GFP基因上游的非模板链，模板链进行两个碱基替换，如图2所示，将其导入受体细胞设法使其重复上述实验过程，结果仍出现了绿色荧光。
图2
①请阐述上述过程受体细胞中仍出现绿色荧光的机制：______________________
_____________________________________________________________________。
②上述过程说明 Polθ还具有类似于________酶的作用，科研人员发现 Polθ基因在正常细胞中表达，主要用于发挥此作用。
(4)结合上述信息，请利用Polθ抑制剂和单克隆抗体为研发癌症的靶点治疗提供新思路______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)结合图示，DNA双链断裂破坏的是两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键；由于碱基互补配对，两 ssDNA 悬臂微同源区能够结合。(2)结合图示可知，在Polθ的作用下，缺失的单链在延伸，因此Polθ具有催化磷酸二酯键形成的作用，使小分子脱氧核苷酸聚合形成单链，达到修复的作用；微同源区的单链片段相当于该过程中的引物(一小段DNA序列，能启动DNA单链的合成)，根据这个引物开始合成子链，按照碱基互补配对原则，合成缺失的单链。(3)模板链改变后蛋白质没有变化，说明 Polθ依然能得到正确的翻译模板，从而翻译出绿色荧光蛋白，GFP基因断裂后，模板链的碱基替换部位被切除，Polθ以含核糖核苷酸的片段为模板合成出正确的模板链(逆转录)，进而表达出绿色荧光蛋白GFP；Polθ能催化RNA→DNA的过程，说明Polθ有逆转录的作用。(4)单克隆抗体具有高度特异性，Polθ具有修复DNA的作用，而癌细胞或者肿瘤细胞也是基于改变引起的，本身不希望它们的DNA完整或DNA正常表达，此时Polθ抑制剂就能很好地发挥作用，将能特异性识别肿瘤细胞的单克隆抗体与Polθ抑制剂结合，利用抗原—抗体特异性结合的原理，找到肿瘤细胞，抗体与肿瘤细胞特异性结合后释放Polθ抑制剂，特异性抑制肿瘤细胞DNA断裂后的修复。
[答案] (1)磷酸二酯 碱基互补配对原则 (2)催化合成DNA子链 引物 (3)GFP基因断裂后，模板链的碱基替换部位被切除，Polθ以含核糖核苷酸的片段为模板合成出正确的模板链，进而表达出绿色荧光蛋白GFP 逆转录 (4)将能特异性识别肿瘤细胞的单克隆抗体与Polθ抑制剂结合，抗体与肿瘤细胞特异性结合后释放Polθ抑制剂，特异性抑制肿瘤细胞DNA断裂后的修复
(教师用书独具)
1．研究表明，服用α 干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作。若限制酶EcoRⅠ识别G↓AATTC，BamHⅠ识别G↓GATCC。下列选项不正确的是( )
A．步骤①中，利用 PCR 技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列
B．在过程③中T DNA 整合到受体细胞的染色体 DNA 上
C．科研人员在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC 序列，目的是方便后续的剪切和连接
D．过程④中，科研人员最终未能检测出干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞
B [步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列，A正确；在过程③将重组质粒导入根瘤农杆菌，而在侵染人参愈伤组织细胞时，T DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，B错误；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接，C正确；干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞，这会导致通过该方法不能检测出干扰素基因，D正确。]
2．(2022·山东聊城一模)克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆，治疗性克隆有希望最终解决供体器官短缺和器官移植出现的排异反应，如图表示治疗性克隆的过程。下列叙述正确的是( )
A．上述过程利用了核移植和胚胎移植技术
B．①、②过程不进行DNA复制和蛋白质的合成
C．胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
D．治疗性克隆解决了器官移植的排异反应，已成为目前器官移植的常用手段
C [结合图示可知，该过程中没有用到胚胎移植，A错误；①、②过程进行有丝分裂和分化，需要进行DNA复制和蛋白质的合成，B错误；动物细胞培养需要在CO2培养箱中进行，C正确；治疗性克隆的细胞来源于自身的细胞，不会产生排异反应，但目前没有成为器官移植的常用手段，D错误。]
3．(2022·广东韶关高三测试)早在新冠病毒感染发生初期，我国就布局了5条疫苗研发的技术路线，包括了灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、减毒流感病毒载体疫苗和核酸疫苗。当前我国全民免费接种的主要是灭活疫苗；而科学家陈薇院士团队自主研制腺病毒载体疫苗具有安全、高效、引发的不良反应少的优点。如图所示为科学家陈薇教授团队研制腺病毒载体疫苗的原理。
(1)如图所示过程中必须用到的酶有________________，腺病毒的作用是____________。
(2)获取目的S蛋白基因是各种疫苗研制途径需要解决的首要问题，通常采用以下两种方法，一是利用____________________________后，PCR技术扩增得到基因S；二是完成________________后，直接人工合成基因S。
(3)新冠病毒检测采用RT PCR技术与荧光定量PCR结合，其中荧光定量PCR技术是将得到的DNA进行大量复制，再使用____________对复制得到的DNA进行检测，并进行荧光标记，该过程利用了____________的原理。
[解析] (1)据图可知，②表示RNA逆转录形成cDNA，需要逆转录酶；④表示基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶。S蛋白基因与腺病毒重组形成新冠疫苗(基因表达载体)，因此腺病毒属于载体，其作用是目的基因的“分子运输车”。(2)目的基因获取方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成，新冠病毒感染发生初期还没有建立相应的基因文库，不能从基因文库中获取，因此通常采用PCR技术扩增和人工合成。利用PCR扩增时，首先提取得到病毒的RNA，然后逆转录形成cDNA，再用PCR技术扩增得到基因S；在人工合成时，首先进行病毒的S基因测序，然后直接人工合成基因S。(3)新冠病毒核酸检测主要用荧光定量RT PCR技术，这种技术是荧光定量PCR技术与RT PCR技术的结合。在检测过程中，先采用RT PCR技术将新冠病毒的核酸(RNA)逆转录为对应的脱氧核糖核酸(DNA)；再采用荧光定量PCR技术，将得到的DNA进行大量复制，同时，使用特异性探针对复制得到的DNA进行检测，打上标记。如果存在新冠病毒核酸，仪器就可以检测到荧光信号，而且，随着DNA的不断复制，荧光信号不断增强，这样就间接检测到了新冠病毒的存在。该过程利用了分子杂交技术。
[答案] (1)逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 目的基因(S蛋白基因)载体(或目的基因的“分子运输车”) (2)病毒的RNA，逆转录得到DNA 病毒的S基因测序 (3)特异性探针 分子杂交技术
4．(2022·重庆一中模拟)生菜的颜色受两对等位基因A/a和B/b控制。野生生菜通常为绿色，遭遇逆境时合成花青素，使叶片变为红色，人工栽培的生菜品种在各种环境下均为绿色。用野生型红色生菜与人工栽培的绿色生菜杂交得到F1，F1自交得到F2，F2中有7/16的个体始终为绿色。育种工作者根据A/a、B/b的基因序列设计特异性引物，分别对F2中部分红色植株的DNA进行PCR扩增，结果如图所示。下列分析错误的是( )
A．人工栽培的生菜均为绿色的根本原因可能是不含有合成红色花青素的基因
B．基因型为A_B_的生菜可能为红色，红色生菜光合作用可能较弱
C．由图中扩增结果可知，编号1到8的红色生菜中杂合植株所占比例为3/8
D．F2中的红色生菜植株自交，若后代在适宜环境下生长发育，则绿色植株所占比例会增大
C [人工栽培的生菜均为绿色的根本原因可能是不含有合成红色花青素的基因，所以不能合成红色花青素，A正确；光合色素主要吸收红光和蓝紫光，红色生菜对红光吸收的少反射的多，故光合作用可能较弱，B正确；由题图中扩增结果可知，编号1到8的红色生菜中，植株3、5的A/a、B/b的基因扩增结果都只有一条带，可知3号和5号的基因是纯合的，其他都是杂合植株，所以杂合植株所占比例为3/4，C错误；F2中的红色生菜植株自交，因为后代在适宜环境下生长发育，而不是在逆境中，所以绿色植株所占比例会增大，D正确。]
5．(2023·广东惠州检测)从图1酶切结果分析，图2中目的基因(长度为2.0 kb)插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是( )
图1
图2
A．①，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ和HindⅢ
C．②，EcoRⅠ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ
B [根据题图分析可知，重组质粒①被EcoRⅠ酶切后，能得到5.8 kb的片段，被BamHⅠ酶切后能产生3.8 kb和2.0 kb两种片段，被EcoRⅠ和HindⅢ两种限制酶同时酶切后，能产生4.5 kb和1.3 kb的片段。而重组质粒②被EcoRⅠ和HindⅢ两种限制酶同时酶切后，产生的片段为2.3 kb和3.5 kb，与图1酶切结果不符合。综上所述，B正确，A、C、D错误。]
课时分层作业(三十九) 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题(2)
1．(2022·北京海淀区高三期中)RNase P是一种内切核酸酶，由RNA和蛋白质组成。无活性的RNase P通过与前体tRNA特异性结合被激活，激活的RNase P剪切前体tRNA，所得的成熟tRNA进入细胞质基质中发挥作用。以下关于RNase P分析不正确的是( )
A．通过破坏磷酸二酯键剪切前体tRNA
B．RNase P能够催化tRNA基因的转录
C．RNase P可能存在于细胞核或某些细胞器中
D．pH、温度都会影响RNase P的活性
B [RNase P是一种内切核酸酶，因此通过破坏磷酸二酯键剪切前体tRNA，A正确；内切核酸酶RNase P能对tRNA前体进行剪切加工，不能催化转录过程，催化转录过程中的酶是RNA聚合酶，B错误；因为线粒体和叶绿体也可以进行基因表达，因此RNase P可能存在于细胞核或某些细胞器中，C正确；pH、温度都会影响酶活性，因此也会影响RNase P的活性，D正确。]
2．(2022·山东济南高三测试)为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增，具体过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A．巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强
B．两套引物需进行两次PCR，由于和两套引物都互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性
C．内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定
D．如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加
D [巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，包括5种基本成分，依次为：引物、耐高温的DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2+，但扩增产物比常规PCR特异性更强，A正确；巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性获得的产物特异性更强，B正确；内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率减小，C正确，D错误。]
3．(2022·辽宁葫芦岛一模)如图是利用重组DNA技术生产能降解农药马拉硫磷的CarE制剂的流程。下列叙述正确的是( )
A．过程①是在小菜蛾细胞的细胞核中进行的
B．过程②获取的CarE基因中不含有启动子和终止子
C．重组DNA技术的核心是将CarE基因导入受体细胞
D．重组表达载体的制备过程中需要限制酶和DNA聚合酶
B [过程①表示通过逆转录合成相应的DNA，该过程是在生物体外进行的，不是在小菜蛾细胞的细胞核中进行的，A错误；过程②获取的CarE基因是以mRNA为模板通过逆转录合成的，因此CarE基因中不含有启动子和终止子，B正确；重组DNA技术的核心是构建含CarE基因的重组表达载体，C 错误；重组表达载体的制备过程中，需要限制酶切割含有CarE基因的DNA片段与载体，然后用DNA连接酶将CarE基因片段拼接到载体的切口处，D错误。]
4．(2022·山东济宁二模)OsGLOl、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示)，利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列叙述正确的是( )
A．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译
B．OsGLOl、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板
C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞
D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况
D [由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，A错误；由题图可知，在同一个T DNA中OsGLOl基因和EcCAT基因的启动子启动转录的方向不同，因此OsGLOl、EcCAT基因转录时不是以DNA的同一条单链为模板，B错误；卡那霉素抗性基因不在T DNA中，而潮霉素抗性基因在T DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，D正确。]
5．(2022·湖北武汉二模)为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现经常将两种或两种以上Bt毒蛋白基因同时转入棉花。②田间策略：主要是为棉铃虫提供庇护所。例如我国长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。关于上述策略，下列叙述错误的是( )
A．转入多种Bt毒蛋白基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
B．转基因棉田周围种植非抗虫棉，可降低棉铃虫抗性基因的突变率
C．为棉铃虫提供庇护所，可使敏感型棉铃虫在种群中维持一定比例
D．为棉铃虫提供庇护所，可使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
B [由于棉铃虫基因突变频率低且不定向，转入多种Bt毒蛋白基因可以降低棉铃虫抗Bt毒蛋白的能力，从而提高抗虫持久性，A正确；基因突变可以自发发生，且具有不定向性，突变频率与环境没有直接关系，所以在转基因棉田周围种植非抗虫棉，不能降低棉铃虫抗性基因的突变率，但可以降低抗性基因的基因频率升高的速度，B错误；在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供庇护所，使敏感型的个体可以生存，在种群中维持一定比例，C正确；为棉铃虫提供庇护所，使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存，由于二者之间存在种内竞争，因此使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓，D正确。]
6．(2022·山东菏泽高三一模)水稻胚乳含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系
第十单元 生物技术与工程
第4讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
考点1 重组DNA技术的基本工具
一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
二、基本工具
1．限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)作用特点：具有专一性，表现在两个方面
①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)作用结果：产生黏性末端或平末端。
①
②
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将限制酶切割下来的DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)类型
常用类型 E．coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)作用：将外源基因送入受体细胞。
(2)常用载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。
(3)最常用载体：质粒。
①本质：裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②特点
1．用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？(选择性必修3 P71“文字信息”)
提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。(选择性必修3 P72“旁栏思考”)
提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
3．限制酶不切割细菌本身的DNA分子，其原因是什么？(选择性必修3 P74“拓展应用”)
提示：含有某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌含有某种限制酶，它本身的DNA也不会被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
1．基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的。 (√)
2．重组DNA技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 (×)
提示：重组DNA技术的基本工具有限制酶、DNA连接酶和载体。
3．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 (×)
提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 (√)
5．做载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (√)
6．DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在－4 ℃冰箱中放置几分钟。 (×)
提示：DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在4 ℃冰箱中放置几分钟。
1．实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是_____________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害
2．用T4 DNA连接酶构建基因表达载体时，研究人员常选用能产生黏性末端的限制酶，理由是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：T4 DNA连接酶连接黏性末端的效率高于连接平末端的效率
1．与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
2．限制酶的选择方法
图甲 图乙
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，与图乙所示质粒连接。
1．CRISPR—Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫SgRNA)和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，原理如图所示。
CRISPR－Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，试分析脱靶最可能原因。
提示：其他DNA序列也含有与向导RNA(SgRNA)互补配对序列 ，造成向导RNA(SgRNA)错误结合而脱靶，而且SgRNA的序列越短，脱靶率会越高。
2．限制性内切核酸酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
提示：
基因工程工具酶的应用
1．(2022·山东济南模拟)如表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断的以下说法中，正确的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ ↓ GGATCC KpnⅠ ↓ GGTACC
EcoRⅠ ↓ GAATTC Sau3AⅠ ↓ GATC
HindⅠ ↓ GTYRAC SmaⅠ ↓ CCCGGG
(注：Y＝C或T，R＝A或G。)
A．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B．限制酶切割后一定形成黏性末端
C．不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端
D．限制酶的切割位点在识别序列内部
C [由图可知，由于Y＝C或T，R＝A或G，因此HindⅠ可以识别多种核苷酸序列，A错误；限制酶切割后可能形成黏性末端或平末端，B错误；不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C正确；限制酶的切割位点在识别序列内部或外部，如Sau3AⅠ，D错误。]
基因工程载体的应用
2．(2022·北京朝阳区二模)农杆菌特有的T DNA能够提高其对宿主细胞的转化，进而使宿主长出冠瘿瘤。如图为T DNA上的部分结构，有关分析错误的是( )
A．T DNA是Ti质粒上特有的序列，在基因工程中广泛应用
B．T DNA整合到宿主细胞基因组DNA上可能会导致基因突变
C．T DNA结构的完整性是诱导宿主植株产生冠瘿瘤的重要条件
D．农杆菌通过改变植物激素的种类与比例诱导细胞的分化方向
A [T DNA是农杆菌特有的序列，该序列可存在于农杆菌所有DNA中，不是Ti质粒所特有的，A错误；基因突变是指DNA分子中碱基对的增添、替换和缺失而引起基因结构的改变，故T DNA整合到宿主细胞基因组DNA上可能会导致基因突变，B正确；基因的结构决定功能，基因要表达功能应保证其具有完整性，故T DNA结构的完整性是诱导宿主植株产生冠瘿瘤的重要条件，C正确；据图可知，重组质粒上有生长素合成基因和细胞分裂素合成基因，两者比例不同可决定植物根或茎的分化，D正确。]
考点2 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效地方法之一。
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
(3)PCR反应过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
1．PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是什么？(选择性必修3 P78“图3－5”)
提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
2．研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。(选择性必修3 P83“拓展应用”)
提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入或者同一染色体多位点插入或者不同染色体多位点插入。外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (√)
2．Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (√)
3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (×)
提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
4．PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 (√)
5．随着转化方法的研究，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 (√)
6．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (√)
1．为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，其作用在于_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：当诱导物存在时，激活或抑制目的基因的表达
2．如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是__________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因，相当于杂合子
1．目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2．筛选出含有目的基因的受体细胞的方法——载体表型选择法
(1)方法1(如图)
①原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
②被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
③筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，图中能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
(2)方法2：β 半乳糖苷酶显色反应选择法
β 半乳糖苷酶显色反应选择法，即我们常说的蓝白斑筛选法，也是一种常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。这种检测方法用到的载体上有LacZ基因，其表达产物为无活性的α肽段。受体细胞可以合成无活性的ω肽段。α肽段与ω肽段结合后可以产生有活性的β 半乳糖苷酶，该酶能将无色的5 溴 4 氯 3 吲哚 β D 半乳糖苷(X gal)水解成蓝色产物。如果目的基因插入LacZ基因的多克隆位点，重组载体转入受体细胞后就不能产生β 半乳糖苷酶，X gal也就无法水解成蓝色产物，因此在筛选平板上含有重组载体的菌落呈白色。
3．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过逆转录或人工方法合成的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，构建基因表达载体时，需要与质粒结合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
1．设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
(1)第1组：__________________________________；
(2)第2组：________________________________。
提示：(1)引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 (2)引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2．研究人员利用基因工程技术将油料作物紫苏DGAT1基因导入四尾栅藻，获得转基因的产油微藻，利用地热废水培养，不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。为检测转基因四尾栅藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如表。
指标 总氮(mg/L) 总磷(mg/L) 氟化物(mg/L)
废水培养基 23.2 4.32 4.56
培养转基因四尾栅藻11天后 1.9 0.45 0.84
该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，请进一步完善实验设计。
实验设计：
提示：应添加对照组：废水培养非转基因四尾栅藻11天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。
考查目的基因的获取
1．(2022·江苏苏州模拟)递减PCR是常规PCR技术的发展，如图表示递减PCR各阶段温度及时间控制。相关叙述错误的是( )
A．PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物、缓冲液等物质
B．第1阶段的目的是使模板DNA充分解旋，减少DNA复杂结构对扩增的影响
C．第2阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板
D．第4阶段72 ℃下维持10 min ，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋
D [结合题意分析可知，PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶(催化DNA子链的形成)、模板DNA、dNTP(原料)、引物、缓冲液等物质，A正确；据图可知，第1阶段是在96 ℃条件下处理4 min，该阶段的目的是使模板DNA在高温下充分解旋，得到单链DNA，以减少DNA复杂结构对扩增的影响，B正确；引物的碱基数量越少变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，故第2阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板，C正确；72 ℃下维持10 min，主要目的是使引物链延伸，以形成新的脱氧核苷酸链，D错误。]
考查基因工程的基本操作程序
2．(2022·湖北华中师大一附中模拟)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列叙述错误的是( )
A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因
B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C．在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞
D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
C [由图可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，A正确；图中质粒与ACA－GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞为成功转入目的基因的细胞或含有普通质粒的细胞，C错误；PCR技术，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，即用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，D正确。]
3．(2023·广东广州六校联考)图1表示新型冠状病毒的结构示意图，其中蛋白S(刺突糖蛋白)通过与人体黏膜细胞表面的ACE2受体结合而进入细胞，蛋白M能刺激机体产生免疫反应；图2表示科研人员研制新冠疫苗的一条技术路线。请据图回答下列问题。
图1
图2
(1)蛋白S和ACE2受体的化学本质________(填“相同”或“不同”)，蛋白M在免疫过程中属于________。
(2)图2中，过程①需要的一种特殊酶是________。过程②是基因工程的核心，形成的重组DNA中含有的组件包括______________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
(3)过程③需要用________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种____________________的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
(4)疫苗Ⅱ导入实验动物体内，________(填“一定”或“不一定”)能引起免疫反应，理由是__________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)新型冠状病毒的蛋白S是糖蛋白，细胞膜上的受体也是糖蛋白，所以两者的化学本质相同。新型冠状病毒的蛋白M可以引起人体发生免疫反应，所以在免疫过程中蛋白M属于抗原。(2)过程①指的是通过逆转录获得目的基因的过程，该过程需要逆转录酶。重组DNA中包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点等组件。(3)将目的基因导入微生物时，需要先用Ca2+处理微生物，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(4)疫苗Ⅱ中的有效成分是DNA，而DNA不能充当抗原，只有表达出蛋白M才能引起免疫反应。目的基因导入动物体内后还需要进行检测，确定目的基因是否表达。
[答案] (1)相同 抗原 (2)逆转录酶 目的基因、标记基因，启动子，终止子、复制原点(答出任意2点即可) (3)Ca2+(或CaCl2) 能吸收周围环境中DNA分子 (4)不一定 疫苗Ⅱ含有能表达出蛋白M的基因，该基因在动物体内只有表达出蛋白M才能引起免疫反应，目的基因导入动物体内不一定能够表达，需要进行进一步的检测(答案合理即可)
考点3 基因工程的应用及蛋白质工程
一、基因工程的应用
二、蛋白质工程
1．概念
(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
(2)手段：改造或合成基因。
(3)结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
2．流程图
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B．翻译，C．分子设计，D．多肽链，E．预期功能。
3．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
(2)其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食的产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
1．利用大肠杆菌可生产出重组人胰岛素，联系前面细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的胰岛素，可用大肠杆菌吗？(选择性必修3 P87“从社会中来”)
提示：不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。
2．野外种植转基因抗A害虫植物的同时，还种植一定量的同种不抗虫植物，可降低抗性害虫在整个害虫种群中所占比例的增加速率。试分析其中的原因。(选择性必修3 P88“文字信息”)
提示：种植一定量的同种不抗虫植物，对抗性害虫的选择作用减弱。
3．对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？ 原因是什么？(选择性必修3 P93“文字信息”)
提示：通过对基因的操作来实现基因控制蛋白质的合成。基因能遗传给下一代。
1．转基因抗病农作物不需要使用农药。 (×)
提示：转基因抗病农作物减少了农药的使用。
2．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物。 (√)
3．利用基因工程技术，将人胰岛素的基因转入大肠杆菌后，大肠杆菌内表达出的胰岛素与人的胰岛素结构相同。 (×)
提示：大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体对核糖体产生的肽链进行加工，故表达出的胰岛素与人的胰岛素结构不同。
4．蛋白质工程常借助计算机建立蛋白质的三维结构模型。 (√)
5．对蛋白质的结构设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 (√)
6．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 (√)
1．用膀胱生物反应器也能生产干扰素，与乳腺生物反应器相比，其优势是____
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
提示：不受年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效
2．利用转基因技术培育的抗虫、耐除草剂转基因玉米成为农业害虫控制和杂草防除的有效手段，其优点有
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：能够有效减少化学药剂的施用，降低人工成本，提高玉米产量和品质，有利于保护生态环境和生物多样性
1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
2．蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目 蛋白质工程 基因工程
基本思路或过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
1．结核病是由结核分枝杆菌(简称结核菌)引起的致死性疾病，接种卡介苗是预防结核病的有效手段。近年来，耐药结核病不断出现。我国科研者研制出了一种重组耐药卡介苗(RdrBCG)，即在原有卡介苗的基础上引入Ag85B和Rv2628两个新的基因，用于辅助治疗耐药结核病。
在重组质粒建构过程中，使用到了限制酶PstⅠ。结合图示所给酶切位点(灰色底色)等信息，写出重组质粒的制备过程。
提示：将Rv2628与质粒混合，加入限制酶PstⅠ和NdeⅠ后，再加入DNA连接酶形成重组质粒1，再将重组质粒1与Ag85B混合，加入限制酶BamHⅠ和HindⅢ，再加入DNA连接酶形成如图所示的重组质粒。
2．通过对Bt蛋白质三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，写出其实验设计思路。
实验设计思路：
提示：参照密码子表，找到合成该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。
考查基因工程的应用
1．(2023·广东广州联考)肿瘤坏死因子(TNF)在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖作用。科研人员利用乳腺生物反应器大量生产肿瘤坏死因子。已知限制酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ的识别序列及切点分别是、、、。回答下列问题：
图1
图2
(1)在构建基因表达载体时，________(填“能”或“不能”)选用PstⅠ切割质粒和含肿瘤坏死因子基因的DNA片段，其原因是____________________；若用HindⅢ和BglⅡ切割含肿瘤坏死因子基因的DNA片段，除选用HindⅢ和BglⅡ组合外还可以选用____________________组合切割质粒。
(2)利用PCR技术扩增TNF基因时，扩增过程可以在________中自动完成。已知DNA复制时，只能从子链的5′端向3′端开始延伸，据此可知应选择下图甲、乙、丙、丁四种引物中的________作为引物，若扩增4次，共需要引物________个。
科学家需将TNF基因与______________重组在一起，通过____________等方法，导入哺乳动物的____________中，由其发育成的转基因动物进入泌乳期后，可以在其分泌的乳汁中获取所需要的TNF。
[答案] (1)不能 用PstⅠ切割质粒会破坏四环素抗性基因 HindⅢ、BamHⅠ (2)PCR仪 乙、丙 30 乳腺细胞中特异表达的基因的启动子等调控元件 显微注射 受精卵
(教师用书独具)
(2022·山东临沂二模)甜柿鲜果肉中含丰富的可溶性糖、微量元素、维生素和β 胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者喜爱。甜柿自然脱涩的涩味程度与乙醛代谢关键酶基因(PDC)的表达情况有关。为筛选PDC基因调控蛋白，科研人员利用质粒A和质粒G(如图1、图2所示)，进行了相关研究。
图2
图3
(1)启动子位于基因首端，存在RNA聚合酶和多种调控蛋白的结合位点，共同影响基因的表达。PDC基因的启动子序列未知，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在__________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据__________和PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增。再将扩增所得PDC基因启动子与质粒A连接并导入代谢缺陷型酵母菌，可用__________的培养基筛选出成功转化的酵母菌Y1。
(2)已知质粒G上的AD基因表达出的AD蛋白与待测蛋白结合形成的融合蛋白足够靠近启动子时，才能够激活后续基因的转录。现从甜柿中提取的总mRNA经________过程合成不同片段的cDNA，然后分别插入质粒G中的________(填序号1～5)位点以获得不同的重组质粒(G1、G2……)，理由是______________
_____________________________________________________________________。
(3)已知插入的不同cDNA片段指导合成不同的待测蛋白，只有待测蛋白为PDC基因调控蛋白时，与AD蛋白形成的融合蛋白才能激活PDC基因启动子。请结合上述实验过程和图3，完善筛选PDC基因调控蛋白的实验思路及预期结果。
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
筛选得到PDC基因调控蛋白在农业生产中的应用前景是___________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)该操作为目的基因和载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接，即在DNA连接酶的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游；体外扩增基因常用的方法是PCR技术，DNA复制常需要引物，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物；由质粒A的图谱可知，带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则用不含尿嘧啶的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1。(2)科研人员从甜柿中提取mRNA，逆转录形成的各种cDNA；将cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，cDNA片段要插入启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因，故选择2作为cDNA的插入位点。(3)要筛选PDC基因调控蛋白，可将携带不同 cDNA 片段的重组质粒 G1 、G2……分别导入酵母菌 Y1 中，然后分别置于含金担子素的培养基上培养。若能在培养基上生长，则该酵母菌含有的cDNA 所表达的蛋白质即为 PDC 基因调控蛋白；甜柿自然脱涩的涩味程度与乙醛代谢关键酶基因(PDC)的表达情况有关，可通过改变调控蛋白的表达量进而调控 PDC 基因的表达，达到控制甜柿的自然脱涩进程的目的。
[答案] (1)DNA连接酶 接头片段 不含尿嘧啶 (2)逆转录(或反转录) 2 插入位点需要在AD基因的启动子和终止子之间，且不能破坏AD基因 (3)实验思路：将携带不同cDNA片段的重组质粒G1 、G2……分别导入酵母菌 Y1 中，然后分别置于含金担子素的培养基上培养。预期结果：若能在培养基上生长，则该酵母菌含有的cDNA 所表达的蛋白质即为 PDC 基因调控蛋白 可通过改变调控蛋白的表达量进而调控 PDC 基因的表达，达到控制甜柿的自然脱涩进程的目的
考查蛋白质工程及应用
2．(2021·辽宁选择性考试)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
D [在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其与底物分别置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。]
考点4 (探究·实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．实验步骤
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
2．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1_mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．DNA粗提取中的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。
1．如图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是( )
① ② ③ ④
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌的目的相同
C．若图③操作后接图②操作，则DNA留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA留在纱布上
B [图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻璃棒搅拌的目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒搅拌的目的是溶解细胞核内的DNA，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。]
2．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B [低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。]
3．(2022·山东济南三模)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因(Wx)编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5′－GCTTCACTTCTCTGCTTGTG－3′，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列叙述正确的是( )
高直链淀粉含量(GG)和中等直链淀粉含量(TT)水稻品种中蜡质基因部分DNA顺序
A．该实验中需设计的引物2为5′－TTCAACTCT CGTTAAATCAT－3′
B．若酶切产物只能观察到450 bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型
C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带
D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
C [由引物1的碱基序列及图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5′－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3′，A错误。若酶切产物只能观察到450 bp的DNA条带，则表明第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，该水稻品种为GG型，B错误。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，C正确。组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同，D错误。]
考点5 生物技术的安全性与伦理问题
一、转基因成果
1．基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域是对微生物的基因改造。
2．转基因动物方面，科学家将生长激素基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内，培育了一批生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜。
3．转基因植物方面，目前已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物。种植转基因植物面积较大的国家有美国、巴西、阿根廷、加拿大等；种植的转基因作物中大豆和玉米最多，其次是棉花和油菜。
二、对转基因产品安全性的争论
三、理性看待转基因技术
1．需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
2．应看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
3．要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
四、关注生殖性克隆人
1．生殖性克隆：指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
2．治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
3．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
五、禁止生物武器
1．种类：致病菌类、病毒类、生化毒剂类等。
2．中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．将来自玉米的α 淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以防止转基因花粉传播的原因是什么？(选择性必修3 P102“相关信息”)
提示：由于α 淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。
2．我国科学家用4种小分子化合物诱导小鼠的成纤维细胞转变成了iPS细胞，这种诱导方法与转入转录因子诱导产生iPS细胞相比，其优点是什么？(选择性必修3 P108“文字信息”)
提示：避免了转入转录因子诱导iPS细胞可能带来的致癌风险。
3．有一种神秘的“X疾病(Disease X)”，它是由未知病原体造成的大规模流行性疾病，一旦暴发可能导致数百万人死亡。你认为这种未知病原体的来源可能有哪些？(选择性必修3 P113“拓展应用”)
提示：这种未知病原体可能来自其他动物或者高科技实验室、由某些科学家制造出来，还有可能是在自然界中经过突变产生的。
1．转基因技术已被用于减少啤酒酵母双乙酰的生成。 (√)
2．理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 (√)
3．可以运用重组DNA技术进行生殖性克隆人研究。 (×)
提示：不允许任何人进行生殖性克隆人研究。
4．生物武器仅包括病毒类。 (×)
提示：生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
5．提供骨髓中的造血干细胞并不会对婴儿的健康造成损伤。 (√)
6．克隆动物实验存在流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。 (√)
1．转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是什么？
_____________________________________________________________________。
提示：叶绿体基因不会通过花粉传给下一代
2．治疗性克隆获得的组织器官在移植时一般不会出现排异反应，其根本原因是什么？_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：治疗性克隆获得的组织和器官的绝大多数遗传物质和患者相同
1．关注转基因生物的优缺点
优点 缺点
(1)解决粮食短缺问题 (2)减少农药使用，从而减少环境污染 (3)节省生产成本，降低粮食售价 (4)增加食物营养，提高附加价值 (5)增加食物种类，提升食物品质 (6)提高生产效率，带动相关产业发展 (1)可能产生新病毒和新的过敏原 (2)可能产生抗除草剂的杂草 (3)可能使疾病的传播跨越物种障碍 (4)可能会损害生物多样性 (5)可能干扰生态系统的稳定性
2．比较试管婴儿和设计试管婴儿
(1)试管婴儿和设计试管婴儿过程(如图所示)
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
项目 试管婴儿 设计试管婴儿
不同点 技术手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断
应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、贫血症等遗传疾病的预防及治疗
相同点 二者都是体外受精、体外进行早期胚胎培养，再经过胚胎移植，从生殖方式上都为有性生殖
2017年8月，科学家运用基因组编辑技术在人类的早期胚胎中修正了与肥厚型心肌病发生相关的基因MYBPC3的突变，使胚胎携带正常MYBPC3基因的概率提高了20%左右。你认为该不该允许对人类胚胎进行基因组编辑的相关研究？请说出你的理由。
提示：不允许。由于目前该技术存在一系列安全风险和伦理问题，如可能会出现“设计婴儿”，“基因脱靶”问题，导入基因与细胞内原有基因相互作用的问题，病毒基因植入问题，因此应禁止将对胚胎细胞进行基因编辑的技术应用于临床。
考查生物技术的安全性问题
1．下面关于生物武器的叙述，错误的是( )
A．世界各国都应当禁止在任何情况下生产、储存和发展生物武器
B．生物武器利用致病菌、病毒、生化毒剂、干扰素及重组致病菌等形成杀伤力
C．生物武器传染性强、作用范围广，应严格禁止
D．消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面
B [干扰素为细胞因子，非生物武器，B错误。]
(教师用书独具)
(2022·山东泰安三模)植物生物反应器主要以整株植物、植物组织或植物悬浮细胞为加工场所，生产药物蛋白。叶绿体遗传转化体系是近几年发展起来的一种新的植物生物反应器。叶绿体转化是以同源重组原理将外源目的基因整合到目标叶绿体基因组中的一种方式，是一种高表达、安全性极高的遗传转化方法。下列相关叙述不正确的是( )
A．植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程
B．构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达
C．植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散
D．把目的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子一定含有此目的基因
D [植物生物反应器首先需要用基因工程技术将目的基因导入植物细胞，其次需要采用植物细胞工程技术将转基因植物细胞培育成转基因植株或转基因植物组织或转基因植物悬浮细胞，因此涉及基因工程和植物细胞工程技术，A正确；要使得目的基因只能在叶绿体中表达，则构建的基因表达载体中要含有叶绿体特异性启动子，B正确；由于受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，因此植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散，C正确；把该基因导入叶绿体DNA中，叶绿体DNA存在于细胞质中，在配子产生过程中并不遵循遗传定律，所以将来产生的配子中不一定含有抗病基因，D错误。]
考查生物技术的伦理问题
2．(2022·湖北华中师大一附中模拟预测)当前生物技术发展非常迅猛，很多生物技术的应用已经与我们的日常生活密切相关。下列有关生物技术的说法或做法正确的是( )
A．设计试管婴儿是指通过遗传咨询有选择地生育优良性状的小孩
B．在我国，通过生殖性克隆有可能解决一些夫妇不孕不育的问题
C．胚胎工程繁育良种时，供体和受体母畜都要进行同期发情处理
D．对囊胚进行胚胎分割时，必须对整个胚胎进行均等分割
C [设计试管婴儿是指通过胚胎移植前对胚胎进行遗传学诊断有选择地生育符合特殊要求的小孩，通过遗传咨询有选择地生育优良性状的小孩能降低遗传病的发生概率，A错误；在我国，通过试管婴儿技术有可能解决一些夫妇不孕不育的问题，B错误；胚胎工程繁育良种时，供体和受体母畜都要进行同期发情处理，保证胚胎移植前后生理环境的相同，C正确；对囊胚进行胚胎分割时，必须对内细胞团进行均等分割，D错误。]
3．(2022·辽宁沈阳模拟预测)下列关于生物技术安全性和伦理问题的叙述，正确的是( )
A．基因身份证含有致病基因和易感基因等涉及个人敏感基因的信息
B．生物武器种类包括致病菌、干扰素、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌
C．抗除草剂基因通过花粉传播到杂草形成“超级杂草”会造成食物安全问题
D．国际上大多数国家在转基因食品标签上都有警示性标记，并注明可能的危害
A [基因身份证是指把个人的致病基因和易感基因检测出来，记录在磁卡上，做成个人基因身份证，A正确；生物武器种类包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等，干扰素不属于生物武器，B错误；抗除草剂基因通过花粉传播到杂草形成“超级杂草”会影响生物多样性，会造成生物安全问题，C错误；转基因食品上只标明原料来自转基因生物，并未标明其危害，D错误。]
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P72)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(3)(选择性必修3 P76)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(4)(选择性必修3 P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(5)(选择性必修3 P84)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 (6)(选择性必修3 P106)生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
2．结论语句
(1)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(2)(选择性必修3 P72)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(3)(选择性必修3 P74)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须含有启动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P84)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(7)(选择性必修3 P93)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
(8)(选择性必修3 P94)对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(9)(选择性必修3 P103)理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(10)(选择性必修3 P107)我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
1．(2022·全国乙卷改编)新冠病毒感染出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疾病防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是____________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明_____________(答出一种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是___________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(超过90 ℃)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒(或注射过新冠疫苗)，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体结合的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)。
[答案] (1)逆转录酶(或反转录酶) (2)特异性核苷酸序列 复性 (3)曾感染新冠病毒，已康复(或注射过新冠疫苗) 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与载体结合的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
2．(2021·福建选择性考试)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为________。
图1
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用________酶将载体P切开，再用________(填“T4 DNA”或“E．coli DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的________和________。选用________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_______________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
图2
[解析] (1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ酶将载体P切开；由于E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
[答案] (1)引物1和引物4 (2)EcoRⅤ T4 DNA 启动子 终止子 XhoⅠ和PstⅠ 钙 (3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
3．(2021·广东选择性考试)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高生产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有________________(答出两种即可)。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有______________(答出两种即可)。
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备____________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是_________________。在分子水平上，可以通过改变____________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[解析] (1)获得目的基因的方法除PCR技术外，还有从基因文库中获取、人工合成等方法。(2)蛋白酶可分解蛋白质，但不会分解DNA；蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性，因此在制备高质量的DNA模板时，去除蛋白可采用酶解法或高温处理。(3)将大肠杆菌作为基因工程的受体细胞时，首先应用Ca2+处理，使其成为能吸收外界DNA的感受态细胞。检测目的基因是否成功表达出酶蛋白可采用抗原—抗体杂交技术。(4)酶的作用条件有适宜的温度、pH等，温度过低，酶的活性会降低，温度过高、强酸或强碱的情况下，酶的活性会降低甚至失活，依据题图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系，这4种酶的最适反应条件不同，会导致可溶性淀粉的分解效率降低。可通过蛋白质工程实现对酶特性的改造和优化，在分子水平上，改变酶相应基因的碱基序列，从而改变酶蛋白的结构，最终实现优化酶特性的目的。
[答案] (1)从基因文库中获取、人工合成 (2)酶解法(使用蛋白酶进行水解)、高温处理 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)可溶性淀粉的分解效率降低 酶相应基因的碱基序列
(教师用书独具)
(2020·江苏高考改编)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种___________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；耐高温的DNA聚合酶的作用是催化________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是____________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′ AACTATGCGCTCATGA 3′ ②5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′ ③5′ AGAGGCTACGCATTGC 3′ ④5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′ AACTATGCG┈┈AGCCCTT 3′
B．5′ AATTCCATG┈┈CTGAATT 3′
C．5′ GCAATGCGT┈┈TCGGGAA 3′
D．5′ TTGATACGC┈┈CGAGTAC 3′
[解析] (1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，耐高温的DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′(引物④)和5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
[答案] (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
课时分层作业(三十八) 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题(1)
1．(2022·广东广州一模)下列有关DNA聚合酶和DNA连接酶的叙述错误的是( )
A．二者的合成需要核糖体的参与
B．二者在酵母菌的细胞核和细胞质中均发挥作用
C．二者在大肠杆菌的拟核和线粒体均有分布
D．二者所催化的反应要消耗细胞代谢产生的能量
C [DNA聚合酶和DNA连接酶的本质都是蛋白质，合成场所都是核糖体，A正确；DNA聚合酶和DNA连接酶可参与DNA复制，DNA复制的场所主要是细胞核，在细胞质的线粒体内也能进行，因此二者在酵母菌的细胞核和细胞质中均发挥作用，B正确；大肠杆菌为原核生物，不含线粒体，C错误；二者所催化的反应为DNA复制，要消耗细胞代谢产生的能量，D正确。]
2．(2022·北京房山区二模)大肠杆菌的质粒—环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是( )
A．①②③共同组成核糖核苷酸
B．质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C．DNA连接酶会使化学键④重新连接
D．若某种限制酶在质粒上只有一个酶切位点，则质粒被切为两个片段
B [①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；DNA连接酶使DNA片段重新连接，这过程形成磷酸二酯键，且磷酸二酯键是由磷酸基团与3号碳原子相连，C错误；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。]
3．(2022·湖北武汉高三模拟)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
注：PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同限制酶。
下列相关叙述错误的是( )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
D．农杆菌可将Ti质粒上的T DNA整合到白玫瑰染色体DNA上
B [靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时使用限制酶PmeⅠ，会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B错误；sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。]
4．(2022·江苏盐城三模)酵母菌报告基因的转录需要激活因子GAL4参与，它由结构功能相互独立的DNA结合域(AD)和转录激活域(BD)构成。AD、BD只有通过特定途径在空间上结合时，才能激活转录。为研究蛋白质X、Y能否特异性结合，科学家通过基因工程将蛋白质X、Y分别与酵母菌中报告基因表达所需AD、BD制成融合蛋白，通过报告基因表达情况进行分析，如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．GAL4的化学本质是蛋白质
B．该技术操作的前提是阻断酵母菌原有的AD、BD结合途径
C．若报告基因成功表达，则表明蛋白质X、Y能特异性结合
D．AD与BD结合后，发挥类似于DNA聚合酶的作用
D [蛋白质X、Y分别结合在AD、BD上形成融合蛋白，说明AD、BD都是蛋白质，即GAL4的化学本质是蛋白质，A正确；要研究蛋白质X、Y能否特异性结合，应该先阻止AD与BD的特异性结合，B正确；若报告基因成功表达了，说明AD与BD结合了，进而说明蛋白质X、Y能特异性结合，C正确；AD与BD结合后，激活的是转录过程，因此发挥的是类似于RNA聚合酶的作用，D错误。]
5．(2022·福建莆田高三质检)非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因(大小为790 bp)中间插入荧光素酶基因(Gluc基因)和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP基因)，从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒(ASFV－Gluc－EGFP)体系，如图1所示。回答下列问题：
图1
(1)构建重组病毒时用的HindⅢ和BamHⅠ都是________酶。
(2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，选用__________(引物组合)进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因__________(填“有”或“没有”)插入病毒ASFV的K基因。
M：指示分子大小的标准参照物。
1：病毒ASFV的PCR产物。
2：重组病毒的PCR产物。
图2
(3)为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞(PAMS)培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种________。支持“重组病毒成功表达”的实验结果为：____________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明______________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
[解析] (1)构建重组病毒时用的HindⅢ和BamHⅠ都是限制性内切核酸(或限制)酶，可以识别并切割特定的DNA序列。(2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，据图1分析，选用引物组合引物1和引物4进行PCR扩增可获得完整的Gluc基因和EGFP基因序列；扩增结果有1、2两种类型，如图2所示，该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因有插入病毒ASFV的K基因，因K基因大小约790 bp(类型1)，而插入成功的应大于790 bp(类型2，约1 758 bp)。(3)为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞(PAMS)培养一段时间后，平均分成A、B两组，根据对照原则，其中A组接种病毒ASFV，B组接种重组病毒。若B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性，则说明“重组病毒成功表达”。(4)科研人员分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。
[答案] (1)限制性内切核酸(或限制) (2)引物1和引物4(或引物4和引物1) 有 (3)重组病毒 B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性 (4)Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制
6．(2023·广东佛山检测)农杆菌Ti质粒上的T DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是( )
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置
C [PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置，D正确。]
7．(2022·山东潍坊高三二模)修复DNA双链断裂的细胞通路在细胞生长、发育和癌变中具有关键作用，近年科学家在哺乳动物真核细胞内发现参与此通路的一种独特的 DNA聚合酶(Polθ)。当DNA 双链发生断裂时，某些酶会在断裂处将5′端链切割(原双链DNA两端的5′端因连有特殊物质“”而避免被切割)，形成局部单链 DNA(ssDNA 悬臂)。其上某些区域的碱基可互补配对，称为微同源区。DNA 发生双链断裂后，Polθ主要承担检测和修复 DNA 双链断裂的工作，如图1表示绿色荧光蛋白基因(GFP)在受体细胞中断裂后的修复过程。GFP含有6个碱基对的微同源区段。
图1
(1)DNA双链因________键断裂而断开，两ssDNA悬臂微同源区结合依赖________。
(2)在 GFP的修复过程中，Polθ的作用具体体现在________，此时微同源区的单链片段相当于该过程中的________，科研人员发现 Polθ基因在肿瘤细胞中高表达，主要用于发挥此项作用。
(3)核糖核苷酸替换是基因组中最常见的 DNA 核苷酸损伤，即 DNA 某条链的部分脱氧核苷酸被核糖核苷酸取代。科学家将 10 个核糖核苷酸序列替换到原 GFP基因上游的非模板链，模板链进行两个碱基替换，如图2所示，将其导入受体细胞设法使其重复上述实验过程，结果仍出现了绿色荧光。
图2
①请阐述上述过程受体细胞中仍出现绿色荧光的机制：______________________
_____________________________________________________________________。
②上述过程说明 Polθ还具有类似于________酶的作用，科研人员发现 Polθ基因在正常细胞中表达，主要用于发挥此作用。
(4)结合上述信息，请利用Polθ抑制剂和单克隆抗体为研发癌症的靶点治疗提供新思路______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析] (1)结合图示，DNA双链断裂破坏的是两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键；由于碱基互补配对，两 ssDNA 悬臂微同源区能够结合。(2)结合图示可知，在Polθ的作用下，缺失的单链在延伸，因此Polθ具有催化磷酸二酯键形成的作用，使小分子脱氧核苷酸聚合形成单链，达到修复的作用；微同源区的单链片段相当于该过程中的引物(一小段DNA序列，能启动DNA单链的合成)，根据这个引物开始合成子链，按照碱基互补配对原则，合成缺失的单链。(3)模板链改变后蛋白质没有变化，说明 Polθ依然能得到正确的翻译模板，从而翻译出绿色荧光蛋白，GFP基因断裂后，模板链的碱基替换部位被切除，Polθ以含核糖核苷酸的片段为模板合成出正确的模板链(逆转录)，进而表达出绿色荧光蛋白GFP；Polθ能催化RNA→DNA的过程，说明Polθ有逆转录的作用。(4)单克隆抗体具有高度特异性，Polθ具有修复DNA的作用，而癌细胞或者肿瘤细胞也是基于改变引起的，本身不希望它们的DNA完整或DNA正常表达，此时Polθ抑制剂就能很好地发挥作用，将能特异性识别肿瘤细胞的单克隆抗体与Polθ抑制剂结合，利用抗原—抗体特异性结合的原理，找到肿瘤细胞，抗体与肿瘤细胞特异性结合后释放Polθ抑制剂，特异性抑制肿瘤细胞DNA断裂后的修复。
[答案] (1)磷酸二酯 碱基互补配对原则 (2)催化合成DNA子链 引物 (3)GFP基因断裂后，模板链的碱基替换部位被切除，Polθ以含核糖核苷酸的片段为模板合成出正确的模板链，进而表达出绿色荧光蛋白GFP 逆转录 (4)将能特异性识别肿瘤细胞的单克隆抗体与Polθ抑制剂结合，抗体与肿瘤细胞特异性结合后释放Polθ抑制剂，特异性抑制肿瘤细胞DNA断裂后的修复
(教师用书独具)
1．研究表明，服用α 干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作。若限制酶EcoRⅠ识别G↓AATTC，BamHⅠ识别G↓GATCC。下列选项不正确的是( )
A．步骤①中，利用 PCR 技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列
B．在过程③中T DNA 整合到受体细胞的染色体 DNA 上
C．科研人员在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC 序列，目的是方便后续的剪切和连接
D．过程④中，科研人员最终未能检测出干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞
B [步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列，A正确；在过程③将重组质粒导入根瘤农杆菌，而在侵染人参愈伤组织细胞时，T DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，B错误；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接，C正确；干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞，这会导致通过该方法不能检测出干扰素基因，D正确。]
2．(2022·山东聊城一模)克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆，治疗性克隆有希望最终解决供体器官短缺和器官移植出现的排异反应，如图表示治疗性克隆的过程。下列叙述正确的是( )
A．上述过程利用了核移植和胚胎移植技术
B．①、②过程不进行DNA复制和蛋白质的合成
C．胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
D．治疗性克隆解决了器官移植的排异反应，已成为目前器官移植的常用手段
C [结合图示可知，该过程中没有用到胚胎移植，A错误；①、②过程进行有丝分裂和分化，需要进行DNA复制和蛋白质的合成，B错误；动物细胞培养需要在CO2培养箱中进行，C正确；治疗性克隆的细胞来源于自身的细胞，不会产生排异反应，但目前没有成为器官移植的常用手段，D错误。]
3．(2022·广东韶关高三测试)早在新冠病毒感染发生初期，我国就布局了5条疫苗研发的技术路线，包括了灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、减毒流感病毒载体疫苗和核酸疫苗。当前我国全民免费接种的主要是灭活疫苗；而科学家陈薇院士团队自主研制腺病毒载体疫苗具有安全、高效、引发的不良反应少的优点。如图所示为科学家陈薇教授团队研制腺病毒载体疫苗的原理。
(1)如图所示过程中必须用到的酶有________________，腺病毒的作用是____________。
(2)获取目的S蛋白基因是各种疫苗研制途径需要解决的首要问题，通常采用以下两种方法，一是利用____________________________后，PCR技术扩增得到基因S；二是完成________________后，直接人工合成基因S。
(3)新冠病毒检测采用RT PCR技术与荧光定量PCR结合，其中荧光定量PCR技术是将得到的DNA进行大量复制，再使用____________对复制得到的DNA进行检测，并进行荧光标记，该过程利用了____________的原理。
[解析] (1)据图可知，②表示RNA逆转录形成cDNA，需要逆转录酶；④表示基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶。S蛋白基因与腺病毒重组形成新冠疫苗(基因表达载体)，因此腺病毒属于载体，其作用是目的基因的“分子运输车”。(2)目的基因获取方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成，新冠病毒感染发生初期还没有建立相应的基因文库，不能从基因文库中获取，因此通常采用PCR技术扩增和人工合成。利用PCR扩增时，首先提取得到病毒的RNA，然后逆转录形成cDNA，再用PCR技术扩增得到基因S；在人工合成时，首先进行病毒的S基因测序，然后直接人工合成基因S。(3)新冠病毒核酸检测主要用荧光定量RT PCR技术，这种技术是荧光定量PCR技术与RT PCR技术的结合。在检测过程中，先采用RT PCR技术将新冠病毒的核酸(RNA)逆转录为对应的脱氧核糖核酸(DNA)；再采用荧光定量PCR技术，将得到的DNA进行大量复制，同时，使用特异性探针对复制得到的DNA进行检测，打上标记。如果存在新冠病毒核酸，仪器就可以检测到荧光信号，而且，随着DNA的不断复制，荧光信号不断增强，这样就间接检测到了新冠病毒的存在。该过程利用了分子杂交技术。
[答案] (1)逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 目的基因(S蛋白基因)载体(或目的基因的“分子运输车”) (2)病毒的RNA，逆转录得到DNA 病毒的S基因测序 (3)特异性探针 分子杂交技术
4．(2022·重庆一中模拟)生菜的颜色受两对等位基因A/a和B/b控制。野生生菜通常为绿色，遭遇逆境时合成花青素，使叶片变为红色，人工栽培的生菜品种在各种环境下均为绿色。用野生型红色生菜与人工栽培的绿色生菜杂交得到F1，F1自交得到F2，F2中有7/16的个体始终为绿色。育种工作者根据A/a、B/b的基因序列设计特异性引物，分别对F2中部分红色植株的DNA进行PCR扩增，结果如图所示。下列分析错误的是( )
A．人工栽培的生菜均为绿色的根本原因可能是不含有合成红色花青素的基因
B．基因型为A_B_的生菜可能为红色，红色生菜光合作用可能较弱
C．由图中扩增结果可知，编号1到8的红色生菜中杂合植株所占比例为3/8
D．F2中的红色生菜植株自交，若后代在适宜环境下生长发育，则绿色植株所占比例会增大
C [人工栽培的生菜均为绿色的根本原因可能是不含有合成红色花青素的基因，所以不能合成红色花青素，A正确；光合色素主要吸收红光和蓝紫光，红色生菜对红光吸收的少反射的多，故光合作用可能较弱，B正确；由题图中扩增结果可知，编号1到8的红色生菜中，植株3、5的A/a、B/b的基因扩增结果都只有一条带，可知3号和5号的基因是纯合的，其他都是杂合植株，所以杂合植株所占比例为3/4，C错误；F2中的红色生菜植株自交，因为后代在适宜环境下生长发育，而不是在逆境中，所以绿色植株所占比例会增大，D正确。]
5．(2023·广东惠州检测)从图1酶切结果分析，图2中目的基因(长度为2.0 kb)插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是( )
图1
图2
A．①，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ和HindⅢ
C．②，EcoRⅠ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ
B [根据题图分析可知，重组质粒①被EcoRⅠ酶切后，能得到5.8 kb的片段，被BamHⅠ酶切后能产生3.8 kb和2.0 kb两种片段，被EcoRⅠ和HindⅢ两种限制酶同时酶切后，能产生4.5 kb和1.3 kb的片段。而重组质粒②被EcoRⅠ和HindⅢ两种限制酶同时酶切后，产生的片段为2.3 kb和3.5 kb，与图1酶切结果不符合。综上所述，B正确，A、C、D错误。]
课时分层作业(三十九) 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题(2)
1．(2022·北京海淀区高三期中)RNase P是一种内切核酸酶，由RNA和蛋白质组成。无活性的RNase P通过与前体tRNA特异性结合被激活，激活的RNase P剪切前体tRNA，所得的成熟tRNA进入细胞质基质中发挥作用。以下关于RNase P分析不正确的是( )
A．通过破坏磷酸二酯键剪切前体tRNA
B．RNase P能够催化tRNA基因的转录
C．RNase P可能存在于细胞核或某些细胞器中
D．pH、温度都会影响RNase P的活性
B [RNase P是一种内切核酸酶，因此通过破坏磷酸二酯键剪切前体tRNA，A正确；内切核酸酶RNase P能对tRNA前体进行剪切加工，不能催化转录过程，催化转录过程中的酶是RNA聚合酶，B错误；因为线粒体和叶绿体也可以进行基因表达，因此RNase P可能存在于细胞核或某些细胞器中，C正确；pH、温度都会影响酶活性，因此也会影响RNase P的活性，D正确。]
2．(2022·山东济南高三测试)为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增，具体过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A．巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强
B．两套引物需进行两次PCR，由于和两套引物都互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性
C．内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定
D．如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加
D [巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，包括5种基本成分，依次为：引物、耐高温的DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2+，但扩增产物比常规PCR特异性更强，A正确；巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性获得的产物特异性更强，B正确；内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率减小，C正确，D错误。]
3．(2022·辽宁葫芦岛一模)如图是利用重组DNA技术生产能降解农药马拉硫磷的CarE制剂的流程。下列叙述正确的是( )
A．过程①是在小菜蛾细胞的细胞核中进行的
B．过程②获取的CarE基因中不含有启动子和终止子
C．重组DNA技术的核心是将CarE基因导入受体细胞
D．重组表达载体的制备过程中需要限制酶和DNA聚合酶
B [过程①表示通过逆转录合成相应的DNA，该过程是在生物体外进行的，不是在小菜蛾细胞的细胞核中进行的，A错误；过程②获取的CarE基因是以mRNA为模板通过逆转录合成的，因此CarE基因中不含有启动子和终止子，B正确；重组DNA技术的核心是构建含CarE基因的重组表达载体，C 错误；重组表达载体的制备过程中，需要限制酶切割含有CarE基因的DNA片段与载体，然后用DNA连接酶将CarE基因片段拼接到载体的切口处，D错误。]
4．(2022·山东济宁二模)OsGLOl、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示)，利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列叙述正确的是( )
A．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译
B．OsGLOl、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板
C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞
D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况
D [由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，A错误；由题图可知，在同一个T DNA中OsGLOl基因和EcCAT基因的启动子启动转录的方向不同，因此OsGLOl、EcCAT基因转录时不是以DNA的同一条单链为模板，B错误；卡那霉素抗性基因不在T DNA中，而潮霉素抗性基因在T DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，D正确。]
5．(2022·湖北武汉二模)为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现经常将两种或两种以上Bt毒蛋白基因同时转入棉花。②田间策略：主要是为棉铃虫提供庇护所。例如我国长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。关于上述策略，下列叙述错误的是( )
A．转入多种Bt毒蛋白基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
B．转基因棉田周围种植非抗虫棉，可降低棉铃虫抗性基因的突变率
C．为棉铃虫提供庇护所，可使敏感型棉铃虫在种群中维持一定比例
D．为棉铃虫提供庇护所，可使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
B [由于棉铃虫基因突变频率低且不定向，转入多种Bt毒蛋白基因可以降低棉铃虫抗Bt毒蛋白的能力，从而提高抗虫持久性，A正确；基因突变可以自发发生，且具有不定向性，突变频率与环境没有直接关系，所以在转基因棉田周围种植非抗虫棉，不能降低棉铃虫抗性基因的突变率，但可以降低抗性基因的基因频率升高的速度，B错误；在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供庇护所，使敏感型的个体可以生存，在种群中维持一定比例，C正确；为棉铃虫提供庇护所，使具有抗毒蛋白和敏感型个体都得以生存，由于二者之间存在种内竞争，因此使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓，D正确。]
6．(2022·山东菏泽高三一模)水稻胚乳含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系
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